CN1197483A - 可诱导的除草剂抗性 - Google Patents

可诱导的除草剂抗性 Download PDF

Info

Publication number
CN1197483A
CN1197483A CN96197232A CN96197232A CN1197483A CN 1197483 A CN1197483 A CN 1197483A CN 96197232 A CN96197232 A CN 96197232A CN 96197232 A CN96197232 A CN 96197232A CN 1197483 A CN1197483 A CN 1197483A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
plant
alcr
gene expression
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN96197232A
Other languages
English (en)
Inventor
I·耶普森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Syngenta Ltd
Original Assignee
Zeneca Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zeneca Ltd filed Critical Zeneca Ltd
Publication of CN1197483A publication Critical patent/CN1197483A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)

Abstract

本发明涉及能够赋予植物以可诱导除草剂抗性的DNA构建体。可通过使用基因开关如衍生于构巢曲霉的alcA/alcR开关达到可诱导作用。本发明具体涉及对除草剂N－膦酰基甲基甘氨酸(草甘膦)和其盐的可诱导抗性。

Description

可诱导的除草剂抗性
本发明涉及DNA构建体和掺入了所述构建体的植物。具体地说，本发明涉及表达赋予植物以除草剂抗性的基因的表达所需的启动子序列。
植物生物技术的最新进展已经产生了对除草剂应用有抗性的转基因植物。用一系列不同的转基因策略已产生了除草剂耐受性。一个记载最多的实例是使用来自吸水链霉菌的细菌生物异源物质去毒基因phosphinothricin乙酰转移酶(PAT)。已成功地用突变的植物基因(例如，编码来自Arabidopsis的乙酰乳酸合酶(ALS)的突变靶位点基因)产生了对除草剂应用有抗性的转基因植物。已在强构成型启动子的控制下表达了PAT和ALS基因。
我们提出了一个***，其中根据具体活化化学物质的应用，以可诱导方式表达赋予除草剂耐受性的基因。该方法对于农场主有许多优点，包括：
1.除草剂耐受性的可诱导控制可以减少任何产量损失的风险，所述产量损失是与除草剂抗性基因的高水平构成型表达相关的。这是生长早期的特定问题，在生长早期，高水平的转基因产物会直接干扰正常发育。另外，高水平表达除草剂抗性基因会导致植物资源的代谢枯竭。
2.以可诱导方式表达除草剂抗性基因使得如果在处理过程中除去了活化化学物质，则可用所述除草剂控制自生苗。
3.用可诱导启动子来启动除草剂抗性基因可降低抗性杂草变成主要问题的风险。如果抗性基因从相关作物传到杂草中，则在不存在诱导化学物质时仍可用除草剂进行控制。如果耐受性基因证实了对全植物控制除草剂的抗性，则这将是特别恰当的，所述除草剂在播种作物前并可能在收获作物后使用(没有诱导性化学物质)。例如可设想在谷类如小麦中的除草剂抗性可异型杂交到杂草野生型燕麦中，或在油菜或canola中的除草剂抗性可转移到野生型芸苔属植物中，由此使这些已经很难对付的杂草具有除草剂抗性。另一实例是在甜菜中除草剂抗性的可诱导表达可降低野生型甜菜成为难题的风险。
已知数种基因调节***(基因开关)并可用其赋予植物以可诱导的除草剂抗性。在Gatz(Current Opinion in Biotechnology(1996)7，168-172)的综述中描述了许多这样的基因开关，包括以下***如四环素阻遏基因开关、Lac阻遏***、铜可诱导***如以ACE1为基础的***、水杨酸可诱导启动子(包括PR-1a***)以及以甾类激素为基础的***如糖皮质激素、孕酮和***受体***。Aoyama等(The Plant Cell(1995)7，1773-1785)描述了对包括来自酵母的GAL 4结合结构域和VP 16激活剂的糖皮质激素受体***的修饰，并设想相似的***可以以例如昆虫甾类激素而不是以哺乳动物甾类激素为基础。的确，最近已经描述了以烟芽夜蛾蜕皮激素受体为基础的***。苯磺酰胺基因开关***也是已知的(Hershey等，PlantMol.Biol.，17，679-690(1991))，还有以构巢曲霉alcR蛋白质和谷胱甘肽S转移酶启动子为基础的***也是已知的。
还已知赋予除草剂抗性的多种基因，例如已描述了其抗性基因并极广泛使用的一种除草剂是N-膦酰基甲基-甘氨酸(草甘膦)和其农业上可接受的盐包括异丙胺、三甲锍、钠、钾和铵盐。
本发明的第一方面提供了可化学诱导的植物基因表达盒，该表达盒含有与靶基因可操作相连的可诱导启动子，所述靶基因可赋予除草剂抗性。
可以使用任何除草剂抗性基因，但赋予N-膦酰基甲基-甘氨酸或其盐或衍生物抗性的基因是特别优选的。
可以使用多种可诱导启动子以赋予可诱导抗性，这些启动子包括上述所列启动子中的任何启动子。
但是用于该领域的特别有用的基因开关是以来自构巢曲霉的alcR调节蛋白为基础的，该蛋白在存在特定醇和酮的情况下，激活从alcA启动子开始的基因表达。该***描述于我们的国际专利申请WO93/21334(该文献引入本文作为参考)。
还详细地表征了来自真菌构巢曲霉的alcA/alcR基因激活***。在构巢曲霉中的乙醇利用途径负责醇和醛降解。已经表明有三个基因与所述乙醇利用途径有关。已经表明基因alcA和alcR靠在一起位于连锁VII组上，而aldA定位于连锁VIII组上(Pateman用等，1984，Proc.Soc.Lond，B217：243-264；Sealy-Lewis HM and Lockington RA，1984，Curr.Genet，8：253-259)。基因alcA编码构巢曲霉中的ADHI，aldA编码AldDH，即负责乙醇利用的第二种酶。用乙醇和许多其它诱导剂(Creaser EH等，1984，Biochemical J.，255：449-454)经转录激活剂alcR可诱导alcA和aldA的表达。alcR基因和共诱导剂负责alcA和aldA的表达，原因是alcR中的许多突变和缺失导致ADHI和aldDH的多效损失(Felenbok B等，1988，Gene，73：385-396；Pateman等，1984；Sealy-Lewis HM & Lockington.1984)。ALCR蛋白质通过与alcA启动子中的三个特异性位点结合而激活从alcA开始的表达(Kulmberg P等，1992，J.Biol.Chem.267：21146-21153)。
克隆(Lockington RA等，1985，Gene，33：137-149)并测序(Felenbok等，1988)了alcR基因。alcR基因的表达是可诱导的、是自身调节的，并由CREA阻遏物介导的葡萄糖阻遏进行调节(Bailey C and Arst HN，1975，Eur.J.Biochem，51：573-577；Lockington RA等，1987，Mol.Microbiology，1：275-281；Dowzer CEA and Kelly JM，1989，Curr.Genet，15：457-459；Dowzer CEA and Kelly JM，1991，Mol.Cell.Biol.，11：5701-5709)。ALCR调节蛋白靠近其N末端含有6个半胱氨酸，这6个半胱氨酸配合成一个锌双核簇(Kulmberg P等，1991，FEBS Letts，280：11-16)。该簇与在其它子囊菌转录因子中发现的高度保守的DNA结合结构域有关。已经表明转录因子GAL4和LAC9含有双核复合物，该复合物具有含两个Zn(II)原子的三叶草型结构(Pan T and Coleman JE，1990，Biochemistry，29：3023-3029；Halvorsen YDC等，1990，J.Biol.Chem.265：13283-13289)。ALCR的结构与该型相似，不同之处是在Cys-3和Cys-4之间有一16个残基的不对称环。ALCR通过与其启动子区中两个特异性位点的结合而有效激活其自身的表达(Kulmberg P等，1992，Molec.Cell Biol.12：1932-1939)。
