CN1150330C - 通过表达高水平的抗生物素蛋白诱导植物雄性不育性 - Google Patents

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Abstract

可以通过提高植物组织中抗生物素蛋白的内源浓度，产生雄性不育植株。通过产生含有表达载体的转基因植株可以达到这种效应，在所述表达载体中，启动子操作性连接至编码抗生物素蛋白的DNA序列。公开了恢复雄性育性的方法。另外，提供了产生具有一种或多种所需谷粒性状的种子的方法。

Description

通过表达高水平的抗生物素蛋白诱导植物雄性不育性
                       发明领域
本发明涉及采用编码抗生物素蛋白的DNA分子控制植物育性的方法。具体地说，本发明涉及产生表达抗生物素蛋白的转基因雄性不育植物的方法。此外，本发明涉及在雄性不育植株后代中恢复雄性育性的方法。本发明也涉及采用表达抗生物素蛋白的雄性不育植株产生杂种种子、特别是具有一种或多种所需谷粒或种子性状的杂种种子的方法。
                       发明背景
在杂种作物生产中控制花粉育性是必要的。参见例如J.M.Poehlman，BREEDING FIELD CROPS，第3版。(Van Nostrand和Reinhold，New York，NY，1987)，该文献通过引用结合到本文中。例如在杂种玉米生产中，花粉育性的控制通常通过在花粉散布之前，物理去除雄性花序或雄花穗来完成。人工去雄是非常费力的。尽管机械去雄比人工去雄更省力，但其可靠性较差，并且需要随后检查作物，通常需要补救性人工去雄。这两种去雄方法均引起母本产量的损失。
然而，最主要的有价值的作物在同一花内均具有功能性的雄性器官和雌性器官；因此，去雄不是一个简单的步骤。尽管可能在花粉散布之前人工去除花粉形成器官，但这种形式的杂种生产的工作量极大并且很昂贵。
也可以通过应用具有杀雄配子体特性的叶喷雾制剂来控制花粉育性。Corss等，SexPlant Reprod.  4：235(1991)。例如，将乙烯利应用于花药，导致小麦额外的花粉有丝***、大麦绒毡层细胞的退化和产生画眉草属(Eragrostis)畸形或败育花粉。Bennet等，Nature  240：566(1972)，Colhoun等，Plant Cell Environ. 6：21(1983)；Berthe等，Crop Sci.18：35(1978)。然而，化学方法的工作量大，存在与引入环境中的化学制剂的毒性有关的潜在问题，并且可能对应用时间非常敏感。
另外，利用杀配子剂的杂种种子的工业生产受化学制剂的成本和可得性的限制，也受应用作用的可靠性和作用时间长短的限制。杀配子剂的一个严重的限制是：它们具有毒害植物的效应，其严重性取决于基因型。其它限制包括：这些化学制剂可能对花期延长的作物无效，因为新产生的花可能不受影响。因此，需要重复应用化学制剂。
目前农作物的许多工业化杂种种子生产***依赖于授粉控制的遗传方法。用作雌系的植株或者不能散布花粉、产生生化上不能实现自花受精的花粉，或者不能制造花粉。不能自花受精的植株被称为“自交不亲和的”。与使用自交不亲和性***相关的困难包括自交不亲和雌系的可得性和繁殖以及自交亲和性的稳定性。在某些情况下，可以通过化学方法克服自交不亲和性，或者可以在阻断花粉的生化机制被激活之前对未成熟芽进行人工授粉。可以被失活的自交不亲和***通常易受严酷的气候条件的破坏，这破坏或降低对自花受精生化阻断的效力。
工业化种子生产更广泛感兴趣的是引起雄性不育性的基于遗传花粉控制的***。这些***有两种一般类型：(1)核雄性不育性，这不能形成花粉，因为在一个或多个核基因中有突变，或(2)细胞质遗传的雄性不育性，通常称为“细胞质雄性不育性”(CMS)，其中因为细胞质的细胞器(通常为线粒体)中的改变，花粉形成被阻断或败育。
核不育性可以或者为显性或者为隐性。通常，仅当雌系的营养繁殖或无性繁殖是可能时，显性不育性才可用于杂种种子的形成。如果不育或可育植株易于区分，则可以使用隐性不育性。然而，显性和隐性不育性***的商业应用性分别受无性繁殖和剔除(rouging)雌行中自花能稔植株的费用的限制。
