JP2007532114A - バチルスにおけるpckA修飾および増強されたタンパク質発現 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本発明はpckA遺伝子が修飾または除去された発現タンパク質を生産するため改変された能力を有するように遺伝子操作された細胞を提供する。特に本発明は、1つ以上の染色体遺伝子が修飾および/または不活性化された(例えば、pckA)、および好ましくは1つ以上の染色体遺伝子(例えば、pckA)が修飾および/またはバチルス染色体から除去された関心のあるタンパク質の増強された発現を示すバチルス種のようなグラム陽性菌に関する。いくつかの更なる態様において、1つ以上の常在染色体領域は修飾および/または対応する野生型バチルス宿主染色体から除去されている。いくつかの好ましい態様において本発明は、バチルスにおける少なくとも一つの関心のあるタンパク質の改善された発現および/または分泌のための方法および組成物を提供する。
図1.パネルAおよびBは、本発明によって提供される1つの方法(「方法1」実施例1を参照されたい)の一般的な概念図を示す。この方法において、遺伝子に隣接する領域および/または常在染色体領域は野生型バチルス染色体外で増幅され、制限酵素(少なくともBamHIを含む)を用いて切断され、およびpJM102へ結合される。前記構築体は大腸菌によりクローン化され、そのプラスミドは単離され、BamHIを用いて線状化され、相補末端を用いて抗菌マーカーに結合される。大腸菌における再度のクローンニングの後、液体カルチャーが培養され、バチルス宿主菌株(好ましくはコンピテントなバチルス宿主菌株)の形質転換プラスミドDNAを単離するために使用される。
本発明は、発現タンパクを生産するために改変された能力を有するように遺伝子操作されている細胞を提供する。特に本発明は、1つ以上の染色体遺伝子が不活性化あるいは修飾された、少なくとも一つの関心のあるタンパク質の強化された発現を示すバチルス種のようなグラム陽性菌に関する。特に好ましい態様において、pckA遺伝子は不活性化あるいは修飾される。いくつかの好ましい態様において、1つ以上の染色体遺伝子は修飾および/またはバチルス染色体から欠失されている。いくつかの更なる態様において、1つ以上の常在染色体領域は、対応する野生型バチルス宿主染色体から欠失されている。好ましい態様において、少なくともpckA遺伝子を含む領域は、バチルス染色体から欠失される。
本発明で言及される全ての特許および出版物は、それらの特許および出版物において開示された全ての配列を含めて、参照により明示的に本発明に組み込まれる。特記のない限り、本発明で使用される全ての専門および科学用語は、本発明が属する当該技術分野における当業者によって一般に理解されている意味と同一の意味を有する(例えば、シングレトン(Singleton)他、「微生物学および分子生物学辞典」第2版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社、ニューヨーク[1994年]、およびヘイおよびマーハム(Hale and Marham)「ハーパーコリンズ生物学辞典」ハーパーペレニアル社、ニューヨーク[1991年]を参照。どちらも当業者に本発明で使用される多くの用語の一般的辞書を提供する)。本発明において記述されたものと類似または同等の方法および材料が、本発明の実施または試験に用いることが可能であったとしても、その好ましい方法および材料が記述されている。数値域は、範囲を定義した数値を含む。本発明および添付のクレームにおいて使用されるように、単数形には、文中に他に明確な指定がない限り、複数の意味が含まれる。従って、例えば、「宿主細胞」にはそのような宿主細胞の複数個が含まれる。
いくつかの好ましい態様において不活性化は欠失によって達成される。いくつかの好ましい態様において、前記遺伝子は相同組換えによって欠失される。例えば、いくつかの態様において、sobが欠失されるべき遺伝子であるとき、ホモロジーボックスの両横に隣接する選択マーカーを有する外来配列を含むDNA構築体が用いられる。ホモロジーボックスは染色体のsbo遺伝子領域に隣接する核酸と相同であるヌクレオチド配列を含む。DNA構築体は、バチルス宿主染色体の相同配列に整列し、ダブルクロスオーバ現象においてsbo遺伝子は宿主染色体から切り出される。
本発明は、pckA遺伝子が修飾または欠失された発現タンパク質を生産するために改変された能力を有するように遺伝子操作されている細胞を提供する。特に本発明は、1つ以上の染色体遺伝子が修飾および/または不活性化された(例えば、pckA)、および好ましくは1つ以上の染色体遺伝子(例えば、pckA)が、修飾および/またはバチルス染色体から欠失された関心のあるタンパク質の増強された発現を有するバチルス種のようなグラム陽性菌に関する。いくつかの更なる態様において、1つ以上の常在染色体領域は修飾および/または対応する野生型バチルス宿主染色体から欠失されている。好ましい態様において、そのような欠失は関心あるタンパク質の改善された生産のような利点を提供する。
上述したように、本発明には大きな染色体欠失と同様に、単一または多数の遺伝子欠失および/または突然変異を含む態様が含まれる。
