CN1031252A - 卤代芳香基腈降解基因、它的使用和含有该基因的细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及对于溴苯甲腈的腈基因的水解作用 专一的腈水解酶、编码该酶的核苷酸顺序和转化的细 胞，在该细胞中，如果提供外来物，则腈水解酶可表 现。转化细胞可表达腈水解酶以提供环境的解毒并 防止溴苯甲腈敏感性细胞受它的细胞毒素的影响。 尤其，所制备的植物可耐溴苯甲腈。

Description

本发明是1987年1月5日提出的编号为PCT/US87/00044的国际申请的部分继续，后者是1986年3月28日提出的编号为845，662的申请的部分继续，而后者又是1986年1月8日提出的编号为817，226的申请的部分继续，在这里，两种申请所揭示的均列为参考。
将新的遗传特性提供给微生物和高等有机体的细胞的机会为其达到新的特性开辟了广阔的前景。一个方面是有关的对于它们的细胞有毒性效应的各种作用剂被使用。例如，在农业上使用的许多化合物可直接杀死害虫、杂草等等。在很多情况下，这些化合物可以具有比较长的停留时间或持效性。
在很多情况下，人们希望辨别有待于被保留的品种和有待于被杀死的物种之间的不同。例如，选择性地杀死杂草而对作物的不利影响最小通常是人们所期望的。大多数情况下，很多广谱除草剂对于作物具有明显的不利影响，所以它们的使用基本上局限于杂草发生前或小心地在杂草发生后使用。
因此，人们对于能够修饰存活的细胞使它们能抵抗应急条件，诸如细胞毒剂很感兴趣。
美国专利第4，535，060号揭示了使用细菌aroA基因将耐草甘膦性传递给草甘膦感受性细胞。Hsu和Camper《Can.J.Microbiol》22∶537-543（1976）描述了从土壤富集培养物中分离4-羟基-3，5-二碘苯甲腈降解物。Hsu和Clemson《Dissert    Intrn.》B36，第8，3708号（1976）描述了3，5-二卤代
腈一类除草剂的微生物降解作用。Ingram和Pullin《Pestic.Sci.》5∶287-291（1974）描述了溴苯甲腈在三种类型土壤中的持久性。Smith《Abstr.Metting    Weed    Soc.Am.》16-17页（1971）描述了在Regina重粘土中溴苯甲腈的降解作用。Smith和Fletcher《Hort.Res.》4∶60-62（1964）报道了3，5-二卤代-4-羟基苯并腈和土壤微生物。
腈水解酶、编码这种腈水解酶的核酸顺序、含有在对它来说腈水解酶基因是外来的所要求的宿主所识别的调节基因的转录和转译调节控制下编码这些腈水解酶的基因的构成物、含有这种构成物的宿主细胞和含有这种构成物的生物体和生物部分或产品均要被提供。溴苯甲腈和/或碘苯甲腈专一性腈水解酶已发现可用于对含有溴苯甲腈和相关的除草剂的生境的解毒和防止宿主细胞受这类除草剂的细胞毒作用。所述结构可用于区别含有这种构成物的宿主细胞和无这种构成物的宿主细胞。
根据本发明的主旨，提供了与卤代的羟基苯并腈，尤其是3，5-二溴-4-羟基苯并腈或3，5-二碘苯并腈有关的新的DNA顺序、构成物、转化了的细胞、植物和肽。本发明涉及一种能够使腈水解，以使腈的除草活性得以解毒的酶的生产和提供对于除草剂敏感的细胞或宿主的保护作用或提供被除草剂沾染的环境的解毒作用。
所感兴趣的结构基因可以从被证明能够采用苯并腈作为氮源，通常能采用苯并腈作为唯一氮源的单细胞微生物，尤其是细菌中得到。此后，在谈及苯并腈或腈水解酶时，苯并腈一般指卤代对羟基苯并腈，尤其是3，5-二碘-4-羟基苯并腈或3，5-二溴-4-羟基苯并腈，腈水解酶一般指能够使用这种卤代苯并腈作为氮源，尤其作为唯一氮源的腈水解酶。
酶可以用各种不同的途径获得，通常是从存在于含有溴苯甲腈或碘苯甲腈的自然环境中的细菌中获得。尤其是从肠道细菌，更尤其是克雷白杆菌属（Klebsiella）是易获得酶的。肺炎克氏杆菌，尤其是变种臭鼻杆菌（ozaenae）可以被用来取酶。从土壤中分离出来的细菌可以放在增加的较高浓度的苯并腈和较少数量的其他氮源的土壤或其他培养基中生长，直到得到可使用苯并腈作为唯一氮源的可生存的细菌为止。
不管含有腈水解酶的细菌源于何处，都必须进行筛选以确保在苯并腈解毒作用中，腈水解酶是有效的。此外，腈水解酶应该对于苯并腈是专一性的，而对于不含卤素的而具有其他取代基的其他的类似物等等则无专一性。因此，本发明的腈水解酶是苯并腈专一性的，如所定义的，而且对于类似物呈相对惰性或对于类似物只有很小的活性。所希望的是，增殖的速度不应有很大的减小，即：与在可比较浓度下，苯并腈作氮源的细菌比较，在通常的氮源，如氨存在下，细菌的增殖速度减少小于10%。这样的结果用非特定的苯并腈是观察不到的。
一旦一个或多个宿主品系得以鉴定，那么一些技术就可用于鉴定腈水解酶的密码顺序。基因可以存在于染色体中或质粒中。基因组可以被分段，尤其是采用限制性核酸内切酶分段，这里一个或多个核酸内切酶可用于提供从5Kb（千碱基对）-50Kb的片断。这此片断可被克隆于合适的细菌，如大肠杆菌中的适应载体上，对所得到的转化体可进行筛选以了解其腈水解酶活性，这里宿主生物体提供负的背景。
一旦一个或多个克隆体被鉴定为具有腈水解酶的活性，则含有所需要的DNA片断的染色体外成分（extrachromosomal    element）：质粒或病毒，可以采用通常的技术分离：如宿主的溶胞作用、DNA的沉淀、从染色体DNA中分离载体DNA、质粒或病毒DNA。然后，染色体外成分可以通过核酸内切酶限制裂解，所需要的片断可通过分离和鉴定不同大小的片断的各种技术，如电泳，密度梯度离心分离等加以分离。
根据片断的大小，它通常需进一步操纵以减小尺寸而更接近于基因的尺寸和它的侧面调节区。操纵含有编码酶的顺序和它的调节侧面顺序的片断的各种技术是存在的。在不同的反应混合物中可以用不同的限制性酶部***解，随后通过片断的克隆以测定那些片断仍然保留有提供腈水解酶表达的能力。
换句话说，酶可以被分离和部分地被定顺序。根据氨基酸顺序，可以制备各种探针，然后，这些探针可用于鉴定具有基因的片断。通过将该方法与限制酶裂解相结合，可进行片断的克隆和检验所需要的基因是否存在。此外，人们可以使用核酸外切酶，如Bal31从片断的一个或两个末端除掉一些核苷酸以进一步减少多余的核苷酸的数目。
另外，基因可以被克隆于一个合适的宿主中，信使RNA可以用一探针筛选分离，并在一合适的体内或体外转译***，如非洲蟾蜍属***（Xenopus    oocytes）或网状溶胞产物（reticulolysate）或其他的***中鉴定。然后，可采用通常的技术：包括涉及逆转录酶和用DNA聚合酶形成互补链技术将分离得到的信使（RNA）用于制备cDNA。在这种情况下，所得到的结构基因无与转录有关的调节区。
腈水解酶基因可以用各种途径来加以修饰，如切除5′末端或3′末端的一个或两个末端、延长5′或3′末端。通常，自然存在的腈水解酶涉及到不大于25，更通常为不大于约20个密码子。这种腈水解酶可被延长到50个氨基酸之多，通常不大于约30个氨基酸。替代、切除和延长可结合使用。因此，该基因可以采用不同的途径操纵以改变酶的特性，以较方便地操纵质粒等。
含有表达腈水解酶的结构基因的DNA顺序可以结合到各种各样其他DNA顺序以引入一个合适的宿主细胞。伴随顺序（companionsequence）取决于宿主的性质、DNA顺序引入宿主的方式和游离基因（episomal    maintenance）的维持和整合是否是需要的。
对于原核的宿主来说，存在着各种各样的载体，这些载体可以通过转化、接合、转导或转染将DNA顺序引入原核宿主。DNA质粒包括各种质粒，如pBR332、pACYC184、pM89、pRK290等;装配型质粒，如pVK100;或各种病毒，如P22等。
对于真核宿主来说，很多种不同的技术可以用于将DNA引入宿主，如用包括非复制DNA顺序的Ca++-沉淀DNA、质粒或极微染色体转化、用含有土壤细菌顺序的T-DNA转化、用微量移液管微量注射或电处理（electroporation）。根据在DNA结构中是否存在感受态复制***，就可测定DNA是否可被复制为游离基因成分，或DNA是否被整合进宿主基因组，和结构基因在宿主中的表达。游离基因成分，如肿瘤诱导质粒，如Ti或Ri，或它们的片断，或病毒，如CaMV、TMV或它们的片断可能被使用，它们对于宿主是不致死的，且这里结构基因以允许表达该结构基因的方式存在于这样的游离基因成分。人们尤感兴趣的是具有复制功能和缺乏其他功能，如致癌作用、毒性等的片断。
从腈水解酶源得到的片断可采用一个合适的克隆载体而克隆。克隆可以在一合适的单细胞微生物，如细菌，例如大肠杆菌中进行。希望的是，人们可能使用装配型质粒，在那里部分或完全消化提供了具有所需要大小的片断。例如，装配型质粒pVK100可以被一个合适的限制酶部分消化并连接到一些由质粒、染色体或它们的喜糠窒屯耆玫降钠仙稀０敖Ｖぶ挥兴璐笮〉钠媳话安⒆嫉剿拗魃锾逯小?
