CN1270636A - 编码羟苯基丙酮酸双加氧酶的dna序列及其于植物中的超量生产 - Google Patents
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Abstract
本文描述了一种通过超量表达一来源于大麦的植物HPPD基因而产生维生素E生物合成能力增强的植物的方法。
Description
本发明涉及的是一种通过把外源或内源HPPD基因在植物或植物部分中进行表达来产生维生素E含量提高的植物的方法。本发明进一步涉及把编码HPPD基因的相应核酸应用于转基因植物中以使后者对HPPD抑制剂具抗性，以及应用编码HPPD的DNA序列来产生一个用以鉴定HPPD抑制剂的检验***。
植物分子遗传学的一个重要目标就是产生糖、酶及氨基酸含量提高的植物。开发维生素含量提高，如维生素E含量提高的植物也同样具有经济意义。
具有维生素E活性的八种天然化合物都是6-色原烷醇(6-Chromanol)的衍生物(Ullmann′s Encyclopedia of Industrial Chemistry，Vol.A 27(1996)，VCH Verlagsgesellschaft，第4章，478-488，维生素E)。第一组(1a-d)是母育酚(tocol)的衍生物，第二组则由生育三烯酚(tocotrienol)的衍生物(2a-d)组成：
1a，α-生育酚： R1＝R2＝R3＝CH31b，β-生育酚[148-03-08]：R1＝R3＝CH3，R2＝H1c，γ-生育酚[54-28-4]：R1＝H，R2＝R3＝CH31d，δ-生育酚[119-13-1]：R1＝R2＝H，R3＝CH3 
2a，α-生育三烯酚[1721-51-3]：R1＝R2＝R3＝CH3
2b，β-生育三烯酚[490-23-3]：R1＝R3＝CH3，R2＝H
2c，γ-生育三烯酚[14101-61-2]：R1＝H，R2＝R3＝CH3
2d，δ-生育三烯酚[25612-59-3]：R1＝R2＝H，R3＝CH3
α-生育酚具有非常大的经济重要性。
通过组织培养或种子诱变及自然选择所获得的维生素E含量提高的作物，其发展有其局限性。一方面，维生素E含量必须尽早在组织培养时就能被监测到，另一方面，只有那些能够从细胞培养成功地再生为植株的植物才能通过组织培养技术来操作。再者，作物在经过诱变及筛选之后可能会表现出不合需求的特征，这些特征必须通过回交，在一些情形中通过反复的回交来消除。同样，通过杂交来提高维生素E含量也被局限于同种属的植物之内。
这些就是为什么遗传工程方法，即把编码维生素E合成的关键生物合成基因分离出来并特定地转移到作物中的方法，比传统培养方法更具优越性的原因。这一方法的条件是生物合成及其调控是已知的而且影响生物合成的基因已经被鉴定。
生育酚在植物及藻类中的生物合成方式是已知的，具体如下：
4-羟苯基丙酮酸 高龙胆酸
↓ ↓
δ-生育三烯酚(2d) δ-生育酚(1d)
↓ ↓
β-或γ-生育三烯酚→ β-或γ-生育酚
(2b or 2c) (1b or 1c)
↓ ↓
α-生育三烯酚(2a)——→α-生育酚 (1a)
生育酚芳香环的前体是对-羟苯基丙酮酸(3)，后者在羟苯基丙酮酸双加氧酶(hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD)的辅助下转变为高龙胆酸(4)，高龙胆酸与叶绿基焦磷酸盐反应脱去CO2获得前体(6)。生育三烯酚生物合成的路线启始于高龙胆酸(4)与香叶基香叶基焦磷酸盐之间的缩合反应，获得前体(5)。前体5或6的酶环化作用分别获得δ-生育三烯酚或δ-生育酚。这些生物合成酶中的一些已被分离出来。
在寻找Arabidopsis(阿布属)中有类胡萝卜素生物合成缺陷的突变体时，鉴定出无法产生活性HPPD的白化表型突变体。如果把这取名为pds 2的突变体在有高龙胆酸存在时进行培养，它将象野生型及绿叶植物一样，生产类胡萝卜素(Norris等人，Plant Cell(1995)7：2139-2149)。这一工作显示HPPD活性是生成具有光合作用活性的叶绿体的先决条件。没有这种酶就无法生成质体醌，在类胡萝卜素生物合成(八氢番茄红素去饱和作用)过程中需要由质体醌来充当被释放的还原相等物的受体。HPPD在质体新陈代谢中发挥有重要的作用，这一事实使其成为除草剂一个感兴趣的目标。Sulcotrione有效地抑制该酶的活性(Schultz等人，FEBS Lett.(1993)318：162-166)。
从下列生物体中已获知了HPPD特异性基因的序列：
| 生物体 | 序列名称 | 数据库访问号码 |
| 人 | HPPD_HUMAN | X 72389 |
| 猪 | HPPD_PIG | D 13390 |
| 鼠 | HPPD_RAT | M 18405 |
| 家鼠 | HPPD_MOUSE | D 29987 |
| Streptomycesavermitilis | SA11864 | U 11864 |
| PseudomonasSp.StrainP.J.874 | HPPD_PSESP | P 80064 |
| Arabidopsis | HPPD_ARAB 1 | AF 900228 |
| HPPD_ARAB 2 | U 89267 |
另外，下列的序列与HPPD序列有显著的同源性，它们于数据库中也可找到：
PEA3_MOUSE：Mus muscula(家鼠)PEA 3多肽，AC X 63190；
MELA_SHECO：Shewanella colwelliana，mel A蛋白，AC M59289；
WO96/38567描述了来源于Arabidopsis thaliana及Daucus carota的HPPD DNA序列。
知道HPPD的DNA序列是产生抗除草剂植物进行作物防护以及增加植物中维生素E合成，如生产维生素E含量提高的动物饲料的绝对的先决条件。
本发明的一个目标是开发一种维生素E含量提高的转基因植物。
本发明的进一步的目标是开发一种拮抗HPPD抑制剂的抗性转基因植物。
我们惊奇地发现这些目标可以通过在植物中超量表达HPPD基因来实现。
本发明的另外一个目标是开发一个用以鉴定HPPD抑制剂的检验***。
我们已经发现这一目标可以通过在一植物或微生物中表达一大麦HPPD基因然后检验化学物质对HPPD酶活的抑制作用来实现。
本发明的第一方面涉及的是通过分离HPPD基因特异的cDNA(HvSD 36)来克隆完整的大麦HPPD基因。
在叶子开始衰老的过程中，叶子中维生素E的含量显著提高(Rise等人，Plant Physiol.(1989)89：1028-1030)。大麦单子叶植物式的叶子显现出一个年龄不同的细胞的梯度，因为其叶子有基部***组织，新细胞通过连续***从这些组织形成。这样，最老的细胞位子叶子的尖端而最年轻的则位于基部。图1示出了播种后不同天数大麦初生叶的图解图。所量得的叶子的全长可以从左侧的标尺上看到。所示的标记为I-IV的是初生叶的叶片片段，它们分化到不同的程度并被选用于基因表达分析。植物是在每日的光/暗光同期(L/D)下培养的，为了诱发开始衰老，6天后把它们剪下来并于黑暗中培养2天(2nD)。对大麦初生叶分化到不同程度的片段的RNA进行“Northern印迹”分析，结果提示HPPD在大麦中的表达是以依赖于发育的形式被控制的。因此，在初生叶基部的***组织区域(I)有大约1600nt长的丰富的转录产物积累。这一转录产物的含量随着组织年龄的增加(IIa及IIb)而减少，并且在完全分化的含有成熟叶绿体的细胞(III)中重新提高。最终，1600nt长的转录产物的含量在初生叶的开始衰老截面(IV)最高。另外，在初叶基部的***组织细胞中可以检测到一个大约3100nt长的转录产物。同样，这一转录产物随着组织成熟程度的增加不再被检测到。
借助于所谓的“差别显示(Differential Display)”方法，首先分离出一个207 bp的cDNA片段，其相应的转录产物在暗诱导开始衰老的情形中聚集于大麦的初生叶中。随后把这一片段(序列方案：序列号：1：核苷位置1342-1549)用作探针从开始衰老的大麦旗叶的cDNA文库(于λ-ZAP-II中)分离出一个含有一个更长的***序列的cDNA克隆。
来源于λ-ZAP-II文库的cDNA亚克隆HvSD 36的图解图是：
把这一cDNA片段(序列方案：序列号：1：核苷位置771-1529)克隆到pBluescript(SK)的EcoRI剪切位点上。另外，在该cDNA的两端都装配一个14 bp的接头，这一序列是连接到λ-ZAP-II所必须的。图中示出了所选择的载体及cDNA本身的限制性位点。
在更进一步的实验中把这一759bp长的cDNA片段用作探针以获得HvSD6的完整序列。为此目的，已经准备了一个来源于五天龄大麦幼苗***组织截面RNA的cDNA文库。Pharmacia(Freiburg)的λ噬菌体ExCell Eco RICIP(产品号：27-5011，45.5kb)被用于这一cDNA文库。
分离出一个1565 bp长的cDNA克隆，看序列方案：序列号：1及2。
在数据库的序列中，长度为434个氨基酸的蛋白质序列与来源于Arabidopsis thaliana的HPPD序列的同源性最高，有58％的同源性。
为了找到一个含有完整的HPPD基因序列的基因组克隆，从Stratagene(Heidelberg)获得一大麦λFIXII文库(产品号946104)。这一文库是用冬大麦Cv.Igri的黄化叶DNA制备的。DNA用Sau 3AI进行部分酶解。在克隆到截体的Xhol剪切位点上之前，片段的末端及噬菌体臂都用核苷充满。第一轮对文库进行了200,000pfu的筛选，仅得到一个与cDNA HvSD6杂交的克隆。把这一重组噬菌体用PstI及SacI进行限制性酶解后，分别获得大小为5400、3800及1800bp的片段，这些片段在与HvSD6探针的“Southern”印迹杂交中可以被检测到。这些亚片段在Bluescript截体中是以被克隆的形式存在的。图3以图解图的形式示明了大麦HPPD基因的构成。
