CN1256632A - 利用核糖核苷酸还原酶r1抑制恶性肿瘤 - Google Patents

Abstract

本发明提供通过使肿瘤细胞与生长调节量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列相互作用来调节人或者其它哺乳动物中细胞恶性特征的方法。本发明还提供和应用生长调节量核糖核苷酸还原酶R1蛋白或生物学活性肽来调节人或其它哺乳动物中细胞恶性特性。可表达核酸序列可以用于基因治疗的载体形式存在。

Description

利用核糖核苷酸还原酶R1抑制恶性肿瘤

发明领域

本发明领域涉及控制肿瘤细胞致瘤性和/或转移的方法。具体地，它涉及核糖核苷酸还原酶R1基因序列及其基因产物抑制恶性肿瘤的用途。

相关现有技术描述

导致DNA合成的第一个独特步骤是核糖核苷酸转变成它们相应的脱氧核糖核苷酸，这一反应在细胞周期中以特定方式由管家基因核糖核苷酸还原酶催化(Lewis等，1978；Reichard，1993；Wright，1989a；Wright等，1990a；Stubbe，1989)。这种哺乳动物酶包括由位于不同染色体上的两个不同基因编码的、通常称为R1和R2的两个不相似的二聚体蛋白成分[Bjrklund等，1993；Tonin等，1987]。哺乳动物蛋白R1是同型二聚体结构并且具有控制酶活性和底物特异性的底物位点和别构剂位点[Wright，1989b；Thelander等，1980；Caras，1985；Wright等，1990a]。蛋白R2是同型二聚体并形成两个等价的稳定催化作用所需的酪氨酰自由基的二核铁中心[Wright等，1990a；Thelander等，1985；McClarty等，1990]。R1和R2蛋白在它们的C-末端相互作用以形成有活性的全酶[Reichard，1993；Wright等，1990a；Davis等，1994]。除了提供底物用于DNA复制，核糖核苷酸还原酶还有其它生物学功能。例如，它的活性可在S期之外受DNA交联剂如苯丁酸氮芥和UV照射诱导，表明此酶在DNA修复过程的作用[Hurta和Wright，1992]。

在细胞周期中，R1和R2有差别地受到调节。R₂蛋白从头合成导致R2蛋白S期相关的增加[Lewis等，1978；Mann等，1988]。细胞周期中增殖细胞内核糖核苷酸还原酶活性和由此的DNA合成及细胞增殖通过R2成分的合成和降解得以控制[Eriksson等，1984；Choy等，1988]。此限速R2成分是能够被细胞周期进程的CDC2和CDK2蛋白激酶介质磷酸化的磷蛋白(Chan等，1993)，并且含有稳定酶活性所需的独特酪氨酰自由基的非血红素铁[Reichard，1993；McClarty等，1990]。

R1蛋白的水平基本上在增殖细胞的细胞周期期间没有变化并且在整个细胞周期中可检测到。象R2 mRNA，R1 mRNA的合成主要发生在S期[Eriksson等，1984；Choy等，1988；Mann等，1988]。与R2蛋白相比，细胞周期中R1蛋白的更广泛分布是由于其半衰期更长[Choy等，1988；Mann等，1988]。

在与肿瘤促进剂或生长因子TGF-β接触的肿瘤细胞中，核糖核苷酸还原酶，尤其是R2成分的调节显著改变[Amara等，1994；Chen等，1993；Amara等，1995b；Hurta和Wright，1995；Hurta等，1991]。在某些人结肠癌中检测到R1缺失[Glenney，1986]。已观察到与非恶性细胞相比，培养的恶性细胞中更高的酶活性水平[Weber，1983；Takeda和Weber，1981；Wright等，1989a]，并且与正常调控组织样品相比，在癌前期和恶性组织中已发现R2蛋白和R2 mRNA水平增高[Saeki等，1995；Jensen等，1994]。在肿瘤促进剂或者生长因子介导的肿瘤进程机制中的转化生长因子β的作用下，转化细胞中核糖核苷酸还原酶，尤其是R2成分的调节明显升高[Amara等，1996；Chen等，1993；Aara等，1995b]。

目前，化疗化合物如羟基脲通过使R2蛋白的铁中心去稳定造成酪氨酰自由基的破坏并阻止细胞通过细胞周期S期的进程而抑制核糖核苷酸还原酶的活性[Ashihara和Baserga，1979]。这些药物在治疗人癌症方面应用性有限，因此需要针对核糖核苷酸还原酶的其它方法。

分子生物学和人基因组计划中的突破展开了以前意想不到的用哺乳动物基因表达来定向介入的可能性[Blaese，1997；Felgner，1997]。这些方法包括诸如将遗传调控序列和特定蛋白导入肿瘤细胞以杀死增殖细胞的基因治疗方法。利用这种方法修饰其中生长必须受到控制的细胞如肿瘤细胞中核糖核苷酸还原酶的表达将是有用的。

发明概述

根据本发明，公开了生长调节量核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列调节人或其它哺乳动物中的细胞致瘤和转移特性的用途。本发明还提供调节人或其它哺乳动物中细胞致瘤和转移特性的方法。此方法包括用生长调节量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列作用于肿瘤细胞的步骤，在用于人的实施方案中可以是SEQ ID No：1或其特定的R1编码序列。可表达核酸序列可以通过基因运送载体得以运送，基因运送载体可以是用于基因治疗的载体形式。在另一实施方案中，能以药物组合物形式存在的R1基因产物蛋白或其生物学活性肽可以被运送到需要调控的细胞。本发明的方法和应用及组合物提供受到调控的细胞中哺乳动物核糖核苷酸还原酶的R1成分普遍升高的表达。

附图描述

正如通过参考下面的详细描述变得更好理解一样，当与随后的附图一起考虑时，本发明的其它优点将容易得到理解，其中：

图1A-B是表示对Myc-附加表位的R1表达的分析的照片[Fan等，1996b]，(A)是通过间接免疫荧光测定、来自pSHD/mR1瞬时转染的BHK细胞，而(B)是通过放射免疫沉淀测定、来自稳定的逆转录包装细胞系PA/mR1。抗Myc表位的抗体9E10用于两种测定。

图2是表示表达重组R1的细胞在软琼脂中降低的生长效率的条形图。将已稳定地用R1病毒载体侵染的细胞系与适当空载体侵染的对照细胞系比较(表1)。所表示的资料来自至少三个独立的实验，每个实验由每个细胞系的三个重复培养板组成。接种物大小(细胞数/培养板)如下：C1/SHD和C1/mR1细胞为5×10⁵，C1/mR2和C1/mR2/mR1细胞为1×10⁵，C1/mR2a/SHD和C1/mR2a/mR1、ras-3/SHD和ras-3/mR1细胞为1×10⁴，并且Colo/SHD和Colo/mR1细胞为1×10³。在所有情况下，表达重组R1的细胞与对照细胞之间形成的集落数量的差异是统计学上显著的(P＜0.001)。

图3是表示与对照N/ras细胞(A)相比，N/ras & ASR1细胞(B)在软琼脂中增高的集落形成效率的培养皿的照片。每个培养皿接种1×10⁴个细胞。N/ras & ASR1细胞形成至少4倍更多的集落，集落普遍大于由N/ras细胞形成的那些。(A)中所示的集落在培养3周后形成而(B)中所示的集落在培养2周后形成。当分析来自每个细胞系各由4个培养皿组成的6个实验时，发现两细胞系表现的集落形成效率的差异有高度显著性(P＜0.0001)。

图4的照片表示(A)表示与对照N/ras细胞(a)相比，N/ras & ASR1(b)中下降的R1蛋白的Western印迹分析结果，并且(B)是(A)中所示的硝酸纤维素膜的印度墨水染色结果[Wright和Anazodo，1996]，表明细胞提取物大约相等的加样量。

发明详述

本发明提供通过使用药理学或基因治疗手段在细胞中增加核糖核苷酸还原酶R1的表达来调节人或其它哺乳动物中细胞恶性特征包括肿瘤抑制的方法。例如，可用生长调节量的提供哺乳动物核糖核苷酸还原酶的R1成分普遍升高的表达的哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列(对人，见SEQ ID NO：1)作用于肿瘤细胞。在选择性实施方案中，对细胞进行药理学处理以增加R1表达。更进一步的实施方案中，用核糖核苷酸还原酶R1蛋白或者其生物学活性类似物或衍生物作用于细胞。可表达核酸序列一般在能以用于基因治疗的载体形式存在的基因运送载体中提供。

本发明进一步提供和利用用于调节人或其它哺乳动物中恶性细胞生长的药物组合物，包含有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1或其类似物的可表达核酸序列，并且可存在于载体和药学生理学上可接受的载体或稀释剂中。在本发明的实施方案中，进一步提供和利用用于调节人或其它哺乳动物中恶性细胞生长的药物组合物，包含有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1蛋白或其生物学活性类似物或衍生物和药学生理学上可接受的载体或稀释剂。