与乙醇利用途径有关的三个基因alcR、alcA和aldA的调节是在转录水平上的(Lockington等，1987；Gwynne D等，1987，Gene，51：205-216；Pickett等，Gene，51：217-226)。
在构巢曲霉中另有两种醇脱氢酶。ADHII存在于培养在非诱导培养基的菌丝体中，并因乙醇的存在而受到阻遏。ADHII由alcB编码，也在alcR的控制下(Sealy-Lewis & Lockington，1984)。通过与啤酒酵母的adh菌株互补还克隆了第三种醇脱氢酶。该基因alcC定位于连锁VII组中，但未与alcA和alcR相连。基因alcC编码ADHIII，但对乙醇的利用极少(Mcknight GL等，1985，EMBO J，4：2094-2099)。已经表明ADHIII与无氧逆境期中构巢曲霉的存活有关。葡萄糖的存在不会抑制alcC的表达，这表明它可能不在alcR的控制下(Roland LJ and Stromer JN，1986，Mol.Cell.Biol.6：3368-3372)。
总之，构巢曲霉只有当其在存在各种醇和酮的条件下培养时，才表达由基因alcA编码的醇脱氢酶I(ADHI)。通过由alcR基因编码并进行构成型表达的调节蛋白传递诱导作用。存在诱导剂(醇或酮)的情况下，调节蛋白激活alcA基因的表达。存在诱导剂的条件下，调节蛋白还刺激其自身的表达。这意味着在诱导条件下(即当存在醇或酮时)，产生高水平的ADHI酶。相反，在没有诱导剂的条件下，不表达alcA基因和其产物ADHI。存在葡萄糖的条件下，也抑制alcA的表达和酶的产生。
因此，alcA基因启动子是可诱导启动子，存在诱导剂的条件下由alcR调节蛋白(即蛋白质/醇或蛋白质/酮混合物)激活。已经克隆并测序了alcR和alcA基因(包括各自的启动子)(Lockington RA等，1985，Gene，33：137-149；Felenbok B等，1988，Gene，73：385-396；Gwynne等，1987Gene，51：205-216)。
已研究了某些植物中的醇脱氢酶(adh)基因。在玉米和其它谷物中，它们在无氧的条件下被打开。玉米adh基因的启动子区含有在无氧条件下表达所必需的300 bp调节元件。但是，在任何植物均未发现alcR调节蛋白的等同物。因此，在植物不知道有alcR/alcA型的基因调节***。alcR在植物细胞中的构成型表达并不激活内源adh活性。
根据本发明的第二个方面，提供了可化学诱导的植物基因表达盒，该表达盒含有与编码alcR调节蛋白的alcR调节序列可操作相连的第一启动子，和与赋予除草剂抗性的靶基因可操作相连的可诱导启动子，存在有效外源诱导剂的条件下，由调节蛋白激活可诱导启动子，由此用诱导剂引起靶基因的表达。
可诱导启动子优选衍生于alcA基因启动子，但也可以衍生于alcR、aldA或其它alcR诱导的基因。
我们已发现出于至少下列原因，alcA/alcR开关特别适用于启动除草剂耐受基因。
1.已经发展了用alcA/alcR开关启动高水平的基因表达。另外，优选用强构成型启动子如多遍在蛋白启动调节蛋白alcR。可高水平表达被诱导的转基因其表达水平与由强构成型启动子如35 CaMV表达差不多。
2.如果在将活化化学物质与除草剂同时使用的情况下使用基因开关，就需要迅速提高除草剂抗性基因的水平。图1表明应用诱导化学物质后，标记基因表达(CAT)的时间过程。该研究表明在叶面施用诱导化学物质后，CAT表达迅速增加(2小时)。以构成型方式表达调节蛋白时，就立即发生了诱导作用的早期动力学，因此没有时间延迟就发生了转录因子的合成。另外，我们选择了简单的两组分***，该***不依赖复杂的信号转递***。
3.我们用农艺实践中所用的各种溶剂测试了alcA/alcR***的特异性。营养液培养的秧苗***表明乙醇、丁-2-醇和环己酮均诱导报道基因的高水平表达(图2)。相反，当将表1中所列的农艺实践中所用的醇和酮叶面喷雾施用时，只有乙醇产生高水平的被诱导报道基因活性(图3)。
表1
1  异丁基甲基酮        13 丙酮基丙酮
2  葑酮                14 JF5969(环己酮)
3  2-庚酮              15 N-甲基吡咯烷酮
4  二异丁酮            16 聚乙二醇
5  5-甲基-2-己酮       17 丙二醇
6  5-甲基戊-2，4-二醇  18  苯乙酮
7  基甲基酮            19 JF4400(甲基环己酮)
8  2-戊酮              20 丙-2-醇
9  甘油                21 丁-2-醇
10 γ-丁内酯           22 丙酮
11 双丙酮醇            23 乙醇
12 四氢糠醇            24 dH2O
这是具有显著性的，因为暴露于配制溶剂不会发生转基因的非正常诱导。乙醇不是农业化学制剂中常用的组分，因此，在农田中，如果有适宜的喷洒方法，可将乙醇视为alc A/R基因开关的特异性诱导剂。
4.许多生物和非生物逆境如病原体感染、热、冷、干旱、创伤、洪水均不能诱导alcA/alcR开关。此外，各种非溶剂化学处理如水杨酸、乙烯、脱落酸、植物生长素、赤霉酸以及各种农业化学品，均不能诱导alcA/alcR***。
第一个启动子可以是构成型或组织特异性的，是发育程序化的甚至是可诱导的。调节序列alcR基因可从构巢曲霉中获得，并编码alcR调节蛋白。
可诱导启动子优选是可从构巢曲霉得到的alcA基因启动子或从alcA启动子的调节序列以及来自操纵植物细胞之基因启动子(包括任何植物基因启动子)的核心启动子区衍生的“嵌合”启动子。当用醇或酮诱导剂时，alcA启动子或相关“嵌合”启动子由alcR调节蛋白激活。
可诱导启动子还可衍生于可从构巢曲霉得到的aldA基因启动子、alcB基因启动子或alcC基因启动子。
诱导剂可以是任何有效的化学物质(如醇或酮)。适于与alcA/alcR衍生的盒一起使用的化学物质包括Creaser等(1984，Biochem J.225，449-454)列举的那些如丁-2-酮(乙基甲基酮)、环己酮、丙酮、丁-2-醇、3-氧代丁酸、丙-2-醇、乙醇。
基因表达盒对应用的外源化学诱导剂作出反应，从而能够从外部激活由所述盒调节的靶基因的表达。所述表达盒是高度可调节的，并适用于植物中的一般应用。
表达盒的两部分可在同一构建体或不同的构建体上。第一部分含有亚克隆到表达载体中的调节序列cDNA或基因序列，所述表达载体带有启动所述序列表达的植物操作启动子。第二部分含有至少部分可诱导启动子，所述启动子控制下游靶基因的表达。存在适宜诱导剂的条件下，由所述盒第一部分产生的调节蛋白通过刺激该盒第二部分中的可诱导启动子而激活靶基因的表达。
在实践中，将含有本发明表达盒的构建体通过转化***到植物中。然后可通过将化学诱导剂应用到所述植物上来激活构建体中靶基因的表达，所述靶基因位于本发明化学可控启动子的控制下。
可以使用任何适用于靶植物或植物细胞的转化方法，包括用含重组Ti质粒的根瘤农杆菌感染、电穿孔、细胞和原生质体的微注射、微粒转化和花粉管转化。然后在适宜的情况下，转化细胞可再生成其中新核物质已稳定掺入到基因组中的整植株。转化的单子叶和双子叶植物均可用该方法得到。
可生产的遗传工程修饰植物的实例包括大田作物、谷类、水果和蔬菜，如：canola、向日葵、烟草、甜菜、棉花、大豆、玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、西红柿、芒果、桃、苹果、梨、草莓、香蕉、甜瓜、马铃薯、胡萝卜、莴苣、卷心菜、洋葱。
本发明还提供了含本发明基因表达盒的植物细胞。通过转化，基因表达盒可稳定地掺入到植物基因组中。本发明还提供了含所述细胞的植物组织或植物，以及由其衍生的植物或种子。