本发明具体涉及其序列编码HPPD或其功能相同物的表达***，以及应用这些表达***产生维生素E含量提高的植物。核酸序列可以是，例如，DNA或cDNA序列。适合于***到本发明的表达***中的编码序列有，例如，那些编码HPPD以及那些具使宿主超量表达维生素E的能力的序列。
另外，本发明的表达***含有调控性核酸序列，它支配编码序列在宿主细胞中的表达。根据一个优选的实施例，本发明的表达***包括上游，即编码序列的5′端，的一个启动子以及下游，即其3′端，的一个多腺苷酸化信号以及，如果合适，其他的调控元件，这些元件与位于其间的HPPD基因的编码序列是呈操作性连接的。操作性连接应被理解为使启动子、编码序列、终止子以及，如果适合，其它调控元件的安排顺序可以使所有的调控元件在编码序列被表达时都能完成其预期的功能。用于操作性连接的优选序列有，但不局限于，用于保证在非原质体、液泡、质体、线粒体、内质网、细胞核、脂质体或其它室区中的亚细胞定位的引导肽(targeting sequence)以及翻译增强子，如烟草花叶病毒的5′端前导序列(Gallie等人，Nucl.Acids Res.15(1987)8693-8711)。
例如，可以把植物表达***掺合到烟草转化载体pBinAR-Hyg中。图4所示的是带有35S启动子的烟草转化载体pBinAR-Hyg(A)以及带有种子特异的启动子云扁豆蛋白796(B)的pBinAR-Hyg
-HPT：潮霉素磷酸转移酶
-OCS：章鱼肉碱合酶终止子
-PNOS：胭脂碱合酶启动子
-同时示明的还有那些载体的单一性限制性位点。
原则上，所有可以控制外来基因在植物中表达的启动子都适合充当本发明表达***的启动子。具体地，植物启动子或来源于植物病毒的启动子是优选的。花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子(Frank等人，Cell 21(1980)285-294)是特别优选的。已知这一启动子含有各种不同转录效应子的识别序列，这些效应子联合导致导入基因的永久性、组成型表达(Benfey等人，EMBO J.8(1989)2195-2202)。
本发明的表达***可以另外含有一个化学诱导型的启动子，它可以控制外源HPPD基因在一个特定的时间点在植物中进行表达。可被使用的此类启动子有，例如PRP1启动子(Ward等人，Plant，Mol.Biol 22(1993)，361-366)，可被水杨酸诱导的启动子(WO95/19443)，可被苯磺胺药物诱导的启动子(EP-A 388186)，可被四环素诱导的启动子(Gatz等人，(1992)Plant J.Z，397-404)，可被脱落酸诱导的启动子(EP-A 335528)或者可被乙醇或环己酮诱导的启动子(WO93/21334)。
另外，特别优选的启动子是那些确保表达能够在那些维生素E或其前体于其中进行生物合成的组织或植物器官中进行的启动子。特别值得提及的启动子是那些能够保证叶子特异表达的启动子。值得一提的启动子是马铃薯胞质FBPase或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等人EMBO J.8(1989)2445-2455)。
在种子特异启动子的辅助下可以使一外来蛋白在转基因烟草的种子中稳定表达，其数量可达全部可溶性种子蛋白的0.67％以上(Fiedler及Conrad，Bio/Technology 10(1995)，1090-1094)。因此，本发明的表达***可以含有，例如，一个种子特异启动子(优选的是云扁豆蛋白(US 5504200)，USP(Baumlein，H等人Mol.Gen，Genet.(1991)225(3)，459-467)或LEB4启动子(Fiedler及Conrad，1995))，LEB4信号肽，待被表达的基因以及一个内质网固位信号。图4以示例的形式示出了这样一个表达***的构成。
本发明的一个表达***是这样制备的：把一个含有合适的HPPDDNA序列及优选地一个插于启动子及HPPD DNA序列之间并编码叶绿体特异转运肽的DNA的合适的启动子，以及一多腺苷酸化信号用常规的重组及克隆技术融合在一起。上述常规重组及克隆技术描述于，例如，T.Maniatis、E.F.Fritsch及J.Sambrook编著的Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)以及T.J.Silhary M.L.Berman及L，W.Enquist编著的Experiments With Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1984)以及Ausubel等人编著的Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc，and Wiley-Interscience(1987)。
特别优选的序列是那些能够保证导向进入非原生质、质体、液泡、线粒体、内质网，或者通过缺省合适的操纵序列，停留于形成的室区及细胞溶胶(Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)，285-423)，在内质网上的定位已被证明对蛋白在转基因植物中的数量积累是特别有利的(Schouten等人，Plant Mol.Biol.30(1996)，781-792)。
本发明还涉及其DNA序列编码HPPD融合蛋白的表达***，这一融合蛋白的一部分是一转运肽，它支配这一多肽的移位。特别优选的是叶绿体特异转运肽，它是在HPPD基因产物已被移位到叶绿体中之后从HPPD上被酶切下来的。特别优选的是来源于质体转酮醇酶(Plastidtransketolase，TK)的转运肽或其功能相等物(如核酮糖-1，5-二磷酸羟化/加氧酶(rubisco)小亚基或铁氧还蛋白NADP氧化还原酶的转运肽)。
编码HPPD的核苷***序列可以是人工合成的，也可以是天然的，或者是人工合成及天然DNA组分的混合物。通常有制备好的带有植物所优选的密码子的合成核苷序列。这些植物所优选的密码子可以从那些具有最高蛋白表达频率并在大多数感兴趣的植物种属中被表达的密码子中确定。在制备表达***时，可以对不同的DNA片段进行操作以获得一个可以以正确的方向阅读并具备有正确阅读框的核苷序列。为了使DNA片段相互连接，可以在片段上连接上接头。
可以沿着转录的方向给本发明的启动子及终止子有利地配置一个或多个接头，这接头可含有一个或多个限制性位点，用以***这一序列。经验上，接头含有1至10个，大部分情况下是1至8个，优选的是2至6个，限制性位点。通常，位于调控区内的接头的大小少于100bp，大多数少于60bp，但至少有5bp。本发明的启动子可以是宿主植物本身的或同源的，也可以是外来的或异源的。本发明的表达***沿着5′-3′转录方向含有本发明的启动子，任何需要的DNA序列以及一个转录终止区。各种不同的终止区可以根据需要相互交换。
另外也可以进行一些操作来提供合适的限制性位点或除去多余的DNA或限制性位点。当适合进行***、删除或置换，如转换及颠换时，可以使用体外诱变、引物修复、限制或连接等方法。
只要进行合适的操作，如限制、平整末端重叠处的
回缩或填充，就可以为片段提供互补的末端用于连接。
本发明能取得成功的重要之处在于连接了特异性的内质网固位信号SEKDEL(Schouten，A.等人，Plant Mol.Biol.30(1990)，781-792)，这使表达水平比平均值高3至4倍。在动植物蛋白质中天然存在的定位于内质网上的其它固位信号也可被用于构建表达***。
优选的多腺苷酸化信号是植物多腺苷酸化信号，优选的是那些本质上对应于根癌农杆菌T-DNA多腺苷酸化信号的，具体是Ti质体pTiACH5 T-DNA的基因3(章鱼肉碱合酶)(Gielen等人，EMBO J.3(1984)835页开始)或其功能相等物。
本发明的表达***可以包括，例如，一组成型启动子(优选的是CaMV 35S启动子)、LeB4信号肽、待被表达的基因以及内质网固位信号。优选的内质网固位信号是氨基酸序列KDEL(赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸)。
编码HPPD基因的融合表达***优选地被克隆到一载体，如pBin 19之上，这一载体适合于转化根癌农杆菌。用这一载体转化的农杆菌随后可以被以已知的方法用以转化植物，特别是作物，如烟草，例如可以通过把经过切割的叶子或叶子片段浸渍在农杆菌溶液中然后再把它们放在合适的培养基上培养来进行转化。用农杆菌进行植物转化的方法见于，例如，Transgenic Plants，第一卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung及R.Wu编著，Academic Press，1993，第15-38页中F.F.White的Vectors for Gene Transfer in Higher Plants。经过切割的叶子或叶子片段的被转化的细胞可以被以已知的方法用以再生、转基因植物，这些植物含有一个用以表达一个整合于本发明表达***中的HPPD基因的基因。
为了用一编码HPPD的DNA来转化宿主植物，把一本发明的表达***以***序列的形式掺合到一重组载体中，这一重组载体的载体DNA另外还含有功能性调控信号，如用于复制或整合的序列。合适的载体描述于，例如，“Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology”(CRC Press)，第6/7章，第71-119页(1993)。
使用上述的重组及克隆技术，可以把本发明的表达***克隆到允许它们复制的合适的载体，如大肠杆菌中。合适的克隆载体有，例如pBR332、pUC系列，M13 mp系列及pACYC 184。特别合适的是那些不仅能在大肠杆菌中复制，而且能在农杆菌中复制的二元载体。