如本领域已知的，例如通过激活适当途径增加表达或者增加mRNA稳定性的药物可药理学地处理细胞以增加R1表达。例如，用毛喉素或霍乱毒素刺激cAMP合成增加其中含有功能基因的细胞中R1的表达[Hurta和Wright，1994]。其它可以使用的试剂包括3-异丁基-1-甲基呫吨(cAMP降解的抑制剂)。R1 mRNA的表达通过蛋白激酶C途径调控，因此增加此途径的信息稳定性的药物可增加R1 mRNA的可用性[Chen等，1994A]。

调节是指细胞转化特征如无贴壁依赖性生长和其它本领域已知的以及在实施例中举例说明的其它特征的抑制。调节包括肿瘤抑制活性和减慢肿瘤生长和/或引起肿瘤退化和致瘤性和转移潜能降低的活性。调节包括对任何异常细胞或组织生长或增殖的抑制作用并包括使细胞转变为正常表型。

生长调节量的可以基因治疗载体形式存在的核糖核苷酸还原酶的可表达核酸序列或者R1基因产物本身或其类似物或衍生物或者本发明的用于增加R1细胞表达的药物根据良好医疗实践给药并决定剂量，考虑每个病人的临床病情、给药部位及方法、给药时间表、病人年龄、性别、体重和其它医师已知的因素。用于此处目的的药物“有效量”因此由本领域已知的考虑因素而确定。该量必须有效地达到改善，包括但不限于肿瘤缩小和增加的存活率或更迅速恢复或者症状的改善或消除和其它本领域技术人员选择作为适当标准的指标。

此处所用的基因治疗是指将目的遗传物质(如DNA或RNA)转移入宿主以治疗或预防遗传或获得性疾病或病理表型。目的遗传物质编码期望在体内合成的产物(如蛋白、多肽、肽或功能RNA)。例如，目的遗传物质可编码有治疗价值的激素、受体、酶、多肽或肽。综述通常见“基因治疗”(药理学进展40，Academic Press，1997)。

已发展了基因治疗的两个基本方法：(1)离体(2)体内基因治疗。离体基因治疗中细胞取自病人，并且培养的同时进行体外处理。一般地，功能置换基因通过适当基因运送载体/方法(转染、转导、同源重组等)导入细胞并且需要表达***，然后修饰的细胞在培养中增殖并放回宿主/病人中。已证明这些遗传工程再植入细胞在原位产生转染的基因产物。

体内基因治疗中，靶细胞不是取自病人而是将要转移的基因原位导入受体机体细胞中，即受体内。另外，如果宿主基因是缺陷型的，基因在原位修复[Culver，1998]。已证明这些遗传改变的细胞在原位产生转染的基因产物。

基因表达载体能够运送/转移异源核酸进入宿主细胞。表达载体可以包括本领域已知的以细胞选择性方式调控核酸导向、表达和转录的元件。应当指出基因的5’UTR和/或3’UTR通常可被表达载体的5’UTR和/或3’UTR置换。因此，如此处所用的，表达载体可以按照需要不包含SEQ ID NO：1中所示的5’UTR和/或3’UTR而仅包含R1的特定氨基酸编码区，R1肽或此编码区可以受到修饰以产生R1类似物。

表达载体可包含用于调控异源物质的转录启动子并且可以是组成型或诱导型启动子以允许选择性转录。可选择性地包含获得必要转录水平所需的增强子。增强子一般是任何与编码序列(顺式)连接起作用以改变由启动子决定的基础转录水平的非翻译DNA序列。表达载体也可包括如此处下面所描述的选择基因。

载体是基因运送工具的一种方式并且可通过本领域内多种已知方法中的任一方法导入细胞或组织中。这些方法一般描述于Sambrook等，分子克隆：实验室手册，Cold Springs Harbor Laboratory，纽约(1989，1992)，Ausubel等，分子生物学现行实验方法，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)，Chang等，体细胞基因治疗，CRC Press，Ann Arbor，MI(1995)，Vega等，基因靶向，CRC Press，Ann Arbor，MI(1995)，载体：分子克隆载体和它们的应用概论，Butterworths，BostonMA(1988)和Gilboa等(1986)，并且包括例如稳定或瞬间转染、脂质转染、电穿孔和用重组病毒载体侵染。另外，涉及中枢神经***的载体见美国专利4,866,042，而对阳性-阴性筛选方法见美国专利5,464,764和5,487,992，也见美国专利5,698,443；5,686,278；5,538,885；5,691,176；5,585,254；5,614,396；5,670,488；5,599,712；5,645,829；5,641,680和5,688,773。

通过侵染导入核酸提供超过其它所列方法的一些优点。由于它们的侵染性质可获得更高的效率。而且，病毒是非常专一的并且一般在特定细胞类型中侵染和繁殖。因此，它们的天然特异性可用于将载体靶向体内或组织内或混和的细胞培养物内的特定细胞类型中。病毒载体也可用特异受体或配体修饰以通过受体介导的事件来改变靶向特异性。

用于导入和表达重组序列的DNA病毒载体的特定例子是腺病毒衍生的载体Adenop53TK。此载体表达用于阳性或阴性筛选的疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因和所需重组序列的表达盒。此载体可用于侵染带有腺病毒受体的细胞包括大多数上皮细胞源性癌以及其它细胞。这种载体及其它表现相似期望功能的载体可用于治疗混和的细胞种群包括例如体外或离体细胞培养物，组织或受治疗的人(见例如美国专利5,691,176；5,585,254；5,670,488；5,681,731)。

可向载体增加其它特征以确保其安全性和/或增强其治疗效果。这些特征包括例如可用于对用重组病毒侵染的细胞负选择的标记。这种负选择标记的一个实例是上面所描述的赋予对抗生素gancyclovir敏感性的TK基因。因为负选择通过抗生素的加入提供可诱导的***，因此它是可控制侵染的手段。

另外，由于提供诸如横向侵染和靶向特异性的优点，重组病毒载体可用于目的核苷酸的体内表达。横向侵染是在例如逆转录病毒的细胞周期中固有的，并且由于横向侵染，单个侵染的细胞产生许多子代病毒体，它们出芽脱落并侵染邻近细胞。结果是大范围迅速侵染，其中大多数不是被原始病毒颗粒最初侵染的。这与其中侵染因子仅通过雌性子代传播的垂直侵染相反。不能横向播散的病毒载体也可得到制备。如果期望的目的是将特定基因导入仅仅局限数量的靶细胞，这种特征是有用的。

如上所述的，在许多种情况下病毒已进化成非常专一的侵染因子以逃避宿主防御机制。一般地，病毒在特定细胞类型中侵染和繁殖。病毒载体的靶向特异性利用了其天然特异性以特异地靶向预定细胞类型并因此将重组基因导入侵染的细胞。本发明的方法中所用的载体将取决于要靶向的目的细胞类型并且将为本领域的技术人员所知。例如，如果要治疗乳腺癌，那么将使用用于这种上皮细胞的特异载体。同样，如果要治疗造血***的疾病或病理状况，那么将使用对血细胞及其前体细胞特异的，优选地对造血细胞的特定类型特异的病毒载体。

逆转录病毒载体可以得到构建作为侵染颗粒起作用或者经历仅仅一次最初一轮侵染。在前一种情况下，修饰病毒基因组以使其保持所有必需基因、调控序列和合成新病毒蛋白和RNA的包装信号。一旦这些分子得到合成后，宿主细胞将RNA包装入新的病毒颗粒，它们能进行新一轮侵染。也对载体的基因组进行基因工程操作以编码和表达目的重组基因。就非侵染性病毒载体来说，通常对载体基因组进行突变来破坏将RNA包入病毒颗粒所需的病毒包装信号。没有这样的信号，形成的颗粒将不会进行随后的多轮侵染。载体特定类型取决于预期应用。实际的载体已知并且在本领域内可容易地得到或者可用熟知的方法学由本领域技术人员构建。

重组载体可以多种方式施用。如果使用病毒载体，例如，操作可利用它们的靶向特异性并因此不必在疾病部位局部给药。然而，局部给药可提供更快和更有效的治疗，给药也可通过例如给病人静脉内或皮下注射来进行。将病毒载体注射入脊髓液也可用作一种给药方式，尤其在神经退化性疾病中。注射之后，病毒载体将进入循环直到它们以适当侵染靶向特异性识别宿主细胞。

给药的可选择方式可以通过在疾病或病理状况部位局部直接注射或通过注射入供给部位营养的血管***或脊髓液。局部给药是有利的，因为没有稀释效应并且因此需要小剂量就可实现大多数靶细胞中的表达。另外，因为可以使用侵染注射区内所有细胞的载体，局部注射可减少其它给药形式所需的靶向要求。如果只期望在注射区的细胞特定亚群中表达，那么可使用对目的亚群特异的启动子和调节元件以达到目的。这样的非靶向载体可以是例如病毒载体、病毒基因组、质粒、噬菌粒等。也可使用转染载体如脂质体将上面所描述的非病毒载体导入注射区内的受体细胞。本领域技术人员已知这些转染载体。

