CN110951692A - 糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞测定法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株，选用Hela细胞，转染带有绿色荧光蛋白标签的糖皮质激素受体，通过抗生素筛选，获得稳定转染GFP‑GR的Hela细胞株。还公开了该转基因细胞株的测定方法，包括：步骤1：根据糖皮质激素及其受体的作用机制，构建糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株；步骤2：通过给药转基因细胞株，定量检测该细胞株在细胞质区域向细胞核区域移动的比率。该方法细胞受试载体可无限扩增使用，无额外损耗费用；通过高内涵筛选技术，可实现多个样本同步检测，具有成本低廉、通量极高、灵敏度较高的特点。该方法可在活体层面用于乳品、污水、养殖动物尿液等糖皮质素EDCs的检测。

Description

糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞测定法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞测定法。

背景技术

内分泌干扰化合物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)，也称环境激素(Environmental Hormone)，是食品和环境中存在的能干扰人类或动物内分泌***并导致异常效应的物质。EDCs可通过干扰动物体内天然激素合成、分泌、运输和代谢等途径，对生殖、乳腺发育、神经内分泌、甲状腺代谢、癌症、肥胖以及心血管等诸多内分泌***产生影响，即使该物质微量，长期暴露也能带来生物体内分泌失调。内分泌效应涉及***、雄性激素、糖皮质激素和盐皮质激素效应等。糖皮质激素是肾上腺皮质激素的一种，分别通过糖皮质激素受体(glucocorticoids receptor，GR)和盐皮质激素受体(mineralocorticoidsreceptor，MR)发挥其功能。糖皮质激素缺乏会伴随一系列复杂症状发生，严重时可威胁生命，自然代谢条件下，机体通过昼夜循环进行糖皮质激素的释放和调节。然而，过量的糖皮质激素会引起免疫抑制和多种副作用，如代谢紊乱、肥胖、高血压、动脉粥样硬化等疾病，儿童性成熟加快，男性生育力降低等。

糖皮质激素是养殖业生产中常用的抗炎、抗过敏药物，可用于治疗家畜炎症及免疫疾病等，同时由于该药物还有一定的促生长作用，因而被广泛使用。常见药物有***、倍他米松、氟米龙、***龙等。大量糖皮质激素类EDCs进入环境和农业水源***，通过生物链富集和产业链迁移在肉类、乳品及其制品等食品中残留，而目前尚无有效方法降解此类物质，进而最终影响人体健康和环境生物多样性。据报道，北京大学Hong Chang采用LC-ESI-MS/MS检测(LOD:0.2-0.5μg/kg)我国北京地区河流及污水中5种类固醇激素，监测结果分别为：糖皮质激素(河流52ng/L，污水390ng/L)，***(河流9.8ng/L，污水25ng/L)，雄激素(河流480ng/L，污水1887ng/L)，孕激素(河流50ng/L，污水75ng/L)，但目前仍然尚无有效削减方法来防控此类风险。因此，有效监测食品及环境中糖皮质激素类EDCs残留十分重要，且刻不容缓。

目前，国标、行标等涉及糖皮质激素内分泌干扰物检测方法主要有9套，其中基于液相色谱串联质谱方法有8套，包括了《GB/T 21981-2008动物源食品中激素多残留检测方法液相色谱-质谱/质谱法》、《GB/T 24800.2-2009化妆品中四十一种糖皮质激素的测定液相色谱/串联质谱法和薄层层析法》等；酶联免疫法(ELISA)1套，包括了《SN/T 4141-2015畜及畜产品中糖皮质激素残留量检测方法酶联免疫法》。气相色谱质谱方法检出限为0.2μg/kg(以***计)，ELISA酶联免疫检出限可达0.125-4μg/kg(以***计)。此外，还有基于细胞增殖的体外生物测定方法，以及通过器官增重、生长发育等动物实验的体内生物方法等研究，但上述方法均存在一些瓶颈和不足，主要体现在：(1)糖皮质素EDCs在环境和食品中无处不在，医院排放、塑化剂和包装材料使用、农业投入品残留、环境重金属本底等，大量未知或已知糖皮质素EDCs原型及其代谢产物可能会被漏检或无法检测，现有质谱和ELISA等方法在满足高通量、灵敏度、时间和成本之间不平衡，目前未大量开展此类摸底排查和监测，原因主要在于成本昂贵和检测时间较长，因此开发新型的通量更高、成本更低、灵敏度良好以及检测时间合理的检测方法至关重要；(2)诱导糖皮质激素效应物质广泛存在，有已知和未知的多种化学物及其结构类似物，开发更为广谱性、非靶向性，且可实现总体筛查糖皮质素EDCs方法的迫切性尤为突出。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明的目的是提供一种糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株，其利用绿色荧光蛋白作为可追踪标签，细胞质至细胞核移位的糖皮质激素受体作为靶标蛋白，转染Hela细胞得到。