本发明进而涉及把本发明的表达***用于转化植物、植物细胞、植物组织或植物器官。这一应用的优选目的是提高植物的维生素E含量。
根据所选择的启动子的不同，表达可以特定地发生于叶子、种子或其它植物器官中。本发明同时还涉及这些转基因植物、它们的繁殖材料、它们的植物细胞、植物组织及植物器官。
另外，本发明的表弹***也可以被用于对细菌、蓝藻、酵母菌、丝状真菌以藻类进行转化，以提高其维生素E产量。
把外来基因转移到植物基因组中称为转化。这一过程利用上述的把植物组织或植物细胞转化及再生为植物的方法来获得暂时的或稳定的转化。合适的方法有通过聚乙二醇诱导DNA的摄取进行转化、使用基因枪的弹道学方法-即所谓的“粒子轰击方法”、电穿孔、把干胚胎置于含有DNA的溶液中进行温育、微量注射以及农杆菌介导的基因转移。上述的方法描述于，例如，Transgenic Plants，第一卷，Engineering andUtilizotion，S.D.Kung及R.Wu编著，Academic Press(1993)第128-143页中的B.Jenes等人的Techniques for Gene Transfer以及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)第205-225页中。最好把待表达的基因构成克隆到一个适合转化根癌农杆菌的载体，例如pBin 19，之上(Bevan等人，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。
经由本发明表达***转化的农杆菌也可以被以已知的方法用于转化植物，特别是作物，如谷类、玉米、燕麦、大豆、大米、棉花、制糖甜菜、Canola、向日葵、亚麻、***、马铃薯、烟草、西红柿、含油种子油菜、紫花苜蓿、莴苣以及各种各样的树木、坚果及葡萄藤种属，例如可以通过把切割后的叶子或叶子片段浸渍到农杆菌溶液中然后再把它们培养在合适的介质中进行转化。
根据本发明，编码HPPD基因的功能相等序列是那些虽然含有不同的核苷序列但却具有所需功能的序列。因此，功能相等物包括那些此处所述的序列的天然突变体以及人工的核苷序列，如通过化学合成的适应于植物密码子选择的人工核苷序列。
功能相等物也可以被理解为，具体而言：原来通过提取获得的编码HPPD的序列的天然或人工的突变体，这些突变体仍具有所需的功能。突变包括置换、添加、删除、颠换或***一个或多个核苷残基。因此，本发明还包括通过对此处所述的核苷序列进行修饰以后所获得的那些核苷序列。这类修饰的目的在于，例如，对包含于其中的编码序列进行进一步的限制，或者，例如***另外的限制性酶酶切位点。
功能相等体还包括那些与起始基因或基因片段相比较，功能更加显著或比较不显著的突变体。
其它合适的还有那些只要能够如上所述通过在作物中超量表达HPPD基因而使植物中维生素E含量提高的人工DNA序列。这种人工DNA序列以通过，例如，通过分子模拟辅助构建的具有HPPD活性的蛋白质的反向翻译，或者体外筛选进行确定。特别合适的是通过根据宿主植物特定的密码子选择把多肽序列反向翻译所获得的编码DNA序列。特定的密码子选择可以被一熟悉植物遗传方法的专家通过对待转化的植物的其它已知基因的计算机评估容易地获得。
值得提及的本发明的其它合适的核酸序列相等物还有：编码融合蛋白的序列，这一融合蛋白的一个组分是一植物HPPD多肽或其功能相等物部分。融合蛋白的第二部分可以是，例如，一个具有酶活性的多肽或是一抗原性多肽序列(如myc-tag或his-tag)，在上述序列的辅助下可以检测HPPD的表达。然而，这优选的是一调控蛋白序列，如，一信号肽或转运肽，它可以把HPPD蛋白引导到所需的作用位点。
然而，本发明还涉及一转运肽及一已根据本发明进行生产的具有HPPD活性的多肽的表达产物及融合产物。
提高维生素E含量，根据本发明的目的，指的是通过HPPD基因在植物中进行功能性超量表达所人工获得的，与未经基因工程改造的植物至少可以持续一代植物的提高的维生素E生物合成能力。
维生素E生物合成的位置通常是叶片组织，所以HPPD基因在叶片进行特异表达是有利的。然而应该理解的是，维生素E生物合成并不一定要局限于叶片组织，它也可以在植物的其它器官，如含脂肪的种子，中以组织特异的形式进行。
另外，外源HPPD基因的组成型表达是有利的。另一方面，诱导型表达也是合乎需求的。
通过转基因表达的HPPD基因的表达效力可以例如在体外通过幼苗***组织繁殖来确定。另外，HPPD基因表达的本质及水平的变化及其对试验植物维生素E生物合成的影响，可以通过温室实验进行试验。
本发明进而涉及用本发明表达***转化的转基因植物，以及这类植物的转基因细胞、组织、器官及繁殖材料。于本发明中特别优选的是转基因作物，如大麦、小麦、黑麦、玉米、燕麦、大豆、大米、棉花、制糖甜菜、Canola、向日葵、亚麻、***、马铃著、烟草、西红柿、含油种子油菜、紫花苜蓿、莴苣以及各种各样的树木、坚果及葡萄藤种属。
用于本发明目的的植物可以是单子叶或双子叶植物，或者藻类。
如上面已经述及，HPPD是Sulcotrione类型除草剂的合适目标。考虑到可能存在更有效的HPPD抑制剂，必须提供一个可供抑制剂/酶结合研究使用的合适的试验***。为此目的，例如，把完整的大麦HPPD cDNA序列克隆到一表达载体(pQE，Qiagen)中并于大肠杆菌中超量表达。
在本发明表达***的辅助下表达的HPPD蛋白特别适合用于发现HPPD特异的抑制剂。
为此目的，例如，可以把HPPD用于酶化验，确定在待测活性物质存在及不存在时HPPD活性的变化。通过对两次所确定的活性进行比较就可以获得待测活性物质抑制行为上一些质量及数量上的证据。
使用本发明的试验***可以快速简单地对大量的化学物质进行筛选，确定其除草特性。用这一方法可以从大量的物质中有目的地、可重复地筛选出高效价的物质以便随后对其进行更深入的试验，这些试验都是业内行家所熟悉的。
本发明进而涉及可以用上述试验***进行鉴定的除草剂。
把编码HPPD的基因序列(序列号：1)在植物中进行超量表达可使植物对HPPD抑制剂的抗性提高。本发明同时也涉及如此产生的转基因植物。
本发明进而还涉及：-转化植物的方法，包括把本发明的表达***导入植物细胞、愈伤组织、整株植物或植物原生质体之中。-植物在产生植物HPPD中的应用。-通过本发明DNA序列的更高效表达，用本发明的表达***来产生对HPPD抑制剂抗性增强的植物。-本发明的表达***，通过在植物中表达本发明的DNA序列产生维生素E含量提高的植物中的应用。-用本发明的表达***来产生一个用以鉴定HPPD抑制剂的测试***。
下面以实施例来对本发明进行解释，但这些实施例并非本发明的局限：通用克隆方法
在本发明范围内所进行的克隆步骤，如限制性酶切、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段纯化、把核酸转移到硝酸纤维及尼龙膜上、DNA片段连接、大肠杆菌细胞转化、细菌培养、噬菌体增殖以及重组DNA的序列分析，都是根据Sambrook等人(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress；ISBN 0-87969-309-6中所描述的方法进行的。
下面使用的细菌菌株(大肠杆菌、XL-I Blue)来自Stratagene，NP66则来自Pharmacia。用以转化植物的农杆菌菌株(根癌农杆菌，C58C1，带有质粒pGV 2260或pGV 3850 Kann)是Deblaere等人所描述的(Nucl.Acids Res.13(1985)4777)。作为替代，也可以使用农杆菌菌株LBA4404(Clontech)或其它合适的菌株。可被用于克隆的载体有pUC19(Yanish-Perron，Gene 33(1985)，103-109)、pBluescript SK-(Stratagene)，pGEM-T(Promega)、pZerO(Invitrogen)、pBin19(Bevan等人，Nucl.Acids Res.12(1984)，8711-8720)以及pBinAR(Hofgen及Willmitzer，Plant Science 66(1990)212-230)。
重组DNA的序列分析
根据Sanger所描述的方法(Sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74(1977)，5463-5467)用-Licor生产的激光荧光DNA测序仪(MWG Biotech，Ebersbach有售)对重组DNA分子进行测序。植物表达***的制备
在质粒pBin19(Bevan等人，Nucl.Acids Res.(1984)12，8711)中***-35S CaMV启动子，这-启动子是-EcoRI-KpnI片段，对应于花椰菜花叶病毒核苷酸6909-7437(Franck等人，Cell 21(1980)285)。Ti质粒pTiACH5(Gielen等人，EMBO J.3(1984)835)的T-DNA基因3的多腺苷酸化信号(核苷11749-11939)是以PvuII-Hind III片段的形式被分离的，在加上SphI接头后被克隆到载体pBmAR-Hyg的SpHI-Hind III酶切位点之间的Pvu II酶切位点上。这样就获得质粒pBinAR(Hofgon及Willmitzer，Plant Science 66(1990)221-230)。使用实施例实施例1.HPPD特异的cDNA序列的分离