在此所用的类似物是指与核糖核苷酸还原酶R1的天然氨基酸序列相比其氨基酸序列有一些差异的变异体(可用替代的术语改变、氨基酸序列改变、氨基酸序列变异体)。通常，类似物一般与功能上相关的任一部分至少70％同源。更优选的实施方案中，与氨基酸序列的同源性至少80％并可达到95％的同源性。当至少一个残基缺失、***或替代后，类似物的氨基酸或核酸序列可与核糖核苷酸还原酶R1蛋白的不同，但蛋白保留功能，即有生物学活性。糖基化作用的差异提供类似物。

此处所用的衍生物可指提供如此处的实施例中所示的相同或相似的生物活性的核糖核苷酸还原酶R1蛋白的肽片段。理解到肽片段可能不象整个蛋白分子有效但它仍可提供如此处实施例中所测定的生物学活性。然而，对于不同的运送***，肽片段提供比全蛋白更好的药动力学参数，因此可作为一种替代。可修饰R1的特异性氨基酸编码区以产生如此处上面所描述的用于基因治疗的生物学活性的R1肽衍生物。衍生物还可指本领域已知的蛋白或肽的药学上可接受的修饰以在不明显改变其生物学活性的情况下增加流动性和溶解度。

生物学活性指的是分子、类似物或衍生物的生物学性质，并且在本文中指体内效应物或直接或间接由天然发生的(天然)核糖核苷酸还原酶R1，尤其是如实施例中测定的和规定的所发挥的活性。效应物发挥作用包括但不限于受体结合、任何酶的活性或酶的调节活性、任何载体结合活性、任何激素活性、任何促进或抑制细胞与细胞外基质或者细胞表面分子的粘附、或者任何结构上的功用。如本领域技术人员已知的，按实施例中所公开的，可确定类似物或衍生物的生物学活性。

核糖核苷酸还原酶R1蛋白或其生物学活性类似物或衍生物可以通过根据序列合成蛋白或肽来制备，或者通过克隆技术重组地制备，或者如本领域已知的分离并应用天然基因产物和/或其部分。

应用核糖核苷酸还原酶R1和其生物学活性类似物或衍生物时，给药可一次给药或在几天到几个月的时期内多次给药直到病变减少。治疗时间一般与疾病进程时间和药物效力及接受治疗的病人种类成比例。最适的剂量时间表可以通过测定体内的药物积累来计算。本领域的普通医生可容易地确定最适剂量、给药方法学和重复率。最适剂量可随核糖核苷酸还原酶R1、生物学活性类似物和衍生物的相对效力而不同，并且一般可根据体外和体内动物研究和临床试验的ED₅₀值来确定。

核糖核苷酸还原酶R1和其生物学活性类似物或衍生物可以是药物组合物中与药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和赋形剂结合的活性成分。组合物可以口服、皮下、表面给药或者非肠道包括静脉内、动脉内、肌肉内腹膜内、和鼻内给药以及鞘内的和灌输技术给药。也可用栓剂和化合物植入物。治疗对象是恒温动物，尤其是哺乳动物包括人。药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和赋形剂及植入物载体一般是指惰性的，无毒的固体或液体填充物、稀释剂或不与本发明的活性成分反应的包装材料。

将非肠道给药时，本发明的药物组合物一般制成单位剂量的可注射形式(溶液、悬浮液、乳剂)。适用于注射的药物制剂包括无菌水性溶液或分散体和用于重新组成进入无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。载体可以是溶剂或者含有例如，水、乙醇、多元醇(例，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油的分散介质。

适当的流动性的保持可以通过，例如应用包被剂如卵磷脂、维持分散体中所要求的颗粒大小以及表面活性剂的应用。非水性赋形剂如棉籽油、芝麻油、橄榄油、大豆油、玉米油、向日葵油或花生油和酯类如异丙基肉豆蔻酸酯也可用作化合物组合物的溶剂***。另外，也可加入增强组合物的稳定性、无菌和等渗性的多种添加剂包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。可用多种抗细菌和抗真菌剂例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来保证微生物作用的防止。在许多情况下，含有等渗试剂例如，糖、氯化钠等是可取的。可通过应用延缓吸收试剂如硬脂酸铝和明胶产生可注射的药物形式的延长吸收。然而，根据本发明，所用的任何赋形剂、稀释剂或添加剂应与化合物相容。

无菌的可注射的溶液的制备可通过如所期望地，将本发明实施中所用的化合物与多种其它成分混和入所要求量的合适的溶剂中。

通过本领域已知的任何方法可实现表面给药并且可包括将药物组合物混和到乳膏、软膏或者经皮肤的膜中。

药物制剂可以含有任何相容的载体如多种赋形剂、佐剂、添加剂和稀释剂的可注射制剂应用于病人；或者本发明所用的化合物可以缓慢释放的皮下植入物或定向运送***如单克隆抗体、载体运送、iontophoretic、聚合物基质、脂质体和中心球形式非肠道应用于患者。本发明中有用的运送***的例子包括：美国专利号5,225,182；5,169,383；5,167,616；4,959,217；4,925,678；4,87,603；4,486,194；4,447,233；4,447,224；4,439,196和4,475,196。许多其它这样的植入物、运送***和组件为本领域技术人员熟知。

本发明中所应用的药物制剂可口服给予患者。可采用传统方法如给予片剂、悬浮液、溶液、乳剂、胶囊、粉末、糖浆等中的化合物。

优选已知的经口、皮下或非肠道运送包括静脉内、动脉内、肌内、腹膜内、和鼻内给药以及鞘内的和输入技术并且保留生物学活性的技术。

可以和例如Ommaya贮存器一起用于在中枢神经***鞘内运送。美国专利5,455,044提供了关于应用用于中枢神经***运送的分散***或者见于关于中枢神经***运送的讨论的美国专利5,558,852。另外，可应用通过血脑屏障的药物制剂[Betz等，1994；Brem等，1993]。这样的制剂可利用现可获得的方法产生本发明中与脑转运载体结合造成转运通过屏障的嵌合肽[Pardridge等，1992；Pardridge，1992；Bickel等，1993]。而且，在适当情况下可采用破坏血脑屏障[Neuwelt等，1980]。

此处下面的实施例中得到的结果第一次表明哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1成分升高的表达可抑制细胞的转化特征如无贴壁依赖性生长。与这些结果相一致的是观察到R1序列反义定向的表达导致R1蛋白减少并且如无贴壁依赖性生长能力明显地升高所表明的细胞转化增加。与本研究中所用的小鼠细胞系相似，人肿瘤Colo 320HSR细胞系R1过量表达也导致降低的无贴壁依赖性生长，表明R1也在人细胞中发挥抑制功能。明显地，R1基因表达水平在决定恶性肿瘤潜能中是重要的并且表达减少可增加恶性肿瘤相关特征。

如实施例所示，在体内R1的表达也能够抑制致瘤性和恶性肿瘤潜能。试验的4个细胞系中的3个在增高的R1表达的情况下表现出动物增高的肿瘤潜伏状态和降低的肿瘤生长特性。

有意思的是，以前已表明的R2过量表达对于细胞的转化、致瘤性和恶性特征具有相反的效果。R2的过量表达与激活的癌基因一起加速肿瘤进程，并且这一过程表现出至少部分通过MAPK途径的变化来调节[Fan等，1996a]。先前的工作[Fan等，1996a]和本研究表明核糖核苷酸还原、DNA合成的关键限速活动所需的两个不同的蛋白R1和R2[Reichard，1993；Wright，1989a]在肿瘤细胞中过量表达时具有截然相反的恶性肿瘤相关效果。可表明的是细胞中R1和R2水平之间存在着微妙的平衡并且这种平衡的消失明显改变肿瘤细胞的恶性潜能。如此处下面实施例中所示R1表达的调节表达的改变可作为新的恶性肿瘤抑制剂。

以上的讨论提供了应用R1作为恶性肿瘤抑制剂的事实基础。和本发明的应用一起用的方法可通过下面非限制性的实施例和所带的图来表示。实施例基本方法：分子生物学基本方法：

一般所采用的本领域已知的和未特异性描述的标准的分子生物学技术如下Sambrook等，分子克隆：实验室手册，Cold Springs HarborLaboratory，New York(1989，1992)；Ansubel等，分子生物学现行实验方法，John Wiley和Sons，Baltimore，Maryland(1989)；和Perbal，分子克隆实用指导，John Wiley & Sons，New York(1988)。多聚酶链反应(PCR)一般按PCR实验方法：方法和应用的指导。Academic Press，San Diego，CA(1990)中的方法进行。载体：本领域技术人员可构建用于本发明的载体并应包含所有的实现序列的期望的转录的表达元件。可选择表达元件以满足仅在目标细胞中表达。其中有益的特征如用于在不同的形式中核酸的恢复的机制也可包含在载体中。本领域的任一普通技术人员将了解哪一种表达元件与特定的细胞类型相容。可采用如此处所述的本领域内的多种已知方法中的任一种方法将载体导入细胞或组织。表达载体

