CN1197481A - 细胞呼吸的抑制和雄性不育植株的产生 - Google Patents

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Abstract

一种抑制靶植物组织中基因表达的方法,包括稳定转化一种类型的植物细胞,由该细胞可再生出带有一种基因构建物的完整植株,该基因构建物含有在靶植物组织中起作用的组织特异性或发育特异性启动子和一种破坏基因,该基因编码的蛋白在表达后能够抑制靶组织的细胞呼吸,导致细胞死亡,所说的破坏基因选自T－urf13基因、编码α－或β－微管蛋白的基因、两种必需的玉米细胞周期基因cdc25和复制起始激活子(ROA)的短义共抑制和线粒体内膜的腺嘌呤核苷酸转运蛋白(ANT)的短义构建物。

Description

细胞呼吸的抑制和雄性不育植株的产生
本发明涉及通过使用一种基因产生雄性不育植株的方法，该基因可在植株中表达并抑制一种必需的细胞功能，从而破坏所选植株特征的充分表达。
我们的国际专利申请号WO90/08831描述了使用多种也被我们称为“花粉灭活基因”的破坏基因对呼吸的破坏作用并就此要求专利保护。
这些灭活基因以这种方式发挥作用的能力各异，因而需要进一步改良的基因序列，以便具体应用时可做适当选择。
本发明的目的是提供用于抑制基因表达的基因。
根据本发明，提供了抑制靶植物组织中基因表达的方法，包括稳定转化一种类型的植物细胞，由该细胞可再生出携带含有在靶植物组织中起作用的组织特异性或发育特异性启动子和一种破坏基因的基因构建物的完整植株，上述破坏基因编码的蛋白表达后能够抑制该靶组织的细胞呼吸，导致细胞死亡，其特征在于所说的破坏基因选自T-urf13基因、编码α-或β-微管蛋白的基因、两种必需的玉米细胞周期基因cdc 25和复制起始激活子(ROA)的短义(short sense)共抑制和线粒体内膜腺嘌呤核苷酸转运蛋白(ANT)的短义构建物。
由于短义共抑制而下调基因活性的描述参见我们的国际专利申请号WO90/08299。
α-或β-微管蛋白基因作为破坏物，通过使植物细胞中微管排列去稳定，从而抑制靶组织中必需的微管功能，导致细胞的死亡。
两种必需的玉米细胞周期基因cdc25和复制起始激活子(ROA)的短义共抑制的应用，破坏了细胞***，从而提供了靶器官或靶组织的生长缺陷。
优选启动子为花药和/或绒毡层特异性启动子或花粉特异性启动子，使得该破坏蛋白表达时再生的植株为雄性不育株。更为优选的花药和/或绒毡层特异性启动子采用附图中图1或2或3所示的cDNA序列并按照我们的国际专利申请号WO90/08826中所述方法得以分离。
含有图1、2和3所示DNA序列的质粒已按照《布达佩斯条约》进行了保藏，详情如下：
质粒pMS10包含于大肠杆菌RR1宿主中，含有本文图1所示的基因序列，于1989年1月9日保藏在国立工业和海洋微生物保藏有限公司，登记号为NCIB 40090。
质粒pMS14包含于大肠杆菌DH5α宿主中，含有本文图2所示的基因序列，于1989年1月9日保藏在国立工业和海洋微生物保藏有限公司，登记号为NCIB 40099。
质粒pMS18包含于大肠杆菌RR1宿主中，含有本文图3所示的基因序列，于1989年1月9日保藏在国立工业和海洋微生物保藏有限公司，登记号为NCIB 40100。
本发明中这些基因序列的分离和鉴定在WO93/01294中详述。
其它启动子也可使用，例如绒毡层特异性MFS14启动子。
本发明也提供已通过转化将携带基因构建物的一种基因构建物稳定整合至其基因组中的植株，前一种基因构建物含有在靶植物组织中起作用的组织特异性或发育特异性启动子和一种破坏基因，该基因编码的蛋白能在表达后抑制靶组织细胞的一种必需的细胞功能，如呼吸、微管排列或细胞***，导致细胞死亡。
本发明也提供已有一种基因构建物稳定整合至其基因组中的植株，特别是一种单子叶植株，更特别是一种玉米植株，上述基因构建物含有在靶组织细胞中起作用的组织特异性启动子和一种破坏基因，该基因编码的蛋白质能抑制靶组织中所说细胞的一种必需的细胞功能，如呼吸或微管，导致细胞死亡，其特征在于所说的破坏基因选自T-urf13基因、腺嘌呤核苷酸转运蛋白的短义构建物、编码α-或β-微管蛋白的基因和必需的细胞周期基因cdc25和ROA的短义下调。
这些基因构建物可作为抑制生长的手段用于多种生物有机体，从简单的单细胞生物到诸如植物和动物等复杂的多细胞生物。通过使用组织或细胞特异性启动子，复杂的生物体中特定的细胞或组织可被靶向作用并破坏掉。本发明提出的一个具体应用是破坏雄花发育必需的细胞，导致雄性不育。
本发明因而提供一种阻止或抑制植物细胞的生长和发育的方法，其基于抑制诸如呼吸或微管等必需细胞功能的基因构建物。该方法可广泛用于多种需要抑制特定细胞或组织的作物。
尤其引人关注的是抑制玉米的雄性育性以原位产生F1杂种。线粒体功能的抑制作为一种雄性不育机制的概念来源于一些先前对玉米T-型胞质雄性不育(cms-T)的研究，研究表明雄性不育表型和线粒体功能异常有关。尽管线粒体功能异常和cms-T之间直接的因果关系尚有待证实，已有越来越多的证据表明功能完全正常的线粒体特别是在绒毡层细胞中是必需的。在小孢子发生过程中，这一点尤为关键，因为对绒毡层细胞提出的代谢要求导致线粒体数目增加40倍。
因而我们提供多种作用于线粒体以抑制其功能性呼吸的负突变。当限定表达于玉米花药组织中时，这些突变会导致雄性不育表型。
我们也利用α-或β-微管蛋白基因的表达来破坏细胞功能。在正常细胞周期，微管蛋白基因的表达由其内源启动子密切调控，并与细胞对这些蛋白的需求密切配合，这些蛋白在植物生长发育期间聚合并装配成微管。在特定组织中或发育的特定阶段，使用非微管蛋白启动子以不受调控的方式表达微管蛋白基因，则游离微管蛋白单体和聚合成微管的微管蛋白之间的平衡将被破坏，导致微管复合物不稳定和细胞功能异常。当表达于绒毡层或花药的其它细胞时，这后一种效应会引起植物不育。