本发明还提供一种糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株的测定方法，细胞受试载体可无限扩增使用，无额外损耗费用，并且通过高内涵筛选技术，基于高分辨图片成像及模型分析手段，可实现多个样本同时同步检测，成本非常低廉且通量极高。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株，选用Hela细胞，转染带有绿色荧光蛋白标签的糖皮质激素受体，通过抗生素筛选，获得稳定转染GFP-GR的Hela细胞株。

本发明还提供一种糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株的测定方法，包括以下步骤：

步骤1：根据糖皮质激素及其受体的作用机制，构建糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株；

步骤2：通过给药所述转基因细胞株，定量检测该细胞株在细胞质区域向细胞核区域移动的比率。

优选的是，步骤1中构建糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株，具体包括以下步骤：

S1：质粒pTet-GFP-GR、pTet-tTAK和pSV2-neo分别通过热激法转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素的LB平板进行培养后，分别挑取单克隆菌株；再经含氨苄青霉素的LB液体培养基培养后，抽提质粒并进行测序；

S2：将测序正确的三个质粒分别进行线性化和纯化；

S3：纯化后的质粒按pTet-GFP-GR、pTet-tTAK和pSV2-neo混合后，利用脂质体介导法转染Hela细胞，通过抗生素G418及tet筛选稳定表达绿色荧光蛋白信号的转基因细胞。

优选的是，分别利用限制性内切酶XmnI对pTet-GFP-GR，NotI对pTet-tTAK，EcoRI对pSV2-neo进行单酶切，并利用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切结果进行鉴定。

优选的是，线性化后的质粒浓度约为166-393ng/μL。

优选的是，pTet-GFP-GR：pTet-tTAK：pSV2-neo按质量比为10：10：1混合。

优选的是，脂质体介导法转染Hela细胞之前还包括以下步骤：利用G418抗生素对所述Hela细胞进行浓度筛选，并于37℃、5％CO₂条件下培养14d，以获得导致细胞全部死亡的最小浓度；

导致细胞全部死亡的G418最小浓度为800μg/mL。

优选的是，所述Hela细胞按10⁵个/平板接种至60cm平板中，待生长至汇合率80％左右即可用于转染实验。

本发明还提供一种所述的转基因细胞株的应用，应用于环境安全、食品安全或临床医学领域样本中化学物诱导的糖皮质激素类内分泌干扰联合效应中。

优选的是，所述样本来自于监测污水、人体及养殖动物体液、乳粉及其制品中任意一种。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开的一种糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株，是利用绿色荧光蛋白(GFP)作为可追踪标签，细胞质至细胞核移位的糖皮质激素受体(GR)作为靶标蛋白，转染Hela细胞得到。糖皮质激素受体(GR)是一种质-核转移受体，当不存在相应激素时，GR存在于细胞质中，同时结合多种热休克蛋白和免疫亲和素，进而形成复杂的多蛋白复合体；当糖皮质激素进入细胞时，GR结合相应激素配体并从多蛋白复合体中脱离，由细胞质移动至细胞核区域，进而与核区的GR调控元件(GR regulatory elements，GREs)相互作用，最终引起糖皮质激素受体特异性转录调控。当不同浓度糖皮质激素EDCs作用后，表现出质-核转移比率不同，且该值与糖皮质素EDCs成正比，该值可作为细胞毒理学评价手段，与空白对照、阴性对照、阳性(***)对照比对可得出本底及待检样本的定性与定量结果。