本发明还提供了控制植物基因表达的方法，包括用化学可诱导植物基因表达盒转化植物细胞，所述表达盒含有与编码alcA调节蛋白的alcR调节序列可操作相连的第一启动子，以及与赋予除草剂抗性的靶基因可操作相连的可诱导启动子，存在有效外源诱导剂条件下，由所述调节蛋白激活可诱导启动子，由此通过诱导剂的应用而引起靶基因的表达。
除草剂抗性的这种可诱导表达策略可通过预喷洒化学激活剂来达到，如果是作用缓慢的除草剂如N-膦酰基甲基甘氨酸(通常称为草甘膦)可将化学诱导剂与除草剂一起作为桶混制剂加入。
该策略适用于任何抗性赋予基因/相应的除草剂组合。例如alcA/alcR开关基因可与下列基因一起使用：
1.玉米谷胱甘肽S转移酶(GST-27)基因(参见我们的国际专利公开WO 90/08826)，该基因可赋予对乙酰氯苯胺类除草剂如乙基乙草安、甲氧毒草安和杂草锁的抗性。
2.Phosphinotricin乙酰转移酶(PAT)，该基因可赋予对通常称为glufosinate的除草剂的抗性。
3.玉米乙酰乳酸合酶基因突变体(参见我们的国际专利公开WO90/14000)和其它基因，这些基因赋予对磺酰脲和咪唑啉酮类除草剂的抗性。
4.赋予草甘膦抗性的基因。所述基因包括草甘膦氧化还原酶基因(GOX)(参见国际专利公开WO 92/00377，孟山都公司)；编码5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(EPSPS)的基因，包括I型和II型EPSPS，编码突变EPSPS的基因，和编码如由叶绿体过渡肽和EPSPS组成的EPSPS融合肽的基因(参见例如EP 218 571、EP293 358、WO 91/04323、WO92/04449和WO 92/06201，均属孟山都公司)；与CPLyase表达有关的基因。
现在用下列非限制性实施例并参考附图来描述本发明各种其它优选的特征和实施方案，其中：
图1说明应用诱导化学物质后，标记基因表达(CAT)的时间过程；
图2说明在用各种溶剂润湿根部时，被诱导的报道基因表达的水平；
图3说明当叶面喷洒表1中所列化学物质时，被诱导的报道基因的活性水平；
图4说明通过将alcR cDNA连接到pJR1中来产生35S调节构建体；
图5说明报道构建体的生产；
图6是表达盒和具体植物转化构建体的总结；
图7说明来自拟南芥属RUBISCO的叶绿体过渡序列1(CPT1)；
图8表示质粒pMJB1的序列；
图9是质粒pJRIi的图谱；
图10说明碧冬茄EPSPS I型基因的叶绿体过渡序列CTP2；
图11是质粒pUB-1的图谱；
图12是质粒pMF6的图谱；
图13是质粒pIE109的图谱，其中数字表示碱基对(不成比例)并使用下列缩写：
ADHi          来自玉米的醇脱氢酶；
PAT           phosphinothricin乙酰转移酶(Basta
              抗性基因)；
AMP           氨苄青霉素抗性基因；
CaMV35S       花椰菜花叶病毒35S启动子；
nos Poly A    胭脂氨酸合酶多聚A区；
ori           来自pUC的复制原点ColEl
图14是质粒pMV1的图谱，其中数字表示碱基对(不成比例)并使用与图13相同的缩写以及下列缩写：
UBQp          玉米遍在蛋白启动子；
UBQi          玉米遍在蛋白内含子；
nos            胭脂氨酸合酶3’终止子；
CZP 1 GOX      叶绿体过渡肽-草甘膦氧化酶序列；
CZP2 GPSPS     叶绿体过渡肽-EPSP合成酶序列；
图15说明通过连接pAr3和pBSSK来制备质粒pUC4；
图16是质粒pMV2的图谱，其中数字表示碱基对(不成比例)并使用与图14相同的缩写以及下列缩写：
AlcA          构巢曲霉alcA启动子；
AlcR          构巢曲霉alcR启动子；
图17是质粒pDV1-pUC的图谱；
图18是质粒pDV2-pUC的图谱；
图19是质粒pDV3-Bin的图谱；
图20是质粒pDV4-Bin的图谱；
图21是说明转化体中EPSPS和GOX表达的Western印迹。
实施例
我们选择用赋予草甘膦抗性的基因来举例说明alcA/alcR基因开关。用该开关来启动植物中草甘膦氧化酶(GOX)的可诱导表达。可开关的GOX已被单独表达或与5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸(EPSPS)CP4构成型表达一起进行表达。已构建了最适于在单子叶和双子叶作物中表达的构建体。实施例1alcR调节构建体的产生
已公开了alcR基因组DNA序列，因此能够进行alcR cDNA样品的分离。
将alcR cDNA克隆到表达载体pJR1(pUC)中。pJR1含有花椰菜花叶病毒35S启动子。该启动子是构成型的植物启动子，并连续表达调节蛋白。nos聚腺苷酸化信号在该表达载体中。
图4说明通过将alcR cDNA连接到pJR1中来产生35S调节构建体。用BamHI部分限制alcR cDNA克隆，然后在琼脂糖凝胶上电泳，切下并纯化2.6 kb片段。然后将该片段连接到已用BamHI限制，然后用磷酸酶处理以防止再环化的pJR1载体中。由此将alcR基因置于该“35S-alcR”构建体中CaMV 35S启动子和nos 3’聚腺苷酸化信号的控制下。实施例2产生含嵌合启动子的alcA-CAT报道构建体
质粒pCaMVCN在35S启动子和nos转录终止子之间含有细菌氯霉素转移酶(CAT)报道基因(“35S-CAT”构建体)。
将alcA启动子亚克隆到载体pCaMVCN中以产生“alcA-CAT”构建体。部分alcA启动子和部分35S启动子的融合产生了嵌合启动子，在该嵌合启动子的控制下可进行基因表达。
图5说明报道构建体的产生。alcA启动子和35S启动子有相同的TATA盒，通过重组PCR技术，可用该盒将两个启动子连在一起，分别扩增alcA启动子的246 bp区与pCaMVCN的CAT基因的5’末端(含35S启动子的部分-70核区)，然后用PCR剪接在一起。然后用BamHI和HindIII限制消化该重组片段。用BamHI和HindIII部分消化pCaMVCN载体，然后电泳以分离正确的片段并将其与重组片段相连。
将连接混合物转化到大肠杆菌中，并铺在富琼脂培养基上。用小量制备法从所得菌落中分离质粒DNA，然后通过大小电泳和限制图谱测定回收重组克隆。将连接接点测序以检查是否回收了正确的重组体。实施例3草甘膦抗性构建体
在图6中列出了表达盒与具体的植物转化构建体的总结。双子叶植物载体1
载体1是含有草甘膦氧化酶基因(GOX)的构成型对照质粒，所述草甘膦氧化酶基因与由增强的35S CaMV启动子(ES)启动的拟南芥属RUBISCO(CPT1)的叶绿体过渡序列1(图7)和TMVω翻译增强序列(TMV)融合。载体1使用胭脂氨酸合酶终止子(nos)。用专利公开WO 92/00377的信息，通过在翻译起点ATG加入NcoI位点，在5’末端加入KpnI来合成加入了CTP1的合成GOX基因。在合成过程中缺失内SphI位点和NcoI位点，而不改变氨基酸的使用。将CTP1 GOX合成序列分离为NcoI KpnI片段，然后用标准分子克隆技术连接到NcoI KpnI切割的pMJB1中，pMJB1是以pIBT211为基础的质粒，含有带两个增强子的CaMV 35启动子，所述增强子与代替烟草蚀刻病毒5’非翻译前导序列的烟草花叶病毒翻译增强子序列连接，并用胭脂氨酸合酶多聚(A)信号(nos)终止(图8)。
将含增强的35 CaMV TMV序列CTP1 GOX和nos终止子的盒(图17的双子叶植物载体1 pUC)分离为HindIII EcoRI片段，并连接到HindIIIEcoRI切割的pJRIi(Bin 19基的植物转化载体(图9))中。双子叶植物载体2
用来自专利WO 92/04449的资料，在翻译起点ATG用NcoI合成与碧冬茄的EPSPSI型基因的叶绿体过渡序列CTP2融合的合成EPSPS CP4基因(图10)。在EPSPS CP4基因中的内SphI位点是沉默的，从而不改变氨基酸使用。
将含合成CTP2 CP4 EPSPS的片段分离为NcoI SacI片段并连接到pMJBI中。将含带有两个增强子的CaMV 35启动子、TMVω序列CTP2过渡肽、EPSPS和nos终止子的片段分离为EcoRI HindIII片段(双子叶植物载体2 pUC图18)，然后克隆到pJRIi中以得到双子叶植物载体2pUC(图18)。