我们也建议采用细胞周期的必需基因如cdc25和ROA的短义下调。当在绒毡层或花药的其它细胞中表达时，这后一种效应会引起植物不育。
用于转化植物细胞的方法对本发明并非特别适合，适于靶植物的任何方法均可使用。转基因植株可由转化细胞再生获得。文献中已介绍了大量的转化方法，如使用根癌农杆菌或其Ti质粒的农杆菌感染法、电穿孔、植物细胞及原生质体的显微注射、微弹转化和花粉管转化，仅举几例。这些已知方法的具体细节可参见有关文献。
作为破坏单细胞生物酵母中线粒体功能的这些基因构建物的形成和检测将在此进行叙述。这些基因构建物可用来抑制转化植株的植物细胞生长和分化的机制也将进行叙述。这些方法的目的是使用酵母作为模式***，对表达破坏线粒体功能的蛋白的基因构建物进行鉴定和优化。植物细胞将用选定构建物进行转化并由其再生完整植株。
附图如下：
图1示质粒pMS10所含的花药特异性cDNA的DNA序列；
图2示质粒pMS14所含的绒毡层特异性cDNA的DNA序列；
图3示质粒pMS18所含的花药特异性cDNA的DNA序列；
图4示T-urf 13基因的序列(SEQ ID NO 1)，下划线示引物Turf-1(SEQ ID NO 2)和Turf-2R(SEQ ID NO 3)；
图5示来自白花丹叶烟草ATP-2基因(SEQ ID NOS 4和5)、编码59氨基酸区的DNA，并示出引物PREB-IB(SEQ ID NO 6)和PREB-R(SEQ ID NO 7)；
图6示pre-β序列的酶切位点；
图7为载体pCaMVI1N之图；
图8为载体RMS17之图；
图9为载体pIE109之图；
图10示MFS14启动子序列(SEQ ID NO 8)，具有下列特征：
2198位转录起点CCT″A″CAA(共有序列CTC″A″TCA)
2167位ATCCATT(可能为TATA盒基序)
2141位CCAT(可能为CAAT盒基序)
2233位cdna起点CAC″A″CAG
2295位翻译起点GCAACAATGGCG(共有序列TAAACAATGGCT)；
图11为载体RMS11载体之图；
图12为载体pMANT3之图；
图13说明玉米细胞系转化载体的构建；及
图14条形图示在多种不同试验中产生的转化子数。
本发明将以如下实施例进行介绍。实施例1玉米转化载体RMS17的构建
我们采用PCR扩增来自cms-T玉米(品系RW33：TMS)的T-urf13基因，以及来自白花丹叶烟草的线粒体靶序列pre-β。植物材料的DNA样品采用Edwards等(“核酸研究”1991，19，1349)所述方法制备。
PCR中完整T-urf 13基因的扩增使用引物turf-1(5′ATCGGATCCATGATCACTACTTTCTTAAACCTTCCT-3′，SEQ ID NO 2)和turf-2R(5′TAGTCTAGATCACGGTACTTGTACGCTATCGGT-3′，SEQ ID NO3)，引物根据Dewey等(1986，“细胞”44，429-449)提供的序列信息设计。PCR条件为94℃变性0.8min，65℃退火1min，72℃延伸2.5min，35个循环。为便于以后的克隆，设计PCR引物使其在基因的5′和3′端分别引入BamHI和XbaI的单一的限制位点。这些引物相对于T-urf13基因序列的位置示于图4。
同样，采用PCR扩增白花丹叶烟草的ATP2基因的编码功能性pre-β线粒体靶序列的59个氨基区，所用引物为PREB-IB(5′ATCGGTACCGCCATGGCTTCTCGGAGGCTTCTCGCCT-3′，SEQID NO 6)和PREB-R(5′ATCGGATCCCGCTGCGGAGGTAGCGTA-3′，SEQ ID NO 7)，引物根据Boutry等(1987，“自然”328，341)提供的序列信息设计。PCR条件如上所述，但退火温度调低至60℃。为便于以后的克隆，PBEB-IB和PREB-2R设计时在扩增片段的5′和3′端分别引入KpnI和BamHI单一的限制位点。这些引物相对于ATP2基因的位置示于图5。
扩增后，pre-B PCR片段用KpnI和BamHI消化以产生粘性末端，并克隆至载体pUC18的相应位点，得到质粒pPB1。TURF-13的PCR产物随后以BamHI和XbaI消化，并克隆至pPB1的相应位点，得到质粒pPB2。在pPB2中pre-β序列符合读框地与T-urf13基因融合，使得完整产物在植物细胞中表达后将转运至线粒体。在推测的位点55-56位残基之间切割pre-β序列，将释放T-urf13蛋白，其NH2-末端具有来自pre-β序列的4个多余残基(图6)。
pBB2中的pre-β/T-urf13基因融合体以KpnI和SalI消化切除，使其平端化并克隆至质粒pCAMVI1N(图7)中，该质粒以BamHI消化并使之平端化，得到了pPB3。该克隆步骤使pre-β/T-urf13基因融合体处于CAMV 35S启动子的转录控制之下。AdhI内含子存在于该构建物中以提高玉米细胞的表达水平(Mascarenhas等，1990“植物分子生物学”，15，913-920)，而nos 3′序列提供polyA附加位点。为产生终末载体RMS17(图8)，来自p1E109(图9)的PAT选择盒以EcoRI片段引入pPB3的单一EcoRI位点，PAT选择盒使我们可以在bialaphos上体外选择转化的玉米细胞。实施例2以RMS17转化BMS玉米细胞
本试验的目的是证实在培养的BMS玉米细胞中preβ/TURF-13基因构建物的表达使细胞活力下降，细胞活力以转化后转基因愈伤组织的形成来进行估量。RMS17载体(图8)导入培养的BMS细胞采用下述碳化硅纤维介导的转化技术：碳化硅晶须的制备