本发明还公开了该转基因细胞株的测定方法，该基因细胞系利用脂质体转染法，同时转染三个质粒，分别为pTet-GFP-GR、pTet-tTAK以及pSV2neo；其中pTet-GFP-GR和pTet-tTAK两个质粒均受tet启动子控制，二者共同完成四环素关闭(tet-off)***。即当外源添加四环素tet时，tet与细胞本身含有的tTK蛋白结合，进而导致tet启动子不能被开启，此时tTK和GFP-GR(基因序列如SEQ ID NO：1所示)均不表达；当去除tet时，tTK蛋白可结合到tet启动子上，同时开启tTK及GFP-GR的表达，tTK的大量表达进而促进tet启动子不断开启；pSV2neo则用于提供neo抗性基因，便于通过G418抗生素筛选稳定细胞株。所筛选的稳定细胞株可通过给药后，通过荧光信号在细胞质区域向细胞核区域移动的比率来得出结果，该结果测定及计算均通过高内涵筛选仪实现。

本发明公开的转基因细胞的测定方法中，细胞受试载体可无限扩增使用，无额外损耗费用，大大降低成本；并且通过高内涵筛选技术，基于高分辨图片成像及模型分析手段，在一块96孔板上即可同时实现20-25个样本(3个平行)的同步检测，成本非常低廉且通量极高，同时灵敏度极高，可达10^-9mol/L-10^-8mol/L(以***计)或0.39μg/L-3.9μg/L(以***计)。该方法可应用到食品及环境中乳品、污水、养殖动物尿液等糖皮质素EDCs的检测中，非常方便，具有成本低、通量高、灵敏度高等特点。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明pTet-Splice的质谱图；

图2为本发明pTet-tTAK的质谱图；

图3为本发明pSV2-neo的质谱图；

图4为本发明pTet-GFP-GR、pTet-tTAK、pSV2-neo的单酶切结果；其中，从左至右依次为泳道1-8，泳道1和2分别为marker；泳道3和4分别为pTet-GFP-GR酶切前后结果；泳道5和6分别为pTet-tTAK酶切前后结果；泳道7和8分别为pSV2-neo酶切前后结果；

图5为本发明筛选出的Hela-GFP-GR克隆；A、B分别为筛选出Hela-GFP-GR克隆的其中两个，A编号为2-C11，B为3-D5，分别拍照明场、GFP-GR以及细胞固定后GFP-GR；

图6为本发明Hela-GFP-GR细胞加入***(Dexa)标准品后筛选稳定细胞株；A为Control，即未加入Dexa标准品；B为加入10^-7mol/L Dexa标准品；

图7为本发明Dexa检测Hela-GFP-GR稳株细胞的质核转移情况；

图8为本发明细胞区域分选结果；

图9为不同Dexa浓度对Hela-GFP-GR不同作用时间影响其质核迁移的情况；核质比为1是空白对照(DMSO)基准表达水平；

图10为本发明pTet-GFP-GR测序结果；其中，第一条为测序结果，第二条为序列信息。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明所用到的部分试验材料和仪器来源，如果涉及到没有具体列出的试验材料或者仪器均为市面上通过常规的商业渠道能够购买所得的。

pTet-splice、pTet-tTAK(thermofisher)、pSV2-neo(ATCC)。

GFP-GR全基因合成及重组形成pTet-GFP-GR质粒，由南京金斯瑞公司完成。

Trans5α感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)。

胰蛋白胨、酵母提取物(OXOID)，NaCl(西陇科学股份有限公司)，Amp(北京全式金生物技术有限公司)。

无内毒素质粒小抽试剂盒(Gene star)，质粒纯化试剂盒由(天根生化科技有限公司(北京))。

Hela细胞株(ATCC)。MEM培养基、无酚红MEM培养基、胎牛血清、胰酶、PBS溶液(Gibco)，HEPES溶液(北京索莱宝)，活性炭处理胎牛血清CD-FBS(Hyclone)。

Lipo3000，opti-MEM(Thermofisher)；G418(北京索莱宝)，四环素tet(Sigma)；***标准品(CAS：50-05-2；天津阿尔塔)。

25cm²培养瓶、60cm培养平板、12孔板、6孔板、96孔板、96孔板(黑色，透明底)、50ml和15ml离心管等耗材(corning，NEST)。

高内涵筛选***(PerkinElmer，Operetta CLS^TM)、台式离心机、荧光倒置显微镜(Olympus，IX73/DP80)。

实施例1

一种糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株的筛选方法

1)质粒的抽提和测序

质粒pTet-GFP-GR[是由pTet-splice(如图1所示)和GFP-GR全基因重组而成]、pTet-tTAK(如图2所示)和pSV2-neo(如图3所示)分别通过热激法转化入大肠杆菌Trans5α感受态细胞，涂布于LB(Amp)平板培养，37℃培养过夜，分别挑取单克隆菌株。将所得的单克隆菌株转接到30mL LB(Amp)液体培养基中培养过夜，利用无内毒素质粒小抽试剂盒进行质粒抽提。