用5’-引物ACCGCTCGAGCCACCATGGAACAAAAGCTTATTTCTGAAGAAGACTTGATGCATGTGATCAAGCGAGA(SEQ ID No：2)斜体是可能的核糖体结合信号Kozak序列[Kozak，1987]；下划线的是编码人Myc表位的序列；粗体字的是天然ATG起始密码子)，和3’-引物CCGCTCGAATCAGGATCCACACATCAG(SEQ ID No：3；粗体字是终止密码子)和模板质粒pcD-M₁[Thelander和Berg，1986]采用聚合酶链式反应(PCR)获得人Myc附加表位的小鼠R1cDNA[Fan等，1996b]。用蛋白酶K处理PCR产物，用Xhol消化，凝胶纯化并与去磷酸化的Xhol-消化的pLXSHD质粒连接[Miller等，1993；Fan等，1996c]以产生逆转录病毒载体pSHD/mR1。除了PA317-来源的稳定的包装系是通过用组氨醇筛选15天获得的之外，逆转录病毒载体的包装和病毒原料的制备可通过如前已描述的应用Ψ2和PA317细胞系来实现[Fan，等，1996a；1996b]。为获得用于反义定向中R1的表达载体，通过PCR方法用引物GCCTCGAGCTGACAGTCGTCTCTGTCCCT(SEQ ID No：4)和TAAAGCTTATCACTTAGAAA TGTTTATTTCAAAAT(SEQ ID No：5)，制备小鼠R1cDNA，用Xho1和HindIII消化并***哺乳动物表达质粒pc DNA3(Invitrogen Corp.)，以产生质粒PASR1。pSHD/mR1和/pASR1的构建都通过序列分析来证实并且通过内切核酸酶消化来限制。细胞系和细胞培养

本研究中所用的细胞系及相关资料见表1所示。细胞常规地在含有8％小牛血清(Fetalclone III，Hyclone)的α-极限必需培养基(MEM)中培养。为产生表达重组的R1的细胞，在1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物存在下，用SHD/mR1病毒原种侵染细胞，从稳定的包装系PA/mR1制备细胞[Fan等，1996a；Miller，等，1993]。稳定的侵染物(≥500克隆)的获得是通过用取决于细胞系的4-15mM组氨醇筛选，然后收集并扩增。相对应的对照的细胞系用缺少R1序列的LXSHD病毒产生。通过用LipofectAmine试剂盒(Life Technologies)转染NIH 3T3细胞，随后用G418筛选产生R1反义表达细胞[Egan等，1987a；Taylor等，1992]。细胞生长速率的评定可通过测定在1.0N NaOH制备的细胞提取物在260nm的吸光度[Kempe，等，1976]，和/或在种植后在不同的时间点进行细胞计数[Egan等，1987a]。在含有15ml的碱性琼脂(在含有10％胎牛血清的MEM中0.5％的Bacto琼脂)和10ml生长琼脂(在含有10％胎牛血清的MEM中0.33％的琼脂)的10cm组织培养板中估计软琼脂中的生长。从亚融合培养物收获细胞并在14-21天后计数集落数[Fan等，1996a；1996b；Taylor等，1992]。致瘤性和转移的测定

如以前所描述的C3H/HeN同基因小鼠(Charles River BreedingLaboratories，Quebec)用于这些测定[Fan等，1996a；Egan等，1987b]。从亚融合的、对数生长的培养物中制备细胞，用胰蛋白酶/EDTA溶解温和处理收集细胞并调细胞至合适的浓度。肿瘤潜伏期的确定是通过将细胞注射到皮下并且记录形成触诊可查到肿瘤(2×2mm)所需的时间。21天后，从小鼠切除肿瘤并计录肿瘤的重量。就没有肿瘤形成的，保留小鼠到注射后2个月然后杀检。关于转移的测定，如所描述的，将细胞注射进入6-8周龄的C3H/HeN同基因小鼠的尾静脉并在21天后估计肺部肿瘤的数目[Fan等，1996a；Egan等，1987b]。为证实相等数量的试验以及注射了对照细胞，以100个细胞/每培养板接种含生长培养基的重复培养板。培养10天后，培养板用亚甲蓝染色并计数集落数目。检测重组R1蛋白的表达

用间接免疫荧光测定检测BHK细胞中重组的R1蛋白的瞬时表达[Fan等，1996a，b]。用LipofectAmine试剂以pSHD/mR1质粒转染生长在盖玻片上的70％融合的细胞。转染20小时后，用磷酸缓冲盐水pH7.2(PBS)中制备的3％甲醛进行细胞固定、用0.1％Triton X-100(PBS中)透化，与抗-Myc表位单克隆9E10抗体(American Type Culture Collection)培养细胞，冲洗，与FITC结合的羊抗-小鼠IgG(整个分子，Sigma)反应，再次冲洗，最后在荧光显微镜下检查[Leonhardt等]。应用以前所描述的步骤，用9E10抗体，从[³⁵S]蛋氨酸/半胱氨酸-标记的细胞进行重组的R1的免疫沉淀[McClarty等，1990；Goding，1978]。一些实验中R1蛋白水平的测定是按以前所描述的应用抗R1单克隆抗体，AD203作Western印迹分析来进行的[McClarty等，1990；Fan等，1996a]。核糖核苷酸还原酶测定

按以前所描述的测定从SC2/mR1和对照的SC2/SHD细胞系中制备的粗提物中的核糖核苷酸还原酶活性[Lewis，1978；Hurta和Wright，1992；Hurta，等，1991]。在某些实验中，采用结合纯化的重组R2蛋白和9E10抗体-沉淀的R1蛋白来进行酶的测定。按描述的[Goding，1978]制备携带表面蛋白A和家兔抗小鼠IgG的Pansorbin细胞(甲醛固定的葡萄球菌，Calbiochem，La Jolla，CA)。此结合物进一步与过量的9E10抗体培养并冲洗5次。将20μl的此复合物(10％悬浮液)加到1.0ml的从5×10⁷细胞制备的提取物中并将其置于摇床上4℃下摇动2小时，用含10mg/ml的牛血清白蛋白的PBS洗3次，加入1.0μg的纯化的重组R2蛋白后测定核糖核苷酸还原酶活性[Hurta和Wright，1992；Fan等，1996a；Mann等，1991]。实施例1重组R1的表达

为在细胞中过量表达R1蛋白，构建了哺乳动物表达载体pSHD/mR1。此载体中，人Myc-表位附加的R1 cDNA的表达受长的末端重复序列的逆转录病毒启动子的调控[Miller等，1993]。重组的R1的表达首先在瞬时转染的BHK细胞中进行分析。应用抗Myc单克隆9E10抗体的间接免疫荧光测定揭示了pSHD/mR1转染的细胞中重组的R1蛋白的胞质表达(图1A)。作为对照，未转染的或空载体pLXSHD转染的细胞没有表现出任何特异性的荧光。在证明重组的R1蛋白可在哺乳动物细胞中表达之后，然后应用逆转录病毒包装细胞将可表达的DNA转化进入有侵染性的，具有高的运送效率的但复制缺陷型载体病毒中。再次分析了稳定的包装系PA/mR1中的重组的R1的表达。用9E10抗体免疫沉淀检测了来自从已用[³⁵S]蛋氨酸/半胱氨酸代谢法标记的PA/mR1细胞(表1)制备的提取物中单一的近似88KDa的蛋白(图1B)。如所预料的，从稳定的对照病毒包装细胞系PA/SHD中没有沉淀出蛋白(图1B)。这些结果表明，可以达到重组的R1蛋白的稳定的表达。

然后测定细胞表达的重组R1是否具有生物学活性。本研究中用SHD/mR1或LXSHD病毒载体侵染羟基脲抗性小鼠L细胞系，SC2并用于筛选稳定的侵染物(表1)。由于SC2细胞表达相对于R1亚单位更多的R2，此细胞系中生物学活性R1蛋白的表达将导致增高的核糖核苷酸还原酶活性[McClarty等，1990]。四个实验中，从SC2/mR1细胞中制备的粗提物中CDP还原酶活性是13.2±0.7nmol/mg蛋白/hr比从对照SC2/SHD细胞制备的提取物中的(10.1±0.2nmol/mg/hr约高30％。进一步，来自C1/mR1细胞的重组R1用9E10抗体免疫沉淀并且通过将冲洗的免疫沉淀物与纯化的重组R2蛋白相结合而用来测定核糖核苷酸还原酶活性[Hurta和Wright，1992；Fan等，1996a；Mann等，1991]。在三个独立的实验中，当用C1/mR1细胞(表1)作为重组的R1来源时，检测到酶的活性为15.4±2.0pmol/mg/hr，并且如所预料的，当用对照的C1/SHD细胞时没有活性发现(表1)。实施例2过量表达R1的细胞的降低的贴壁不依赖性