宿主生物体可能进行筛选了解其是否具有耐苯并腈特性。受体菌株可被修饰以提供合适的遗传特性。这些特性可以用于进行转导体的选择。在微生物中，可采用一所需要的移动质粒，将转导体接合到另外的微生物中。已有各种技术可用来进一步减小含有腈水解酶的结构基因的片断的尺寸。例如，可用各种限制性内切酶，如EcoRⅠ、BglⅡ、SmaⅠ等分离、裂解装配型质粒载体，得到的片断可克隆于一合适的载体中，较方便的是以前所用的装配型质粒载体。各种小尺寸的克隆载体，如pACYC177和pACYC184来代替装配型质粒载体是可行的。因此，较佳为小于约5Kb（千碱基对），通常小于约4Kb，更佳为小于约2Kb的片断可被克隆并提供耐苯并腈特性。
希望的是，片断为约1Kb并小于约5kb，较佳为小于约4Kb，尤其好的至少为1047bp（碱基对），特别好的是包括有至少1100bp，最好为小于约1.5Kb的侧面区。特别令人感兴趣的是从臭鼻杆菌中得到的BglⅡ-SmaⅠ片断，尤其是约1210bp的PstⅠ-HincⅡ片断。
人们较感兴趣的是切除腈水解酶基因，使其5′-末端最多为5个密码子，3′末端至多为10个密码子，或将最多为50密码子，通常不大于30密码子，较佳为不大于20个密码子加入到5′末端和/或3′末端。因此，所得到的酶可能由于多到具有50个氨基酸不同于自然存在的酶，较通常的是不大于30个氨基酸，较佳地为不大于25个氨基酸，其中包括取代、延长和切除结合使用。
腈水解酶可以通过任何合适的来源，或者原核细胞或者真核细胞，包括细菌、酵母菌、丝状真菌、植物细胞等表达。得不到分泌时，酶可以根据已知的方式，通过使细胞溶解和使腈水解酶分离而被分离。通常的方式包括色谱、电泳、亲合色谱法等。通常地，溴苯甲腈可以通过一合适的功能团，如羟基基团，接合到一个不溶载体上，并用作腈水解酶分离的“包装”。
在由Harper，《Biochem.J.》167∶685-692（1977）所描述的条件下腈水解酶的专一活性至少为约0.1微摩尔NH3/分/毫克蛋白质，通常为至少0.5或更高。
纯化了的酶可以用各种不同的途径来使用。它可用于直接测定溴苯甲腈、碘苯甲腈或其他有关的苯并腈。换句话说，目的酶可以通过被接合到一个感兴趣的分析物，如半抗原或抗原，或到抗体上，而作为诊断分析中的标记物，正如在美国专利第3，654，090号;3，817，837;和3，850，752中所描述过的分析那样。接合的方法以及分析物浓度的测定在这些专利中已有详细的描述，它们的阐述的合适部分在这里列为参考。
编码腈水解酶的DNA顺序可以各种途径而被使用。DNA顺序可用作为自然型或变异型腈水解酶分离的探针。换句话说，DNA顺序可用于整合，通过重组到宿主中而将耐苯并腈性传递给宿主。
对于植物细胞而言，结构基因作为结构的一部分，通过极微量注射而引入植物细胞核，通过重组到宿主基因组中而整合。换句话说，电处理可用于将结构基因引入植物宿主细胞。在结构基因是从具有不被植物宿主识别的调节信号的源中获得的情况，人们需要引入合适的调节基因用于表达。在病毒或质粒，如肿瘤诱导质粒被使用和被列图情况下，限制性位点可以选择在启动子的下游，结构基因可以在与离启动子一合适的距离被***。DNA顺序不提供一个合适的限制性位点，它可以用一个核酸外切酶，如Bal31进行多次消化，并***一个合成的限制性核酸内切酶位点（联结子）。
人们较感兴趣的是使用肿瘤诱导质粒，如Ti或Ri，那儿腈水解酶基因可被整合到植物细胞染色体之中。Ti质粒和Ri质粒的使用的描述可见PCT公开号WO84/02913、02919和02920和EPO申请0，116，718和Matzke和Chilton，《J.Mol.App.Genetics》1∶39-49（1981）。
通过使用T-DNA的右边缘或两个边缘，所说的边缘位于含有腈水解酶结构基因的“表达盒”的侧面，在由植物宿主所识别的用于起始和终止的转录和转译调节信号下，“表达盒”可整合到植物基因组中，并提供在不同分化阶段的植物细胞中表达腈水解酶。
可以制备各种构成物用于在植物细胞中表达。该构成物可提供一个“表达盒”，该“表达盒”在植物中具有表达植物宿主中腈水解酶的功能。
为了进行转录，可以使用各种转录起始区（启动区）：或者构成区或者诱导区。
转录起始区结合到编码腈水解酶的结构基因，以提供起始密码上游的转录起始，通常在起始密码子的200个碱基以内，在那里未转译的5′区缺少ATG。
结构基因的3′-末端具有一个或多个终止密码子，该终止密码子加入到在植物宿主中起作用的转录终止区，该终止区可以与相同的或不同的结构基因结合作为起始区。
“表达盒”的特征在于它记住了转录起始区、在起始区转录控制下的结构基因、用于终止转录和以合适的方法处理信使RNA的终止区的方向。
通常所指的欧派因启动区和终止区可作为转录或转译调节区以得到腈水酶的组成表达。换句话说，其他的启动区和/或终止区也可使用，尤其是那些在植物宿主中可提供诱导表达或调节表达的启动区。Ti质粒中可以被使用的启动子区包括：欧派因启动区（opine    promoter）如：章鱼碱合成酶启动区、蓝曙红合成酶启动区、agropine合成酶启动区、mannopine合成酶启动区等等。其他的启动区包括病毒启动区，如CaMV区VI启动区或全长（35S）启动区，与核酮糖-1，5-二磷酸羧化盐基因，如小亚基与云扁豆蛋白、贮藏蛋白、β-全大豆球蛋白、纤维素形成等相关的基因相结合的启动子。
各种顺序可采用通常的途径结合到一起。启动区通过结构基因，如所述的基因的5′区，可限制性列图被鉴定，顺序可以选择和分离。同样，终止区可作为结构基因3′区分离出来。顺序也可以被克隆和加入合适地定向，以提供在植物宿主中腈水解酶基因的组成表达。
通过引入表达腈水解酶的功能基因而修饰作物植物细胞，人们可将其浓度为能保证基本完全或完全地除去杂草，而作物则相对不受影响的苯甲腈、碘甲腈或类似的除草剂施用于各种作物。以这种方式，可以得到较好的经济效应，因为肥料和水可更充分地被利用，并可避免由于杂草存在而引起的不利影响。
表达腈水解酶的“表达盒”可引入各种各样植物中，包括：玉米、小麦、大豆、烟草、棉花、西红柿、土豆、芸苔属物种、稻、花生、牵牛花、向日葵、甜菜、草坪草（turfgrass）等在内的单子叶植物和双子叶植物。这种基因可存在于细胞中或植物的某些部分，包括胼胝、组织、根部、块茎、繁殖体、胚、种子、叶子、籽苗、花粉等中。
通过提供具有耐苯并腈特性的植物，各种配方可用于保护作物不受杂草危害，因此可增强作物的生长并减少向植物竞争营养。例如，溴苯甲腈可以单独用于杂草的生长后防治，而它对作物，如向日葵、大豆、谷物、棉花等则是安全的，或者，它可与其他产品一起形成配方。
在配方中，用于大田里的农药的通常的量为约0.1～4磅/英亩，较佳为0.2～2磅/英亩溴苯甲腈，其他的除草剂的量为约0.1～4磅/英亩活性成分。配方中可包括其他的添加剂，如去污剂、佐剂、喷雾剂、粘性剂、稳定剂等等。配方还可以是湿的或干的，包括可流动的粉末、可乳化的浓缩液和液态浓缩液，如已有的技术中所周知的。
除草剂溶液可以采用通常的方式使用，例如，通过喷洒、灌溉、撒粉末而使用。
下面的实例是为了说明本发明而提供的，而并非将本发明局限于此。
材料和方法
限制酶和用于连接作用的T4连接酶是根据制造商的推荐而使用。克隆和分子分析的标准方法是根据Maniatis等《分子克隆：实验室操作》（Cold    Spring    Harbor    Laboratory，New    York，1982）进行。克隆分析是采用Ish-Horowitz等《Nucl.Acids    Res.》9∶2989-2998（1981）中描述的方法进行。