质粒浓度为147-508ng/μL(OD_260/280在1.82-1.85)，分别各取20μL样品，送生工测序，测序结果均正确，如图10所示，其余保存待用。

2)质粒线性化和纯化

分别利用限制性内切酶XmnI对pTet-GFP-GR，NotI对pTet-tTAK，EcoRI对pSV2-neo进行单酶切，利用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切结果进行鉴定。

酶切成功的线性化质粒，利用质粒纯化试剂盒进行除盐除酶，线性化后的质粒浓度约为166-393ng/μL，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果如图4所示。

3)脂质体介导法转染Hela细胞

脂质体转染实验前，将Hela细胞按10⁵个/平板接种至60cm平板中，待生长至汇合率80％左右即可用于转染实验。

质粒转染细胞前，还需要用G418抗生素对需要转染的Hela细胞进行作用浓度筛选，以得到最佳抗生素筛选浓度。具体为：Hela细胞按10⁵个/孔接入6孔板，G418浓度分别设置为0μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL和1000μg/mL，置于37℃，5％CO₂条件下培养14d，以获得导致细胞全部死亡的最小浓度。每个实验至少设置3个平行，最终获得的G418筛选浓度为800μg/mL。

用于转染的三个质粒按pTet-GFP-GR：pTet-tTAK：pSV2-neo质量比为10：10：1比例进行混合；阴性对照：利用等体积无菌水替代。按照lipo3000转染试剂说明及推荐转染质粒用量，将质粒、转染试剂及opti-MEM分别混合，最终混合后静置15min，滴加入Hela细胞平板，放置于培养箱培养，24h后可依据细胞情况换液，48h后更换为带有800μg/mL抗生素G418、5μg/mL tet的新鲜MEM完全培养基[简记为MEM完全培养基(+T+G)]。

加入抗生素后，连续培养7-10d，至阴性对照组细胞全部死亡，且实验组内细胞克隆未连片铺满整个平板，即可进行后续筛选。

4)稳株筛选转基因细胞株

a：将转染初步筛选的细胞消化离心收集，利用MEM完全培养基(+T+G)将细胞稀释至接种浓度为1个细胞/孔，接入96孔板，连续培养至可见孔内有明显的单克隆或混合克隆细胞。

将上述克隆分别扩大培养，50％继续培养，50％用于荧光信号检测。检测前去除tet后培养1d，通过荧光倒置显微镜检测，筛选出有绿色荧光蛋白信号的克隆(如图5所示)。

b：对上述筛选出带绿色荧光蛋白信号的克隆并扩大培养，对克隆进一步给药筛选，去除tet后1d，阴性对照为MEM完全培养基，给药组为添加10^-7mol/L***(Dexa)的MEM完全培养基，给药24h后拍照观察。筛选得到的克隆则一直连续用MEM完全培养基(+T+低浓度G)维持，传代2-3次后，去除tet进行荧光信号检测，直至去除G418后仍可以维持荧光信号不丢失，即筛选的稳株转基因细胞(如图6所示)。

实施例2

糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株的测定方法(以***为例)

1)对筛选出的Hela-GFP-GR稳株细胞进行给药时间和给药浓度测试。

为了尽可能排除培养基和血清中的影响因素，改用无酚红MEM培养基和活性炭处理过CD-FBS。Hela-GFP-GR去除tet培养1d，消化计数，按照10⁴个/孔接入黑色96孔板，培养过夜后，分别加入Dexa 10^-6mol/L、10^-7mol/L、10^-9mol/L、10^-11mol/L和10^-13mol/L，设空白对照(DMSO)，每个浓度至少3个平行，分别在给药后0.5h、1h和4h后进行细胞固定以及Hochest33342(Ex/Em 350/361nm)染色。