干晶须均在通风橱中使用，以防吸入和可能的肺部损伤。这些晶须有可能致癌，因为它们与石棉具有类似的特性。Silar SC-9晶须由Advanced Composite Material Corporation Greer，South Carolina，USA提供。无菌晶须悬液事先按下述方法配制。约50mg晶须加入预先称重的1.5ml Eppendorf管，盖上离心管，再次称重，以确定晶须的重量。管盖以注射针头刺穿，覆以双层铝箔。管子高压灭菌(121℃，15psi，20min)并干燥。每次试验均配制新鲜的晶须悬液，因为据报道使用新鲜的悬液时DNA转化水平较使用陈旧的悬液时为高。使用无菌去离子水配制5％(重量/体积)的晶须悬液。临用前，将悬液涡旋混合数秒钟使晶须悬浮。DNA转化细胞
所有步骤均在无菌工作台上进行。DNA使用下列方法转化进细胞中。该方法的具体改良在文中已指出。
使用去尖端的Gilson吸头吸取细胞和晶须悬液。吸取100μl新鲜的BMS培养基(见附录1)至无菌Eppendorf管中。向其中加入40μl 5％(w/v)的晶须悬液和25μl(1mg/ml)质粒DNA，使用台式涡旋混合器(Vortex Genie 2 Scientific industries，Inc.)以最高速度涡旋混合60秒钟。随后，立即加入500μl细胞悬液，即250μl叠集细胞。随后将Eppendorf管盖上，管口向上以最高速度涡旋混合60秒钟。同样的方法用于转化其它细胞系。
本试验包括三个对照。两个阳性对照载体为仅含有PAT选择盒的pPG3和RMS15，RMS15与RMS17基本相同，但RMS-17中的T-urf13基因为线粒体偶联蛋白基因UCP所取代，后者对培养的BMS细胞没有作用。两个构建物中均有pre-β靶序列。阴性对照应完全阻止转基因愈伤组织的形成，它由RMS13提供，RMS13与RMS17基本相同，但preβ/T-urf13基因融合体为细胞毒性核糖核酸酶基因，芽胞杆菌RNA酶基因所取代。
本试验中形成的转基因愈伤组织的平均数示于表1表1
  每次重复的转基因愈伤组织的数量
  载体   平均数     1     2     3
  pPG3    -     44     33     39
  RMS13    0     0     0     0
  RMS15    40     30     43     38
  RMS17    12     13     23     16
这些数据表明相对于两个阳性对照pPG3和RMS15，preB/T-urf13融合基因的表达引起转基因愈伤组织形成的明显下降(P＜5％或稍好)。这提示T-urf13蛋白靶向线粒体，对这些细胞有毒害作用，推测是对线粒体功能有影响。细胞毒性核糖核酸酶芽胞杆菌RNA酶的表达完全阻止了转化愈伤组织的形成。实施例3玉米转化载体RMS11的构建
RMS11为一种转化载体，其中pre-β/T-urf13基因融合体的表达由玉米绒毡层(tapteum)启动子MFS14控制。MFS14启动子和-2198到+97非翻译前导区的序列示于图10。采用这种方法，T-urf13蛋白的表达限于产生花粉的细胞，而非整个植株。
为构建RMS11，使来自pPB2、含有pre-β/T-urf13融合基因的KpnI-SalI片段平端化并连接于质粒pSC9平端化BamHI位点，产生pPB4。在pPB4中，pre-β/T-urf13基因融合***于-152到+97 MFS启动子片段和nos 3′聚腺苷酸化序列之间。该完整盒以SacI和EcoRI消化由pPB4中切除，并克隆至pSC7的相应位点，得到质粒pB5。pSC7含MFS14启动子的-153到-5800区，使得由pPB4引入的SacI-EcoRI片段重新产生全长5.8kb的MFS14启动子。
RMS11(图11)通过在pPB5的单一EcoRI位点引入来自p1E109的PAT体外选择盒构建完成。实施例4通过粒子轰击用RMS11转化玉米细胞以产生稳定转化的雄性不育植株
玉米转化载体RMS11被用来通过粒子轰击转化可再生的玉米细胞培养物。培养材料
脆性(Friable)胚发生II型愈伤组织由不成熟的合子胚诱生，合子胚取自温室或花盆(filed)中生长的以近交系B73的花粉授粉后10到12天的A188植株。用于愈伤组织诱生和维持的培养基基于Armstrong和Green改良的N6培养基。具体而言，培养基含有6mML-脯氨酸，2％(w/v)蔗糖，2mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和3％(w/v)Gelrite(注册商标，Caroline Biological Supply)pH6.0。悬浮培养开始之前愈伤组织需生长4-4周。在基于MS的液体培养基中开始悬浮培养，培养基含100mg/l肌醇，2mg/l 2，4-D，2mg/l 1-萘乙酸(NAA)，6mM脯氨酸，200mg/l酪素水解物(Difco Laboratories)，35(w/v)蔗糖和5％(v/v)椰子乳(Difco Laboratories)，pH6.0。细胞悬浮物在该培养基中于125ml锥形瓶中28℃黑暗维持，于旋转式摇床以125rpm振荡。悬浮培养物每3.5天继代一次，方法为加入3ml叠集细胞和10ml培养基至20ml新鲜培养基。轰击时悬浮培养物培养时间一般为6个月到1年。由冷藏状态恢复的悬浮培养物用于某些转化。微粒轰击