借助于Liang及Pardee的DDRT-RCR方法(Science(1992)257，967-972)，把在L/D光周期(光照16小时/黑暗8小时)下培养9天的大麦的初生叶mRNA种群的组成与培养11天(9天培养，随后进行2天的暗处理以诱导开始衰老)的大麦的初生叶的进行了比较(Humbeck及Krupinska，J.Photochem、Photobiol.36(1996)，321-326)。在每一情形中，用“Superscript RT”酶(Gibco BRL，Eggenstein)把0.2μg的总RNA转变为cDNA。除了RNA以外，每一反应批次(20μl)还含有20μM dNTPs，10μM DTT，1xRT缓冲液以及1μM(dT)12VN引物。这些反应所需的锚定“引物”(anchor“primers”)是根据Liang及Pardee的数据合成的：1. 5′-TTTTTTTTTTTTAG-3′2. 5′-TTTTTTTTTTTTCA-3′3. 5′-TTTTTTTTTTTTAC-3′4. 5′-TTTTTTTTTTTTGT-3′
在cDNA已被合成之后，把每一情形中的有关序列都进行10批次的扩增，分别使用下列的不同的随机“引物”：1. 5′-TACAACGAGG-3′ 2. 5′-GGAACCAATC-3′3. 5′-AAACTCCGTC-3′ 4. 5′-TGGTAAAGGG-3′5. 5′-CTGCTTGATG-3′ 6. 5′-GTTTTCGCAG-3′7. 5′-GATCTCAGAC-3′ 8. 5′-GATCTAACCG-3′9. 5′-GATCATGGTC-3′ 10.5′-GATCTAAGGC-3′
在每一情形中的20μl体积中，每一PCR反应批次含有1xPCR缓冲液，2μM dNTPs，2.5μCi(α33P)-dATP，1μM(dT)12VN-“引物”，1/10体积的RT混合液(Sambrook等人，Molecular Cloning-ALaboratory Manual，1989)，1单位Taq DNA聚合酶(Boehringer，Mannhein)以及1μM 10-mer的随机“引物”。在-Unoblock(Biometra)中进行PCR反应，程序如下：
1. 94℃ 2分钟
2. 94℃ 30秒
3. 40℃ 2分钟
4. 72℃ 30秒
5. 72℃ 5分钟
6. 4℃ 保存，直到进一步处理
步骤2、3、4连续进行40次。这样每次反应及“引物”结合大约可以获得100条cDNA。
不同于Liang及Pardee的方案的是，扩增后的cDNA片段是用非变性聚丙烯酰胺凝胶进行分离的，凝胶组成如下：6％(v/v)丙烯酰胺(Long Ranger，AT Biochem)，1.2xTBE缓冲液、0.005％(v/v)TEMED以及0.005％(w/v)APS(Bauer等人，Nucl.Ac.Res.(1993)21，4272-4280)。
在每种情形中，每一PCR批次的3.5μl分别用2μl的上样缓冲液(dye II，Sambrook等人，1989)处理，然后上样到凝胶上。为了确定cDNA条带样式(图5)的重复性，从九天龄及十一天龄的大麦初生叶分别制备两份独立的RNA样品，平等用于如下分析。所示的是两个不同引物结合(A和B)的结果；作为举例，用箭头强调了九天龄与十一天龄样品之间条带样式的两处区别。随后在凝胶分析时只对那些在两份来源于开始衰老植物的样品中均出现，而在对照样品中不出现的条带加以考虑。电泳是在40瓦(0.8瓦/厘米3)、1xTBE缓冲液中进行的，时间2.5小时。在cDNA片段已经分离开来之后，把凝胶转移到滤纸(Schleicher & Schull，Dassel)上。在凝胶于50℃干燥之后，把一X光胶片置于其上。用一手术刀片把仅出现于样品11及11′的放射自显影相片中的cDNA条带从干胶上切下，并用100μl 1xTE缓冲液沸煮洗脱。经过乙醇沉淀的DNA用10μl的水重悬以供进一步测试之用。用这一批次所用的“引物”对DNA重新进行扩增，然后再把其克隆、测序并用作Northern印迹杂交的探针。
为了测试有关的cDNA是否真的是开始衰老特异(seneszenzspezifisch)的转录产物，把它与来源于不同发育阶段的叶片的RNA进行杂交：A.1.来源于在L/D光周期中培养9天的植物的初生叶的RNAA.3.来源于10天龄(第10天无光照)植物的初生叶的RNAA.4.来源于11天龄(第10及11天无光照)植物的初生叶的RNAA.5.来源于12天龄(2天黑培养后再行光照)植物的初生叶的RNA
在每一情形中，用于RNA分析的样品是在原始暗期的中间收集的。B.来源于在七个不同时间点从田间收集的旗叶的RNA(图6)。这些
叶子在5月29日已经完全长大，在6月21日其叶绿素含量仅为初
始的10％弱。在图6中用箭头示明了开始衰老过程的起始点(即从6月
15日达到全长算起17天之后)。开始衰老的起始点被定义为光***II
效力下降的时间点(Humbeck等人，Plant Cell Environment
(1996)19：337-344)。
为了使滤纸与上述的RNA样品进行杂交，除了使用HPPD探针之外，为了比较，还使用了编码核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基的rbcS基因的特异性探针。图6所示的是用cDNA HvSD 36以及rbcS基因特异探针与“Northern印迹”A和B的杂交。滤纸A携带有来源于，在L/D光周期下生长9天(9)、再于黑暗中分别培养1及2天(10，11)以及随后再回到光照条件1天(12)的大麦初生叶的RNA。滤纸B含有来源于从1992年5月29日至6月21日从田间收集的旗叶的RNA。箭头标示了开始衰老起始点6月15日。从图6可以看出，rbcS特异的mRNA数量多，而HPPD特异的mRNA则相对较少。在9天龄植物的初生叶中，HPPD特异的mRNA在转移到黑暗中之前是检测不到的，但在暗期中则有显著的积累。当对植物恢复光照时，这一mRNA的数量显著减少。在旗叶中，在长到全长且未开始衰老的叶子中就已经可检测到少量的HPPD特异mRNA。早在开始衰老真正开始的4天前，表达水平更高。这一mRNA的最大数量出现于开始衰老的叶子中。把这一用cDNA探针HvSD36检测到的转录产物(S：序列；d：黑暗，DDRT凝胶中第36号片段)与已知的RNA种属进行大小的比较，显示其长度大约为1.6Kb。
采用DDRT-PCR获得三个相互独立的cDNA片段，它们都显示这一样式而且其序列分析也表明它们确实代表同-转录产物。最长片段的大小为230bp。最后用“Sure CloneTM Ligaion Kit”(Pharmacia，Freiburg)，参照制造商的使用说明，把230 bp长的PCR产物克隆到载体pUC18的SmaI酶切位点上。把重组质粒转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中。由于因为方法学的原因，这一片段仅对应于相关转录产物的3′端，所以其序列信息开始时并不足以鉴定出数据库中与其有明确同源性的序列。为了分离出更大的相应的cDNA，用230bp长的片段作为探针筛选了开始衰老旗叶RNA的一个λZAPII文库(Stratagene，Heidelberg)。进行这一步骤时，参照“DNA Labeling and Detection Kit”(Boehringer，Mannheim)的使用说明用Dig-dUTP对探针进行标记。参照“ZAP-cDNA Synthesis Kit”(Stratagene，Heidelberg)的方案对文库进行检验。
对此处所述的探针进行了150,000pfu的检验。其中有39个噬菌斑呈阳性，对其中的12个噬菌体菌落进一步进行实验。在制备噬菌体之后，***的片段通过PCR进行扩增并通过电泳进行分离。用HvSD 36探针进行Southern印迹杂交可以从经过如上处理的12个噬菌体菌落中挑选出含有最长的阳性“***序列”的噬菌体菌落。在重新划平板之后，把噬菌体进一步进行杂交。把单一的噬菌斑切下来并洗脱，然后参照Stratagene的方案用一辅助噬菌体对其进行体外剪切(ExassitTM Interference-Resistant Helper Phage With SOLRTM Strain)。经过上述处理后获得的所谓的“phagemids”含有克隆于pBlueskript(SK-)中的cDNA。
随后进行质粒的制备，然后再用EcoRI从Blueskript(SK-)上把相关的“***序列”剪切下来。用HvSD 36获得的cDNA含有一长度大约为800bp的***序列。用“Sequi Therm Excel Long-Read DNA-Sequenzierangs-Kit”(Epicentre Technologies，Biozym Diagnostic，Oldendorf)以及结合到Blueskript载体上序列区的用IRD41标记的通用引物测定了cDNA的完整的序列。用Licor生产的自动测序仪4000L的红外激光对DNA片段进行监测。测序之后，每一种情形中都存在有一长度刚好为759bp的序列，该序列的两端都连接有-14bp长的接头。这些接头被用于在构建cDNA文库时把cDNA片段连接到噬菌体λZAPII(Stratagene，Heidelburg)的臂上。
在数据库的序列中，含有180多个氨基酸的蛋白质序列HvSD 36与人HPPD的序列同源性最高达41％。考虑到用“Northern印迹”所检测到的转录产物的长度(大概1600nt)可以推定，这一cDNA仍缺少850-900bp。
为了获得一完整的cDNA，我们构建了另一cDNA文库。在“Dynabeads”(Dynal，Hamburg)的辅助下从五天龄大麦幼苗的基部***组织区提取mRNA并用“Time Saver cDNA Synthese Kit”(Pharmacia，Freiburg)把其转录为cDNA，然后在cDNA上连接上EcoRI/NotI连接物(Pharmacia，Freiburg)并把其连接到λExcell载体(Pharmacia，Freiburg)上。最后，在“Gigapack II Gold Set”(Stratagene，Heidelburg)的辅助下把重组噬菌体DNA包装成噬菌体蛋白。用759 bp长的HvSD 36探针进行了400,000pfu的筛选，检测到5个噬菌体。参照Pharmacia(Freiburg)的使用说明在细菌菌株NP66的辅助下把“phagemids”从噬菌体中剪切下来。从细菌个体菌落中分离出重组pExCell质粒并把其转移到细菌菌株D115α中进行繁殖。