上述のように、単一および多遺伝子欠失に加えて、本発明は大きな染色体欠失を提供する。本発明のいくつかの好ましい態様において、常在染色体領域またはそれらの断片は、改変バチルス菌株を生産するためにバチルス宿主細胞から欠失される。いくつかの態様において、前記常在染色体領域には、プロファージ領域、抗菌領域(例えば、抗生剤領域)、制御領域、多隣接単一遺伝子領域および/またはオペロン領域が含まれる。本発明で言及される常在染色体領域を示す座標は、バチルス・スブチルス菌株168染色体マップに従って特定される。数は通常、それが存在するならば、リボソーム結合部位の発端と、またはコード領域の末端と関連しており、通常は存在可能なターミネータを含まない。菌株168のバチルス・スブチルスのゲノムは周知であり(クンスト(Kunst)他、ネイチャー、390巻、249−256頁[1997年]、ヘンナー(Henner)他、Microbiol.Rev.、44巻、57−82頁[1980年]を参照のされたい)、一つの4215kb染色体からなる。しかし、本発明もまた、任意のバチルス菌株由来の類似配列を含む。特に好ましくは、他のB.スブチルス菌株、B.リケニフォルミス菌株、およびB.アミロリケファシエンス菌株である。
この領域は、B.スブチルス168染色体の約1959410bp(ppsE)〜1997178bp(ppsA)において見出される。本発明を用いて、染色体の約1960409〜1998026bpに対応する約38.6kbの切片が欠失された。このオペロン領域は、抗菌性合成に関与し、プリパスタチン合成酵素をコードする。
この領域は、B.スブチルス168染色体の約1781110bp(pksA)〜1857712bp(pksR)において見出される。本発明を用いて、染色体の約1781795〜1857985bpに対応する約76.2kbの切片が欠失された。この領域は、ポリケチドシンターゼをコードし、抗菌性合成に関与する(スコッチ(Scotti)他、遺伝子、130巻、65−71頁[1993年])。
この領域は、B.スブチルス168染色体の約3513149bp(yvfF)〜3528184bp(yveK)において見出される。本発明を用いて、染色体の約3513137〜3528896bpに対応する約15.8kbの切片が欠失された。この領域は、推定多糖類をコードする(ダルトワ(Dartois)他、バチルスに関する第7回国際会議(1993年)、パスツール研究所[1993年]、56頁を参照されたい)。この領域には以下の遺伝子が含まれる。すなわち、yvfA−F、yveK−T、およびslrである。B.スブチルス168染色体の約3529014〜3529603bpにおいて見出されるslr遺伝子領域は、約589bp切片を含む。この領域はyvfF−yveKオペロンの制御領域である。
この領域は、B.スブチルス168染色体の約3279750bp(yukL)〜3293206bp(yuiH)において見出される。本発明を用いて、染色体の3279418〜3292920bpに対応する約13.0kbの切片が欠失された。この領域は、カテコール性シデロフォン2,3−ジヒドロキ安息香酸−グリシン−スレオニン三量体エステルバシリバクチンをコード化する(メイ(May)他、J.Biol.Chem.、276巻、7209−7217頁[2001年]を参照されたい)。この領域には以下の遺伝子が含まれる。すなわち、yukL、yukM、dhbA−C,EおよびF、およびyuiI−Hである。
a)皮膚領域について
i)yqcCからyqaMを含む、約2666663から2693807の座標位置、および、
ii)rapEからphrEを含む、約2658440〜2659688の座標位置、
b)PBSXプロファージ領域について
i)xkdAからxkdXを含む、約1320043〜1345263の座標位置、および、
ii)xkdEからxkdWを含む、約1326662〜1345102の座標位置、
c)SPβ領域について
i)yodVからyonAを含む、約2149354〜2237029の座標位置、
d)DHB領域について
i)dhbFからdhbAを含む、約3282879〜3291353の座標位置、
e)yvfFからyveK領域について
i)yvfBからyveQを含む、約3516549〜3522333の座標位置、
ii)yvfFからyveKを含む、約3513181〜3528915の座標位置、および、
iii)yveQからyveLを含む、約3521233〜3528205の座標位置、
f)プロファージ1領域について
i)ybcOからybdEを含む、約213926〜220015の座標位置、および、
ii)ybcPからybdEを含む、約214146〜220015の座標位置、
g)プロファージ2領域について
i)rapIからcspCを含む、約546867〜559005の座標位置、および
h)プロファージ4領域について
i)yjcMからydjJを含む、約1263017〜675421の座標位置、である。
以下の実施例は、本発明のある好ましい態様および側面を明示およびさらに説明するために提供されるものであり、その範囲を限定するものとして解釈されない。
欠失菌株の作成
この実施例は、図1にも示されている「方法1」を記述する。この方法において、バチルス菌株に形質転換されることになるDNA構築体を保有するpJM102プラスミドベクターを生産するために、大腸菌を使用した。(上記ペレーゴ(Perego)を参照されたい)。欠失部位の5’および3’末端に直接隣接する領域を、PCR増幅した。バチルス・スブチルス染色体と相同である31塩基対、およびプライマーの5’末端由来の6塩基対に位置する6塩基対制限酵素部位を含む長さ約37塩基対になるように、PCRプライマーを設計した。構築体の上流および下流末端の特異な制限部位、およびクローニングに用いるための二つの断片間のBamHl部位を操作するために、プライマーを設計した。抗菌マーカー用のプライマーは、断片の両末端にBamHl部位を有した。可能であれば、欠失した常在染色体領域のプロモーターを除去するように、しかし、直ぐ隣接区域に全てのターミネータを残すように、PCRプライマーを設計した。染色体配列、遺伝子位置決め、およびプロモータおよびターミネータ情報の一次資料は、クンスト他(997年、上記参照)から、また当業者に既知のSubtiListワールドワイドウエブサーバーからも得た(例えば、モッツァー他、上記参照)。多数の欠失を、本発明を用いて作成した。この方法により作られた欠失からのプライマー配列のリストを、表1に示す。プライマー表記システムの説明のために図2にも参照を作成した。