悬浮细胞先过1.0mm然后过0.5mm筛。叠集体积为0.2ml的已过筛细胞悬浮于5ml悬浮培养基中，使用4.7cm微量分析固定器(holder)通过真空抽滤使细胞均匀分布于Whatman 4号滤纸盘上。超螺旋质粒DNA沉淀于钨微粒上，使用DuPont PDS-1000 Biolistics(注册商标)装置轰击，基本上按厂商说明进行。靶植物轰击一次。转化子的选择和植株的再生
轰击之后，每一滤纸盘(带有细胞)被转至基于N6的培养基，其中含有100mg/l肌醇、2mg/l 2，4-D、3％(w/v)蔗糖和0.3％(w/v)Gelrite，pH6.0。使用NPT II基因进行选择时，培养基中添加200mg/l硫酸卡那霉素。7天和再过14天后，分别将滤纸盘转至含有选择物质的新鲜培养基中。悬浮培养物分成两等份，分别均匀地涂布于100×20mm平皿中的20ml含有选择物质和3％(w/v)Gelrite的固体培养基上。2-5周后，移出生长迅速、推测已转化的愈伤组织，转至新的选择培养基表面。将组织转至基于MS的培养基以再生植株，培养基含有1g/l肌醇、1mg/l NAA、6％(w/v)蔗糖和3％(w/v)Gelrite，pH6.0。2-3周后，将组织转至含有0.25mg/l NAA和3％(w/v)蔗糖的MS培养基中，并置于光下，使胚胎发芽。植株随后生长于半强度(Half-strength)的基于MS的培养基中约1-2周，培养基中含有500mg/l肌醇、3％(w/v)蔗糖和0.3％Gelrite，pH6.0，再将植株转移至温室中。
转移至温室后，对各独立转化克隆的植株采用PCR检测MFS14/pre-B/T-urf13基因构建物的存在。使用Edwards等(1991，“核酸研究”，19，1349)所述方法由小叶样中提取DNA并用于PCR，所用引物为14-SA(5′-AGACGCTGAGCTCAAGGACGTGA-3′SEQ ID NO9)和turf-2R(该引物序列见实施例1)。
植株开花时，采用目测标准对温室中各独立转化克隆的植株进行评定，上述标准是为CMS品系建立的，见表2所述。4级及4级以下植株为功能性不育。每一独立PCR阳性克隆的累计不育级数示于表3，并与以RMS11轰击产生但MFS14/pre-B/T-urf13基因构建物PCR检测为阴性的玉米品系相比较。
以能育的非转基因BE70植株的花粉与不育植株回交。一个这样的回交(克隆YK23，植株5×BE70)获得的子代种子种植于温室中，并长至开花。通过PCR和PAT检测(后者确定转化过程中所用的选择标志是否存在)分析MFS14/pre-B/T-urf13基因构建物的存在，植株的育性级数示于表4。开花前由温室中除去PCR阴性的植株。植株1和2PCR检测结果不确定，保留至开花。植株12保留作为对照。由表4可见，6个子代植株是不育的，并且这种不育性与PCR或PAT检测转基因的存在一致。这符合单个转基因座的存在导致不育(的看法)。
表2花药分类(根据L.M.Josephson)
    0级 无花药外露
    1级 花药外露少于半数且均细小、干燥并坚硬，无花粉散出
    2级 出现多数花药外露，但均细小、干燥并坚硬，无花粉散出
    3级 部分可育花药外露并有花粉散出，花药外露的比例极不稳定
    4级 少量不正常花药，有大约75-100％花药外露
    5级 花药正常，完全能育
*4级和5级雄花穗视为能育
表3
    克隆   植株编号   育性级数   P.C.R.
    WK23     2     0     +
    3     3     +
    WK23     2     0     +
    YK23     3     0     +
    1     4     +
    YK23     4     5     -
表4
    植株   PCR检测   PAT检测   育性级数
  YK23/5/1     +/-     -     0
  YK23/5/2     +/-     +     0
  YK23/5/3     -     除去
  YK23/5/4     -     除去
  YK23/5/5     -     未发芽
  YK23/5/6     +     +     1
  YK23/5/7     +     +     0
  YK23/5/8     -     除去
  YK23/5/9     +     +     0
  YK23/5/10     -     除去
  YK23/5/11     +     +     0
  YK23/5/12     -     -     5
实施例5玉米转化载体pRMS-23的构建
我们已检测了来自玉米腺嘌呤核苷酸转运蛋白(ANT)基因的短义(short-sense)构建物的表达是否会引起玉米细胞生长的缺陷。采用PCR分离玉米ANT片段，引物根据Bathgate等(1989，“欧洲生物化学杂志”，83，303-310)发表的玉米基因序列设计。
使用PCR扩增ANT基因片段，所用引物为MANT-1(5′-ATGCCCGGGCTTGCAATGTCTGTTAGCGGTGGCATCA-3′，SEQ IDNO 10)和MANT-2RB(5-ATGCCCGGGCGATGGGGTAAGATGCAAGACCA-3′，SEQ ID NO 11)。PCR条件为94℃变性0.8分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸2.5分钟，35个循环。为便于以后的克隆，设计PCR引物使得它们在基因的5′和3′末端引入单一的SmaI限制位点。玉米ANT基因序列发表于“欧洲生物化学杂志”(1989)183，303-310。MANT-1引物序列见于该基因编码序列的始端，MANT-2R引物序列靠近该基因的末端。