如此分离得到的最长的cDNA克隆HvSD36长度为1565bp，其序列得到完整的测定(看序列表)。实施例2.基因组序列性质确定
为了鉴定含有HPPD基因序列的基因组克隆，从Stratagene(Heidelberg)获得一大麦的λFIXII文库。这一文库是用冬大麦CV、Igri的白化叶DNA制备的。这一DNA是经过Sau 3AI部分酶解的。在把其克隆到载体的XhoI剪切位点之前，片段的两端以及噬菌体的臂都用核苷充满。对文库进行第一轮200,000pfu的筛选，仅获得一个与cDNAHvSD36杂交的克隆。用PstI及SacI对这一重组噬菌体进行限制性酶解，然后分离获得长度为5400、3800、1800bp的片段，这些片段可用HvSD36探针通过“Southern”印迹杂交检测到。这些亚片段在Bluescript载体中以被克隆的形式存在。
文库的筛选是参照HybondN膜的方案进行的。用Klenow酶，用32P-dATP对探针进行“random priming”扩增以对其进行标记，以供文库筛选以及“Southern”印迹杂交之用(Sambrook等人(1989)Molecular Cloning.A laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory，New York)。
用大麦(Carina)的总DNA进行基因组“Southern印迹”(图7)。在每一情形中，用BamHI(B)，EcoRI(E)，HindIII(H)或XBAI(X)对15μgDNA进行酶解然后用0.75％的琼脂糖凝胶对其进行分离。在转移到Hybond N+膜(Amersham，Braunschweig)之后，参照膜生产商的使用说明用759 bp长的HvSD 36不完全cDNA探针进行杂交，并检测到以下片段：BamHI：6.0，3.9及3.0Kbp.EcoRI：＞10KbpHindIII：8.3，2.6，1.1及1.0KbpXbaI：9.0，5.2及4.2Kbp
片段的长度是通过与-DNA大小标准物(Kb-Leiter，GibcoBRL，Eggenstein)进行比较而估计的。实施例3.HvSD蛋白序列的同源性比较
把HvSD 36蛋白序列与数据库中的蛋白质序列进行比较，发现它与到目前为止已知的下列蛋白质序列具同源性：
10 20 30 40 50HPPD_Hv .......... .......... .......... ........MP PTPTTPAATGHPPD_Ath .......... .......... .......... ...MGHQNAA VSENQNHDDGHPPD_HUMAN .......... .......... .......... .......... ..........HPPD_RAT .......... .......... .......... .......... ..........HPPD_PIG .......... .......... .......... .......... ..........HPPD_MOUSE .......... .......... .......... .......... ..........HPPD_PSESP .......... .......... .......... .......... ..........MELA_SHECO .......... .......... .......... .......... ..........PEA3_MOUSE MTKSSNHNCL LRPENKPGLW GPGAQAASLR PSPATLVVSS PGHAEHPPAA
60 70 80 90 100HPPD_Hv AAAAVTPEHA RPHRMVRFNP RSDRFHTLSF HHVEFWCADA ASAAGRFAFAHPPD_Ath AASSPGFKLV GFSKFVRKNP KSDKFKVKRF HHIEFWCGDA TNVARRFSWGHPPD_HUMAN M TTYSDKGAKP ERGRFLH--F HSVTFWVGNA KQAASFYCSKHPPD_RAT YWDKGPKP ERGRFLH--F HSVTFWVGNA KQAASFYCNKHPPD_PIG M TSYSDKGEKP ERGRFLH--F HSVTFWVGNA KQAASYYCSKHPPD_MOUSE M TTYNNKGPKP ERGRFLH--F HSVTFWVGNA KQAASFYCNKHPPD_PSESP ADLYENP MGLMGFEFIE LASPTPNTLEMELA_SHECO MASEQNP LGLLGIEFTE FATPDLDFMHPEA3_MOUSE PAQTPGPQVS ASARGPGPVA GGSGRMERRM KGGYL---DQ RVPYTFCSKS
110 120 130 140 150HPPD_Hv LGAPLAARSD LSTGNSAHAS QLLRSGSLAF LPT--APYAN G-CDAA----HPPD_Ath LGMRFSAKSD LSTGNMVHAS YLLTSGDLRF LFT--APYSP S-LSAGEIKPHPPD_HUMAN MGFEPLAYRG LETGSREVVS HVIKQGKIVF VLS--SA--- -------LNPHPPD_RAT MGFEPLAYKG LETGSREVVS HVIKQGKIVF VLC--SA--- -------LNPHPPD_PIG IGFEPLAYKG LETGSREVVS HVVKQDKIVF VFS--SA--- -------LNPHPPD_MOUSE MGFEPLAYRG LETGSREVVS HVIKRGKIVF VLC--SA--- -------LNPHPPD_PSESP PIFEIMGFTK VATHRSKDV- HLYRQGAINL ILN--NE--- ----------MELA_SHECO KVFIDFGFSK LKKHKQKDI- VYYKQNDINF LLN--NE--- ----------PEA3_MOUSE PGNGSLGEAL MVPQGKLMDP GSLPPSDSED LFQDLSHFQE TWIAEAQVPD
160 170 180 190 200HPPD_Hv --TASLPSFS ADAARRFSAD HGIAVRSVAL RVADAAEAFR ASRRRGARPAHPPD_Ath TTTASIPSFD HGSCRSFFSS HGLGVRAVAI EVEDAESAFS ISVANGAIPSHPPD_HUMAN --------WN KEMGDHL-VK HGDGVKDIAF EVEDCDYIVQ KARERGAKIMHPPD_RAT --------WN KEMGDHL-VK HGDGVKDIAF EVEDCEHIVQ KARERGAKIVHPPD_PIG --------WN KEMGDHL-VK HGDGVKDIAF EVEDCDYIVQ KARERGAIIVHPPD_MOUSE --------WN KEMGDHL-VK HGDGVKDIAF EVEDCDHIVQ KARERGAKIVHPPD_PSESP ---------P HSVASYFAAE HGPSVCGMAF RVKDSQKAYK RALELGAQPIMELA_SHECO ---------K QGFSAQFAKT HGPAISSMGW RVEDANFAFE GAVARGAKPAPEA3_MOUSE SDEQFVPDFE ---SENLAFH SPTTRIKKEP QSPRTDPALS CSRKPPLPYH
210 220 230 240 250HPPD_Hv FAPV------ -----DLGRG FAFAEVELYG --DVVLRFVS HP--DG--TDHPPD_Ath SPPI------ -----VLNEA VTIAEVKLYG --DVVLRYVS YKAEDT--EKHPPD_HUMAN REP------- -WVEQDKFGK VKFAVLQTYG --DTTHTLVE KMN-----YIHPPD_RAT REP------- -WVEEDKFGK VKFAVLQTYG --DTTHTLVE KIN-----YTHPPD_PIG REEVC-CAAD VRGHHTPLDR AR----QVWE --GT---LVE KMT-----FCHPPD_MOUSE REP------- -WVEQDKFGK VKFAVLQTYG --DTTHTLVE KIN-----YTHPPD_PSESP HI-------- ----ETGPME LNLPAIKGIG --GAPLYLID RFGEGSSIYDMELA_SHECO AD-------- ----EV--KD LPYPAIYGIG --DSLIYFID TFGDDNNIYTPEA3_MOUSE HGEQCLYSRQ IAIKSPAPGA PGQSPLQPFS RAEQQQSLLR ASSSSQSHPG
260 270 280 290 300HPPD_HV VPFLPGFEGV TNPDA----- VDYGLTRFDH VVGNVP--EL -APAAAYIAGHPPD_Ath SEFLPGFERV EDASSF---P LDYGIRRLDH AVGNVP--EL -GPALTYVAGHPPD_HUMAN GQFLPGYEAP AFMDPLLPKL PKCSLEMIDH IVGNQPDQEM -VSASEW---HPPD_RAT GRFLPGFEAP TYKDTLLPKL PSCNLEIIDH IVGNQPDQEM -ESASEW---HPPD_PIG LDSRPQPSQT LLHRLLLSKL PKCGLEIIDH IVGNQPDQEM -ESASQW---HPPD_MOUSE GRFLPGFEAP TYKDTLLPKL PRCNLEIIDH IVGNQPDQEM -QSASEW---HPPD_PSESP IDFV--FLEG VDRHPVGA-- ---GLKIIDH LTHNVYRGRM -A---YWANFMELA_SHECO SDF-----EA LDEPIITQ-- -EKGFIEVDH LTNNVHKGTM -E---YWSNFPEA3_MOUSE HGYLGEHSSV FQQPVDMCHS FTSPQGGGRE PLPAPYQHQL SEPCPPYPQQ