结果如图7所示：高内涵采集图像结果显示，Dexa可引起GFP-GR质核转移，对照组加入DMSO而未加入Dexa，未发生GFP-GR质核转移。并且添加Dexa组，当添加10^-7mol/L Dexa后经过0.5h后，发生细胞质核转移。

2)数据处理和结果计算

通过高内涵筛选***获得图像后，需要对细胞核和细胞整体区域进行选定。首先利用hochest33342进行细胞核的分选，再利用GFP信号进行细胞整体区域的分选。随后通过两个区域相差，得到我们所需要的细胞质区域。最终利用高内涵***分别计算给出细胞核和细胞质区域的GFP信号强度，结果如图8所示。

如图9所示，随着Dexa浓度升高，核质比增加，最佳Dexa作用浓度为10^-7mol/L；由于1h处，在10^-6mol/L水平下即出现表达降低情况，因此最佳时间为0.5h左右或更为提前。随着Dexa作用时间增加，10^-7mol/L及更高浓度Dexa核质比反而比作用时间短的实验组降低；而低浓度的Dexa核质比略有小幅度增加。该情况可能与长时间作用下细胞开始增殖***，且细胞之间形成连片和叠落等情况有关，这些因素会影响软件对细胞整体区域的划分，最终影响其荧光强度计算。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所

<120> 糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞测定法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3147

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccttg gccaacactt 180

gtcactactt tcacttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaaacag 240

catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaaagaac tatatttttc 300

aaagatgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt 360

aatagaatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct tggacacaaa 420

ttggaataca actataactc acacaatgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaaggcgcc 720

ggcgctggtg ctggtgctgg cgccatcagc gcgctgatcc tggactccaa agaatcctta 780

gctccccctg gtagagacga agtccctggc agtttgcttg gccaggggag ggggagcgta 840

atggactttt ataaaagcct gaggggagga gctacagtca aggtttctgc atcttcgccc 900

tcagtggctg ctgcttctca ggcagattcc aagcagcaga ggattctcct tgatttctcg 960

aaaggctcca caagcaatgt gcagcagcga cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag 1020