细胞转化经常伴随体外贴壁不依赖生长，这通常与体内致瘤潜能相关，并且可根据增殖和在含有琼脂的培养基中形成集落的能力来评价。[Fan等，1996a；Egan等，1987a]。为研究R1在细胞转化中可能发挥的作用，用PA/mR1病毒载体或者空的病毒对照LXSHD侵染CIRAS-1细胞(表1)。CIRAS-1细胞来源于野生型、用致肿瘤的T24 H-ras转染的非恶性小鼠10T 1/2细胞[Egan等，1987a]。以前的研究已表明这是中等恶性的细胞系，并且可作为用于分析转化和恶性肿瘤相关特征的好模型[Hurta和Wright，1995；Fan等，1996a，Egan等，1987a；Wright等，1993]。组氨醇筛选之后获得的稳定的侵染物用来评价软琼脂生长能力。发现，与对照的C1/SHD细胞相比，含有增高的水平的R1的C1/mR1细胞在软琼脂中形成集落的效率明显降低[图2]。还用含有下调的R2表达的细胞试验了R1表达对于其软琼脂上生长的影响。C1/mR2是表达重组的R2的CIRAS-1衍生物并已获得增高的恶性潜能[Fan等，1996a]。再次观察到与对照的C1/mR2细胞相比，有增高的R1的C1/mR2/mR1细胞的集落形成效率明显降低(图2)。

为排除(尽管不可能)观察到的有R1细胞的下降的软琼脂生长效率可能是用本质的更低的生长效率从相对异种的细胞群筛选细胞的结果，从C1/mR2细胞分离命名为C1/mR2a的亚克隆。两细胞系(C1/mR2a/mR1)和对照的(¹mR2a/SHD)来源于这个亚克隆群(表1)。当与对照的C1/mR2a/SHD细胞相比较时，与有亲本系的观察相一致，C1/mR2a/mR1细胞表现出相似的软琼脂中生长效率的降低(图2)。这表明降低的贴壁不依赖性是由重组R1的表达引起的。实施例3

以上试验的细胞系是小鼠来源的。为确定是否如软琼脂中生长能力的改变，人肿瘤细胞中重组的R1的表达也改变转化特征，应用了人结肠腺癌Colo 320HSR细胞系[Quinn等，1979]。用含有R1序列的病毒载体侵染这些细胞以获得Colo/mR1细胞系(表1)。有趣的是，当与含有空载体的Colo/SHD细胞相比较时，有Colo/mR1细胞的软琼脂中的生长效率下降了约50％(图2)。实施例4带有含升高的R1的细胞体内致瘤和/或转移潜能的抑制作用

为进一步评价R1表达的改变在恶性进程中可能起的作用，在体内模型中分析了C1/mR1细胞的致瘤的和转移特性。与对照的C1/SHD细胞相比，C1/mR1细胞表现出明显降低的恶性潜能(表2)。尽管所有皮下注射C1/SHD细胞的小鼠在注射约11天后发展成肿瘤，即使在注射两月之后，也没有注射C1/mR1细胞的动物形成可检查到的肿瘤。另外，实验的转移测定表明，与对照的C1/SHD细胞相比，在形成肺转移上C1/mR1细胞大为降低(表2)。用另一种以前已描述的，称为ras-3的，独立筛选的T24H-ras转染的小鼠10T 1/2细胞系进行了相似的实验[Taylor等，1992]。尽管ras-3细胞中重组R1的肿瘤抑制活性不如观察到的CIRAS-1来源细胞中的显著，与对照的ras-3/SHD细胞相比，如根据延长的肿瘤潜伏期和更小的肿瘤大小来判断，带有ras-3/mR1细胞的致瘤性明显降低。与CIRAS-1来源的细胞相似，当与对照的ras-3/SHD细胞相比时，ras-3/mR1细胞表现出显著降低的转移潜能(表2)。

还在体内试验了重组R1的表达对含有下调的R2表达的细胞的恶性潜能的影响。与以前的观察相一致，C1/mR2细胞表现出比对照的C1/SHD细胞更高的致瘤的和转移潜能，证实了R2的恶性肿瘤促进功能[Fan等，1996a]。还与体外实验中(图2)获得的资料相一致的是，C1/mR2/mR1细胞的恶性比对照的C1/mR2细胞大为降低(表2)。而且，C1/mR2/mR1细胞的致瘤和转移潜能降低到比C1/SHD细胞的明显更低的水平(表2)。

然后试验了用于改变含有多重癌基因变化的高度恶性细胞系的恶性特征的重组的R1表达的潜在能力。已经很好地鉴定了用激活的H-ras、c-myc、和p53的突变的致癌的形式一起转染的RMP-6小鼠10T 1/2系[Taylor等，1992；Huang等，1995]，并将其用于本研究。不象上面研究的R1过量表达细胞系，当与对照的RMP/SHD细胞相比时(表2)，RMP/mR1细胞(表1)没有表现出致瘤性的改变。与这些体内的结果相一致，软琼脂生长实验中观察到RMP/mR1和RMP/SHD细胞有近似的相同的集落形成效率。然而有趣的是，在实验性转移测定中，RMP/mR1细胞在同基因小鼠中形成比对照的RMP/SHD细胞明显少的肺部肿瘤(表2)。表2中所示的肺转移的数目的差异实际上估计不足，因为得到RMP/SHD细胞的小鼠内的肺肿瘤一般比那些注射RMP/mR1细胞的小鼠的肺中形成的肿瘤更大。这些结果表明高度恶性的RMP-6细胞中R1的过量表达明显抑制转移潜能。实施例5反义表达R1的致癌ras转染的细胞的增高的贴壁非依赖性

反义序列的表达是为实现基因表达下调的常用的方法[Spearman等，1994；Wright和Anazodo，1996]。如果如上面所表明的，R1能抑制细胞的转化，那么R1反义序列的表达应该降低R1蛋白的水平并且进一步增加转化特征。为验证这些，构建了相对于载体启动子，将R1序列置于反义方向的表达载体。用此反义载体和表达T24 H-ras癌基因的pHO6T质粒共转染NIH 3T3细胞[Egan等，1987a]。H-ras表达转化哺乳动物细胞使之经常能在含生长培养基的软琼脂中形成集落[Fan等，1996a；Egan等，1987a]。评价用G418筛选之后获得的稳定的共转染物的贴壁不依赖生长。与上面所描述的实验中得到的结果相一致，当与含有H-ras癌基因不含R1反义序列的对照N3/ras细胞相比较时，含有R1反义序列的N/ras & ASR1细胞表现出软琼脂中明显更高的集落形成效率(图3)。如所预料的，Western印迹分析(图4)和Northern印迹分析表明N/ras &ASR1细胞中的R1表达比N/ras细胞中的更低。塑料培养板表面N/ras &ASR1和N/ras细胞的生长速率近似相同，为14-16小时的两倍时间。

整个本申请中，根据作者、年和专利序号参考了多个发表文章包括美国专利。这些发表文章的完全引证列在下面。在本申请中参考引用了这些发表文章和专利的公开内容的全部以更全面地描述与本发明相关的领域。