310 320 330 340 350HPPD_Hv FT---GFHEF AEFTAEDVGT TESGLNSVVL ANNSEGVLLP LNEPVHGTKRHPPD_Ath FT---GFHQF AEFTADDVGT AESGLNSAVL ASNDEMVLLP INEPVHGTKRHPPD_HUMAN YLKNLQFHRF WSVDDTQVHT EYSSLRSIVV ANYEESIKMP INEPAPG-KKHPPD_RAT YLKNLQFHRF WSVDDTQVHT EYSSLRSIVV ANYEESIKMP INEPAPG-RKHPPD_PIG YMRNLQFHRF WSVDDTQIHT EYSALRSVVM ANYEESIKMP INEPAPG-KKHPPD_MOUSE YLKNLQFHRF WSVDDTQVHT EYSSLRSIVV TNYEESIKMP INEPAPG-RKHPPD_PSESP YEKLFNFREI RYF---DIKG EYTGLTSKAM TAPDGMIRIP LNE--ESSKGMELA_SHECO YKDIFGFTEV RYF---DIKG SQTALISYAL RSPDGSFCIP INE--GKGDDPEA3_MOUSE NFKQ-EYHDP LYEQAGQPAS SQGGVSGHRY PGAGVVIKQE RTDFAYDSDV
360 370 380 390 400HPPD_Hv RSQIQTFLEH HGGPGVQH-I AVASSDVLRT LRKMRARSAM GGFDFLPPPLHPPD_Ath KSQIQTYLEH NEGAGLQH-L ALMSEDIFRT LREMRKRSSI GGFDFMPSPPHPPD_HUMAN KSQIQEYVDY NGGAGVQH-I ALKTEDIITA IRHLRER--- -GLEFLSVP-HPPD_RAT KSQIQEYVDY NGGAGVQH-I ALRTEDIITT IRHLRER--- -GMEFLAVP-HPPD_PIG KSQIQEYVDY NGGAGVQH-I ALKTEDIITA IRSLRER--- -GVEFLAVP-HPPD_MOUSE KSQIQEYVDY NGGAGVQH-I ALKTEDIITA IRHLRER--- -GTEFLAAP-HPPD_PSESP AGQIEEFLMQ FNGEGIQH-V AFLSDDLIKT WDHLKSI--- -GMRFMTAPPMELA_SHECO RNQIDEYLKE YDGPGVQH-L AFRSRDIVAS LDAMEGS--- -SIQTLDIIPPEA3_MOUSE PGCASMYLHP EGFSGPSPGD GVMGYGYEKS LRPFPDDVCI VPKKFEGDIK
410 420 430 440 450HPPD_Hv PKYYEGVRRL AGD--VLSEA QIKECQELGV LVDRDDQG-- --VLL-----HPPD_Ath PTYYQNLKKR VGD--VLSDD QIKECEELGI LVDRDDQG-- --TLL-----HPPD_HUMAN STYYKQLREK LKTAKIKVKE NIDALEELKI LVDYDEKG-- --YLL-----HPPD_RAT SSYYRLLREN LKTSKIQVKE NMDVLEELKI LVDYDEKG-- --YLL-----HPPD_PIG FTYYKQLQEK LKSAKIRVKE SIDVLEELKI LVDYDEKG-- --YLL-----HPPD_MOUSE SSYYKLLREN LKSAKIQVKE SMDVLEELHI LVDYDEKG-- --YLL-----HPPD_PSESP DTYYEMLEGR LPN----HGE PVGELQARGI LLDGSSESGD KRLLL-----MELA_SHECO E-YYDTIFEK LPQ----VTE DRDRIKHHQI LVDGDEDG-- --YLL-----PEA3_MOUSE QEGIGAFREG PPYQR----- -RGALQLWQF LVALLDDPTN AHFIAWTGRG
460 470 480 490 500HPPD_Hv QIFTKPVGDR PTLFLEMIQR IGCMEKDERG EE----YQKG GCGGFGKGNFHPPD_Ath QIFTKPLGDR PTIFIEIIOR VGCMMKDEEG KA----YOSG GCGGFGKGNFHPPD_HUMAN QIFTKPVQDR PTLFLEVIQR HNHQ------ ---------- ---GFGAGNFHPPD_RAT QIFTKPMQDR PTLFLEVIQR HNHQ------ ---------- ---GFGAGNFHPPD_PIG QIFTKPMQDR PTVFLEVIQR NNHQ------ ---------- ---GFGAGNFHPPD_MOUSE QIFTKPMQDR PTLFLEVIQR HNHQ------ ---------- ---GFGAGNFHPPD_PSESP QIFSETLMGP --VFFEFIQR -----KGDD- ---------- ---GFGEGNFMELA_SHECO QIFTKNLFGP --IFIEIIQR -----KNNL- ---------- ---GFGEGNFPEA3_MOUSE MEFKLIEPEE VARLWGIQKN RPAMNYDKLS RSLRYYYEKG IMQKVAGERY
510 520 530 540 550HPPD_Hv --------SE LFK-SIE-DY --EKS--LEA KQSAAV-QGSHPPD Ath --------SE LFK-SIE-EY --EKT--LEA KQLVGHPPD HUMAN --------NS LFK-AFEEEQ --NLRGNLTN METNGVVPGMHPPD RAT --------NS LFK-AFEEEQ --ALRGHPPD_PIG --------NS LFK-AFEEEQ --ELRGNLTD TDPNGVPFRLHPPD_MOUSE --------NS LFK-AFEEEQ --ALRGNLTD LEPNGVRSGMHPPD_PSESP --------KA LFE-SIERDQ --VRRGVLST -DMELA_SHECO --------KA LFE-SIERDQ --VRRGVLPEA3_MOUSE VYKFVCEPEA LFSLAFPDNQ RPALKAEFDR PVSEEDTVPL SHLDESPAYL
560 570HPPD_HvHPPD_AthHPPD_HUMANHPPD_RATHPPD_PIGHPPD_MOUSEHPPD_PSESPMELA_SHECOPEA3_MOUSE PELTGPAPPF GHRGGYSY名词：HPPD-Hv：Hordeum vulgare 4-羟苯基丙酮酸双加氧酶(HvSD 36)HPPD-Ath：Arabidopsis thaliana 4-羟苯基丙酮酸双加氧酶HPPD-HUMAN：H.Sapiens 4-羟苯基丙酮酸双加氧酶HPPD-PIG：猪4-羟苯基丙酮酸双加氧酶HPPD-RAT：鼠F异型抗原HPPD-MOUSE：家鼠4-羟苯基丙酮酸双加氧酶MELA-SHECO：S.colwelliana melA蛋白HPPD-PSESP：Pseudomonas sp.(P.J.874菌株)4-羟苯基丙酮酸
双加氧酶PEA3-MOUSE：Mus musculus(家鼠)PEA3多肽
同源性最高的是Arabidopsis序列，整个序列的同源性达58％(412个氨基酸的同源性为62％)，接下来是HPPD_RAT，为35％(365个氨基酸的比较)，HPPD-HUMAN，为34％(365个氨基酸的比较)，以及HPPD-MOUSE，为34％(371个氨基酸的比较)。实施例4大麦(Hordeum vulgare)的培养
在一个环境可控的箱体，即所谓的Mitscherlich pots中，用控制的条件，在每升含有4克Osmocote 5M(Urania，Hamburg，Germany)的土壤中培养大麦幼苗(Hordeum Vulgare L.CV.Carina，AckermannSaatzucht，Irbach，Germany)15天。为了使生长均匀进行，把种子放在湿润的滤纸上萌芽，4℃2天，21℃1天，只种植那些初生根纵向生长相同的幼苗。把这种幼苗转移到土壤中之后，给它们覆盖1.5cm厚的经过筛选的土壤。此后，把植物培养9天，光照16小时(120μm·m-2·S-1)，黑暗8小时，结合温度变换(白天21℃，晚上16℃)。9天之后，在上述的温度把植物在黑暗中保存2天(第10及11天)以诱导其开始衰老。实施例5烟草的培养
烟草是参照已知的方法进行培养的。所用的烟草栽培品种为Nicotiana tabacum cv.Xanthi。实施例6烟草的转化
把含有HPPD基因序列1的本发明的表达***克隆到载体pBinAR-Hyg中(图4)。随后以已知的方法用这一载体对实施例5中所述的烟草植株进行转化。实施例7提高生育酚在烟草中的生物合成能力