大肠杆菌菌株MM294可用于所有的克隆实验（Hanahan，《Mol.Biol》166∶557-80，1983）。
所使用的抗生素的水平为：Cm（氯霉素）25μg/ml;Tc（四环素）10μg/ml;Ap（青霉素）300μg/ml。
质粒DNAs在大肠杆菌中的转化是根据Mandel和Higa，《J.Mol.Biol》53∶159-162（1970）所描述的方法进行。
对沾染有溴苯甲腈的土壤样品得到的细菌分离体进行分离和筛选。一种这样的微生物被鉴定为肺炎克氏杆菌亚种臭鼻杆菌。对从上述生物体得到的溴苯甲腈专一性腈水解酶进行部分纯化和表征鉴定，产生了一表观分子量为34KDal（千道尔顿）的活性酶。在固体L-琼脂上重复传代培养臭鼻杆菌后，可分离出一种变异体，当将这种变异体放在一定的液体培养基上生长时，它不再能够利用溴苯甲腈作为唯一的氮源，每升液体培养基中含有KH2PO4（1.5g），K2HPO4（3.5g）、MgSO4·7H2O（0.1g），酵母提取物（50mg）、柠檬酸盐、甘油和丁二酸盐（均为0.1%）和痕量元素，如Barnett和Ingraham《J.Appl.Bacteriol.》18∶131-143（1975）中所描述的。该培养基此后称为YETE多碳培养基。YETE多碳培养基含有0.05%溴苯甲腈。尽管这个微生物不利用溴苯甲腈作为唯一氮源，它可在含0.05%溴苯甲腈的L-肉汁培养基中生长到完全密度。臭鼻杆菌变异体菌落被筛选出来并在10ml    L-肉汁培养基中生长。从含有溴苯甲腈的LB平板中也选择出三个独立的臭鼻杆菌菌落并在同样的条件下生长。这样四个相同的臭鼻杆菌菌落同时在供有0.05%溴苯甲腈的10ml    L-肉汁培养基中生长。在30℃，培养物生长到完全密度，采用Ish-Horowitz等，《Nucl.Acids    Res.》9∶2989（1981）所述的方法从每一培养物中制备小型质粒DNA（mini-prepplasmid）。未消化的质粒DNAs在0.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，并用溴化3，8-二氨基5-乙基-6-苯基菲啶嗡染色剂将质粒带染成肉眼可见。
在溴苯甲腈存在或缺乏的条件下生长的臭鼻杆菌变异体呈现为一种单质粒种（大小为68Kb），而在0.05%溴苯甲腈存在下生长的三个臭鼻杆菌菌落则呈现为较大的质粒种（90Kb）。在缺乏溴苯甲腈情况下，两种质粒形式在三个臭鼻杆菌菌落的二个中存在。这个数据表明，当溴苯甲腈选择作用被解除时，较大的质粒种转化为较小的质粒种将伴随着失去约22Kb质粒DNA。
将所有四种菌落放在含有0.05%溴苯甲腈的200ml L-肉汁培养基中生长。细胞用Frech压力机粉碎，上层清液用含有0.05MKPO4（pH7.5）;2.5mM二硫苏糖醇（DTT）的缓冲液渗析和测定各个粗抽提物以了解溴苯甲腈专一的腈水解酶的活性。从臭鼻杆菌变异体制备的粗抽提物不含有可测定的腈水解酶活性，而其它的臭鼻杆菌粗抽提物都显示出腈水解酶专一活性，分别为0.124，0.105和0.143微摩尔NH3/分/mg蛋白质。细胞在30℃下在含有0.1%葡萄糖和0.04%溴苯甲腈的M9培养基中[Miller（1972）《分子遗传学》，（Cold Spring Harbor Laboratory]生长到对数期中期。粗提取物是通过将细胞粉碎、超离心和在含有0.05MKPO4（pH7.5）和2.5mMDTT的缓冲液对上层清液渗析而制备的。在所有的分析试验中，底物的浓度是3mM溴苯甲腈。释放的NH3是用Harper《Biochem.J.》167∶685-692（1977）所述的方法监测。臭鼻杆菌变异体在含有溴苯甲腈的L-肉汁培养基中生长的能力可能引起微生物获得化合物的不渗透性。但是，该微生物不能在利用溴苯甲腈作为唯一氮源的限定的培养基中生长。
简单地说，臭鼻杆菌腈水解酶表观上是质粒编码的。编码酶的基因似乎是位于在缺乏溴苯甲腈选择作用的情况下，从臭鼻杆菌质粒丢失的一个22Kb质粒DNA片断上。
臭鼻杆菌溴苯甲腈专一性腈水解酶在大肠杆菌中的表达
在0.05%溴苯甲腈选择下生长的臭鼻杆菌的质粒DNA被制备，DNA转化到大肠杆菌菌株MM294（thi、gyr A96，endⅠ、hsdR17）。转化体在氮缺乏（N-）固体琼脂糖小型培养基上[每升含KH2PO4（1.5g）、K2HPO4（3.5g）、MgSO4·7H2O（0.1）和0.1%葡萄糖，另添加0.05%溴苯甲腈作为唯一氮源]上进行选择。在5天培养后，10个菌落出现在选择性平板上。这些菌落在含0.05%溴苯甲腈的L-琼脂平板上重新被划线并进行在MM294中是否存在硫胺素营养缺陷型标记物的试验。在缺乏硫胺素（维生素B1）的小型培养基中没有菌落生长表明，该菌株是大肠杆菌MM294。而在提供硫胺素和0.05%溴苯甲腈作为唯一氮源的M9培养基中，所有的菌落均可生长。在缺乏溴苯甲腈的这种培养基中则观察不到菌落生长。这些菌落中的二个被选出进一步分析。对含有90Kb质粒的大肠杆菌MM294的粗抽提制剂进行溴苯甲腈专一性腈水解酶活性分析时，得到比活性为0.216微摩尔NH3排出/分/mg。含有较小质粒种的大肠杆菌MM294不产生可测定的腈水解酶活性。在大肠杆菌中较大（90Kb）质粒则被称为pBrxl，而较小（68Kb）质粒则被定为pBrxlΔ。
为了证实含有质粒pBrxl的大肠杆菌菌株MM294由于溴苯甲腈专一性腈水解酶反应的结果可产生合适的代谢物，将2ml MM294（pBrxl）的培养物放在供有0.05%溴苯甲腈的M9培养基中在30℃生长24小时。一个培养物的过滤物样品在C18HPLC（高压液相色谱）柱中层析。在培养物过滤物中所有加入的溴苯甲腈被转化为一个新的代谢物峰。通过光谱分析代谢物峰鉴定为3′5′-二溴-4-羟基苯酸（DBHB）。因此，编码腈水解酶的溴苯甲腈专一性质粒在大肠杆菌中表达的产物是与在臭鼻杆菌中所观察到的一样。
溴苯甲腈专一性腈水解酶基因在大肠杆菌中被克隆
为了测定编码溴苯甲腈专一性酶的DNA片断在大肠杆菌中是否可克隆，质粒pBrxl用BamHⅠ进行消化，结果分别得到53Kb和37Kb的两条带。BamHⅠ片断被连接到大肠杆菌质粒载体pACYC184的BamHⅠ位点上[Chang和Cohen，《J.Bacteriol.》134∶1141（1978）]，并转化到大肠菌菌株MM294中。克隆到pACYC184的BamHⅠ位点引起耐四环素基因不能***。十个耐氯霉素四环素敏感的菌落被选出，小规模制备的克隆分析所制备的DNA，并用BamHⅠ来消化DNA，四个克隆含有37Kb BamHⅠ片断，而一个克隆含有pBrxl的较大的53Kb的BamHⅠDNA片断。五个克隆体含有一个克隆的BamHⅠ片断，它在与从pBrxl中自发缺少22Kb质粒DNA后仍保留的DNA片断相应的质粒pBrxlΔ中也发现。所有这十个克隆体，在有20μg/ml氯霉素（为了选择质粒）的200ml L-肉汁培养基中进行生长，粗抽提制剂可得到，并进行溴苯甲腈专一性腈水解酶活性测定。四种含有37Kb BamHⅠ片断的克隆体所显示的腈水解专一活性为0.140微摩尔NH3排出/分/mg蛋白质，而在其余六个克隆体中，则观察不到可检测的腈水解酶的活性。这个数据表明编码溴苯甲腈专一性腈水解酶的活性基因位于从质粒pBrxl克隆的37Kb BamHⅠ片断上，在缺乏溴苯甲腈选择作用下，自发缺失的22Kb    DNA片断是37Kb    BamHⅠ片断所固有的。
为了证实BamHⅠ片断对载体pACYC184的定向，用EcoRⅠ消化上述四种克隆体的DNA，并在0.07%琼脂糖凝胶上电泳。质粒pBrxl和pBrxlΔ的结合的EcoRⅠ消化液也进行分析。