测定双子叶植物载体2接点的序列时，鉴定了另一***在SacI位点和nos终止子起点之间的序列。该序列为：5’AGG CTG CTT GAT GAG CTC GGT ACC CGG GGA TCC ATGGAG CCG AAT 3’双子叶植物载体3
通过用EcoRI切割双子叶植物载体2并***ΔEcoRI SphIΔEcoRI接头来构建带有EPSPS和GOX基因的对照载体。该接头的序列如下：
5’AAT TAG GGG CAT GCC CCT 3’
用SphI切割所得载体以释放克隆在双子叶植物载体1的SphI位点并位于35 CaMV启动子5’端的表达盒B。从双子叶植物载体3-pUC(图19)将表达盒1)和2)以HindIII和EcoRI片段切下并克隆到pJRIi中。双子叶植物载体4
通过从“palcCAT”以PstI片段切下CAT基因来构建可诱导GOX载体。将含alcA启动子和nos终止子的载体带进行凝胶纯化，然后与PstI-XhoI-KpnI-PstI接头相连，该接头的序列如下：
5’GCC ACT CGA GCT AGG TAC CCT GCA 3’
通过序列分析确定其方向。将双子叶植物载体1)的TMVω和CTP1GOX序列分离为XhoI KpnI片段，然后克隆到含XhoI-KpnI-PstI接头的alc A nos载体中。alcA TMV CTP1 GOX nos盒以HindIII片段切下，然后克隆到植物转化载体“p35S-alcR”中以形成双子叶植物载体4(图20)，所述转化载体含有位于35 CaMV启动子控制下的alcR cDNA nos终止子。双子叶植物载体5
用下列克隆方法制备含可诱导GOX和构成型EPSPS基因的双子叶植物载体5(图22)。通过将ΔEcoRI-HindIII-ΔEcoRI接头克隆到EcoRI位点修饰双子叶植物载体2(pDV2-pUC)，从而允许CaMVen-CTP2-EPSPS-nos盒以HindIII片段切下来。然后，将该片段连接到HindIII切割的pDV-Bin中。通过与放射性标记的寡核苷酸杂交来筛选含所有三个盒(即35S-AlcR、CaMVen-CTP2-EPSPS-nos和AlcA-CTP1-GOX-nox)的重组体。通过测定跨所有边界的序列来证实方向。单子叶植物载体载体1：盒D
将EcoRI-NotI-EcoRI接头(5’AATTCATTTGCGGCCGCAAATG3’)***到双子叶植物载体pDV1中。用NcoI切割该质粒，用DNA聚合酶I Klenow片段补平5’悬垂端。然后用NotI切割线性载体，将所得的含CTP1 GOX和nos终止子的平整/NotI片段连接到SmaI/NotI消化的含多遍在蛋白启动子、多遍在蛋白内含子及一个KpnI-NotI-KpnI接头(5’CATTTGCGGCCGCAAATGGTAC3’)***片段的pPUB1载体(图12)中。将HindIII-NotI-HindIII接头(5’AGCTTGCAGCGGCCGCTGCA3’)***到所得的构建体中。载体1：盒E
将EcoRI-NotI-EcoRI接头(5’AATTCATTTGCGGCCGCAAATG3’)***到双子叶植物载体pDV2中。用NcoI切割该质粒，用DNA聚合酶IKlenow片段补平5’悬垂端。然后用NotI切割线性载体，将所得的含CTP2EPSPS和nos终止子的平整/NcoI片段连接到SmaI/NotI消化的pPUB1载体中以产生质粒1，所述载体含有多遍在蛋白启动子、多遍在蛋白内含子及一个KpnI-NotI-KpnI接头(5’CATTTGCGGCCGCAAATGGTAC3’)***片段。从pIE108(图14)中切下PAT选择性标记盒(35S CaMV启动子、AdhI内含子、phosphinothricin乙酰转移酶基因(PAT)、nos终止子)，然后克隆到质粒1的HindIII位点上以得到单子叶植物盒E。用诊断性的限制消化来证实选择性标记盒以与CTP2 EPSPS盒相同的方向***在5’到3’。
用NotI从盒D切下含多遍在蛋白启动子、多遍在蛋白内含子、CTP1GOX和nos终止子的片段，然后连接到NotI盒E中以形成单子叶植物载体1(图14)。用限制消化来证实两个盒是以相同方向***的。
从pIE108中切下选择性标记盒(35S CaMV启动子、AdhI内含子、phosphinothricin乙酰转移酶基因(PAT)、nos)，然后克隆到5)中的HindIII位点以得到单子叶植物盒E。载体1
用NotI从盒D切下含多遍在蛋白启动子、多遍在蛋白内含子、GOX和nos的片段，然后克隆到NotI切割的盒E中以形成单子叶植物载体1。载体2：盒F
将含有alcR cDNA和nos终止子序列的来自pUC4的EcoRI片段用DNA聚合酶I Klenow片段补平末端，用KpnI-NotI-KpnI接头***片段连接到pUB1中，并用限制分析确定方向。从pIE108中切下后，将PAT选择性标记盒***在HindIII位点，然后用限制分析确定方向以得到载体1。用HindIII切割上述含多遍在蛋白启动子、多遍在蛋白内含子、CTP2EPSPS和nos终止子的质粒1，***ΔHindIII-NotI-HindIII接头并测序确定方向以得到载体2，所述接头为：
5’AGCTCGCAGCGGCCGCTGCA3’
           5’GCGTCGCCGGCGACGTTCGA3’
将ClaI-NcoI-ClaI接头(5’CGATGCAGCCATGGCTGCAT3’)***到pMF6(图13)以得到载体3。从pDV1中切下含CTP1 GOX的NcoI/KpnI片段，然后***到NcoI/KpnI切割的载体3中以得到载体4。从载体4中切下含玉米AdhI内含子、CTP1 GOX的SalI片段，然后连接到含alcA启动子和nos终止子的用SalI切割的pUC2中，通过测序确定方向以得到载体5。将来自载体5的含alcA启动子、玉米AdhI内含子、CTP1 GOX和nos终止子的HindIII片段连接到HindIII切割的载体2中，然后通过限制消化确定方向。将来自所得构建体的含多遍在蛋白启动子、多遍在蛋白内含子、CTP2 EPSPS、nos终止子、alcA启动子、玉米AdhI内含子、CTP1 GOX和nos终止子的NotI片段连接到NotI切割的载体1中，并通过限制分析确定方向以得到单子叶植物载体2(图16)。实施例4植物转化
用Holsters等(1978)描述的冻融法，将用于双子叶植物转化的质粒转移到根瘤农杆菌LBA4404中。
用Bevan(1984)描述的叶圆片法产生烟草转化体。在含100mg/l卡那霉素的培养基上再生苗。生长出根后，将植物转移到温室中并在16小时光/8小时黑暗的条件下培养。
用Moloney等(1989)描述的子叶叶柄法完成油菜(Brassica napus cvwestar)的转化。在卡那霉素(15mg/l)上筛选转化的材料。将长出根的苗直接转移到含肥料的土壤中，在控制条件的温室(16小时白天，白天20℃，黑夜15℃，60％RH)中培养至成熟。
按照Klein等(1988)描述的颗粒轰击法完成玉米的转化。在1mg/lbiolophos上进行筛选。
利用我们的国际专利公开WO 95/10178所述的保卫细胞原生质体法完成甜菜的转化。
下列表2和3中列出了所得转基因植物的详细结果。
        表2-烟草转化的详细结果
载体    种    移出的苗   生根的
pDV1    烟草    150       57
pDV2    烟草    150       60
pDV3    烟草    270       77
pDV4    烟草    350       135
pDV5    烟草    150       75
           表3-油菜转化的详细结果
载体    种   长出苗的愈伤组织    生根的
pDV1    OSR      14              14颗苗
pDV2    OSR      13              13颗苗
pDV3    OSR      18              18颗苗
pDV4    OSR      20              20颗苗
pDV5    OSR      19              18颗苗实施例5转基因植物的分析聚合酶链反应(PCR)