大腸菌をバイパスするためのPCR融合を用いたDNA構築体の作成
この実施例は、図3にも示されている「方法2」を記述する。プライマーを抗菌マーカーのプライマー配列と相補的である25bp「テイル」を用いて設計したことを除いて、方法1と同様に上流および下流の断片を増幅した。「テイル」は、本発明において直接増幅される配列と相同ではないが、もう一つのDNA配列と相補的なプライマーの5’末端の塩基対と定義される。同様に、抗菌剤を増幅するプライマーは、前記断片のプライマーと相補的である「テイル」を含む。任意の所与の欠失について、前期欠失X−UFfusおよび欠失X−URfusは相互に相補体である。これはまた、DF−fusおよびDF−fusプライマーセットについても当てはまる。更に、いくつかの態様において、これらのプライマーはプラスミド・ベクター作成用の方法1において用いられるものと類似する制限酵素部位を有する(表3および米国特許US5,023,171を参照されたい)。表3はPCR融合による欠失構築体の作成に有用なプライマーのリストを提供する。表4はPCR融合による欠失構築体の作成に有用なプライマーの追加リストを提供する。しかし、この表において、全ての欠失構築体phleoRマーカーを含むことになる。
大腸菌をバイパスするためにPCR融合を用いたpckA欠失構築体の作成
上記欠失に加えて、pckAもまた修飾される。前記PCRプライマーpckAUF、pckA−2Urfus、spcffus、spcrfus、pckA DffusおよびpckA DRを、鋳型としてB.スブチルス168誘導体の染色体DNAおよびpDG1726(Guerout−Fleury他、遺伝子、167巻(1−2)、335−336頁[1995年]を参照されたい)を使用したPCRおよびPCR融合反応に用いた。前記プライマーを表5に示す。これらの欠失変異体の構築に用いる方法は、上述の方法1と同じであった。
大腸菌クローニング段階をバイパスするためのPCR断片の連結を用いたDNA構築体の作成およびバチルス・スブチルスの直接形質転換
この実施例において、PCR断片の連結を用いたDNA構築体を作成およびバチルスの直接形質転換の方法(「方法3」)を記述する。具体例によって、連結方法を示すためにprpC、sigD、およびtdh/kblの修飾を示す。実際にsigD、およびtdh/kblを1つの方法により、およびprpCを代わりの方法で構築した。
B.スブチルス染色体のtdh/kbl領域に隣接する上流および下流断片を、隣接DNAの内側プライマーをタイプIIの制限部位を含むように設計したこと以外は方法1の記述と同様のPCRにより増幅した。loxP−スペクチノマイシン−loxPカセットのプライマーを、隣接し相補的に突出した同じタイプII制限部位を用いて設計した。左側面および右側面について特異な突出は、DNAに隣接する上流および下流の間の抗菌カセットの直接的な連結を可能とした。全てのDNA断片を適当な制限酵素を用いて消化し、前記断片を製造業者の取扱説明書を使用してキアゲン社製キアクイック(登録商標)PCR精製キットを用いて精製した。この精製に続いて、BioRad P−6ゲルを含む1mLのスピンカラムで脱塩し、2mMのTris−HCl、pH7.5で平衡化した。断片を、サバント・スピード・バックSC110システムを用いて124〜250ng/μLまで濃縮した。各断片0.8〜1μgの3つの小片の連結を、14〜16℃で16時間、15〜25μLの反応容積で、12U T4リガーゼ(ロシュ社製)を用いて行なった。所望の連結生産物の総収量は、アガロースゲル上における標準DNAラダーとの比較計算で、反応当たり100ngより大であった。この連結混合物を形質転換反応のために精製をしないで使用した。この構築体用のプライマーを以下の表6に示す。
PCRの連結によるDNA分子を作成する追加的な実施例により、遺伝子prpCの部分的インフレーム欠失を含むバチルスの直接形質転換用のDNA断片を増幅した。prpC遺伝子を含むB.スブチルス染色体DNAのA3953bp断片を、プライマーp95およびp96を用いるPCRで増幅した。前記断片を特異制限部位PflMIおよびBstXIにおいて開裂した。これにより、三つの断片、上流、下流、および中央の断片が生成した。後者は欠失された断片であり、prpC遺伝子の内部に位置する170bp〜なる。前記消化混合物を、キアゲン社製キアクイック(登録商標)PCR精製キットを用いて精製し、続いてBioRad社製P−6ゲルを含む1mLのスピンカラムにおいて脱塩し、2mM Tris−HCl、pH7.5で平衡化した。第二PCR反応において、ゲノムDNA断片における部位と相補的な開裂部位をともに有する、BstXI部位を含むプライマーおよびPfIMIを含む下流プライマーを用いて、抗菌カセット、loxP−スペクチノマイシン−loxPを増幅した。前記断片をPfIMIおよびBstXIを用いて消化し、上記染色体断片について記述したように精製した。上流、抗菌カセット、および下流断片の三つの小片の連結を、上記tdh/kblのように行なった。所望の連結生産物の収量は同様であり、連結生産物を下記に詳述するように、xylRcomKコンピテント・バチルス・スブチルスの形質転換のための更なる処理をしないで用いた。
部分的遺伝子型xylRcomKを有する宿主株バチルス・スブチルスの細胞を、1%のキシロースを含むルリア・バータニ培地における2時間の培養によって形質転換受容性(competent)にした。これは、米国特許出願番号09/927,161号、(出願日2001年8月10日)に記述されており、1のOD550まで参照により本発明に組み込まれる。この培養物は6時間培養から播種した。全培養物は300rpmで振とうしながら37℃で培養した。0.3mLの分量を、丸底型2mL管において培養液および30%グリセロールの1:1混合物として凍結し、将来使えるように液体窒素において保存した。