37Kb    BamHⅠ片断对于载体pACYC184的两个取向被确定并分别称为质粒pBrx2和pBrx3。也可观察到，22KbDNA片断从质粒pBrx2和pBrx3自发地缺少也是三种EcoRⅠ片断所固有的。这些EcoRⅠ片断的大小分别为18Kb、3Kb和1.9Kb。如果腈水解酶结构基因不被EcoRⅠ限制位点一分为二，那么编码溴苯甲腈专一性腈水解酶的基因应定位于这三种EcoRⅠ片断中的一种。
对于大肠杆菌（pBrx3）的溴苯甲腈专一性腈水解酶的定位进行了研究，结果加下。
表1
溴苯甲腈专一性腈水解酶是大肠杆菌中的一种周质酶
培养条件a腈水解酶比活性b
甲苯化细胞（L-肉汁培养基）    0.829
溶菌酶处理的细胞（L-肉汁培养基）    0.796
全细胞（L-肉汁培养基）    0.770
全细胞（L-肉汁培养基    Brxl）    1.25
全细胞（M9）    0.950
全细胞（M9′Brxl）    1.45
全细胞/pACYC184（M9）    0
注：a含有质粒pBrx3的大肠杆菌（MM294）细胞在5毫升的培养物在指定的培养基中在37℃下被培育到停滞期。培养物中含有20μg/ml氯霉素和0.04%溴甲苯腈（Brxl），正如所述的那样。从每个培养物腥〕鲆籱l，用腈水解酶缓冲液（0.1MKPO4，pH7.5）洗涤一次，细胞悬浮于0.1ml同样的缓冲液中。取50μl样品进行有或没有3mM溴苯甲腈作为底物的腈水解酶活性的测定，据Harpe，《Biochem.J.》167∶685-692（1977）所述的方法进行。
b，微摩尔NH3/分/mg.在O.D.600测定的蛋白质为1.4＝109细胞/ml＝150μg。
这些数据表明，腈水解酶的细胞定位是一周质空间。其次可看到在培养基中缺乏溴苯甲腈时酶可被表达，故认为溴苯甲腈诱导对于酶的表达是不需要的。
溴苯甲腈专一性腈水解酶的进一步纯化。
进行臭鼻杆菌腈水解酶进一步纯化后，得到下列的结果。
表2
从大肠杆菌中纯化溴苯甲腈专
一性腈水解酶（起始物质为6克细胞）
级分 体积 蛋白质 微摩尔NH3/分 S.Ab.
粗的a100ml 210mg 18.15 0.086
30-50%    6ml    83mg    26.77    0.250
NH4SO4
DEAE    56ml    19mg    15.52    0.820
交联葡聚糖
注：a在含有0.04%溴苯甲腈和葡萄糖的M9培养基中，在30℃下细胞生长到对数生长期的中期。粗抽提物通过细胞粉碎、超离心，并在含有0.05MKPO4（pH7.5）和2.5mM DTT的缓冲液中渗析而制备。在所有腈水解酶测定中，底物浓度均为3mM。
b微摩尔NH3/分/ng。
一个2.5cm2×10cm的层析柱放在含有0.05%KPO4（pH7.5）、2.5mM DTT和1mM EDTA的缓冲液中平衡。样品被加入，在上述柱的缓冲液中用300ml线性梯度为从0.02-0.40M氯化钠展开层析柱。含有1MNaCl的缓冲液在梯度末了时使用。
收集5ml级分和0.075ml等份的轮换级分进行腈水解酶活性的测定。在0.22M盐浓度下洗脱，得到单一酶活性峰。约75%加入的活性腈水解酶在活性级分中被回收。
DEAE层析柱中横跨腈水解酶峰宽度的级分用0.02MKPO4（pH7.5）渗析，并将50μl（6μg蛋白质）每一级分加入11.25%变性La emmli凝胶中。与DEAE层析柱中的活性峰相对应的富集蛋白质带是分子量为34，000的多肽。在活性层析柱级分中富集不到其它的多肽。这些数据支持了溴苯甲腈专一性腈水解酶是一种分子量约为34，000的多肽和可能是单个基因的产物的观点。
克隆pBrx2采用EcoRⅠ完全消化，分离得一约19Kb的片断。该片断被***到EcoRⅠ消化的pACYC184载体（3.9Kb）中，提供了一质粒pBrx5，它以先前描述的方法转化到大肠杆菌中。质粒已采用通常的方法加以分离，并用BglII消化，得到一约6.7Kb的片断，它仍***于pACYC184载体之中。然后，分离的质粒pBrx7用SmaⅠ和BglII消化，得到一约3.9Kb的片断，它被***SmaⅠ-BamHⅠ消化的pACYC177（3.7Kb）中（Chang和Cohen，《J.Bacteriol》134∶1141-1156（1978）。最终得到的耐青霉素的质粒以先前描述的方法被转化到大肠杆菌中，转化体在青霉素选择培养基中选择，得到质粒pBrx8，它携带有在3.9Kb片断上的腈水解酶基因。
用PstⅠ对pBrx8进行部分消化，把一些片断***PstⅠ消化的pUC18[Yanisch-Perron等，《Gene》33∶103-119（1985）]中。最终得到的质粒在大肠杆菌中克隆，并检测腈水解酶活性。一个克隆体具有5.3Kb质粒pBrx9，后者被分离出来并用PstⅠ和HincⅡ进一步消化，结果得到了一个在比较均匀的PstⅠ到HincII、CIaⅠ、SalⅠ、ScaⅠ和SphⅠ限制位点的方向上的1210b    P片断。PstⅠ-HincII片断根軸anger等《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》74∶5463-5468（1977）中所描述的方法进行定顺序。结果得到的顺序（具有被编码的合适的氨基酸）是由如下的顺序表示。
65
CTGCAGGATAGTAGGGGCTTGAAGAGGATACGCTGTTTGGCGAGCCATCAAAATAAGGGGATTTTC
Figure 881041734_IMG1
基本上无5′-和3′-非编码侧翼区的PstⅠ-HincⅡ片断可以用EcoRⅠ衔接物连接，用EcoRⅠ消化，现在这样就作好了准备可通过***至pCGN451的EcoRⅠ位点而将其引入植物“表达盒”。
pCGN451包括一个章鱼碱盒，该盒含有大约通过EcoRⅠ衔接物融合到基因的3′末端的1，566bp5′非编码区和约1，349bp的3′非编码DNA。pTi协调物对于3′区为11，207-12，823，对于5′区为13，643-15，208，如Barke等《plant    Molecular    Biology》2∶335（1983）中所定义的。5′片断是这样得到的：一个含有编码区的5′末端的小亚克隆片断以BamHⅠ-EcoRⅠ片断被克隆于pBR322上，作为质粒pCGN407。BamHⅠ-EcoRⅠ片断在编码区有一XmnⅠ位点，而pBR322则有二个XmnⅠ位点。pCGN407用XmnⅠ消化，用Bal31核酸酶切除，并将EcoRⅠ衔接物加入片断。在EcoRⅠ和BamHⅠ消化后，片断就是按尺寸划分将各个级分克隆和分析顺序。在一种情况下，完全编码区和10bp的5′未转译顺序被除去，留下5′未转译区，mRNA分解代谢物激活蛋白（cap）位点和完整的16pb的5′未转译区（到BamHⅠ位点）。这个小片断是通过在7%丙烯酰胺凝胶上进行大小分级得到的，洗提得到约130bp长度的片断。这种大小分级的DNA连接到M13mp9中，对几个克隆进行定顺序，并将顺序与章鱼碱合成酶基因已知的顺序相比较。M13构成物被称为pI4，它的质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ消化，所提供的小片断被连接到含有pTi    A6的上游5′顺序的XhoⅠ到BamHⅠ片断上（Garfinkel和Nester，《J.Bacteriol.》144∶732，1980）和被连接到含有3′顺序的EcoRⅠ到XhoⅠ的片断上。所得到的XhoⅠ片断被克隆进pUC8衍生物的XhoⅠ位点上，被称为pCNG426。这个质粒不同于pUC8，它具有一个可被DNA聚合酶Ⅰ填入的EcoRⅠ位点，当一个XhoⅠ衔接物被***到pUC8的唯一的HincⅡ位点时，通过HincⅡ限制性核酸内切酶的核酸酶污染作用，它会失去PstⅠ和HindⅢ位点。所得到的质粒pCGN451具有可用于把蛋白质编码顺序***在5′非编码区（它含有1，550bp的5′非转译顺序，包括T-DNA的右边缘，mRNA分解代射激活蛋白位点和16bp的5′一非转译顺序）和3′区（它含有267bp的编码区，终止密码子，196bp的3′-非转译DNA、多腺苷酸位点和1，153bp的3′非转录顺序）之间的EcoRⅠ位点。