尽管有涉及使用CMS的杂交方案，但对其商业价值有限制。一个CMS***的实例是位于细胞质的线粒体中的特定突变，该突变在合适的核背景中可以导致不能形成成熟花粉。在某些情况下，核背景可以补偿细胞质突变，发生正常的花粉形成。特定的核“恢复基因”使得具有CMS线粒体的植株能够形成花粉。一般而言，使用CMS用于种子的工业化生产涉及使用三个繁殖系：雄性不育系(母本)；保持系，与雄性不育系等基因，但具有功能完全的线粒体；和父本系。父本系的细胞质可以携带或不携带特定的恢复基因。
对于诸如蔬菜的从杂种回收种子不重要的作物而言，CMS***可以不用恢复而使用。对于杂种的果实或种子是商业产品的作物而言，杂种种子的育性必须由父本中特定的恢复基因来恢复，或必须对雄性不育杂种进行授粉。可以通过包括小百分率的雄性可育植株以实施授粉，来达到对非恢复杂种授粉。在大多数物种中，CMS性状是母系遗传的，因为所有的细胞质细胞器均通常仅从***遗传。
CMS***有一些限制，这可能阻碍它们作为雄性不育植株生产的仅有的解决方法。例如，一种玉米特定的CMS类型(T细胞质)使得对因特定真菌感染而产生的毒素敏感。尽管CMS***仍用于许多作物，但CMS***在某些环境条件下可能失灵。
因此，显然非常需要不通过人工、机械、化学和传统遗传方法而控制花粉产生的方法。
                       发明概述
因此，本发明的一个目的是提供产生通过异源表达抗生物素蛋白赋予不育的雄性不育植株的方法。
本发明的再一目的是提供嵌合基因，所述嵌合基因包含可操作连接至植物启动子序列的编码抗生物素蛋白的DNA序列。
本发明的再一目的是提供逆转通过表达抗生物素蛋白引起的雄性不育性的方法。
本发明的另一目的是提供具有一种或多种所需谷粒或种子性状的种子生产方法。
按照本发明的一个实施方案，通过提供包含可操作连接至植物启动子序列的编码抗生物素蛋白的核苷酸序列的分离DNA分子，达到这些目的和其它目的。在一个优选实施方案中，所述分离DNA分子包含于表达载体中。在另一优选实施方案中，所述植物启动子序列为组成型启动子，在另一优选实施方案中，所述组成型启动子是遍在蛋白启动子。在另一优选实施方案中，所述抗生物素蛋白基因可操作地连接至输出信号序列。
按照本发明的另一实施方案，提供转基因植物，其中所述植物包含含有抗生物素蛋白基因的异源核苷酸序列，并且其中所述异源核苷酸序列提高所述植物组织中抗生物素蛋白的浓度，引起雄性不育性。在优选实施方案中，所述转基因植物是玉米植株、大豆植株、canola植株或向日葵植株。在另一优选实施方案中，所述异源DNA分子还包含一个组成型启动子序列，在一个优选实施方案中，该组成型启动子序列是遍在蛋白启动子序列。在另一优选实施方案中，所述异源DNA分子还包含一个组织特异性启动子。所述特别优选的组织特异性启动子是花药特异性启动子。
按照本发明的又一方面，提供产生转基因雄性不育植株的方法，包括将一表达载体引入植物细胞中，所述表达载体包含一个启动子和一个抗生物素蛋白基因，其中所述启动子控制所述抗生物素蛋白基因的表达，并且其中所述抗生物素蛋白基因的表达引起雄性不育性。在一个优选实施方案中，由所述植物细胞再生转基因植株。在另一优选实施方案中，所述启动子包括遍在蛋白启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子。
按照本发明的再一方面，提供用抗生物素蛋白基因产生雄性可育杂种植株的方法，包括产生包含上述DNA分子的第一亲本雄性不育植株，其中抗生物素蛋白的表达引起雄性不育性；产生表达第二外源基因的第二转基因亲本植株；并使第一亲本与第二亲本异花受精，产生表达第二外源基因的杂种植株，并且其中第二外源基因的表达减少杂种植株中抗生物素蛋白的表达，由此产生雄性可育杂种植株。
在本发明该方面的一个优选实施方案中，所述第二外源基因选择反义基因、核酶基因和外部指导序列基因。在另一优选实施方案中，所述反义基因包含抗生物素蛋白mRNA序列，在再一优选实施方案中，所述抗生物素蛋白mRNA序列在诱导型启动子控制之下。在又一优选实施方案中，所述核酶基因包含抗生物素蛋白mRNA序列。在又一优选实施方案中，所述外部指导序列基因包含抗生物素蛋白mRNA序列。在再一优选实施方案中，第一亲本植株的DNA分子还包含一个操作性连接至所述启动子的LexA操纵基因，其中所述第二外源基因为LexA抑制基因。在另一优选实施方案中，所述启动子序列是花药特异性启动子序列，包含选自以下的一个花药框(anther box)：SEQ IDNO：4的核苷酸序列；SEQ ID NO：5的核苷酸序列；SEQ ID NO：6的核苷酸序列；和它们的功能性片段。