已用举例说明的方式对本发明进行了描述，应理解的是所用的术语指的是对词的本质的描述而不是限制。

明显地，根据上面所述，本发明的多种修饰和变异是可行的。因此，在附加的权利要求范围之内，可实施本发明而不必按特定的描述。表1关于细胞系的信息命名        亲本系            相关的特征鉴定和转基因表达                        参考或出处BHK                                                                               ATCCψ²                              逆转录病毒包装                                  ATCCPA317                             逆转录病毒包装                                  ATCCPA/SHD       PA317                包装对照病毒LXSHD                               本研究PA/mR1       PA317                包装SHD/mR1^*病毒                              本研究SC2          L60                  与R1相比R2过量                                  McClarty等SC2/SHD      SC2                  hisD⁺                                         本研究SC2/mR1      SC2                  mR1，hisD⁺                                    本研究C1RAS-1      10T1/2               T24 H-ras                                       Egan等C1/SHD       C1RAS-1              hisD⁺，T24 H-ras                              本研究C1/mR1       CIRAS-1              mR1^*，hisD⁺，T24 H-ras                       本研究C1/mR2       CIRAS-1              mR2^*，T24 H-ras                                Fan等C1/mR2/SHD   C1/mR2               hisD⁺，mR2^*，T24 H-ras                       本研究C1/mR2/mR1   C1/mR2               mR1，hisD⁺，mR2^*，T24 H-ras                  本研究C1/mR2a/SHD  C1/mR2a^           hisD⁺，mR2^*，T24 H-ras                       本研究C1/mR2a/mR1  C1/mR2a^           mR1^*，hisD⁺，mR2^*，T24H-ras                 本研究ras-3(或R-3) 10T1/2               T24，H-ras                                      Taylor等ras-3/SHD    ras-3                hisD⁺，T24 H-ras                              本研究ras-3/mR1    ras-3                mR1^*，hisD⁺，T24 H-ras                       本研究RMP-6        10T1/2               T24 H-ras，c-myc，p53突变体                     Taylor等RMP/SHD      RMP-6                hisD⁺，T24 H-ras，c-myc，p53突变体            本研究RMP/mR1      RMP-6                mR1^*，hisD⁺，T24H-ras，c-myc，p53突变体      本研究Colo 320HSR                       人结肠癌                                        ATCCColo/SHD     Colo 320HSR          hisD⁺                                         本研究Colo/mR1     Colo 320HSR          mR1^*，hisD⁺                                  本研究NIH 3T3                                                                           ATCCN/ras        NIH3T3               T24 H-ras neo⁺                                本研究N/ras & ASR1 NIH3T3               反义R1，T24 H-ras，neo⁺                       本研究ATCC美国典型培养物保藏中心。^*分别是mR1和mR2，人Myc表位附加的R1和R2蛋白。⁺选择性标记基因，hisD(组氨醇脱氢酶)和neo(新霉素磷酸转移酶)。^C1/mR2a是来自C1/mR2的亚克隆。表2表达重组R1蛋白的细胞降低的致瘤和转移潜能

                         致瘤性测定^*(皮下肿瘤)                           转移测定⁺(肺肿瘤)细胞系              频率            潜伏期(天)     重量(g)               频率      肿瘤数      PC1/SHD               5/5             11±2         0.3±0.1                5/5      44±13C1/mR1               0/5             -             -                       5/5      6±3     ＜0.001ras-3/SHD            5/5             9±2          0.9±0.3                5/5      120±22ras-3/mR1            4/5             14±2         0.3±0.2                4/5      4±2     ＜0.001C1/mR2               10/10           8±1          ＞1.0^                10/10    195±34C1/mR2/mR1           2/10^         19±4         ＞0.1^                10/10    20±6    ＜0.001RMP/SHD              4/4             7±1          1.1±0.3                4/4      61±8RMP/mR1              4/4             7±1          1.0±0.2                4/4      27±7    ＜0.001*皮下注射的细胞数如下：RMP/SHD和RMP/mR1细胞为1×10⁵，所有其它细胞系为3×10⁵。+静脉注射的细胞数为：RMP/SHD和RMP/mR1细胞为2×10⁵，所有其它细胞系为1×10⁶。^用C1/mR2细胞注射的小鼠在注射后21天杀检。估计这些小鼠的肿瘤至少为1.0g。用C1/mR2/mR1注射的小鼠之一在第15天形成肿瘤；第21天杀检此小鼠，估计肿瘤小于0.1g。此组中另一小鼠有生长非常慢的肿瘤，在第23天可检测到且第60天时估计小于0.1g。

参考文献

Amara等，1994.在哺乳动物核糖核苷酸还原酶R2 mRNA的3’-未翻译区的新的细胞质蛋白结合活性的佛波酯调控以及在信息稳定性中的作用。生物化学杂志269：6709-7071。

Amara等，1995A.羟基脲抗性细胞中信息稳定性改变的调控和核糖核苷酸还原酶R1和R2信使RNAs的肿瘤促进剂反应的顺反相互作用。癌症研究55：4503-4506。

Amara等1995B.在哺乳动物核糖核苷酸还原酶成分R2的mRNA的3’-未翻译区定义一个新的顺式元件：在转化生长因子-β₁诱导的mRNA稳定中的作用。核酸研究23：1461-1467。

Amara等，1996.在哺乳动物核糖核苷酸还原酶成分R2的mRNA的3’-未翻译区定义一个新的顺式元件：顺反相互作用和信息稳定性。生物化学杂志271：20126-20131。

Ashihara和Baserga，1979.细胞同步化。酶学方法58：248-262。

Betz等，1994.基础神经化学。分子的细胞，(Raven Press Ltd，NY)第五版，681-699

Bickel等，1993.“脑中通过载体介导的肽药物运送的体内药理学效应”美国国家科学院院报90(7)2618-2622

Blaesse，1997.癌症基因治疗。276(6)：111-115。

Bjrklund，等，1990.生物化学，29：5452-5458

Bjrklund等，1993.编码小鼠核糖核苷酸还原酶的亚单位(R1蛋白)的基因的结构和启动子的鉴定。美国国家科学院院报90：11322-11326。

Brem等，“多聚物作为设计用于治疗恶性脑肿瘤的调控的药物运送”欧洲药理学与生物药理学杂志39：2-7(1993)

Capecchi，“通过同源重组改变基因组”科学244：1288-1292(1989)。

Caras等，1985.克隆的小鼠核糖核苷酸还原酶亚单位M1 cDNA揭示了与大肠杆菌和疱疹病毒的核糖核苷酸还原酶的氨基酸序列同源性。生物化学260：7015-7022。

Chan等，1993.核糖核苷酸还原酶R2蛋白的磷酸化：关于pδ4^cdc2和CDK2蛋白激酶的作用的体内和体外证据。生物化学32：12835-12840。

Chem等，1993.正常和佛波酯刺激条件下哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1 mRNA稳定性：在3’-未翻译区顺反相互作用的参与。欧洲分子生物学组织杂志12：3977-3986。

Chem等，1994A.哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1 mRNA稳定性的调节由核糖核苷酸还原酶R1 mRNA 3’-未翻译区顺反相互作用通过蛋白激酶C调控的途径介导。生物化学杂志.302：125-132。

Chem等，1994B.定义一种新的与独特的胞质的反式作用蛋白相结合的核糖核苷酸还原酶R1 mRNA顺式元件。核酸研究22：4796-4797。

Choy等，1988.涉及核糖核苷酸还原酶的抗药性的分子机制：在升高的药物浓度存在下筛选的一系列细胞系相关的小鼠细胞系中的羟基脲抗性。癌症研究48：2029-2035。

Culver，1998.用于人ADA基因的突变的修复的定点重组。(摘要)以反义DNA和RNA为基础的治疗，1998，二月，Coronado，CA.

Davis等，1994.重组的小鼠核糖核苷酸还原酶R1亚单位的亚单位相互作用区的纯化、鉴定和定位。生物化学杂志269：23171-23176。

Egan等，1987A.H-ras的表达与转移潜能相关：关于10T 1/2和NIH3T3细胞中转移表型的直接调控的证据。分子细胞生物学7：830-837。

Egan等，1987B.用编码蛋白激酶的癌基因的转化诱导转移表型。科学238：202-205。

Eriksson等，1984.哺乳动物核糖核苷酸还原酶的细胞周期依赖性调节。亚单位M2的S期相关的升高由蛋白从头合成调控。生物化学杂志259：11695-11700。

Fan等，1996A.核糖核苷酸还原酶R2成分是与激活的癌基因共同作用以决定转化和恶性潜能的新的恶性肿瘤决定因素。美国国家科学院院报，93：14036-14040。

Fan等，1996B.由逆转录病毒载体介导的R2 cDNA稳定的表达所表明的，铁蛋白基因表达和核糖核苷酸还原酶R2蛋白之间的关联。欧洲生物化学学会联合会快报。FEBS Lett.382：145-148。

Fan等，1996C.来自与胸苷酸合酶缺陷的大肠杆菌互补的砂眼衣原体的基因的克隆。在：第94次美国微生物学学会全体会议摘要中p.134.