含有章鱼碱合成酶（ocs）盒的XhoⅠ片断被***质粒pCGN517，它具有耐四环素基因和耐卡那霉素基因。pCGN517是通过将从pUC4k（Vieira，《Gene》19∶259，（1982））中得到的Kanr基因引入唯一的PstⅠ位点而从pHC79（Hohn，《Gene》11∶291，（1980）中制备的。pCGN517用SalⅠ消化，XhoⅠ片断被***到唯一的SalⅠ位点中。
XhoⅠ片断被***到第二个质粒pCGN529中。pCGN529是通过将从Tn5（Rothstein等，1981《Movable    Genetic    Elements》99页，Cold    Spring    Harbor    Laboratories，ColdSpring Harbor，NY）的Kanr基因***并将从pRi A4 T-LDNA（White和Nester，《J.Bacteriol》（1980）144∶710）中的2.4Kb的BglⅡ片断***到在用Tn5Kanr基因取代pACYC184的HindⅢ-BamHⅠ片断后仍保留的BamHⅠ位点中而从pACYC184制备的。
在ocs盒的独特EcoRⅠ上，把EcoRⅠ腈水解基因***含有ocs盒的XhoⅠ片断上，将该片断分别***pCGN517和pCGN529即得到质粒pN1和pN2，它们分别被引入根癌病土壤杆菌或发根病土壤杆菌，用于整合到Ti质粒或Ri质粒的T-DNA上。对于不同的质粒的整合可以以3途径接合法来进行，如由Comai等《Plasmid》10∶21-30（1983）中所描述的。含有质粒pRK2073、pN1或pN2的大肠杆菌宿主和根瘤病土壤杆菌A722（Garfinkel，《J.Bacteriol.》（1980）144∶732）或发根病土壤杆菌A4    T（White，《ibid》（1980）144∶710）的过夜培养物进行过夜培养，培养物适当地混合，并在含有150μg/ml卡那霉素的AB板上展开。对单个菌落重复划线两次。正确整合由总的土壤杆菌DNA印迹分子杂交分析（Southern    analysis）而证实。核酸内切酶消化了的DNA用切口转译的pBrx8探查。
溴苯甲腈专一性水解酶基因在瘿组织中的表达
在2.6Kb片断上携带的腈水解酶基因的质粒pBrx9用BamⅠ消化，并用Bal31处理以除去一些5′侧翼区。加入BamHⅠ衔接物并达到重新终止。所得到的具有耐α-氨基苄青霉素特性的质粒以先前描述的方法转化到大肠杆菌中，转化体是在α-氨基苄青霉素选择性培养基上选择出来，得到在2.6Kb片断上携带腈水解酶基因的5.2Kb的质粒pBrx16和pBrx17。用BamHⅠ消化pBrx16并用HincⅡ部分消化它，可得到1.2Kb的腈水解酶基因片断。
将BamHⅠ-HincⅡ片断***BamH1-SmaⅠ消化的pCGN46中，得到含有腈水解酶基因片断的6.6Kb质粒pBrx22。
pCGN46（Comai等，《Nature》（1985）317∶741-744）是一个Mannopine合成酶（MAS）“表达盒”，它含有MAS启动区和ocs3′区。pCGN46的构造是以下列的方式来完成的。一个携带含有annopine合成酶启动子区（PMAS）的部分T-RDNA（Barke等，《plant Mol.Biol》（1983）2∶325）的约5.5Kb pEcoRⅠ片断（EcO13或EcoC）在称为pVK232的载体上克隆。用EcoRⅠ对pVK232消化后，Eco13被***pACYC184的EcoRⅠ位点，得到质粒pCGN14。用SphⅠ和ClaⅠ消化pCGN14（分别在Barker等的顺序的21562位置和20128位置进行，supra），从而移去已***到pUC19（pharmacia，Inc.）中的PMAS区，所述pUC19已经被SphⅠ和AccⅠ进行消化了，最后得到pCGN40。PMAS区包括被完全甲基化的ClaⅠ识别位置，所以可抗消化。
pCGN40用EcoRⅤ和EcoRⅠ进行消化，EcoRⅤ位点在T-DNA中，而EcoRⅠ位点则在pUC19聚合衔接物中，从而可得到具有PMAS区的片断。含有章鱼碱合成酶盒的pCGN451用SmaⅠ和EcoRⅠ进行消化，较大的片断是从已被移去章鱼碱合成酶5′区的pCGN451分离出来。EcoRⅤ-EcoRⅠPMAS区被取代进pCGN451中的章鱼碱合成酶5′区，在那里转录起始和终止区是用聚合衔接物分离而得到pCG46。
含有1.2Kb腈水解酶基因片断的质粒pBrx22以先前所述的方法转化进大肠杆菌。质粒用通常的方法分离，并用XhoⅠ消化，得到一个含有MAS启动区的4.1Kb片断、含有25碱基对细菌5′未转译顺序的溴苯甲腈基因和ocs3′区。4.1Kb片断***到SalⅠ消化的质粒pCGN783中而得到约31Kb的质粒pBrx28。
pCGN783的构造、pCGN167的构造
为了构造pCGN167，CaMV（bP为7144-7735）[Gardner等，《Nucl.Acids    Res.》9∶2871-2888（1981）]的AluⅠ片断是通过用AluⅠ消化而得到，然后克隆进M13mp7（Vieira，《Gene》（1982）19∶259）的HincⅡ位点，产生了C614。C614的EcoRⅠ消化液是从含有35S启动子的C614得到了EcoRⅠ片断，它被克隆进pUC8（Vieira等，《基因》（1982）19∶259）的EcoRⅠ位点就得到了pCGN146。
为了修整启动子区，用BglⅡ和Bal31处理BglⅡ位点（bp7670），并将一BglⅠ衔接物粘连接到Bal31处理的DNA上，得到pCGN147。
含有一个启动子区、可选择的标记物（带有2ATG′s的KAN）和3′区的pCGN148a是通过用BglⅠ消化pCGN528（见下面）和***pCGN147的BamHⅠ-BglⅡ启动子片断而加以制备，该片断被克隆进pCGN528的BglⅡ位点，因此，BglⅡ位点是与pCGN528的卡那霉素基因相邻近。
用于该构成物的往复性载体pCGN528是以下列方法制备的：pCGN525是用HindⅢ-BamHⅠ消化含有Tn5的质粒，Tn5包含卡那霉素基因（Jorgenson等，《Mol.Gen.》（1979）177∶65），并将含有卡那霉素基因的HindⅢ-BamHⅠ片断***pACYC184的四环素基因中的HindⅢ-BamHⅠ位点（Chang    &    Cohen，《J.Bacteriol.》（1978）134∶1141-1156）来制得。pCGN526是通过将pTi    A6（Thomashow等，《Cell》（1980）19∶729-739）的BamHⅠ片断19***pCGN525的BamHⅠ位点而制备的。pCGN528是通过用XhoⅠ消化而从pCGN526中删除小的XhoⅠ片断并重新连接而得到的。
pCGN149a是通过将pMB9    KanⅩⅪ的BamHⅠ卡那霉素基因片断克隆进pCGN148a的BamHⅠ位点而制备的。