上述の方法に加えて、トランスクリプトームDNAアレイ法を本発明の突然変異体の発生において用いた。最初に標的RNAを、当該技術分野に既知であるグアニジン酸フェノール抽出によりバチルス菌株より回収し(例えば、ファレル(Farrell)、『RNA方法論』(第2編)、アカデミック・プレス社、サンディエゴ、81頁を参照されたい)、deSaizieu他(deSaizieu他、J.Bacteriol.、182巻、4696−4703頁[2000年])から採用された方法および本発明で記述された方法により時間ポイントをビオチン標識cDNAに逆転写した。総RNA(25mg)を100mLの反応において、一晩37℃で培養した。反応は、1×ギブコ社製ファーストストランド・バッファ(50mM Tris−HCl、pH8.3、75mM KCl、3mM MgCl2)、10mM DTT、40mMランダム六量体、各0.3mMのdCTP、dGTPおよびdTTP、0.12mMのdATP、0.3mMのビオチン−dATP(NEN0、2500ユニットスーパースクリプトII逆転写(ロシュ社製)。RNAを除去するために、前記反応を0.25M NaOH溶液とし、65℃で30分間培養した。前記反応をHClを用いて中和し、核酸を2.5M酢酸アンモニウムを含むエタノールにおいて−20℃で沈殿させた。ペレットを洗浄し、空気乾燥し、水中に再懸濁し、UV分光法により定量化した。反応収量は、約20〜25mgビオチン標識cDNAであった。
上述の構築体を用いて生産された菌株の分析により、以下の発酵が導かれた。14L規模の培養をBIOLAFITTE(登録商標)発酵槽において行なった。7リットル当たりの培地の構成成分を表9に掲載する。
改変バチルス菌株を得るための宿主細胞の形質転換
一旦DNA構築体を、上述の方法1または2により作成し、それを適切なバチルス・スブチルス実験室菌株に形質転換した(例えば、BG2036またはBG2097、任意のコンピテントバチルス即時型宿主細胞を、本発明の方法において使用することが可能である)。細胞を適当に0.5ppmフレオマイシンまたは100ppmスペクチノマイシンの選択培地においてプレートした(フェラーリおよびミラー、「バチルスの発現:グラム陽性モデル」、『遺伝子発現システム:発現技術に関する自然の利用』所収、65−94頁[1999年])。実験室菌株を、バチルス・スブチルス生産宿主菌株2回またはBG3594および次にMDT98−113、1回に形質転換する欠失を有する染色体DNA源として使用した。単一コロニーを単離するために形質転換体をストリーク(streak)し、採取および5mLのLBプラス適当な抗菌剤において一晩増殖させた。染色体DNAを、当該技術分野に知られているように単離を行なった(たとえばハードウッド他、上記を参照されたい)。
振とうフラスコ・アッセイ−プロテアーゼ活性の測定
一旦DNA構築体をコンピテント・バチルス・スブチルス菌株に安定的に組み込むと、スブチリシン活性を振とうフラスコ・アッセイにより測定し、活性を野生型レベルと比較した。アッセイは、当該技術分野に既知のスブチリシン生産に好適な50mLの増殖培地を含む250mlのバッフル・フラスコにおいて行なった(クリスチャンソン(Christianson)他、Anal.Biochem.、223巻、119−129頁[1994年]、およびシャ(Hsia)他、Anal.Biochem.、242巻、221−227頁[1996年]を参照されたい)。培地に50μLの8時間8mLの培養物を播種し、37℃で40時間、250rpmで振とうして増殖させた。次に、プロテアーゼ活性アッセイのために1mLのサンプルを17、24および40時間目で採取した。プロテアーゼ活性を、モナーク・オートマチック・アナライザーを用いて405nMで測定した。サンプルを2回バッファーにおいて、1:11(3.131g/L)に希釈した。正しい機械のキャリブレーションを保障するコントロールとして、一つのサンプルを1:6(5.585g/L)、1:12(2.793g/L)および1:18(1.862g/L)に希釈した。図7は、種々の改変バチルス・スブチルスクローンに於けるプロテアーゼ活性を示す。図8は、バチルス・スブチルス野生型菌株(未改変)および対応する改変欠失菌株(−sbo)および(−slr)における振とうフラスコの培養液から測定した改善したプロテアーゼ分泌を表すグラフを示す。プロテアーゼ活性(g/L)を17、24および40時間後に測定した。
pckA欠失構築体
この実施例において、本発明のpckA欠失突然変異体が追加的に記述される。実施例2Bに示したように、pckA欠失構築体を、大腸菌使用の要件を回避するためにPCR融合法を用いた実施例2Bにおける記述のように生産をした。この実施例において、実施例に従って生産した欠失突然変異体を修飾した。前記PCRプライマーであるpckA−1、pckA−2、pckA−3、pckA−4、pckA−5、およびpckA−6(表5を参照されたい)を、鋳型としてバチルス・スブチルスBG2816および168pDG1726(Guerout−Fleury他、遺伝子、167巻、(1−2)335−336頁[1995年]を参照されたい)の染色体DNAを用いたPCRおよびPCR融合反応に使用した。これらの欠失突然変異体の構築において使用した方法は、上述の方法1と同じである。
Claims (84)
- 修飾pckA遺伝子を含む微生物。
- 前記pckA遺伝子が欠失していることを特徴とする請求項1に記載の微生物。
- 前記pckA遺伝子が不活性化されていることを特徴とする請求項1に記載の微生物。
- グラム陽性細菌である請求項1に記載の微生物。
- 前記グラム陽性細菌がバチルス(Bacillus)種であることを特徴とする請求項4に記載の微生物。