为HPPD cDNA提供一CaMV 35S启动子并用这一35S启动子使其在烟草中超量表达。同时，使用种子特异的云扁豆蛋白基因启动子来特定地提高烟草种子中生育酚的含量。把经过有关构建物转化的烟草植株置于温室中进行培养。在所有的情形中，与未经转化的植株相比较，α-生育酚的浓度都提高了。序列方案(1)普通信息
(i)申请人
(A)名称：BASF AG
(B)街道：Carl Bosch
(C)城市：Ludwigshafen
(D)联邦国家：德国
(F)邮政编码：67056
(G)电话：0621-60-52698
(ii)申请题目：大麦HPPD序列
(iii)序列数目：2套
(iv)计算机可读格示：
(A)记录介质：软盘
(B)计算机：IBM PC可兼容类型
(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatertIn release #1.0，Version #1.25(EPA)(2)序列号：1的信息
(i)序列特征：
(A)长度：1565个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链特征：双链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：无
(iii)antisense：无
(vi)原始来源
(A)生物体：大麦hppd
(D)发育阶段：开始衰老期
(vii)直接来源
(A)文库：大麦λFIXII文库
(B)克隆：pHvSD 36序列
(ix)特征：
(A)名称：CDS
(B)位置：9..1313
(x)发表细节：
(A)作者：Krupinska，Karin
(B)题目：Overexpression of HPPD
(C)刊物：Overexpression of HPPD
(G)日期：1998
(K)在序列号：1中的有关残基：1至1565
(xi)序列描述：序列号：1：CGCACACC ATG CCG CCC ACC CCC ACC ACC CCC GCG GCT ACC GGC GCC GCC 50
Met Pro Pro Thr Pro Thr Thr Pro Ala Ala Thr Gly Ala Ala
1 5 10GCC GCG GTG ACG CCG GAG CAC GCG CGA CCG CAC CGA ATG GTC CGC TTC 98Ala Ala Val Thr Pro Glu His Ala Arg Pro His Arg Met Val Arg Phe15 20 25 30AAC CCG CGC AGC GAC CGC TTC CAC ACG CTC TCC TTC CAC CAC GTC GAG 146Asn Pro Arg Ser Asp Arg Phe His Thr Leu Ser Phe His His Val Glu
35 40 45TTC TGG TGC GCG GAC GCC GCC TCC GCC GCC GGC CGC TTC GCG TTC GCG 194Phe Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ala Phe Ala
50 55 60CTC GGC GCG CCG CTC GCC GCC AGG TCC GAC CTC TCC ACG GGG AAC TCC 242Leu Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser
65 70 75GCG CAC GCC TCC CAG CTG CTC CGC TCG GGC TCC CTC GCC TTC CTC TTC 290Ala His Ala Ser Gln Leu Leu Arg Ser Gly Ser Leu Ala Phe Leu Phe
80 85 90ACC GCG CCC TAC GCC AAC GGC TGC GAC GCC GCC ACC GCC TCC CTG CCC 338Thr Ala Pro Tyr Ala Asn Gly Cys Asp Ala Ala Thr Ala Ser Leu Pro95 100 105 110TCC TTC TCC GCC GAC GCC GCG CGC CGG TTC TCC GCC GAC CAC GGG ATC 386Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Arg Phe Ser Ala Asp His Gly Ile
115 120 125GCG GTG CGC TCC GTA GCG CTG CGC GTC GCA GAC GCC GCC GAG GCC TTC 434Ala Val Arg Ser Val Ala Leu Arg Val Ala Asp Ala Ala Glu Ala Phe
130 135 140CGC GCC AGT CGT CGA CGG GGC GCG CGC CCG GCC TTC GCC CCC GTG GAC 482Arg Ala Ser Arg Arg Arg Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala Pro Val Asp
145 150 155CTC GGC CGC GGC TTC GCG TTC GCG GAG GTC GAG CTC TAC GGC GAC GTC 530Leu Gly Arg Gly Phe Ala Phe Ala Glu Val Glu Leu Tyr Gly Asp Val
160 165 170GTG CTC CGC TTC GTC AGC CAC CCG GAC GGC ACG GAC GTG CCC TTC TTG 578Val Leu Arg Phe Val Ser His Pro Asp Gly Thr Asp Val Pro Phe Leu175 180 185 190CCG GGG TTC GAG GGC GTA ACC AAC CCG GAC GCC GTG GAC TAC GGC CTG 626Pro Gly Phe Glu Gly Val Thr Asn Pro Asp Ala Val Asp Tyr Gly Leu
195 200 205ACG CGG TTC GAC CAC GTC GTC GGC AAC GTC CCG GAG CTT GCC CCC GCC 674Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Leu Ala Pro Ala
210 215 220GCA GCC TAC ATC GCC GGG TTC ACG GGG TTC CAC GAG TTC GCC GAG TTC 722Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Phe Thr Gly Phe His Glu Phe Ala Glu Phe
225 230 235ACG GCG GAG GAC GTG GGC ACG ACC GAG AGC GGG CTC AAC TCG GTG GTG 770Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn Ser Val Val
240 245 250CTC GCC AAC AAC TCG GAG GGC GTG CTG CTG CCG CTC AAC GAG CCG GTG 818Leu Ala Asn Asn Ser Glu Gly Val Leu Leu Pro Leu Asn Glu Pro Val255 260 265 270CAC GGC ACC AAG CGC CGG AGC CAG ATA CAG ACG TTC CTG GAA CAC CAC 866His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Phe Leu Glu His His
275 280 285GGC GGC CCG GGC GTG CAG CAC ATC GCG GTG GCC AGC AGT GAC GTG CTC 914Gly Gly Pro Gly Val Gln His Ile Ala Val Ala Ser Ser Asp Val Leu
290 295 300AGG ACG CTC AGG AAG ATG CGT GCG CGC TCC GCC ATG GGC GGC TTC GAC 962Arg Thr Leu Arg Lys Met Arg Ala Arg Ser Ala Met Gly Gly Phe Asp
305 310 315TTC CTG CCA CCC CCG CTG CCG AAG TAC TAC GAA GGC GTG CGA CGC CTT 1010Phe Leu Pro Pro Pro Leu Pro Lys Tyr Tyr Glu Gly Val Arg Arg Leu
320 325 330GCC GGG GAT GTC CTC TCG GAG GCG CAG ATC AAG GAA TGC CAG GAG CTG 1058Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Ala Gln Ile Lys Glu Cys Gln Glu Leu335 340 345 350GGT GTG CTC GTC GAT AGG GAC GAC CAA GGG GTG TTG CTC CAA ATC TTC 1106Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu Gln Ile Phe
355 360 365ACC AAG CCA GTA GGG GAC AGG CCG ACC TTG TTC CTG GAG ATG ATC CAG 1154Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Leu Phe Leu Glu Met Ile Gln