pMB9    KanⅩⅪ是一种pUC4K变异体（Vieira    &    Messing，《Gene》（1982）19∶259～268），它具有XhoⅠ位点的缺失（XhoⅠ    Site    missing），但是，它含有一个Tn903中的功能性卡那霉素基因，可以在土壤杆菌中有效地选择。
pCGN149a用BglⅡ和SphⅠ消化。用BamHⅠ和SphⅠ消化作用而分离得的M1（见下面）的BamHⅠ-SphⅠ片断取代pCGN149a中的小BglⅡ-SphⅠ片断。这样就得到了pCGN167，这是一种含有一个全长度的CaMV启动子、1ATG-卡那霉素基因，3′末端和细菌Tn903-型卡那霉素基因的构成物。M1是pCGN550中的EcoRⅠ片断（见pCGN587的构造），它以这样一种方式被克隆进M13mp9的EcoRⅠ克隆位点，即在1ATG-卡那霉素基因中的PstⅠ位点是与M13mp9的聚合衔接物区邻近的。
709的构造（1ATG-卡那霉素-3′区）
将含有pUC18（Yanisch-perron，ibid）的EcoRⅠ-HindⅢ衔接物的pCGN566***pUC13-cm（K.Buckley，《Ph.D.thesis》，UC-San    Diego，1985）的EcoRⅠ-HindⅢ位点。含有ORF1和2（Barker等，（1983），Supra）的pNW31C-8，29-1（Thomashow等，《Cell》19∶729，1980）的HindⅢ-BglⅡ片断亚克隆进产生pCGN703的pCGN566的HindⅢ-BamHⅠ位点上。
含有pTi    A6[相当于pT115955（Barke等，（1983）supra）的碱基2396-2920]的转录本7的3′区的pCGN703的San3A片断亚克隆进生产pCGN709的pUC18（Yanisch-Perron等，（1985），Supra）的BamHⅠ位点上。
pCGN766C的构造（35S启动子-3′区）
含有CaMV-35S启动子、1ATG-卡那霉素基因和pTi    A6的BamHⅠ片断19的pCGN167（结构见infra）的HindⅢ-BamHⅠ片断被克隆进生产pCGN976的pUC19（Norrander等，（1983），Supra;Yanisch-Perron等，（1985），Supra）的BamHⅠ-HindⅢ位点。
转录本7的35S启动子和3′区是通过将pCGN976（35S启动子）的0.7Kb    HindⅢ-EcoRⅠ片断和pCGN709（转录本7∶3′，结构可参考Supra）的0.5Kb    EcoRⅠ-SalⅠ片断***生产pCGN766C的pCGN566的HindⅢ-SalⅠ位点而产生的。
pCNG783的最后构造
pCGN766C（CaMV-35S启动子）的0.7Kb    HindⅢ-EcoRⅠ片断与pCGN726    C（1-ATG-KAN-3′区）的1.5Kb    EcoRⅠ-SalⅠ片断相连结，***pUC119（J.Vieira，Rutgers大学，N.J.）的HindⅢ-SalⅠ位点得到pCGN778。
pCGN778的2.2Kb区，含有CaMV35S启动子（1-ATG-KAN-3′区）的HindⅢ-SalⅠ片断取代pCGN739的HindⅢ-SalⅠ聚合衔接物而得到pCGN783。
用BamHⅠ消化pBrx17，和用HincⅡ部分消化它，结果得到1.2Kb腈水解酶基因片断。BamHⅠ-HincⅡ片断***BamHⅠ-SmaⅠ消化的pCGN566中，得到含有腈水解酶基因片断的3.7Kb质粒PBrx25。
pCGN566以下列方式构造。用EcoRⅠ和HindⅢ消化pUC13（CmR）（Ken Buckley，ph.D.thesis，U.C.，San Diego），pUC18和pUC19的HindⅢ和聚合衔接物分别***线性化的pUC13而得到pCGN566，它携带耐氯霉素标记物。
含有1.2Kb腈水解酶基因片断的质粒pBrx25以先前描述的方法***大肠杆菌中。质粒采用通常的方式分离并用BamHⅠ和EcoRⅠ消化而再得到1.2Kb腈水解酶基因片断。BamHⅠ和EcoRⅠ片断***BamHⅠ和EcoRⅠ消化的pCGN46中而得到含有腈水解酶基因片断的6.6Kb质粒pBrx27。
pBrx27是以先前描述的方法转化到大肠杆菌中。质粒用通常的方法分离，并用XhoⅠ消化而得到含有MAS启动子、在转译顺序中含有11个碱基对的细菌5′的溴苯甲基基因和ocs3′区的4.1Kb的片断。将4.1Kb片断***SalⅠ消化的pCGN783而得到约31Kb的质粒pBrx29。
腈水解酶表达的测定
质粒pBrx28和pBrx29，被转化到根癌病土壤杆菌菌株K12。（Nester，《Ann.Rev.Micro.》（1981）35∶531;Hoekrma等，《Nature》（1983）303∶179）。K12（pBrx28）和K12（pBrx29）被用于在Kalanchoe上形成瘿（Garfinke，《J·Bacteriol》（1980）144∶732）。
约1g（新鲜的重量）瘿组织在含有0.1M    Tris（pH7.5）、10mM    EDTA、0.15M    NaCl、0.05%NP-40、25mg/mlBSA、1mM    DTT和0.13μg/ml    leupeptin的缓冲液中的液氮中磨碎。在加入0.05克聚乙烯吡咯烷酮（Sigma）后使样品均质化，然后，在4℃下，在15，000g离心15分钟。通过将纯化的腈水解酶注入兔子中而制备的25μl抗血清和250μl10%（W/V）的S·aureus（Calbiochem）悬液加入到每一个上清液中，在4℃下培养16小时。然后将样品离心，丸状物（pellet）用20mM    Tris（pH7.5）、1mM    EDTA、150mM    NaCl和0.05%NP-40清洗二次。在90℃下，丸状物再悬浮于100μl    0.125MTris（pH6.8）、4%SDS（十二烷基硫酸钠）、20%甘油和10%BMe中加热2分钟。所有样品均在10%聚丙烯酰胺凝胶（Laemmti，V.K.，《Nature》227∶680-685（1970））上电泳。重新溶解的多肽被转移到硝化纤维素过滤器（Sch leicher和Schuell）中，如Burnette所描述的（《Anal.Biochem.》112∶195-203（1981））。然后将硝化纤维素过滤器（Schleicher & Schuell）在BLOTTO（Johnson等，《Gen.Anal.Technol。》1∶38-43（1983））中，于42℃培养1-3小时。然后，于室温下，在含有1∶50的抗腈水解酶血清的溶液的BLOTTO中培养过夜。过滤物用20mM Tris（pH7.5）、150mM NaCl洗涤10分钟，用含有0.05% Tween（吐温）-20的相同的缓冲液洗涤20分钟和用无Tween-20的缓冲液再洗涤10分钟。往滤物中加入含有106cpm/ml125I-标记蛋白质A（9毫居里/mg;NEN）的BLOTTO，并在室温下培养2小时。过滤物用50mM Tris（pH7.5）、1MNaCl和0.4%Sarkosyl洗涤过夜。漂洗和干燥后，滤物在-70℃，使用杜邦克鲁尼克斯强化血清在柯达克AR X射线胶片上感光。
与发根病土壤杆菌共培养的烟叶切片的转化和再生