- 非修飾pckA遺伝子を有する微生物と比較して、少なくとも1つの関心のあるタンパク質の改善された発現を示すことを特徴とする請求項5に記載の微生物。
- 前記バチルス種内の少なくとも1つの常在染色体領域が変異バチルス株を生産するために修飾されており、ここで前記変異バチルス株が前記バチルス種と比較して前記関心のあるタンパク質をより高レベルで発現することを特徴とする請求項6に記載の微生物。
- 前記変異バチルス株が前記関心のあるタンパク質をコードするヘテローグなポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項7に記載の微生物。
- 変異バチルス株がバチルス・スブチリス(B. subtilis)であることを特徴とする請求項7に記載の微生物。
- 前記少なくとも1つの修飾された常在染色体領域が、ブロファージ領域、抗菌領域、制御領域、多隣接単一遺伝子領域、およびオペロン領域からなる群より選択されることを特徴とする請求項7に記載の微生物。
- 前記少なくとも1つの修飾された常在染色体領域が、PBSX領域、皮膚領域、ブロファージ7領域、SPβ領域、プロファージ1領域、プロファージ2領域、プロファージ3領域、プロファージ4領域、プロファージ5領域、プロファージ6領域、PPS領域、PKS領域、yvfF−yveK領域、DHB領域およびそれらの断片からなる群より選択されることを特徴とする請求項10に記載の微生物。
- 前記少なくとも1つの修飾された常在染色体領域が欠失により修飾されていることを特徴とする請求項10に記載の微生物。
- 前記欠失が1つ以上の常在染色体領域またはそれらの断片を含み、ここで前記常在染色体領域が約0.5〜500キロ塩基を含むことを特徴とする請求項12に記載の微生物。
- 前記pckA遺伝子の欠失を含む改変バチルス株。
- 少なくとも1つのプロテアーゼを生産することを特徴とする請求項14に記載の改変バチルス株。
- 前記プロテアーゼがスブチリシン(subtilisin)であることを特徴とする請求項14に記載の改変バチルス株。
- 前記スブチリシンが、スブチリシン168、スブチリシンBPN’、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンDY、スブチリシン147、スブチリシン309、およびそれらの変異体からなる群より選択されることを特徴とする請求項16に記載の改変バチルス株。
- sbo、slr、ybcO、csn、spollSA、sigB,phrC、rapA、CssS、trpA、trpB、trpC、trpD、trpE、trpF、tdh/kbl、alsD、sigD、prpC、gapB、fbp、rocA、ycgN、ycgM、rocF、およびrocDからなる群より選択された少なくとも1つの染色体遺伝子における少なくとも1つの欠失を更に含むことを特徴とする請求項14に記載の改変バチルス株。
- degU、degQ、degS、scoC4、spollE、およびoppAからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子における少なくとも一つの突然変異を含むことを特徴とする請求項18に記載の改変バチルス株。
- 前記突然変異がdegU(Hy)32を含むことを特徴とする請求項20に記載の改変バチルス株。
- 外来配列を含む少なくとも1つのDNA構築体を更に含むことを特徴とする請求項14に記載の改変バチルス株。
- 前記外来配列が少なくとも1つの選択マーカーおよび前記pckA遺伝子を含むことを特徴とする請求項21に記載の改変バチルス株。
- 前記外来配列が、sbo、slr、ybcO、csn、spollSA、sigB,phrC、rapA、CssS trpA、trpB、trpC、trpD、trpE、trpF、tdh/kbl、alsD、sigD、prpC、gapB、fbp、rocA、ycgN、ycgM、rocF、およびrocDからなる群より選択された少なくとも一つの遺伝子を更に含むことを特徴とする請求項22に記載の改変バチルス株。
- 前記少なくとも1つの選択マーカーが前記遺伝子の2つの断片間に位置していることを特徴とする請求項23に記載の改変バチルス株。
- 前記外来配列が選択マーカーおよび少なくとも1つのホモローグ・ボックスを含み、ここで該ホモロジー・ボックスが前記選択マーカーの5’および/または3’末端に隣接することを特徴とする請求項21に記載の改変バチルス株。
- 前記外来配列が前記改変バチルス株のゲノムに組み込まれていることを特徴とする請求項21に記載の改変バチルス株。
- 配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号37、配列番号25、配列番号21、配列番号50、配列番号23、配列番号27、配列番号19、配列番号31、配列番号48、配列番号46、配列番号35、および配列番号33からなる群より選択される核酸配列に示される少なくとも1つの配列を含む単離核酸。
- 配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号38、配列番号26、配列番号22、配列番号57、配列番号24、配列番号28、配列番号20、配列番号32、配列番号55、配列番号53、配列番号36、および配列番号34からなる群より選択されるアミノ酸をコードする単離核酸配列。
- 選択マーカー、およびcssS遺伝子、cssS遺伝子断片またはこれらのホモローグ配列のいずれかを含む外来配列を含む精製されたDNA構築体。
- 前記選択マーカーが前記cssS遺伝子の2つの断片間に位置していることを特徴とする請求項29に記載のDNA構築体。
- 前記外来配列が、前記選択マーカーの5’および/または3’末端に隣接する、少なくとも1つのホモロジー・ボックスを更に含むことを特徴とする請求項29に記載のDNA構築体。