PCR获得估计大小为1050bp的一个DNA片段，该DNA以SmaI消化并亚克隆至pUC18的SmaI位点，得到pMANT1。随后nos 3′多腺苷酸化信号序列作为SacI-EcoRI片段被引入pMANT1中位于ANT基因3′端的相应位点，得到pMANT2。带有CaMV 35s启动子和来自pCaMVI1N(图5)的ADH1内含子的HindIII-BamHI片段被引入pMANT2的相应位点，得到pMANT3。向pMANT3的单一EcoRI位点引入来自pIE109(图7)的PAT体外选择盒完成pRMS-23(图12)的构建。实施例6以pRMS-23转化BMS玉米细胞
本试验的目标是证明培养的BMS玉米细胞中pRMS-23的表达引起以两次独立试验转化后转基因愈伤组织形成表示的细胞活力降低。载体DNA采用实施例2所述的碳化硅纤维转化技术导入培养的BMS细胞。
以pRMS23转化后，确定形成的转基因愈伤组织的平均数，与只含体外选择盒的阳性对照pPG3相比较(表5)。这些数据表明短义腺嘌呤核苷酸转运蛋白基因的表达导致形成的愈伤组织减少。
表5
  每次重复的转基因愈伤组织数
    1     2     3 平均数
试验1
    pPG3     16     20     22     19
    pRMS-23     3     4     3     3
试验2
    pPG3     49     48     40     46
    pRMS-23     10     15     23     16
实施例7玉米转化载体pTBR和pTBS的构建
我们检测了α-微管蛋白基因不受调控地表达是否会导致玉米细胞生长的缺陷。制备了含有来自分离自牛筋草两种生物型的α-微管蛋白cDNA的编码序列的两种构建物。pTBR(图13)含有来自牛筋草二硝基苯胺抗性生物型的α-微管蛋白cDNA，该cDNA片段作为平末端的Hinf I片段克隆至pCaMVI1N(图7)的平末端的BamHI位点。pTBS(图13)含有来自二硝基苯胺敏感生物型的α-微管蛋白cDNA，其克隆正如构建pTBR所述。实施例8以pTBR和pTBS转化BMS玉米细胞
本试验的目的是证明pTBR和pTBS在培养的BMS玉米细胞中表达引起以转化后转基因愈伤组织形成表示的细胞活力的下降。载体DNA采用实施例2所述的碳化硅纤维转化技术导入培养的BMS细胞。
以pTBR和pTBS转化后，确定形成的转基因愈伤组织的平均数，与只含体外选择盒的阳性对照pPG3相比较(图14)。这些数据表明不受调控地表达来自牛筋草任一生物型的α-微管蛋白基因都引起转基因愈伤组织形成的显著下降。
           序列表(1)一般信息：
(i)申请人：
   (A)名称：ZENECA LIMITED
   (B)街道：15 Stanhope Gate
   (C)城市：London
   (E)国家：UK
   (F)邮政编码(邮区号)：W1Y 6LN
(ii)发明名称：雄性不育植株的产生
(iii)序列数：11
(iv)计算机可读形式：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作***：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：357碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(vi)初始来源：
   (A)生物：T-urf13基因
(xi)序列表述：SEQ ID NO：1：ATCGGATCCA TGATCACTAC TTTCTTAAAC CTTCCTCCCT TTGATCAAGG TTTGGTATTT      60TTCGGTTCTA TTTTTATTTT TTTTTTGTGC ATATTATTGA TAAAGGGATA TCTCCGTAAA     120ATGGATGATT CCTATTTGGC TCAACTCTCC GAGTTAGCCA ACCACAATAG AGTGGAAGCG     180GCAAAAGCGG GCCACGTGGC CCTGCATGAG CTATCCTTCT CGTGGTTGAG GGGGGTTCAA     240ATTAGGGTGA GGACCTTACC TATACAACGG AATGAAGGAG GGGGTCGAAG CAACGACCAA     300TCCACTCTCT CTAAGCCTAA GTATTCCTCA ATGACCGATA GCGTACAAGT ACCGTGA        357(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：36碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(vi)初始来源：
   (A)生物：Turf-1引物
(xi)序列表述：SEQ ID NO：2：ATCGGATCCA TGATCACTAC TTTCTTAAAC CTTCCT                         36(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：33碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(vi)初始来源：
   (A)生物：Turf-2R引物
(xi)序列表述：SEQ ID NO：3：TAGTCTAGAT CACGGTACTT GTACGCTATC GGT                            33(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：269碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(vi)初始来源：