按照Edwards等(1992)所述的方法，制备用于转基因植物PCR分析的基因组DNA。用Jepson等(Plant Molecular Biology Reporter，9(2)，131-138(1991))所述的条件完成PCR。设计各导入盒的引物组。
用下列寡核苷酸混合物对植物进行分析：
pDV1 TMV1+GOX1，  GOX3+nos1
pDV2 TMV1+EPSPS1，EPSPS3+nos1
pDV3 EPSPS3+GOX1
pDV4 35S+AlcR1，  AlcA2+GOX1
pDV5 35S+AlcR1，  AlcA2+GOX1，TMV1+EPSPS1
寡核苷酸序列如下：
TMV1     5′  CTCGAGTATTTTTACAACAATTACCAAC
GOX1     5′  AATCAAGGTAACCTTGAATCCA
GOX3     5′  ACCACCAACGGTGTTCTTGCTGTTGA
NOS1     5′  GCATTACATGTTAATTATTACATGCTT
EPSPS1   5′  GTGATACGAGTTTCACCGCTAGCGAGAC
EPSPS3   5′  TACCTTGCGTGGACCAAAGACTCC
35S      5′  GTCAACATGGTGGAGCACG
AlcR1    5′  GTGAGAGTTTATGACTGGAGGCGCATC
AlcA2    5′  GTCCGCACGGAGAGCCACAAACGA在草甘膦上进行筛选Tobacco var Samsun和Brassica napus var Westar在草甘膦上的杀伤曲线
在各种草甘膦浓度下，对这两个种进行试验，在烟草的情况下，用带一叶结的5-6mm茎段，在油菜的情况下，用生长顶端加两片叶子，***到含0、0.0055、0.011、0.0275、0.055和0.01mM草甘膦异丙胺盐的MS培养基中。生长两周后记录结果，并列于下列表4。
                 表4
浓度   Westar                                   烟草
0      茎生长良好，有4-5片新叶，根长最长为5cm   如OSR
0.005  没有茎生长，1片新叶子，根长1cm           没有任何器官生长
0.011  没有茎生长，没有新叶子，根长～0.5cm      ‘’
0.0275 没有茎生长，没有新叶子，根长～2cm        ‘’
0.055  没有任何器官生长，茎末端变黑             ‘’
0.01   与0.055mM的相同                          ‘’
在0.01和0.05mM的草甘膦上完成草甘膦耐受转化体的筛选。构成型耐受植物
根据野生型植物得到的数据，在含上述水平草甘膦的MS培养基上筛选pDV1，2和3 PCR阳性初级转化体。对于烟草，通过将每个转化体的3或4个茎切片***到培养基中，并用未转化的Samsun作对照来完成。评分是以大多数的行为为基础。温室中，将在更高浓度除草剂下有耐受性的植物培养至成熟，以收集种子。分离试验
将种子在10％漂白粉中灭菌10分钟。用无菌水洗涤数次后，将200个种子播种在含100mg/l卡那霉素的1/2 MS培养基(2.3g/l MS盐、1.5％蔗糖、0.8％Bactoagar pH5.9)上。种子于26℃培养，16小时/8小时光/暗，然后计分。Western分析抗体生产
用pET表达***，在大肠杆菌中过表达GOX和EPSPS。IPTG诱导后，从摇瓶培养的细胞膏中电洗脱GOX和EPSPS，并用于免疫兔(每克隆两只动物)。制备用于免疫印迹的组织提取物
用搅拌器将120mg叶组织加60mg PVPP和500μl提取缓冲液(50mMTris-HCl pH 8，1mM EDTA，0.3mM DTT)研磨数分钟。匀浆后，将提取物以15000rpm离心15分钟。将上清液贮存于-80℃直到使用。按照Bradford方法测定提取物中的蛋白质浓度。SDS-PAGE和免疫印迹
用SDS-PAGE分离25μg蛋白质。电泳缓冲液为14.4％(w/v)甘氨酸、1％(w/v)SDS和3％(w/v)Tris碱。按Laemmli所述上样。
SDS-PAGE后，用Biorad的电印迹装置，用40mA将蛋白质过夜电印迹到硝酸纤维素(HybondTMC，Amersham)上。用溶解在12mM HCl中的0.05％CPTS将膜染色。用12mM HCl漂洗印迹，并用0.5M NaHCO3脱色5-10分钟，然后用水剧烈漂洗。然后用Amersham ECL试剂盒将膜阻断、进行免疫检测并洗涤。用1∶10000稀释的兔抗GOX或抗EPSPS多克隆抗体作为第一抗体，用1∶1000稀释的与辣根过氧化物酶结合的抗兔第二抗体进行间接免疫检测。再进行过夜洗涤以除去背景。用Amersham的ECL试剂盒完成检测，结果示于图21，其中(1)道是对照，其余的道是转化体。Western分析表明有些转化体能够表达GOX和EPSPS。构成型耐受植物
从各草甘膦耐受植物制备细胞提取物，用适宜于转化体的抗体，通过Western分析评估所表达的蛋白质量。在较高水平的草甘膦下，检测到表达很高水平GOX或EPSPS的植物，说明表达水平与除草剂耐受性有关。可诱导耐受性植物
为了说明对草甘膦的可诱导耐受性，将用pDV4和5转化的PCR阳性初级转化体直接转移到温室中。2周后，用乙醇根浸液(5％溶液)诱导植物，并在进行Western分析前放置24小时，诱导后用Western分析评估GOX的表达水平。在使植物恢复到非诱导状态达一段时间后，重复Western分析以筛选可诱导耐受性植物。取在乙醇处理后GOX表达水平最高的植物进行时间过程分析。在乙醇处理后6、12、18、24、36、48小时用Western分析评估GOX水平。
在温室试验中用pDV4和pDV5的高表达GOX的植物说明可诱导的草甘膦耐受性。通过将根浸液施用于盆栽植物，用各种乙醇浓度(1-15％)来诱导植物。GOX诱导后，用草甘膦喷洒植物。同样用除草剂处理野生型对照和未诱导的植物。Northern分析
通过Northern印迹分析，用CTP2 EPSPS探针为NcoI SacI片段，分析含双子叶植物载体2)、3)和5)的初级转化体。用CTP1 GOX探针为NcoI KpnI片段，通过Northern印迹分析含双子叶植物载体1)、3)的初级转化体。同样，用CTP2 EPSPS探针分析含单子叶植物载体1)和2)的转基因玉米系。
通过叶面施用5％乙醇来处理含双子叶植物载体5)和单子叶植物载体2)的转化体以诱导GOX水平。处理后24小时分离RNA，用CTP1 GOX探针进行Northern分析。
取对适宜表达盒PCR阳性的并有GOX或EPSPS转录本水平的初级转化体进行进一步分析。草甘膦氧化还原酶试验
按Kishore和Barry(WO 92/00377)所述完成草甘膦氧化还原酶分析。这些分析包括用氧电极测量氧的草甘膦依赖性摄取，通过与2，4-二硝基苯肼反应检测乙醛酸的形成，用HPLC测定腙，或优选用[3-14C]-草甘膦为底物，并在阴离子交换柱上经HPLC检测放射性氨甲基膦酸的形成。EPSPS试验
用下列方法检测植物提取物中的5-烯醇-丙酮酰莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶活性：(1)跟踪磷酸烯醇丙酮酸底物的消失(按Rubin，J.L.，Gaines，C.G.and Jesen，R.A.，in Plant Physiol(1984)75，839-845所述)；或(2)反向进行试验并与丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶偶联(按Mousdale D.M.and CogginsJ.R.in Planta(1984)160，78-83所述)；或(3)用14C标记的磷酸烯醇丙酮酸为底物并用在阴离子交换柱上的HPLC检测放射性EPSP的形成并按Della-Cioppa等(Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)(1986)，83，6873-6877)所述，用直通型放射性检测仪检测。用后一试验来证实，正如所预期的，EPSP合酶活性对草甘膦抑制作用相对具有抗性。