- 前記DNA配列が、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号37、配列番号25、配列番号21、配列番号50、配列番号29、配列番号23、配列番号27、配列番号19、配列番号31、配列番号48、配列番号46、配列番号35、および配列番号33からなる群より選択される少なくとも一つの核酸配列を含むことを特徴とする請求項29に記載のDNA構築体。
- 配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号38、配列番号26、配列番号22、配列番号57、配列番号30、配列番号24、配列番号28、配列番号20、配列番号32、配列番号55、配列番号53、配列番号36、および配列番号34からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする少なくとも1つの遺伝子を含むことを特徴とする請求項29に記載のDNA構築体。
- 請求項29に記載のDNA構築体で形質転換された宿主細胞。
- 大腸菌およびバチルス細胞からなる群より選択されることを特徴とする請求項34に記載の宿主細胞。
- 前記外来配列が前記宿主細胞における染色体に組み込まれていることを特徴とする請求項34に記載の宿主細胞。
- 微生物により少なくとも1つのタンパク質の生産を増強する方法であって、
a)微生物宿主細胞を提供する工程、
b)改変株を生産するために前記宿主細胞におけるpckA遺伝子を不活性化する工程、および
c)前記タンパク質の発現に適した条件下で前記改変株を成長させる工程
を含む方法。 - 前記改変株により発現された前記タンパク質を回収する工程を更に含むことを特徴とする請求項37に記載の方法。
- 前記宿主細胞が大腸菌およびバチルス細胞からなる群より選択されることを特徴とする請求項37に記載の方法。
- sbo、slr、ybcO、csn、spollSA、sigB,phrC、rapA、CssS、trpA、trpB、trpC、trpD、trpE、trpF、tdh/kbl、alsD、sigD、prpC、gapB、fbp、rocA、ycgN、ycgM、rocF、およびrocDからなる群より選択される少なくとも一つの染色体遺伝子を不活性化する工程を更に含むことを特徴とする請求項37に記載の方法。
- 前記タンパク質がホモローグタンパク質およびヘテローグタンパク質からなる群より選択されることを特徴とする請求項37に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの染色体遺伝子が挿入不活性化により不活性化されていることを特徴とする請求項37に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのタンパク質が、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、抗体、ホルモン、および成長因子からなる群より選択されることを特徴とする請求項37に記載の方法。
- 関心のあるタンパク質を発現する改変バチルス株を得るための方法であって、pckA遺伝子を含む外来遺伝子を含むDNA構築体でバチルス宿主細胞を形質転換する工程含み、ここで前記外来配列が改変バチルス株を生産するために前記バチルス宿主細胞の染色体に組み込まれ、更に1つ以上の染色体遺伝子が不活性化されており、および少なくとも1つの関心のあるタンパク質の発現に好適な成長条件下で前記改変バチルス株を成長させる工程を含むことを特徴とする方法。
- 前記少なくとも1つの関心のあるタンパク質が、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、抗体、ホルモン、および成長因子からなる群より選択されることを特徴とする請求項44に記載の方法。
- 前記バチルス宿主細胞が、バチルス・リケニフォルミス(B.licheniformis)、バチルス・レントゥス(B.lentus)、バチルス・スブチルス(B.subtilis)、バチルス・アミロリケファシエンス(B.amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(B.brevis)、バチルス・ステアロテルモフィルス(B.stearothermophilus)、バチルス・アルカロフィルス(B.alkalophilus)、バチルス・コアグランス(B.coagulans)、バチルス・サーキュランス(B.circulans)、バチルス・プミルス(B.pumilus)、バチルス・チューリンギエンシス(B.thuringiensis)、バチルス・クラウシ(B.clausii)、バチルス・メガテリウム(B.megaterium)およびバチルス・スブチリスからなる群より選択されることを特徴とする請求項44に記載の方法。
- 前記バチルス宿主細胞が組換え宿主細胞であることを特徴とする請求項44に記載の方法。
- 前記改変バチルス株により生産される前記関心のあるタンパク質が回収されることを特徴とする請求項44に記載の方法。
- 前記DNA構築体が更に選択マーカーを含むことを特徴とする請求項44に記載の方法。
- 前記選択マーカーが、前記バチルス宿主細胞の前記染色体へ前記外来配列を組み込んだ上で前記外来配列から切り出されることを特徴とする請求項49に記載の方法。
- 前記外来配列が、sbo、slr、ybcO、csn、spollSA、sigB,phrC、rapA、CssS、trpA、trpB、trpC、trpD、trpE、trpF、tdh/kbl、alsD、sigD、prpC、gapB、fbp、rocA、ycgN、ycgM、rocF、およびrocDからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子を更に含み、ここで前記DNA構築体がバチルス宿主細胞の染色体に組み込まれ、前記バチルス宿主細胞の前記染色体上に存在する1つ以上の遺伝子の欠失をもたらすことを特徴とする請求項44に記載の方法。