   (A)生物：ATP-2白花丹叶烟草基因
(ix)特征：
   (A)名称/图解：CDS
   (B)位置：1...267
   (D)其他信息/密码子_起始点＝1
(xi)序列表述：SEQ ID NO：4：ATG GCT TCT CGG AGG CTT CTC GCC TCT CTC CTC CGT CAA TCG GCT CAA       48Met Ala Ser Arg Arg Leu Leu Ala Ser Leu Leu Arg Gln Ser Ala Gln1               5                  10                  15CGT GGC GGC GGT CTA ATT TCC CGA TCG TCA GGA AAC TCC ATC CCT AAA       96Arg Gly Gly Gly Leu Ile Ser Arg Ser Ser Gly Asn Ser Ile Pro Lys
         20                  25                  30TCC GCT TCA CGC GCC TCT TCA CGC GCA TCC CCT AAG GGA TTC CTC TTA      144Ser Ala Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Pro Lys Gly Phe Leu Leu
     35                  40                  45AAC CGC GCC GTA CAG TAC GCT ACC TCC GCA GCG GCA CCG GCA TCT CAG      192Asn Arg Ala Val Gln Tyr Ala Thr Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln
 50                  55                  60CCA TCA ACA CCA CCA AAG TCC GCC AGT GAA CCG TCC GGA AAA ATT ACC      240Pro Ser Thr Pro Pro Lys Ser Ala Ser Glu Pro Ser Gly Lys Ile Thr65                  70                  75                  80GAT GAG TTC ACC GGC GCT GGT TCG ATC GG                               269Asp Glu Phe Thr Gly Ala Gly Ser Ile
             85(2)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：89氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白
(xi)序列表述：SEQ ID NO：5：Met Ala Ser Arg Arg Leu Leu Ala Ser Leu Leu Arg Gln Ser Ala Gln1               5                  10                  15Arg Gly Gly Gly Leu Ile Ser Arg Ser Ser Gly Asn Ser Ile Pro Lys
         20                  25                  30Ser Ala Ser Arg Ala Ser Ser Arg Ala Ser Pro Lys Gly Phe Leu Leu
     35                  40                  45Asn Arg Ala Val Gln Tyr Ala Thr Ser Ala Ala Ala Pro Ala Ser Gln
 50                  55                  60Pro Ser Thr Pro Pro Lys Ser Ala Ser Glu Pro Ser Gly Lys Ile Thr65                  70                  75                  80Asp Glu Phe Thr Gly Ala Gly Ser Ile
             85(2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：37碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(vi)初始来源：
   (A)生物：PREB-IB引物
(xi)序列表述：SEQ ID NO：6：ATCGGTACCG CCATGGCTTC TCGGAGGCTT CTCGCCT                               37(2)SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：27碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(vi)初始来源：
   (A)生物：PREB-2R引物