在本发明该方面的又一优选实施方案中，所述花药框具有SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列，所述花药特异性启动子还包含一个选自以下的核心启动子：CaMV 35S核心启动子、SEQ ID NO：7的核苷酸序列、SEQ ID NO：8的核苷酸序列、SEQ ID NO：9的核苷酸序列和它们的功能片段。
按照本发明的再一方面，提供恢复因表达抗生物素蛋白赋予雄性不育的植株的育性的方法，包括向所述植物喷散生物素溶液。
按照本发明的又一方面，提供产生具有一种或多种目的谷粒或种子性状的种子的方法。在本发明的一个优选实施方案中，将携带一个或多个拷贝抗生物素蛋白基因的雄性不育第一亲本植株作为母本，与第二亲本植株杂交，所述第二亲本植株为雄性可育的，且携带一种或多种目的谷粒或种子性状。产生具有父本谷粒或种子性状的种子。在优选实施方案中，所述亲本植物是玉米、大豆、canola或向日葵。在本发明的又一优选实施方案中，所述抗生物素蛋白基因是链霉抗生物素蛋白基因。
                       附图简述
图1显示抗生物素蛋白编码质粒PHI5168，其中玉米遍在蛋白启动子(包括其第一外显子加第一内含子)驱动大麦α淀粉酶输出信号序列和抗生物素蛋白编码区的表达。
图2显示编码bar基因的质粒PHI610。
                       优选实施方案的详述
1.定义
在以下描述中，广泛使用的多种术语。提供以下定义以有助于理解本发明。
结构基因是转录为信使RNA(mRNA)的DNA序列，所述mRNA然后翻译为特定多肽特性的氨基酸序列。
外源基因在本说明书中是指操作性连接至至少一个异源调节元件的DNA序列。例如，如果该基因的表达受玉米5126结构基因的花药特异性调节元件的控制，则玉米5126结构基因以外的任何基因均被认为是外源基因。
启动子是指导基因转录的DNA序列，所述基因诸如结构基因、反义基因、核酶基因或外部指导序列基因。通常，启动子位于基因的5’区，接近转录起始位点。如果启动子是诱导型启动子，则对诱导剂应答而提高转录速率。相反，如果该启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂的调节。植物启动子是指导基因在植物组织中转录的启动子序列。
核心启动子含有启动子功能(包括TATA框和转录起始)的基本核苷酸序列。根据该定义，在缺乏可以增强活性或赋予组织特异性活性的特定序列的情况下，核心启动子可能有或没有可检测活性。例如，SGB6核心启动子由SGB6基因转录起始位点5’方向的约38个核苷酸组成，而花椰菜花叶病毒(CaMV)35S核心启动子由35S基因组转录起始位点5’方向的约33个核苷酸组成。
组织特异性启动子是这样一种DNA序列，当它操作性地连接至一种基因时，指导该基因在生物特定组织中的转录水平高于在某些或所有其它组织中的转录水平。例如， 花药特异性启动子是指导相连接的基因在植物花药组织中以较高水平转录的DNA序列。例如，SGB6花药特异性启动子可以指导外源基因在花药组织中表达，但在根组织或胚芽鞘组织中不表达。
本文所用的“花药特异性启动子”包含两种功能元件：“花药框”和核心启动子。特定的花药框可以具有典型增强子的功能特征。花药框和核心启动子的组合可以刺激基因表达的程度高于单独的核心启动子刺激的表达程度。甚至在含有花药框和源自不同基因的核心启动子的嵌合花药特异性启动子的情况下也是如此。下文描述了这类嵌合花药特异性调节元件。
操纵基因是位于基因5’方向并含有由抑制蛋白识别并结合的核苷酸序列的DNA序列。抑制蛋白与其相关操纵基因的结合，导致抑制该基因的转录。例如，LexA基因编码结合至LexA操纵基因的抑制蛋白。
分离的DNA分子是已经与生物的DNA分离的DNA片段。例如，编码抗生物素蛋白基因的克隆DNA分子是一种分离的DNA分子。分离DNA分子的另一实例是化学合成的DNA分子或酶促产生的cDNA，它不整合入生物的基因组DNA。
增强子是可以提高转录效率的DNA调节元件。