Filatov等，小鼠核糖核苷酸还原酶R1和R2基因对紫外线引起的DNA损伤的反应的诱导。生物化学杂志.271：23698-23704。

Gilboa等，1986.应用逆转录病毒载体对克隆的基因的转移和表达。生物技术BioTechniques 4(6)：504-512。

Gingras等，1991.癌症研究50：4061-4066。

Glenney，1986.Anal.Biochem.79：4002-4005。

Goding，1978，免疫学方法杂志20：241-253。

Hanania等，1995.人疾病的基因治疗的应用的最新进展。美国医学杂志99：537。

Huang等，1995.由H-ras，c-myc和突变型p53基因过量表达的结合引起的在药物敏感性、基因稳定性和恶性潜能上的多重效应。Iht.J.Oncol.7：57-63。

Hurta等，1991.由恶性的H-ras转染的细胞系中转化生长因子β₁引起的核糖核苷酸还原酶基因表达的早期诱导。生物化学杂志，266：24097-24100。

Hurta和Wright，1992.生物化学杂志，267：7066-7071

Hurta和Wright，1994.在恶性的H-ras转染的细胞系中调控核糖核苷酸还原酶基因表达的环AMP(环磷酸腺苷)信号传导途径的改变。细胞生理学杂志158：187-197。

Hurta和Wright，1995.H-ras恶性转染导致由转化生长因子β₁引起的核糖核苷酸还原酶基因表达的反常调控。

Jensen等，1994.由显微术定向克隆的癌前期乳腺疾病中表达的基因的鉴定。美国国家科学院院报91：9257-9261。

Johnson和Bird，1991.酶学方法中的单克隆抗体的单链Fvb衍生物的构建和它们在大肠杆菌中的生产。(JJ Langone，ed.；Academic Press，New York，NY)203：88-99。

Kempe等，1976.细胞9：541：550。

Kozak，1987.核酸研究20：8125-8148。

Lewis等，1978.在核苷酸可渗透的仓鼠细胞中核糖核苷酸还原的测定。细胞生理杂志94：287-298。

Leonhardt等，细胞71：865-873。

Mader等，1996.美国癌症研究学会第87次年会进展37：547。

Mann等1988.细胞增殖、静止和分化中的核糖核苷酸还原酶M1亚单位。癌症研究杂志48：5151-5156。

Mann等，1991.生物化学30：1939-1947。

McClarty等，1990.哺乳动物细胞中增高的铁蛋白基因表达与增高的核糖核苷酸还原酶基因表达和羟基脲抗性相关。生物化学杂志265：7539-7547。

Miller等，1993.逆转录病毒用于基因转移和表达的应用。酶学方法217：581-599。

Pardridge等，1992.“血脑屏障和脑的药物运送的新方法”WestJ.Med.156(3)281-286。

Pardridge，1992，“肽药物运送到脑的新进展”药理学与毒理学71(1)：3-10

Quinn等，1979.癌症研究39：4914-4924。

Reichard，1993.从RNA到DNA，为什么如此多的核糖核苷酸还原酶？科学60：1773-1777。

Saeki等，1995.人乳腺肿瘤中核糖核苷酸还原酶的免疫组化检测。Int.J.Oncel.6：523-529。

Spearman等，1994.TGF-β₁基因表达的反义寡脱氧核糖核苷酸的抑制作用和小鼠纤维肉瘤细胞的生长和恶性特征的改变。基因149：25-29.

Stubbe，1989.生物学催化作用中蛋白基因的参与？Annu.Rev.Biochem.58：257-285。

Taylor等，1992.细胞转化和肿瘤播散中ras，myc和p53的突变型之间协同相互作用的证据。癌基因7：1383-1390。

Thelander等，1985.哺乳动物核糖核苷酸还原酶M2亚单位。从M2-过度生产的小鼠细胞中分离的一种同源蛋白的鉴定。生物化学杂志260：2737-2741。

Thelander等，1980.来自小牛胸腺的核糖核苷酸还原酶。将酶分离为两个不相同的亚单位，蛋白M1和M2。生物化学杂志255：7426-7432。

Thelander和Berg，1986.分子细胞生物学6：3433-3442。

Thelander等，1990.生物化学杂志255：7624-7432。

Tonin等，1987.羟基脲抗性的仓鼠细胞中扩增的基因的染色体分配Cytogenet Cell Genet.45：102-108。

Weber，1983.癌细胞和化疗设计的生物化学策略。癌症研究43：3466-3492。

Wright & Anazodo，1996.反义分子和它们用于治疗癌症和AIDS(艾滋病)的潜力。癌症杂志8：185-189。

Wright，1989A.来自突变体细胞系的改变的哺乳动物核糖核苷酸还原酶。药理学治疗百科书128：89-111。

Wright，等，1989B哺乳动物细胞中抗药性中羟基脲和相关的化合物R.S.Gupta编辑(CRC Press，Boca Raton，FL.，1989)，Vol.1，pp 15-27.

Wright等1990A.哺乳动物核糖核苷酸还原酶的调控和药物抗性机制以及对DNA合成的意义。生物化学细胞生物学杂志68：1364-1371。

Wright等，1990b抗癌研究10：1247-1256。

Wright等，1993.作为肿瘤向恶性肿瘤发展的促进剂的转化生长因子β和成纤维细胞生长因子。癌基因鉴定性评论4：473-492。

                        序列表(1)基本信息(i)申请人：Wright，Jim A。

          Young，Aiping H。(ii)发明名称：利用核糖核酸酶R1抑制恶性肿瘤(iii)序列数：5(iv)联系地址：

(A)名称：Kohn&Assosiates

(B)街道：30500 Northwestern Hwy.Suite 410

(C)城市：Farmington Hills

(D)州名：Michigan

(E)国家：美国

(F)邮政编号：48334(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30(vi)目前申请资料：

(A)申请号：

(B)递交日：

(C)分类

(viii)律师/代理人信息

(A)名称：Montgomery，Ilene N.

(B)登记号：38,972

(C)参考/著录号：0227.00013(ix)电信信息：

(A)电话：(248)539-5050

(B)传真：(248)539-5055(2)关于SEQ ID NO：1的信息(i)序列特征

(A)长度：3083个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：否(iii)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GGGGATTTGG ATTGTTGCGC CTCTGCTCTG AAGAAAGTGC TGTCTGGCTG GAACTCCAGT        60TCTTTCCCCT GAGCAGCGCC TGGAACCTAA CCCTTCCCAC TCTGTCACCT TCTCGATCCC       120GCCGGCGCTT TAGAGCCGCA GTCCAGTCTT GGATCCTTCA GAGCCTCAGC CACTAGCTGC       180GATGCATGTG ATCAAGCGAG ATGGCCGCCA AGAACGAGTC ATGTTTGACA AAATTACATC       240TCGAATCCAG AAGCTTTGTT ATGGACTCAA TATGGATTTT GTTGATCCTG CTCAGATCAC       300CATGAAAGTA ATCCAAGGCT TGTACAGTGG GGTCACCACA GTGGAACTAG ATACTTTGGC       360TGCTGAAACA GCTGCAACCT TGACTACTAA GCACCCTGAC TATGCTATCC TGGCAGCCAG       420GATCGCTGTC TCTAACTTGC ACAAAGAAAC AAAGAAAGTG TTCAGTGATG TGATGGAAGA       480CCTCTATAAC TACATAAATC CACATAATGG CAAACACTCT CCCATGGTGG CCAAGTCAAC       540ATTGGATATT GTTCTGGCCA ATAAAGATCG CCTGAATTCT GCTATTATCT ATGACCGAGA       600TTTCTCTTAC AATTACTTCG GCTTTAAGAC GCTAGAGCGG TCTTATTTGT TGAAGATCAA       660TGGAAAAGTG GCTGAAAGAC CACAACATAT GTTGATGAGA GTATCTGTTG GGATCCACAA       720AGAAGACATT GATGCAGCAA TTGAAACATA TAATCTTCTT TCTGAGAGGT GGTTTACTCA       780TGCTTCGCCC ACTCTCTTCA ATGCTGGTAC CAACCGCCCG CAACTTTCTA GCTGTTTTCT       840TCTGAGTATG AAAGATGACA GCATTGAAGG CATTTATGAC ACTCTAAAGC AATGTGCATT       900GATTTCTAAG TCTGCTGGAG GAATTGGTGT TGCTGTGAGT TGTATTCGGG CTACTGGCAG       960CTACATTGCT GGGACTAATG GCAATTCCAA TGGCCTTGTA CCGATGCTGA GAGTATATAA       1020CAACACAGCT CGATATGTGG ATCAAGGTGG GAACAAGCGT CCTGGGGCAT TTGCTATTTA       1080CCTGGAGCCT TGGCATTTAG ACATCTTTGA ATTCCTTGAT TTAAAGAAGA ACACAGGAAA       1140GGAAGAGCAG CGTGCCAGAG ATCTTTTCTT TGCTCTTTGG ATTCCGGATC TCTTCATGAA       1200ACGAGTGGAG ACTAATCAGG ACTGGTCTTT GATGTGTCCA AATGAGTGTC CTGGTCTGGA     1260TGAGGTTTGG GGAGAGGAAT TTGAGAAACT ATATGCAAGT TATGAGAAAC AAGGTCGTGT     1320CCGCAAAGTT GTAAAAGCTC AGCAGCTTTG GTATGCCATC ATTGAGTCTC AGACGGAAAC     1380AGGCACCCCG TATATGCTCT ACAAAGATTC CTGTAATCGA AAGAGCAACC AGCAGAACCT     1440GGGAACCATC AAATGCAGCA ACCTGTGCAC AGAAATAGTG GAGTACACCA GCAAAGATGA     1500GGTTGCTGTT TGTAATTTGG CTTCCCTGGC CCTGAATATG TATGTCACAT CAGAACACAC     1560ATACGACTTT AAGAAGTTGG CTGAAGTCAC TAAAGTCGTT GTCCGAAACT TGAATAAAAT     1620TATTGATATA AACTACTATC CTGTACCAGA GGCATGCCTA TCAAATAAAC GCCATCGCCC     1680CATTGGAATT GGGGTACAAG GTCTGGCAGA TGCTTTTATC CTGATGAGAT ACCCTTTTGA     1740GAGTGCAGAA GCCCAGTTAC TGAATAAGCA GATCTTTGAA ACTATTTATT ATGGTGCTCT     1800GGAAGCCAGC TGTGACCTTG CCAAGGAGCA GGGCCCATAC GAAACCTATG AGGGCTCTCC     1860AGTTAGCAAA GGAATTCTTC AGTATGATAT GTGGAATGTT ACTCCTACAG ACCTATGGGA     1920CTGGAAGGTT CTCAAGGAGA AGATTGCAAA GTATGGTATA AGAAACAGTT TACTTATTGC     1980CCCGATGCCT ACAGCTTCCA CTGCTCAGAT CCTGGGGAAT AATGAGTCCA TTGAACCTTA     2040CACCAGCAAC ATCTATACTC GCAGAGTCTT GTCAGGAGAA TTTCAGATTG TAAATCCTCA     2100CTTATTGAAA GATCTTACCG AGCGGGGCCT ATGGCATGAA GAGATGAAAA ACCAGATTAT     2160TGCATGCAAT GGCTCTATTC AGAGCATACC AGAAATTCCT GATGACCTGA AGCAACTTTA     2220TAAAACTGTG TGGGAAATCT CTCAGAAAAC TGTTCTCAAG ATGGCAGCTG AGAGAGGTGC     2280TTTCATTGAT CAAAGCCAAT CTTTGAACAT CCACATTGCT GAGCCTAACT ATGGCAAACT     2340CACTAGTATG CACTTCTACG GCTGGAAGCA GGGTTTGAAG ACTGGGATGT ATTATTTAAG     2400GACAAGACCA GCAGCTAATC CAATCCAGTT CACTCTAAAT AAGGAGAAGC TAAAAGATAA     2460AGAAAAGGTA TCAAAAGAGG AAGAAGAGAA GGAGAGGAAC ACAGCAGCCA TGGTGTGCTC     2520TTTGGAGAAT AGAGATGAAT GTCTGATGTG TGGATCCTGA GGAAAGACTT GGAAGAGACC     2580AGCATGTCTT CAGTAGCCAA ACTACTTCTT GAGCATAGAT AGGTATAGTG GGTTTGCTTG     2640AGGTGGTAAG GCTTTGCTGG ACCCTGTTGC AGGCAAAAGG AGTAATTGAT TTAAAGTACT     2700GTTAATGATG TTAATGATTT TTTTTTAAAC TCATATATTG GGATTTTCAC CAAAATAATG     2760CTTTTGAAAA AAAGAAAAAA AAAACGGATA TATTGAGAAT CAAAGTAGAA GTTTTAGGAA     2820TGCAAAATAA GTCATCTTGC ATACAGGGAG TGGTTAAGTA AGGTTTCATC ACCCATTTAG     2880CATGCTTTTC TGAAGACTTC AGTTTTGTTA AGGAGATTTA GTTTTACTGC TTTGACTGGT     2940GGGTCTCTAG AAGCAAAACT GAGTGATAAC TCATGAGAAG TACTGATAGG ACCTTTATCT     3000GGATATGGTC CTATAGGTTA TTCTGAAATA AAGATAAACA TTTCTAAGTG AAAAAAAAAA     3060AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA                                             3083(2)关于SEQ ID NO：2的信息(i)序列特征