- 前記DNA構築体が、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号37、配列番号25、配列番号21、配列番号50、配列番号29、配列番号23、配列番号27、配列番号19、配列番号31、配列番号48、配列番号46、配列番号35、および配列番号33からなる群より選択される少なくとも一つの核酸配列を含むことを特徴とする請求項44に記載の方法。
- 前記DNA構築体が、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号38、配列番号26、配列番号22、配列番号57、配列番号30、配列番号24、配列番号28、配列番号20、配列番号32、配列番号55、配列番号53、配列番号36、および配列番号34からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする少なくとも1つの遺伝子を含むことを特徴とする請求項44に記載の方法。
- 増強されたプロテアーゼ生産を有するバチルス・スブチリス株を得るための方法であって、DNA構築体によりバチルス・スブチリス宿主細胞を形質転換する工程、改変バチルス・スブチリス株を生産するために、DNA構築体と、バチルス・スブチリス染色体からpckAが欠失したバチルス・スブチリス染色体の相同領域との相同組換えを可能にする工程、および前記プロテアーゼの発現に好適な条件下で改変バチルス・スブチリス株を成長させる工程を含むことを特徴とする方法。
- sbo、slr、ybcO、csn、spollSA、sigB,phrC、rapA、CssS、trpA、trpB、trpC、trpD、trpE、trpF、tdh/kbl、alsD、sigD、prpC、gapB、fbp、rocA、ycgN、ycgM、rocF、およびrocDからなる群より選択される少なくとも一つの遺伝子が前記バチルス・スブチリスの染色体から欠失していることを特徴とする請求項54に記載の方法。
- 前記プロテアーゼが、ホモローグプロテアーゼおよびヘテローグプロテアーゼからなる群より選択されることを特徴とする請求項54に記載の方法。
- 前記プロテアーゼがスブチリシンであることを特徴とする請求項56に記載の方法。
- 前記スブチリシンが、スブチリシン168、スブチリシンBPN’、スブチリシン・カールスバーグ、スブチリシンDY、スブチリシン147、スブチリシン309、およびそれらの変異体からなる群より選択されることを特徴とする請求項57に記載の方法。
- 前記改変バチルス・スブチリス株が、degU、degQ、degS、scoC4、spollE、およびoppAからなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子における一つの突然変異を更に含むことを特徴とする請求項54に記載の方法。
- 前記突然変異がdegU(Hy)32を含むことを特徴とする請求項59に記載の方法。
- 前記改変バチルス・スブチリス株が、1つ以上の常在染色体領域またはそれらの断片の欠失を含み、ここで前記常在染色体領域が約0.5〜500キロ塩基を含むことを特徴とする請求項54に記載の方法。
- 前記DNA構築体が、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号39、配列番号40、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号50、配列番号37、配列番号25、配列番号21、配列番号50、配列番号29、配列番号23、配列番号27、配列番号19、配列番号31、配列番号48、配列番号46、配列番号35、および配列番号33からなる群より選択される少なくとも一つの核酸配列を含むことを特徴とする請求項54に記載の方法。
- 前記DNA構築体が、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号41、配列番号43、配列番号45、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号38、配列番号26、配列番号22、配列番号57、配列番号30、配列番号24、配列番号28、配列番号20、配列番号32、配列番号55、配列番号53、配列番号36、および配列番号34からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする少なくとも1つの遺伝子を含むことを特徴とする請求項54に記載の方法。
- バチルスにおける関心のあるタンパク質の発現を増強するための方法であって、選択マーカーを含むDNA構築体および不活性化する染色体セグメントをバチルス宿主細胞に導入する工程、ここで改変バチルス株を生産するために、前記DNA構築体はバチルス宿主株の染色体に組み込まれ、前記バチルス宿主株からの常在染色体領域またはその断片の欠失を生じ、および前記バチルス宿主株における関心のあるタンパク質の発現に比較して前記改変バチルス株における関心のあるタンパク質の発現が大きくなるのに好適な条件下で前記改変バチルス株を成長させる工程を含む方法。
- 前記関心のあるタンパク質を回収する工程を更に含むことを特徴とする請求項64に記載の方法。
- 前記改変バチルス株から前記選択マーカーを切り出す工程を更に含むことを特徴とする請求項64に記載の方法。
- 前記常在染色体領域が、PBSX、皮膚、ブロファージ7、SPβ、プロファージ1、プロファージ2、プロファージ3、プロファージ4、プロファージ5、プロファージ6、PPS、PKS、yvfF−yveK、DHBおよびそれらの断片からなる群より選択されることを特徴とする請求項64に記載の方法。