cagcagcagc agcagcagca gcagcagcca ggcttatcca aagccgtttc actgtccatg 1080

gggctgtata tgggagagac agaaacaaaa gtgatgggga atgacttggg ctacccacag 1140

cagggccaac ttggcctttc ctctggggaa acagactttc ggcttctgga agaaagcatt 1200

gcaaacctca ataggtcgac cagcgttcca gagaacccca agagttcaac gtctgcaact 1260

gggtgtgcta ccccgacaga gaaggagttt cccaaaactc actcggatgc atcttcagaa 1320

cagcaaaatc gaaaaagcca gaccggcacc aacggaggca gtgtgaaatt gtatcccaca 1380

gaccaaagca cctttgacct cttgaaggat ttggagtttt ccgctgggtc cccaagtaaa 1440

gacacaaacg agagtccctg gagatcagat ctgttgatag atgaaaactt gctttctcct 1500

ttggcgggag aagatgatcc attccttctc gaagggaaca cgaatgagga ttgtaagcct 1560

cttattttac cggacactaa acctaaaatt aaggatactg gagatacaat cttatcaagt 1620

cccagcagtg tggcactacc ccaagtgaaa acagaaaaag atgatttcat tgaactttgc 1680

acccccgggg taattaagca agagaaactg ggcccagttt attgtcaggc aagcttttct 1740

gggacaaata taattggtaa taaaatgtct gccatttctg ttcatggtgt gagtacctct 1800

ggaggacaga tgtaccacta tgacatgaat acagcatccc tttctcagca gcaggatcag 1860

aagcctgttt ttaatgtcat tccaccaatt cctgttggtt ctgaaaactg gaataggtgc 1920

caaggctccg gagaggacag cctgacttcc ttgggggctc tgaacttccc aggccggtca 1980

gtgttttcta atgggtactc aagccctgga atgagaccag atgtaagctc tcctccatcc 2040

agctcgtcag cagccacggg accacctccc aagctctgcc tggtgtgctc cgatgaagct 2100

tcaggatgtc attacggggt gctgacatgt ggaagctgca aagtattctt taaaagagca 2160

gtggaaggac agcacaatta cctttgtgct ggaagaaacg attgcatcat tgataaaatt 2220

cgaaggaaaa actgcccagc atgccgctat cggaaatgtc ttcaggctgg aatgaacctt 2280

gaagctcgaa aaacaaagaa aaaaatcaaa gggattcagc aagccactgc aggagtctca 2340

caagacactt cggaaaatcc taacaaaaca atagttcctg cagcattacc acagctcacc 2400

cctaccttgg tgtcactgct ggaggtgatt gaacccgagg tgttgtatgc aggatatgat 2460

agctctgttc cagattcagc atggagaatt atgaccacac tcaacatgtt aggtgggcgt 2520

caagtgattg cagcagtgaa atgggcaaag gcgatactag gcttgagaaa cttacacctc 2580

gatgaccaaa tgaccctgct acagtactca tggatgtttc tcatggcatt tgccttgggt 2640

tggagatcat acagacaatc aagcggaaac ctgctctgct ttgctcctga tctgattatt 2700

aatgagcaga gaatgtctct acccggcatg tatgaccaat gtaaacacat gctgtttgtc 2760

tcctctgaat tacaaagatt gcaggtatcc tatgaagagt atctctgtat gaaaacctta 2820

ctgcttctct cctcagttcc taaggaaggt ctgaagagcc aagagttatt tgatgagatt 2880

cgaatgactt atatcaaaga gctaggaaaa gccatcgtca aaagggaagg gaactccagt 2940

cagaactggc aacggtttta ccaactgaca aagcttctgg actccatgca tgaggtggtt 3000

gagaatctcc ttacctactg cttccagaca tttttggata agaccatgag tattgaattc 3060

ccagagatgt tagctgaaat catcactaat cagataccaa aatattcaaa tggaaatatc 3120

aaaaagcttc tgtttcatca aaaatga 3147

Claims (10)

1.一种糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株，其特征在于，选用Hela细胞，转染带有绿色荧光蛋白标签的糖皮质激素受体，通过抗生素筛选，获得稳定转染GFP-GR的Hela细胞株。

2.一种糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：根据糖皮质激素及其受体的作用机制，构建糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株；

步骤2：通过给药所述转基因细胞株，定量检测该细胞株在细胞质区域向细胞核区域移动的比率。

3.如权利要求2所述的糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株的测定方法，其特征在于，步骤1中构建糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株，具体包括以下步骤：

S1：质粒pTet-GFP-GR、pTet-tTAK和pSV2-neo分别通过热激法转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素的LB平板进行培养后，分别挑取单克隆菌株；再经含氨苄青霉素的LB液体培养基培养后，抽提质粒并进行测序；

S2：将测序正确的三个质粒分别进行线性化和纯化；

S3：纯化后的质粒按pTet-GFP-GR、pTet-tTAK和pSV2-neo混合后，利用脂质体介导法转染Hela细胞，通过抗生素G418及tet筛选稳定表达绿色荧光蛋白信号的转基因细胞。

4.如权利要求3所述的糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株的测定方法，其特征在于，分别利用限制性内切酶XmnI对pTet-GFP-GR，NotI对pTet-tTAK，EcoRI对pSV2-neo进行单酶切，并利用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切结果进行鉴定。

5.如权利要求3所述的糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株的测定方法，其特征在于，线性化后的质粒浓度约为166-393ng/μL。

6.如权利要求3所述的糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株的测定方法，其特征在于，pTet-GFP-GR：pTet-tTAK：pSV2-neo按质量比为10：10：1混合。

7.如权利要求3所述的糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株的测定方法，其特征在于，脂质体介导法转染Hela细胞之前还包括以下步骤：利用G418抗生素对所述Hela细胞进行浓度筛选，并于37℃、5％CO₂条件下培养14d，以获得导致细胞全部死亡的最小浓度；

导致细胞全部死亡的G418最小浓度为800μg/mL。

8.如权利要求3所述的糖皮质激素内分泌干扰联合效应的转基因细胞株的测定方法，其特征在于，所述Hela细胞按10⁵个/平板接种至60cm平板中，待生长至汇合率80％左右即可用于转染实验。

9.一种如权利要求1所述的转基因细胞株的应用，其特征在于，应用于环境安全、食品安全或临床医学领域样本中化学物诱导的糖皮质激素类内分泌干扰联合效应中。

10.如权利要求9所述的转基因细胞株的应用，其特征在于，所述样本来自于监测污水、人体及养殖动物体液、乳粉及其制品中任意一种。

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