(xi)序列表述：SEQ ID NO：7：ATCGGATCCC GCTGCGGAGG TAGCGTA                                          27(2)SEQ ID NO：8的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：2285碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：双链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(vi)初始来源：
   (A)生物：MFS14启动子
(xi)序列表述：SEQ ID NO：8：AAAAGCGTAC CAGTAAGGGA TAAAGAAAAT AAACAAACAC GAAATGCTTC CCCATCGGCC      60AATTCGCCTA GGTGTGCTAG GAACTGGCCT ATATGTTCGT GTGTGCTTCT CCTATTTTCA     120CCAGAAAACT TAGAAAACTC TGGTATCCTT GCCCCTTGTG GATATGGGAC AATGTCAAAC     180CGGTGATCAT ATGGCTTCTG ATATGATTGC CCCACTCTAT CCACACCAAC TCCGAGTCTA     240TCTCAAAATA GTTTAGCCAT CTCTTCCCTA ATTTTCTACA TTGCACTCGG TGGCAGACCA     300CCGGACCCTA GGCTGTGGGG TTCATTCGGT CGGGCATTGT TATGCCGACC TTCTTGCCAT     360GACCGATTGA TAATGTTGAT CGGCCTGTGA TCATATGGCG TGTTGTGGGT TAAATATGTA     420GGGGGCAGAA CATACTGCCG TTGTGGTATG TAATAATTTG GTGCATAGTG TGCGACAGTA     480GGTTCTGTGT ATGTGTATCC GATATGTCCG GTGGTACATC TGAACTGGCC GGTTGTGTTA     540GCTATTATTG GGGCGCCACG CGTAGCCCTG GTGCGGCCCG GACTATCCGG CAGAGAAAGC     600CGACGGTCTG TGTAAGGGCC GAACTATCCA GACAAAAGCT CGGACGGTCC GACCGTGTAG     660AGGGCCGTCG ATCTGCCAAG CAAGGACGAT GGTGATGGTA TTTGCCCTGG ATATGAGTTC     720ATCAACATAC CATATAATGG ATGGGGCTGC AAATCCCCAT TTGTCGCCGA TGTATTAGAC     780ATAAATATCA TGTTACTAGT TTCATATGAT GGAAAACTAG GAGCAACAGA CTTCTCCAAC     840ATACACGTTA ATTTTCTAAT TGGTTCTTCT AACCCTCTAA TCTAATGCTT CATTTGATTA     900TGCAAATGGT CTACATACTG TTTAATAGAT TGGATGTCGT CGGGTTTACT TACGTTAGGG     960ACTTGAAGCG AAGATAGAAG AGATGTGACG TCGGTATCGC ATGTTTGACA ACTTTCTGGT    1020GACGATCCAC CATGTATTGT GACAAGAATT TCTCCTTCGT TTGACACATG TAGTCCTCGT    1080ATTGTTGTTG CTCATCGGTC GTCGGACTCT TAATAGCCGG CTTTAGGATA TTGTCCGGGG    1140AGATATCGGT GTGATCTTTA GAACCGCCAT TTGATGGCCT GAGTTTTAGT AGATCTAGAC    1200ACATTTCCCC AACGGAGTCG CCAAAAAGTG TGTTGGCGCC GATCCAGGCG CGAAACACTG    1260GAGATGGACC GTTTGGCGGT GTTCTCCGGG TGAGGACGGT CCGCGACCTG GGTCCAGCAG    1320CGACTCTCCT CTACGTGTGT CCGGACGGTC CGTCGTCTGG GGCTCGGACG GTCGCGATGG    1380CGCAGAGGGT CTTCTTCTTC GCAGCCGACC TAGATCTCGC CTCCCGGGAG GGACCGTCGG    1440GGAGGAGAGA TTGTAGGGTG TGTCTTGGCG TCGACAGGCC ACACAATACG CCTCTAGTCG    1500ACGTAGAGCC GAAGAGAGGT GAAGGATTGA GGTAGAAGGA GGCTAAACTT GGGCTAAACT    1560AGAACTACTG CTAATGCATA AGGTAAAAAC GAGAAGTGGA CTTCATTTGA TCGATTGTGG    1620AAGTAATCTG ACTGTAGCCC TTTATCTATA TAAAGGGGAG GTATGGACCC GTTACAAGCC    1680GTTTTCCGAG CTAATCTCAC GGTTTTAGTT AATAAATCCT GCGAGAAACT CGGAACTCTA    1740ACTGATTCTA CTCATGCGCG