互补DNA(cDNA)是通过反转录酶由mRNA模板形成的单链DNA分子。通常，使用与部分mRNA互补的引物来起始反转录。本领域技术人员也用术语“cDNA”来指由单链DNA分子与其互补DNA链组成的双链DNA分子。
术语 表达是指基因产物的生物合成。例如，在结构基因的情况下，表达包括所述结构基因转录为mRNA以及mRNA翻译为一种或多种多肽。
克隆载体是一种能够在宿主细胞中自主复制的DNA分子，诸如质粒、粘粒或噬菌体。克隆载体通常含有一个或少数限制性内切核酸酶识别位点，在这些位点上可以以可检测的方式***外源DNA序列，而不丧失该载体的基本生物功能，克隆载体也含有一个标记基因，该标记基因适用于鉴别和选择用该克隆载体转化的细胞。标记基因通常包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。
表达载体是包含在宿主细胞中表达的基因的DNA分子。通常，将基因表达置于某些调节元件的控制之下，所述调节元件包括组成型或诱导型启动子、组织特异性调节元件和增强子。这种基因被认为是“操作性连接至”所述调节元件。
重组宿主可以是含有或者克隆载体或者表达载体的任何原核或真核细胞。该术语也包括已经进行遗传工程使得在该宿主细胞染色体或基因组中含有所述克隆基因的那些原核或真核细胞。
转基因植物是具有含外源基因的一个或多个植物细胞的植物。
在真核细胞中，RNA聚合酶II催化结构基因的转录，产生mRNA。可以设计一种含有RNA聚合酶II模板的DNA分子，其中RNA转录物的序列与特定mRNA的序列互补。所述RNA转录物称为 反义 RNA，编码反义RNA的DNA序列称为 反义基因。反义RNA分子能够结合至mRNA分子，导致抑制mRNA的翻译。
核酶是含有催化中心的RNA分子。该术语包括RNA核酶、自剪接RNA和自切割RNA。编码核酶的DNA序列称为 核酶基因。
外部指导序列是这样一种RNA分子，它将内源核酶RNase P导向特定种类胞内mRNA，导致RNase P切割所述mRNA。编码外部指导序列的DNA序列称为 外部指导序列基因。
谷粒或种子性状是种子的营养或生理特征，最好受一个显性基因控制，显著影响经济类型。所述谷粒或种子性状包括诸如油、蛋白质和淀粉含量、以及蛋白品质和淀粉类型的这类特征。
单交是两个近交系之间的杂交。
双杂交是两个单交之间的杂交。
三元杂种是一个单交和一个近交系之间的杂交后代。
杂种是一种或多种基因不同的两个个体之间杂交的第一代后代。
近交系是通常源自自花传粉和选择的纯系。
综合系是通过自然传粉特定代数维持的品系、无性系、近交系或它们之间杂种的混合物。繁殖所述组成单位，并以固定时间间隔重建所述综合系。
特殊配合力是杂交中与所有组合平均生产表现相比的遗传品系特殊组合的生产表现。
传粉植株是将花粉贡献给雄性不育母本的雄性可育亲本。传粉植株可以具有许多不同遗传背景中的任一种，因此可以是近交系、杂种、综合自然传粉系或遗传材料。传粉植株可以是转基因系。传粉植株可以携带一种或多种目的种子或谷粒性状。
2.概述
本发明提供通过制备表达抗生物素蛋白的转基因植株产生雄性不育植株的方法。所述抗生物素蛋白可以以非组织特异性方式组成型表达，或可以以花药特异性方式表达。也提供恢复雄性育性的方法。
也提供了产生具有一种或多种目的谷粒或种子性状的杂种种子的方法。在本发明的一个优选实施方案中，携带一个或多个拷贝抗生物素蛋白基因的雄性不育第一杂种作为母本，与携带一种或多种目的谷粒或种子性状的雄性可育第二杂种杂交。产生具有一种或多种父本谷粒或种子性状的杂种种子。
分离抗生物素蛋白基因，将其***适用于引入植物组织的表达载体中。该表达载体还包含一个启动子，它可以是组成型启动子即非组织特异性启动子(诸如遍在蛋白启动子)、组织特异性启动子如花药特异性启动子或诱导型启动子。该表达载体可以包含一个输出信号序列。基因产物高水平表达，然后在细胞质中积累，这可能导致对所述植物细胞的毒性。因此，从细胞质移去所述基因产物可能导致细胞毒性减小。植物基因及其输出信号序列是已知的。参见Jones和Robinson，Tansley Review 17：567-597(1989)。通过标准方法将该表达载体引入植物组织中，选择并繁殖转基因植株。表达抗生物素蛋白的转基因植株为雄性不育。通过在所述转基因植株中共表达抑制抗生物素蛋白基因转录或抑制抗生物素蛋白mRNA翻译的第二基因，可以恢复雄性育性。按照该实施方案，如果将所述抑制基因操作性地连接至诱导型启动子，则可得到抗生物素蛋白基因的暂时抑制。或者，通过向发育中的植株喷散生物素溶液，可以恢复雄性育性。