Claims (15)

1.可化学诱导的植物基因表达盒，所述表达盒含有与赋予除草剂抗性的靶基因可操作相连的可诱导启动子。
2.权利要求1的可化学诱导的植物基因表达盒，其中所述除草剂是N-膦酰基甲基-甘氨酸或其盐或其衍生物。
3.权利要求1或2的可化学诱导的植物基因表达盒，其中所述可诱导启动子是四环素阻遏基因开关、Lac阻遏***、铜可诱导***如以ACE1为基础的铜可诱导***、水杨酸可诱导启动子例如PR-1a***、以甾类激素如糖皮质激素、孕酮和***受体***为基础的***或这些***之一的修饰，如包括酵母GAL4结合结构域和VP16激活剂的糖皮质激素受体***、昆虫甾类激素***如以烟芽夜蛾蜕皮激素受体为基础的***、苯磺酰胺基因开关***、以构巢曲霉alcR蛋白质为基础的基因开关或谷胱甘肽S转移酶启动子。
4.可化学诱导的植物基因表达盒，该表达盒含有与编码alcR调节蛋白的alcR调节序列可操作相连的第一启动子，和与赋予除草剂抗性的靶基因可操作相连的可诱导启动子，存在有效外源诱导剂的条件下，由调节蛋白激活可诱导启动子，由此用诱导剂引起靶基因的表达。
5.权利要求4的植物基因表达盒，其中所述可诱导启动子衍生于alcA、alcR、aldA或其它alcR诱导的基因启动子。
6.权利要求4或5的植物基因表达盒，其中所述可诱导启动子是嵌合启动子。
7.前述权利要求中任一项的植物基因表达盒，其中所述靶基因赋予对除草剂N-膦酰基甲基-甘氨酸或其盐或其衍生物的抗性。
8.含前述任一权利要求的植物基因表达盒的植物细胞。
9.权利要求8的植物细胞，其中所述植物基因表达盒被稳定地掺入到植物基因组中。
10.含有权利要求8或9的植物细胞的植物组织。
11.含有权利要求8或9的植物细胞的植物。
12.从权利要求11的植物衍生的植物。
13.从权利要求11或12的植物衍生的种子。
14.控制除草剂抗性的方法，该方法包括用权利要求1-7中任一项的植物基因表达盒转化植物细胞。
15.在权利要求11或12的植物或权利要求13的种子的田地中选择性地控制杂草的方法，该方法包括施用有效量的除草剂和外源诱导剂。
CN96197232A 1995-08-03 1996-08-02 可诱导的除草剂抗性 Pending CN1197483A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB9515941.4 1995-08-03
GBGB9515941.4A GB9515941D0 (en) 1995-08-03 1995-08-03 DNA constructs