(A)长度：68个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“引物”(iii)假设：否(iii)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：ACCGCTCGAG CCACCATGGA ACAAAAGCTT ATTTCTGAAG AAGACTTGAT GCATGTGATC       60AAGCGAGA                                                                68(2)关于SEQ ID NO：3的信息(i)序列特征

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线型(iii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝“引物”(iii)假设：否(iii)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：CCGCTCGAAT CAGGATCCAC ACATCAG

                                                                    27(2)关于SEQ ID NO：4的信息(i)序列特征

(A)长度：29个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型(iv)分子类型：其它核酸

 (A)描述：/desc＝“引物”(iii)假设：否(iii)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：GCCTCGAGCT GACAGTCGTC TCTGTCCCT                                         29(2)关于SEQ ID NO：5的信息(i)序列特征

 (A)长度：35个碱基对

 (B)类型：核酸

 (C)链型：单链

 (D)拓扑结构：线型(v)分子类型：其它核酸

 (A)描述：/desc＝“引物”(iii)假设：否(iii)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：TAAAGCTTAT CACTTAGAAA TGTTTATTTC AAAAT                                  35

Claims (38)

1.有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列的用途，用于调节哺乳动物中肿瘤细胞的致瘤性。

2.含有有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列和药学生理学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物的用途，用于调节哺乳动物中肿瘤细胞的致瘤性。

3.有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列的用途，用于抑制哺乳动物中肿瘤细胞的生长。

4.含有有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列和药学生理学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物的用途，用于抑制哺乳动物中肿瘤细胞的生长。

5.有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列的用途，用于在哺乳动物中进行基因治疗。

6.含有有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列和药学生理学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物的用途，用于在哺乳动物中进行基因治疗。

7.根据权利要求1-6中的任意一项所述的用途，其中核酸序列以载体形式存在。

8.根据权利要求1-6中的任意一项所述的用途，其中核酸序列是SEQID No：1。

9.根据权利要求1-7中的任意一项所述的用途，其中核酸序列是来自SEQ ID No：1的核糖核苷酸还原酶R1蛋白的编码区。

10.根据权利要求9所述的用途，其中编码区得到修饰以编码核糖核苷酸还原酶R1的生物学活性肽。

11.根据权利要求9所述的用途，其中编码区得到修饰以编码核糖核苷酸还原酶R1的生理学活性类似物。

12.有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的用途，用于调节哺乳动物中肿瘤细胞的致瘤性。

13.含有有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1和药学生理学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物的用途，用于调节哺乳动物中肿瘤细胞的致瘤性。

14.有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的用途，用于抑制哺乳动物中肿瘤细胞的生长。

15.含有有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1和药学生理学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物的用途，用于抑制哺乳动物中肿瘤细胞的生长。

16.根据权利要求12-15中的任意一项所述的用途，其中核糖核苷酸还原酶R1是生物学活性类似物或衍生物。

17.根据权利要求12-16中的任意一项所述的用途，其中核糖核苷酸还原酶R1类似物或衍生物是重组产生的。

18.根据权利要求1-17中的任意一项所述的用途，其中哺乳动物是人。

19.有效量具有如SEQ ID No：1所示的哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1编码序列的可表达核酸序列的用途，用于生产基因治疗载体。

20.一种用于抑制哺乳动物中肿瘤细胞生长的药物组合物，包含有效量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列和药学生理学上可接受的载体或稀释剂。

21.如权利要求20所述的药物组合物，其中可表达核酸序列包含在用于基因治疗的载体中。

22.如权利要求20所述的药物组合物，其中核酸序列是SEQ ID No：1。

23.如权利要求20和21所述的药物组合物，其中核酸序列是来自SEQID No：1的核糖核苷酸还原酶R1的编码区。

24.一种用于抑制哺乳动物中肿瘤细胞生长的药物组合物，包含有效量核糖核苷酸还原酶R1和药学生理学上可接受的载体或稀释剂。

25.如权利要求24所述的药物组合物，其中核糖核苷酸还原酶R1是重组产生的。

26.如权利要求24所述的药物组合物，其中核糖核苷酸还原酶R1是生物学活性类似物或衍生物。

27.如权利要求26所述的药物组合物，其中生物学活性衍生物是肽。

28.一种通过使所述肿瘤细胞与生长调节量核糖核苷酸还原酶R1相互作用来调节哺乳动物中肿瘤细胞致瘤性的方法。

29.权利要求28的方法，其中哺乳动物是人。

30.如权利要求28所述的方法，其中核糖核苷酸还原酶R1是重组产生的。

31.如权利要求28所述的方法，其中核糖核苷酸还原酶R1是生物学活性类似物或衍生物。

32.一种通过使所述肿瘤细胞与生长调节量哺乳动物核糖核苷酸还原酶R1的可表达核酸序列相互作用来调节哺乳动物中肿瘤细胞致瘤性的方法。

33.权利要求32的方法，其中哺乳动物是人。

34.如权利要求32所述的方法，其中可表达核酸序列包含在用于基因治疗的载体中。

35.如权利要求32所述的方法，其中核酸序列是SEQ ID No：1。

36.如权利要求32所述的方法，其中核酸序列是来自SEQ ID No：1的核糖核苷酸还原酶R1的编码区。

37.如权利要求32所述的方法，其中编码区得到修饰以编码核糖核苷酸还原酶R1的生物学活性肽。

38.如权利要求32所述的方法，其中编码区得到修饰以编码核糖核苷酸还原酶R1的生物学活性类似物。

Images