370 375 380AGG ATC GGG TGC ATG GAG AAG GAC GAG AGA GGG GAA GAG TAC CAG AAG 1202Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Arg Gly Glu Glu Tyr Gln Lys
385 390 395GGT GGC TGC GGC GGG TTC GGC AAA GGC AAC TTC TCC GAG CTG TTC AAG 1250Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu Leu Phe Lys
400 405 410TCC ATT GAA GAT TAC GAG AAG TCC CTT GAA GCC AAG CAA TCT GCT GCA 1298Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Ala Lys Gln Ser Ala Ala415 420 425 430GTT CAG GGA TCA TAGGATAGAA GCTGGTCCTT GTATCATGGT CTCATGGAGC 1350Val Gln Gly Ser
435AAAAGAAAAC AATGTTGTTT GTAATATGCG TCGCACAATT ATATCAATGT TATAATTGGT 14l0GAAGCTGAAG ACAGATGTAT CCTATGTATG ATGGGTGTAA TGGATGGTAG AGGGGCTCAC 1470ACATGAAGAA AATGTAGCGT TGACATTGTT GTACAATCTT GCTTGCAAGT AAAATAAAGA 1530ACAGATTTTG AGTTCTGCAA AAAAAAAAAA AAAAA 1565(2)序列号：2的信息
(i)序列特征：
(A)长度：434氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：序列号：2：Met Pro Pro Thr Pro Thr Thr Pro Ala Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala1 5 10 15Val Thr Pro Glu His Ala Arg Pro His Arg Met Val Arg Phe Asn Pro
20 25 30Arg Ser Asp Arg Phe His Thr Leu Ser Phe His His Val Glu Phe Trp
35 40 45Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ala Phe Ala Leu Gly
50 55 60Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala His65 70 75 80Ala Ser Gln Leu Leu Arg Ser Gly Ser Leu Ala Phe Leu Phe Thr Ala
85 90 95Pro Tyr Ala Asn Gly Cys Asp Ala Ala Thr Ala Ser Leu Pro Ser Phe
100 105 110Ser Ala Asp Ala Ala Arg Arg Phe Ser Ala Asp His Gly Ile Ala Val
115 120 125Arg Ser Val Ala Leu Arg Val Ala Asp Ala Ala Glu Ala Phe Arg Ala
130 135 140Ser Arg Arg Arg Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala Pro Val Asp Leu Gly145 150 155 160Arg Gly Phe Ala Phe Ala Glu Val Glu Leu Tyr Gly Asp Val Val Leu
165 170 175Arg Phe Val Ser His Pro Asp Gly Thr Asp Val Pro Phe Leu Pro Gly
180 185 190Phe Glu Gly Val Thr Asn Pro Asp Ala Val Asp Tyr Gly Leu Thr Arg
195 200 205Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Leu Ala Pro Ala Ala Ala
210 215 220Tyr Ile Ala Gly Phe Thr Gly Phe His Glu Phe Ala Glu Phe Thr Ala225 230 235 240Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn Ser Val Val Leu Ala
245 250 255Asn Asn Ser Glu Gly Val Leu Leu Pro Leu Asn Glu Pro Val His Gly
260 265 270Thr Lys Arg Arg Ser Gln Ile Gln Thr Phe Leu Glu His His Gly Gly
275 280 285Pro Gly Val Gln His Ile Ala Val Ala Ser Ser Asp Val Leu Arg Thr
290 295 300Leu Arg Lys Met Arg Ala Arg Ser Ala Met Gly Gly Phe Asp Phe Leu305 3l0 315 320Pro Pro Pro Leu Pro Lys Tyr Tyr Glu Gly Val Arg Arg Leu Ala Gly
325 330 335Asp Val Leu Ser Glu Ala Gln Ile Lys Glu Cys Gln Glu Leu Gly Val
340 345 350Leu Val Asp Arg Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu Gln Ile Phe Thr Lys
355 360 365Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Leu Phe Leu Glu Met Ile Gln Arg Ile
370 375 380Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Arg Gly Glu Glu Tyr Gln Lys Gly Gly385 390 395 400Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu Leu Phe Lys Ser Ile
405 410 415Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Ala Lys Gln Ser Ala Ala Val Gln
420 425 430Gly Ser
Claims (24)
1.编码HPPD的序列号：1的DNA序列及与其杂交的DNA序列。
2.含有一启动子及权利要求1中所述的DNA序列的表达***。
3.如权利要求2中所述的表达***，包含CaMV 35S启动子。
4.如权利要求2中所述的表达***，包含种子特异的云扁豆启动子。
5.如权利要求2中所述的表达***，其中如权利要求1中所述的DNA序列与另一蛋白呈功能性连接并形成一联合翻译产物。
6.如权利要求2中所述的表达***在转化植物中的应用。
7.转化植物的方法，包括把如权利要求2中所述的表达***导入到植物细胞、愈伤组织、整株植物或者植物细胞原生质体之中。
8.转化植物的方法，包括：
1)把如权利要求2中所述的表达***转移到农杆菌菌株中，
2)把形成的重组克隆分离出来，以及
3)把上述重组克隆用于转化植物。
9.如权利要求8中所述的方法，其中转化是在根癌农杆菌菌株的辅助下完成的。
10.如权利要求7中所述的转化植物的方法，其中转化是在电穿孔的辅助下完成的。
11.如权利要求7中所述的转化植物的方法，其中转化借助于粒子轰击方法完成。
12.维生素E含量提高的植物，含有如权利要求2至5中任一所述的表达***。
13.如权利要求12中所述的植物，选自大豆、大麦、燕麦、小麦、含油种子油菜、玉米或向日葵。
14.产生其维生素E含量提高的植物的方法，其特征在于，如权利要求1中所述的DNA序列在植物中表达。
15.如权利要求14中所述的方法，其中DNA序列是在烟草中进行表达的。
16.如权利要求14或15任一所述的方法，其中表达是在植物的叶片或种子中进行的。
17.通过在植物中表达如权利要求1中所述的DNA序列，用权利要求2至5中任一所述的表达***产生其维生素E含量提高的植物。
18.用如权利要求2中所述的表达***产生一用于鉴定HPPD抑制剂的测试***。
19.以如权利要求2中所述的表达***的表达为基础的用于鉴定HPPD抑制剂的测试***。
20.可以用如权利要求19中所述的测试***进行鉴定的除草剂活性物质。
21.如权利要求12中所述的植物在产生植物HPPD中的应用。
22.通过更高效地表达如权利要求1中所述的DNA序列，用如权利要求2中所述的表达***产生对HPPD抑制剂抗性增强的植物。
23.通过更高效地表达如权利要求1中所述的DNA序列来产生对HPPD抑制剂抗性增强的植物的方法。
24.对HPPD抑制剂抗性增强的植物，含有如权利要求2至5中任一所述的表达***。
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