对烟草植物进行纯净培养（25℃，白炽光，16小时）;培养基质MS（1mg/l IAA、0.15mg/l激动素）。通过主芽移植而培养的三周龄的植物被用作组织供体，幼叶（从顶端向下数的第四片）被选择出来，直径为2mm的叶盘被摘下（punched out）并置于含有具有1mg/l IAA的1ml MS培养基的培养皿中，（直径为3cm）。培养皿保持在完全黑暗过夜，然后往这些培养物中加入土壤杆菌（A772xp N1或pN2）细胞（108-109个/ml植物培养基）。在黑暗中进行共培养18-24小时。通过用缺乏激素但含有350mg/l Cefotaxine（Boehringer-Mannheim）的MS培养基洗涤三次后，叶片中无土壤杆菌。叶片转移到一个9cm的含有20mlMS培养基但无激素的培养皿中。phytagar（Gibco，0.6%;cefotaxine    350mg/l）培养皿用石蜡密封，并保持在与组织供体植物相同的条件下。2-5星期后，再生的芽肉眼可见。在6叶阶段，通过将溴苯甲腈溶液直接喷洒到盆栽植物上而进行对植物的喷洒。每一4″盆含有一株植物，并接受2.5ml的喷洒量。植物在生长室中，在25℃，70%相对湿度、60小时光周期下进行生长。喷洒后生长9天，所得到的新叶的长度大于0.5cm。
用于在烟草中表达溴苯甲腈专一性腈水解酶的烟草小亚单位启动子-溴苯甲腈基因嵌合体的构造
烟草ssu启动子盒的构造
含有烟草小亚单位基因的基因组克隆是从由烟草（Samsum）DNA中所制备的EcoRⅠ部分基因库中分离出来的。用豌豆小亚单位cDNA克隆（Broglie等，《Proc.Natl.Acad.Sci.USA》78∶7304-7308，1981）的740bp    Pst    IDNA片断对克隆进行筛选。含有烟草编码区和5′侧翼顺序的一个3.4Kb    EcoRⅠ片断是从Charon32λ-噬菌体克隆（3-8）被克隆到M13mp18（Yanisch-Perron等，《Gene》33∶103-119，1985），它的亚克隆被称为NSUE2018。通过DNA测顺序测定小亚单位蛋白质TATA盒（启动子）的位置和推断的ATG起始密码的位置。一个单链DNA模板是从NSUE2018中制备，并“退火”到25碱基单链合成寡聚体（5′TGTTAATTACACTTTAAGACAGAAA3′）。这个顺序是与烟草小亚单位基因的推断的ATG的25碱基5′是紧密互补的。采用DNA聚合酶I的Klenow片断将引物延长而得到dsDNA，然后用HindⅢ消化得到具有一在引物一端开始的钝端和HindⅢ在另一端突出的双链DNA片断。用SamⅠ和HindⅢ消化pUC18，将上面所制得的dsDNA片断***聚合衔接物中得到被称为pCGN625的4.1Kb质粒。然后用HindⅢ消化pCGN625，用EcoRⅠ消化带有Klenow片断的钝端，并***经EcoRⅠ-SmaⅠ消化的pUC18中，得到4.1Kb质粒pCGN627。一个6.3Kb的DNA片断被得到，它包括一个pACYC177（Chang    &    Cohen，《J.Bacteriol.》134∶1141-1156，1978）中的BamHⅠ-PstⅠ片断在PstⅠ位点结合到含有ocs3′区的PstⅠ-EcoRⅠ片断，bp为12823（EcoRⅠ）到bp10069（PstⅠ）（Barker等，《Plant    Molec.Biol.》2∶235-350，1984）。6.3kb的DNA片断被***到用BamHⅠ和EcoRⅠ消化的pCGN627中，由此使ocs3′区邻近于烟草ssu片断，得到一个7.7Kb质粒pCGN630。
然后，pCGN630质粒是通过用BamHⅠ消化、用Klenow片断平整钝末端、重环化、用KpnⅠ消化、用T4聚合酶钝化末端和***BamHⅠ衔接物进行操纵而得到BamHⅠ位点。所得到的质粒pCGN1509用BglⅡ消化、用Klenow聚合酶平整钝末端，然后用HindⅢ衔接物连接。所得到的pCGN1510在ocs3′区内部有一个HindⅢ位点，和Hind（Ⅳ）位点邻近并在烟草ssu区的外部。然后，pCGN1510用BamHⅠ和SstⅠ消化，BamHⅠ和SstⅠ是在ssu区和ocs3′区之间切割，且pBrx25的BamHⅠ-SstⅠ片断被***，由此以便于在正确的方向上在ssu启动子区和ocs3′终止区之间。所得到的8.9Kb质粒被称为pBrx36。
pBrx36用HindⅢ消化，并***HindⅢ消化的pCGN783，得到pBrx39和pBrx40，它们在转录的相反方向和相同方向分别具有腈水解酶基因和卡那霉素基因。
将质粒转化到根癌病土壤杆菌菌株LBA4404中，然后与烟草（烟草cv.“花黄”）子叶外植物体（分离块）一起共培养。采用通常的技术，使耐卡那霉素的苗再生到烟草植物。
表达溴苯甲腈专一性水解酶基因的基因转入的烟草（Transgenic    Tobacco）植物的表现型
转化了的烟草植物（5-6叶阶段）的叶组织通过通常的Western分析显示出表达了腈水解酶蛋白质。从表面经过消毒（10%次氯酸盐;水洗）的叶子中所得到的约5mm叶子切片悬浮于在光自养条件下的含溴苯甲腈的培养基中。所用的培养基是含有0.93mg/l萘乙酸和0.11mg/l苄基腺嘌呤的MS盐和各种含量的溴苯甲腈。溴苯甲腈的浓度以0.1释稀度变化为10-3-10-6M。光自养条件是5%CO2、10%O2、85%N2。尚未转化的对照烟草叶子切片在10-6M溴苯甲腈中脱色（显示）。对比之下，表达出质粒pBrx39和pBrx40的溴苯甲腈专一性水解酶的转化的叶子切片分别可耐受10-3M和10-4M的溴苯甲腈。
表达溴苯甲腈专一性水解酶基因的基因转入西红柿植物的表现型
西红柿（西红柿CV.UC28）子叶外植物体（分离块）的共培养是以先前描述的再生的烟草和卡那霉素苗相同方法而进行。转化了的西红柿植物（7-10叶阶段）的叶组织通过标准Western分析显示表达出腈水解酶蛋白质。从表面消毒（10%次氯酸盐;水洗）的叶子中得到的约5mm的叶子切片悬浮于在光自养条件下浓度变化的含溴苯甲腈的培养基中。培养基是含有2mg/l 2，4-二氯乙酸，1mg/l异戊基腺嘌呤和100mg/l肌醇和10-5或10-6M的溴苯甲腈的MS盐。所应用的光自养条件与烟草的相同。尚未转化的对照叶子切片在10-6M溴苯甲腈中脱色，而可表达pBrx29的溴苯甲腈专一性腈水解酶基因的转化植物可耐10-5M溴苯甲腈。用商用的溴苯甲腈配方（BUCTRIL）喷洒基因转入的西红柿植物，发现其耐受量为0.5磅/英亩。
具有取代了的C-末端的改变了的腈水解酶的制备
用SphⅠ消化质粒Brx9，然后再环化，以便于在腈水解酶的C-末端去除编码区。pUC18的DNA顺序是处在带有腈水解酶编码区的3′-ShpⅠ位点的“读码框架”内，把约10个密码子加入pUC18的TGA密码子之中。
附加存在的10个密码子是外来的，这就支持了下列事实：这些密码子可以被移去，以得到一个截短的腈水解酶，而对腈水解酶无重大影响。
下面是C-末端修饰的腈水解酶（nit-11）的具有预定的氨基酸顺序。
Figure 881041734_IMG3
Figure 881041734_IMG4
Figure 881041734_IMG5
具有N-末端取代基的修饰的腈水解酶的制备
用BamHⅠ消化质粒pBrx9，然后，用Bal31切除5分钟，移去约51个nt。该酶是钝化的，切除后的线性DNA顺序在连接的条件下用BamHⅠ衔接物连接，用BamHⅠ消化并再环化。所得到的质粒pBrx15约为5.1kb，并在5′末端有少量的密码子被删除。用HincⅠ对pBrx15部分消化，以在从腈水解酶的编码区下游的Hinc位点上劈开，再用BamHⅠ进行完全消化得到一片断，它在5′末端有一截断的腈水解酶的编码区。该片断***已用BamHⅠ和SmaⅠ完全消化过的pCGN566中，得到3.7kb质粒pBrx23。质粒pCGN566是一个带有pUC18和pUC19的聚合衔接物和耐氯霉素基因的pUC13的衍生物。pBrx15中得到的片断被***到带有上游起始密码子的“读码框架”中，由pUC19顺序编码的17个氨基酸代替自然存在的腈水解酶中的氨基酸。