AACCATTCGT GCGCCACCGC TGCCCGTCCC GCGATCGCTC    1800AGTTAACCCT GTGTTGTGCG CTGTGATTTG GTGGCATATA AAACCACATT TGCAATAAAA    1860ATTTGTAGGG ATTTAACATA CCAAGTGCTG CGAAAGGAAT CGTTTTCGGA GGACCCAAAA    1920TTAAAGAGGC AGATGCTAGA GCTCGTCCAG CTCAGCGCTG AGCACCTGTG TTGTCTTCCT    1980CGTCCACGCC GGCGGAGATG AACGGCAACA AAGGCGGAAA GGCCGAGACG CTGAGCTCAA    2040GGACGTGACA CCGCGCGTAC CTCGCGTTCA GTTGGCTCAC ACAACAGCAG CTCGCTCGCC    2100CCAAGCTCCC GCGTCCTGAT CCGTAGGTGA GCCATGCAAA GGTCGCCGCG CGCCCTGATC    2160CATTGCACCC TTCAAAGCTC GAACCTACAA ATAGCGTGCA CCAGGCATCC TGGCCACACC    2220CACACAGCAA GCCAGCAGAG CAGAAAGCAG CCGCAGCCCC AGCCCCCACA AAGACGAAGG    2280CAACA                                                                2285(2)SEQ ID NO：9的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：23碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(vi)初始来源：
   (A)生物：14-SA引物
(xi)序列表述：SEQ ID NO：9：AGACGCTGAG CTCAAGGACG TGA                                               23(2)SEQ ID NO：10的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：37碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(vi)初始来源：
   (A)生物：MANT-1引物
(xi)序列表述：SEQ ID NO：10：ATGCCCGGGC TTGCAATGTC TGTTAGCGGT GGCATCA                                37(2)SEQ ID NO：11的信息：
(i)序列特征：
   (A)长度：32碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA
(vi)初始来源：
   (A)生物：MANT-2RB引物
(xi)序列表述：SEQ ID NO：11：ATGCCCGGGC GATGGGGTAA GATGCAAGAC CA                                     32

Claims (9)

1.一种抑制靶植物组织中基因表达的方法，包括稳定转化一种类型的植物细胞，由该细胞可再生出携带含有在靶植物组织细胞中起作用的组织特异性或发育特异性启动子及一种破坏基因(disrupter gene)的基因构建物的完整植株，该破坏基因编码的蛋白表达后能够抑制该靶组织的细胞呼吸，导致细胞死亡，所说的破坏基因选自T-urf13基因、编码α-或β-微管蛋白的基因、两种必需的玉米细胞周期基因cdc25和复制起始激活子(ROA)的短义(short sense)共抑制及线粒体内膜的腺嘌呤核苷酸转运蛋白(ANT)的短义构建物。
2.一种已通过转化将携带基因构建物的一种基因构建物稳定整合至其基因组中的植株，前一种基因构建物含有在靶植物组织细胞中起作用的组织特异性或发育特异性启动子和一种破坏基因，该破坏基因编码的蛋白表达后能抑制所说靶组织细胞的一种必需细胞功能，如呼吸、微管排列或细胞***，导致细胞死亡。
3.一种已有一种基因构建物稳定整合至其基因组中的植株，该基因构建物含有在靶组织细胞中起作用的组织特异性启动子和一种破坏基因，该破坏基因编码的蛋白能抑制所说靶组织中细胞的一种必需细胞功能，如呼吸或微管，导致细胞死亡，其特征在于所说的破坏基因选自T-urf13基因、腺嘌呤核苷酸的短义构建物、编码α-或β-微管蛋白的基因和必需的细胞周期基因cdc25和ROA的短义下调。
4.权利要求2或3的植株，其为单子叶植株。
5.权利要求4的植株，其为玉米。
6.权利要求1的方法或权利要求2至5任一项的植株，其中启动子为花药-和/或绒毡层-特异性启动子。
7.权利要求6的方法或植株，其中启动子可利用图1到3任一图的cDNA序列分离。
8.权利要求6的方法或植株，其中启动子为来自MFS14基因(SEQ ID NO 8)的启动子。
9.一种已有一种基因构建物稳定整合至其基因组中的雄性不育玉米植株，该基因构建物含有在绒毡层细胞中起作用的绒毡层特异性启动子和一种破坏基因，该破坏基因编码的蛋白能抑制绒毡层细胞的一种必需细胞功能，如呼吸或微管，导致细胞死亡，其特征在于所说的破坏基因选自T-urf13基因、腺嘌呤核苷酸的短义构建物、编码α-或β-微管蛋白的基因和必需的细胞周期基因cdc25和ROA的短义下调。
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