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1197483A true CN1197483A (zh) 1998-10-28

Family

ID=10778720

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN96197232A Pending CN1197483A (zh) 1995-08-03 1996-08-02 可诱导的除草剂抗性

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6380463B1 (zh)
EP (1) EP0843730A1 (zh)
JP (1) JPH11510695A (zh)
CN (1) CN1197483A (zh)
AU (1) AU711653B2 (zh)
BG (1) BG102272A (zh)
BR (1) BR9609886A (zh)
CA (1) CA2224732A1 (zh)
CZ (1) CZ29198A3 (zh)
GB (1) GB9515941D0 (zh)
HU (1) HUP9802867A3 (zh)
MX (1) MX9800861A (zh)
NO (1) NO980450L (zh)
NZ (1) NZ313750A (zh)
PL (1) PL324821A1 (zh)
RU (1) RU2181380C2 (zh)
TR (1) TR199800131T1 (zh)
WO (1) WO1997006269A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1321184C (zh) * 1994-03-15 2007-06-13 中山大学 一种以基因优化方法获得的抗草甘膦基因及其表达载体
CN102905517A (zh) * 2010-04-23 2013-01-30 先锋国际良种公司 基因开关组合物及使用方法
CN110951692A (zh) * 2019-12-03 2020-04-03 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞测定法

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5614395A (en) * 1988-03-08 1997-03-25 Ciba-Geigy Corporation Chemically regulatable and anti-pathogenic DNA sequences and uses thereof
GB9606062D0 (en) 1996-03-22 1996-05-22 Zeneca Ltd Promoters
FR2751347B1 (fr) * 1996-07-16 2001-12-07 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides
EP0946737A2 (en) * 1996-11-07 1999-10-06 Zeneca Limited Herbicide resistant plants
KR100558838B1 (ko) 1997-04-04 2006-03-10 보드 오브 리젠츠 오브 디 유니버시티 오브 네브라스카 유전자이식 디캄바-분해 유기체를 제조하고 사용하기 위한 방법 및 물질
CA2291944A1 (en) * 1997-07-30 1999-02-11 Zeneca Limited Genetic method for controlling sprouting
US6632980B1 (en) 1997-10-24 2003-10-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
GB9902236D0 (en) * 1999-02-01 1999-03-24 Zeneca Ltd Formulation
EP1925672A1 (en) 2001-06-22 2008-05-28 Syngeta Participations AG Abiotic stress responsive polynucleotides and polypeptides
CN1681923B (zh) * 2002-07-18 2010-06-02 孟山都技术有限公司 利用人工的多核苷酸及其组合物来减少转基因沉默的方法
ATE465265T1 (de) * 2003-09-02 2010-05-15 Martin Fussenegger Regulierbare genexpression in säugerzellen und säugern
EP1934354B1 (en) 2005-10-13 2017-11-08 Monsanto Technology, LLC Methods for producing hybrid seed
EP1979366A4 (en) * 2006-01-10 2011-05-25 Ruey J Yu N- (PHOSPHONOALKYL) -AMINOACES, DERIVATIVES AND COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
US20080313769A9 (en) 2006-01-12 2008-12-18 Athenix Corporation EPSP synthase domains conferring glyphosate resistance
BRPI0708480A2 (pt) 2006-03-02 2011-05-31 Athenix Corp processos e composições para aperfeiçoada atividade de enzima em plantas transgênicas
WO2008025068A1 (en) 2006-08-29 2008-03-06 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Synthesis of fatty acids
ITUD20060280A1 (it) * 2006-12-29 2008-06-30 Univ Degli Studi Udine Sequenza artificiale di dna evente funzione di leader in 5' (5'-utr) ottimizzata per la sovraespressione di proteine eterologhe in pianta
CN102573514B (zh) 2007-12-03 2015-01-07 先正达参股股份有限公司 工程化改造酶易感性肌醇六磷酸酶
CN102016046A (zh) 2008-03-04 2011-04-13 华盛顿州立大学 用于区别性调节膜脂和种子油中脂肪酸不饱和性的组合物和方法
CA2743880C (en) 2008-11-18 2020-08-18 James Robertson Petrie Recombinant cells comprising exogenous a5 elongase and methods for producing docosapentaenoic acid
CN101768213B (zh) 2008-12-30 2012-05-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用
CN101817879A (zh) 2009-02-26 2010-09-01 中国科学院遗传与发育生物学研究所 金属硫蛋白及其编码基因与应用
US20130055471A1 (en) 2009-12-15 2013-02-28 Edwin Henricus Antonius HOLMAN Transgenic Ozone-Resistant Plants
US9127288B2 (en) 2010-06-28 2015-09-08 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods of producing lipids
AR083029A1 (es) 2010-12-09 2013-01-23 Syngenta Participations Ag Metodos y composiciones que utilizan arn interferente pequeño (arnip) para el control de nematodos en plantas
KR102003177B1 (ko) 2011-03-25 2019-07-24 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 식물 조절 요소 및 그의 용도
MX354471B (es) 2011-07-01 2018-03-07 Monsanto Technology Llc Métodos y composiciones para la regulación selectiva de la expresión de proteínas.
US8951752B2 (en) 2011-10-20 2015-02-10 University Of Iowa Research Foundation N-demethyase genes and uses thereof
MY188956A (en) 2011-12-27 2022-01-14 Commw Scient Ind Res Org Processes for producing lipids
CA2860416C (en) 2011-12-27 2024-04-30 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Production of dihydrosterculic acid and derivatives thereof
US10822615B2 (en) 2011-12-27 2020-11-03 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Simultaneous gene silencing and suppressing gene silencing in the same cell
AP2014007886A0 (en) * 2012-02-01 2014-08-31 Dow Agrosciences Llc Synthetic chloroplast transit peptides
EA031448B1 (ru) 2012-02-16 2019-01-31 Зингента Партисипейшнс Аг Сконструированные пестицидные белки
HUE033766T2 (en) 2012-06-15 2018-01-29 Commw Scient Ind Res Org Preparation of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells
EP2861740A1 (en) 2012-06-15 2015-04-22 University of Iowa Research Foundation Caffeine responsive promoters and regulatory genes
CA2890235A1 (en) 2012-06-22 2013-12-27 Syngenta Participations Ag Biological control of coleopteran pests
WO2014042923A1 (en) 2012-09-13 2014-03-20 Indiana University Research & Technology Corporation Compositions and systems for conferring disease resistance in plants and methods of use thereof
JP6557142B2 (ja) 2012-09-14 2019-08-07 バイエル クロップサイエンス エルピーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｐ Ｈｐｐｄ変異体および使用方法
PE20170253A1 (es) 2013-12-18 2017-04-14 Nuseed Pty Ltd Lipido que comprende acidos grasos poliinsaturados de cadena larga
US10876130B2 (en) 2014-03-11 2020-12-29 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC HPPD variants and methods of use
EP4311857A3 (en) 2014-04-17 2024-07-31 Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG Recombinant host cell engineered to overexpress helper proteins
SG11201608080RA (en) 2014-04-17 2016-10-28 Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh Recombinant host cell for expressing proteins of interest
EP2952584A1 (en) 2014-06-04 2015-12-09 Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG Improved protein production
AR100874A1 (es) 2014-06-16 2016-11-09 Consejo Nac De Investig Científicas Y Técnicas (Conicet) Genes quiméricos y proteínas de resistencia oxidativa, y plantas transgénicas que incluyen los mismos
KR102527795B1 (ko) 2014-06-27 2023-05-02 커먼웰쓰 사이언티픽 앤 인더스트리알 리서치 오거니제이션 도코사펜타에노산을 포함하는 지질
WO2016004473A1 (en) 2014-07-07 2016-01-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing industrial products from plant lipids
WO2016100333A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 Syngenta Participations Ag Pesticidal microrna carriers and use thereof
CN107109414A (zh) 2014-12-23 2017-08-29 先正达参股股份有限公司 鞘翅目有害生物的生物控制
US11154594B2 (en) 2015-04-10 2021-10-26 Syngenta Participations Ag Animal feed compositions and methods of use
US11624076B2 (en) 2016-04-21 2023-04-11 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC TAL-effector mediated herbicide tolerance
WO2018076335A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Compositions and methods for enhancing abiotic stress tolerance
WO2018098214A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 Bayer Cropscience Lp Axmi669 and axmi991 toxin genes and methods for their use
US20190364908A1 (en) 2016-12-22 2019-12-05 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Use of cry14 for the control of nematode pests
BR112019014720A2 (pt) 2017-01-18 2020-04-07 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC métodos para conferir resistência a doença em uma planta e para aumentar o rendimento em uma planta
US11279946B2 (en) 2017-01-18 2022-03-22 Basf Argicultural Solutions Seed Us Llc BP005 toxin gene and methods for its use
WO2018165091A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
CA3055389A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Hppd variants and methods of use
CA3056920A1 (en) 2017-03-29 2018-10-04 Karlheinz GRILLITSCH Recombinant host cell with altered membrane lipid composition
WO2018213771A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 Cargill, Incorporated Genome editing system
WO2019083808A1 (en) 2017-10-24 2019-05-02 Basf Se IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE AGAINST HPPD INHIBITORS BY REGULATION OF PUTATIVE REDUCED 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE REDUCES IN SOYBEANS
US11279944B2 (en) 2017-10-24 2022-03-22 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Of herbicide tolerance to 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) inhibitors by down-regulation of HPPD expression in soybean
CN117120618A (zh) 2021-02-12 2023-11-24 勃林格殷格翰 Rcv 两合公司 用于增加蛋白质分泌的信号肽
WO2024137438A2 (en) 2022-12-19 2024-06-27 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Insect toxin genes and methods for their use