以上述的顺序为基础，腈水解酶保持有用延长的N-末端氨基酸顺序以及N-末端顺序被切断或用自然存在的N-末端顺序的氨基酸取代其它氨基酸的活性。
下面提供了N-末端被修饰的腈水解酶（nit-23）的顺序。
Figure 881041734_IMG6
Figure 881041734_IMG7
野生型和改变型腈水解酶的纯化
腈水解酶是从含有pBrx9、pBrx11或pBrx28质粒的停滞期MM294大肠杆菌细胞中制备的。培养物在氨苄青霉素选择性条件下生长直到完全细胞腈水解酶，分析得到0    D.640约为2.0。培养物在4℃下在8，000xg离心约15分钟。细胞在0.1M磷酸钾缓冲液（pH7.4）中洗涤，再制成丸状，干燥，并在-20℃冷冻。丸状物在4℃下融化，并悬浮于具有1mM二硫苏糖醇、0.1mM    EDTA的40ml    50mM的磷酸钾（KDE）缓冲液中。然后，将细胞悬液通过French细胞压碎机，并在4℃，在60，000xg离心40分钟。所得到的上清液用KDE缓冲液稀释至蛋白质的浓度为12mg/ml（级分Ⅰ）。对粗级抽提物进行硫酸铵切割，发现25-35%切补物（级分Ⅱ）含有85%的腈水解酶活性。该级分重新悬浮于10ml的KDE缓冲液中，并用该缓冲液广泛地透析。
级分Ⅱ通过用KDE缓冲液平衡的DEAE交联葡聚糖A-50层析柱（4.9cm2×40cm）进一步纯化。腈水解酶峰用在KDE缓冲液中0.1～0.4M Nacl梯度洗提。收集活性级分（级分Ⅲ），用硫酸铵沉淀，并通过25mM组氨酸（pH6.2）渗析。一个医用色谱聚焦层析柱（1.75cm2×20cm）是用20mM组氨酸（pH6.2）平衡后的pBE94制备的。首先用聚合缓冲液（pH4）洗涤，使pH梯度从6～4，再用1M Nacl洗提酶。含有活性酶级分的峰用硫酸铵沉淀，并通过KDE透析（级分Ⅳ）。在11.25%凝胶上进行SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）在约37，000处显示了一个强主带，在约70，000分子量处具有轻微的污染。光密度计扫描显示出，级分Ⅳ腈水解酶制品是99%均质化的。
下表表明纯化的结果和纯化腈水解酶产品的特性。
野生型和改变型溴苯甲腈专一
性腈水解酶的纯化和性质的比较
nit-wt    nit-11    nit-23
硫酸铵切补物    25-35%    10-25%    20-35%
DEAE交联
葡聚糖洗脱    270mM    150mM    290mM
色谱聚焦洗脱    1M    Nacl    pH46    1MNacl
pH6-4的
梯度/1MNacl
洗脱
比活性    25.7    55    19.7
双重纯化    10.3    16.4    35.8
Km（mM）    0.31    0.05    0.11
Vmax（微摩尔/
分/mg）    15    36    9
活性酶形式    二聚体    多聚体    二聚体
遵照上面的方法，可得到耐溴苯甲腈的植物，它可用于存在有溴苯甲腈的大田里种植，而对于作物的生长无明显的不利影响。
本发明的目的是通过使植物具有除草剂特性，尤其是使其对苯并腈除草剂专一性耐性而改良植物。因此，编码腈水解酶的基因可被引入植物宿主中，由此表达基因，并将耐苯并腈特性传递给植物。此外，酶可以通过在通常的细菌宿主中基因克隆而生产，并由此使酶得以表达。可以监测到具有活性的酶具有广泛的用途，可用于鉴定多种分析物或苯并腈基底物。此外，酶和表达酶的细菌可用于从被污染的环境中除去苯并腈除草剂。
尽管本发明已经通过说明和实例而详细地描述了，其目的是更清楚地理解本发明，在附加的权项的范围中可以作出一些变化和修改是很明显的。

Claims (22)

1、一种约34Kb的基本上纯化的经修饰的细菌腈水解酶，它对于3，5-二卤代对羟基苯并腈基本上是专一的，且对于作为底物的溴苯甲腈的专一活性至少为0.1微摩尔NH3/分/mg蛋白质，其特征在于所说的细菌腈水解酶被总数不大于50个氨基酸所组成的取代基、切断片或延长物中的至少一个所修饰。
2、如权利要求1所述的基本上纯的经修饰的细菌腈水解酶，其特征在于所说的细菌腈水解酶对于作为底物的溴苯甲腈的比活性至少为0.1微摩尔NH3/分/mg蛋白质。
3、如权利要求1所述的基本上纯的经修饰的细菌腈水解酶，其特征在于所述细菌腈水解酶的比活性至少为0.5微摩尔NH3/分/mg蛋白质。
4、如权利要求1所述的基本上纯的经修饰的细菌腈水解酶，其特征在于所述的细菌腈水解酶是克氏杆菌的腈水解酶。
5、一种具有外来基因的细菌宿主，其特征在于它可表达对3，5-二卤代对羟基苯并腈专一的基本上纯的修饰的细菌腈水解酶。
6、如权利要求5所述的细菌宿主，其特征在于所述细菌宿主是大肠杆菌。
7、一种“表达盒”，它包括在植物细胞中起作用的转录的方向、转录和转译起始调节区和编码如权利要求1所述的基本上纯的经修饰的腈水解酶的基因，其特征在于所述的腈水解酶对于作为底物的溴苯甲腈的比活性至少为约0.1微摩尔NH3/分/mg蛋白质。
8、如权利要求7所述的“表达盒”，其特征在于所述盒还含有右T-DNA边缘。
9、如权利要求7所述的“表达盒”，其特征在于所述转录和转译起始调节区在植物细胞中是有功能的。
10、如权利要求9所述的“表达盒”，其特征在于所述的转录和转译起始调节区是用于Opine的转录的调节区。
11、一种质粒，其特征在于它可稳定维持在包括“表达盒”的一个大肠杆菌或根癌病土壤杆菌，所述“表达盒”包括在植物细胞中具有功能的转录方向、转录和转译起始调节区和编码基本上纯的且对3，5-二卤代对羟基苯并腈基本专一的经修饰的腈水解酶，且所述腈水解酶对于作为底物的溴苯甲腈的比活性至少为约0.1微摩尔NH3/分/mg蛋白质。
12、如权利要求11所述的质粒，其特征在于所述“表达盒”包括右T-DNA边缘。
13、如权利要求11所述的质粒，其特征在于所述转录和转译起始调节区在植物细胞中是有功能的。
14、如权利要求13所述的质粒，其特征在于所述转录和转译起始调节区在Opine区是有功能的。
15、如权利要求14所述的质粒，其特征在于所述转录和转译起始调节区是mannopine合成酶起始调节区。
16、一种DNA顺序，其特征在于它包括编码对3，5-二卤代对羟基苯并腈基本专一的基本上纯的经修饰腈水解酶的“开放读码框架”，且所述酶对于作为底物的溴苯甲腈的比活性至少为0.1微摩尔NH3/分/mg蛋白质，该DNA顺序在5′或3′末端与其它野生型DNA结合。
17、如权利要求16所述的DNA顺序，其特征在于所述“开放读码框架”是细菌DNA。
18、如权利要求17所述的DNA顺序，其特征在于所述细菌DNA是克氏杆菌DNA。
19、一种植物细胞，其特征在于它包括权利要求7-9中任一项所述的“表达盒”。
20、一种植物部分，其特征在于它包括权利要求19所述的植物细胞。
21、一种植物，其特征在于它包括权利要求19所述的植物细胞。
22、一种生产对3，5-二卤代对羟基苯并腈专一的腈水解酶的方法，其特征在于它包括：
（1）分离可生产对所说的3，5-二卤代对羟基苯并腈专一的腈水解酶的臭鼻杆菌;
（2）在合适的培养基中使所说的臭鼻杆菌生长;和
（3）将所说的臭鼻杆菌进行溶菌并分离所说的腈水解酶。
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