- 前記改変バチルス株が少なくとも2つの常在染色体領域の欠失を含むことを特徴とする請求項64に記載の方法。
- 前記関心のあるタンパク質がホモローグタンパク質およびヘテローグタンパク質からなる群より選択されることを特徴とする請求項64に記載の方法。
- 前記関心のあるタンパク質が、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、抗体、ホルモン、および成長因子からなる群より選択されることを特徴とする請求項69に記載の方法。
- 前記バチルス宿主株が、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・スブチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・クラウシ、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・プミルス、およびバチルス・チューリンギエンシスからなる群より選択されることを特徴とする請求項64に記載の方法。
- 前記改変バチルス・スブチリス株が、degU、degQ、degS、scoC4、spollE、およびoppAからなる群より選択される1つの遺伝子における少なくとも一つの突然変異を更に含むことを特徴とする請求項64に記載の方法。
- 前記突然変異がdegU(Hy)32を含むことを特徴とする請求項72に記載の方法。
- バチルスにおける関心のあるタンパク質の発現を増強するための方法であって、少なくとも1つのバチルス細胞から核酸を得る工程、少なくとも1つの関心のある遺伝子を同定するために前記バチルス細胞からの核酸についてトランスクリプトームDNAアレイ分析を行う工程、DNA構築体を生産するために前記少なくとも1つの関心のある遺伝子を修飾する工程、および改変バチルス株を生産するためにバチルス宿主細胞に前記DNA構築体を導入し、ここで改変されていないバチルスにおける関心のあるタンパク質の発現に比較して前記関心のあるタンパク質の発現が増強されるような条件下で、前記改変バチルス株が関心のあるタンパク質を生産することができることを特徴とする工程を含む方法。
- 前記関心のあるタンパク質が、アミノ酸生合成経路および生分解経路からなる群より選択される少なくとも1つの生化学経路に関係していることを特徴とする請求項74に記載の方法。
- 少なくとも1つの生分解経路が働かない(disable)ことを特徴とする請求項75に記載の方法。
- 前記生分解経路が関心のある遺伝子の転写のために働かないことを特徴とする請求項76に記載の方法。
- 前記バチルス宿主細胞が、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・スブチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・クラウシ、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・プミルス、およびバチルス・チューリンギエンシスからなる群より選択されることを特徴とする請求項74に記載の方法。
- 前記関心のあるタンパク質がホモローグタンパク質およびヘテローグタンパク質からなる群より選択されることを特徴とする請求項74に記載の方法。
- 前記関心のあるタンパク質が、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、抗体、ホルモン、および成長因子からなる群より選択されることを特徴とする請求項79に記載の方法。
- バチルスにおける関心のあるタンパク質の発現を増強するための方法であって、少なくとも1つのバチルス細胞から少なくとも1つの関心のある遺伝子を含む核酸を得る工程、前記関心のある遺伝子を含む増幅断片プールを生産するために前記断片を増幅する工程、DNA構築体を生産するために前記増幅断片を結合する工程、改変バチルス株を生産するためにバチルス宿主細胞に前記DNA構築体を直接的に形質移入し、ここで前記改変バチルス株がprpC、sigD、およびtdh/kblからなる群より選択される修飾遺伝子を含むことを特徴とする工程、改変されていないバチルスにおける前記関心のあるタンパク質の発現に比較して前記関心のあるタンパク質の発現が増強されるような条件下で、前記改変バチルス株を培養する工程を含む方法。
- 前記バチルス宿主細胞が、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・レントゥス、バチルス・スブチルス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステアロテルモフィルス、バチルス・クラウシ、バチルス・アルカロフィルス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・プミルス、およびバチルス・チューリンギエンシスからなる群より選択されることを特徴とする請求項81に記載の方法。
- 前記関心のあるタンパク質がホモローグタンパク質およびヘテローグタンパク質からなる群より選択されることを特徴とする請求項81に記載の方法。
- 前記関心のあるタンパク質が、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、リパーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、抗体、ホルモン、および成長因子からなる群より選択されることを特徴とする請求項83に記載の方法。
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