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5198345A (en) 1985-04-15 1993-03-30 Gist-Brocades N.V. Vectors in use in filamentous fungi
EP0284603B1 (en) 1985-04-15 1998-01-07 Gist-Brocades N.V. Use of promoters of filamentous fungi
NZ228234A (en) 1988-03-08 1992-09-25 Ciba Geigy Ag Non-coding chemically regulatable dna fragments, their use and preparation
EP0463056A1 (en) * 1989-03-17 1992-01-02 E.I. Du Pont De Nemours And Company External regulation of gene expression
WO1990013658A1 (en) * 1989-04-28 1990-11-15 The University Of Alberta Plant hormone regulated expression of genetically engineered gene products in plant cells
DE69132939T2 (de) 1990-06-25 2002-11-14 Monsanto Technology Llc Glyphosattolerante pflanzen
CA2088661C (en) 1990-08-31 2001-12-18 Gerard F. Barry Glyphosate tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
GB9114259D0 (en) 1991-07-02 1991-08-21 Ici Plc Plant derived enzyme and dna sequences
GB9118759D0 (en) * 1991-09-02 1991-10-16 Univ Leicester Recombinant dna
WO1993021334A1 (en) * 1992-04-13 1993-10-28 Zeneca Limited Dna constructs and plants incorporating them
US5717129A (en) * 1995-02-16 1998-02-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for maintaining sterility in plants

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1321184C (zh) * 1994-03-15 2007-06-13 中山大学 一种以基因优化方法获得的抗草甘膦基因及其表达载体
CN102905517A (zh) * 2010-04-23 2013-01-30 先锋国际良种公司 基因开关组合物及使用方法
CN110951692A (zh) * 2019-12-03 2020-04-03 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞测定法
CN110951692B (zh) * 2019-12-03 2020-12-18 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞测定法

Also Published As

Publication number Publication date
NO980450D0 (no) 1998-02-02
WO1997006269A1 (en) 1997-02-20
BG102272A (bg) 1998-09-30
US6380463B1 (en) 2002-04-30
JPH11510695A (ja) 1999-09-21
CA2224732A1 (en) 1997-02-20
NZ313750A (en) 1999-04-29
GB9515941D0 (en) 1995-10-04
CZ29198A3 (cs) 1998-06-17
HUP9802867A3 (en) 2001-01-29
PL324821A1 (en) 1998-06-22
NO980450L (no) 1998-04-01
AU711653B2 (en) 1999-10-21
RU2181380C2 (ru) 2002-04-20
EP0843730A1 (en) 1998-05-27
AU6627896A (en) 1997-03-05
HUP9802867A2 (hu) 1999-03-29
BR9609886A (pt) 1999-05-25
TR199800131T1 (xx) 1998-05-21
MX9800861A (es) 1998-04-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1197483A (zh) 可诱导的除草剂抗性
CN1145691C (zh) 抗旱或抗盐胁迫转基因谷类植物的生产
CN1208464C (zh) 与水稻肌动蛋白第一内含子相联的玉米h3c4启动子、含有它的嵌合基因及转化植物
CN1031252A (zh) 卤代芳香基腈降解基因、它的使用和含有该基因的细胞
CN1192243A (zh) 羟苯丙酮酸双加氧酶基因的dna序列以及含有羟苯丙酮酸双加氧酶基因的抗特定除草剂植物的获得
CN1359422A (zh) 抗除草剂植物
CN1199425A (zh) Dna构建体
CN1228784A (zh) 编码拟南芥的gai基因的核酸
CN1038465A (zh) 在植物中诱导赖氨酸过量生成的方法
US20080104730A1 (en) Yield-improved transgenic plants
CN1270636A (zh) 编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的dna序列及其于植物中的超量生产
WO1999005902A1 (en) Transgenic plants tolerant of salinity stress
CN104487577A (zh) 用于调控表达的诱导型启动子序列及使用方法
EP4032976A1 (en) Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptide, encoding gene thereof and use thereof
CN1914321A (zh) 来自甘薯的蔗糖诱导型启动子
AU2015231111B2 (en) Cry1D for controlling corn earworm
CN1219885C (zh) 转基因植物及其生产方法
JP5631531B2 (ja) 植物に用いる真核生物翻訳開始因子遺伝子調節要素
Ortega et al. An intragenic approach to confer glyphosate resistance in chile (Capsicum annuum) by introducing an in vitro mutagenized chile EPSPS gene encoding for a glyphosate resistant EPSPS protein
AU759068B2 (en) Methods and compositions for producing plants and microorganisms that express feedback insensitive threonine dehydratase/deaminase
US20140090101A1 (en) Transgenic plants with enhanced agronomic traits
CA3081378C (en) K85 mutation-containing plant epsps mutant, and encoding gene and application thereof
CN1309835C (zh) 植物可选择标记物和植物转化方法
CA3083031A1 (en) Plant epsps mutant containing l195p and s247g mutations and encoding gene and use thereof
AU2020101667A4 (en) Application of NAC091D transcription factor protein and its coding gene in inhibiting seed germination

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1015827

Country of ref document: HK