3.编码抗生物素蛋白的DNA分子的分离
可以用已知方法分离编码抗生物素蛋白的核苷酸序列。例如，链霉抗生物素蛋白基因的核苷酸序列是已知的。Argarana等，NucleicAcids Res.， 14(4)：1871-1882(1986)。或者，可以通过Gope等，NucleicAcids Res.， 15：3595(1987)(该文献通过引用结合到本文中)描述的方法，从鸡输卵管cDNA文库中分离编码鸡卵清抗生物素蛋白的cDNA。
可以从已知产生抗生物素蛋白的生物的基因组DNA中获得抗生物素蛋白基因的基因组克隆。例如，通过Keinanen等，Eur.J.Biochem.，220：615(1994)中的所述方法，可以从鸡基因组DNA中克隆鸡抗生物素蛋白基因。
用聚合酶链式反应(PCR)，用标准方法也可以分离抗生物素蛋白基因。参见Erlich，PCR TECHNOLOGY：PRINCIPLES ANDAPPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION(Stockton Press，NY，1989)和Innis等，PCR PROTOCOLS：A GUIDE TO METHODS ANDAPPLICATIONS(Academic Press，San Diego，1990)。可以用诸如ELONGASETM***(Life Techmologies，Inc.，Gaithersburg，MD)的PCR扩增长核苷酸序列的方法，获得较长的核苷酸序列，诸如编码抗生物素蛋白的基因组克隆。可以用市售的寡核苷酸合成仪，诸如AppliedBiosystems(Foster City，CA)供应的那些合成仪，合成与已知抗生物素蛋白基因的5’和3’末端互补的PCR引物。在一个优选实施方案中，所述引物包括含有限制性内切核酸酶酶切位点的额外的核苷酸序列。这类位点的存在，使得能够在用合适的限制性酶处理后，将PCR产物定向克隆入合适的克隆载体中。参见Finney，“PCR产物的分子克隆”，载于CUURENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，Ausubel等编辑(John Wiley & Sons，New York，1987)，第15.7.1页。
PCR的模板DNA可以或者为cDNA或者为基因组DNA，可以用本领域熟知的方法由合适的生物制备。Sambrook等，MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，第二版，(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY 1989)。可以用市售试剂，诸如TriazolTM(Life Technologies，Inc.Gaithersburg，MD)，由鸟类、爬行动物或两栖类组织直接分离基因组DNA。  或者，用市售的试剂盒(Pharmacia，Piscataway，NJ)，用从鸡输卵管组织中提取的mRNA，可以制备编码抗生物素蛋白的cDNA。用poly(dT)或随机六聚物引物，通过标准技术用mRNA制备物作为cDNA合成的模板。参见Sambrook等，见上文。然后，使用市售试剂盒(Pharmacia)进行cDNA合成，用Saiki等，Science  239：487(1988)的方法，将cDNA直接用于PCR。
按照常规技术，诸如使用限制性酶消化提供合适的末端，使用碱性磷酸酶处理以避免不想要的DNA分子的连接，以及用合适的连接酶连接，将用上述方法分离的基因组DNA或cDNA片段***载体中，诸如***噬菌体或粘粒载体中。Ausubel等(编辑)，CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第3.0.5-3.17.5(1990)[“Ausubel”]公开了这类载体的操作技术。
或者，通过用相互引发的长寡核苷酸(mutually priming longoligonucleotides)合成编码抗生物素蛋白的DNA分子，可以获得编码抗生物素蛋白的核苷酸序列。参见例如Ausubel，第8.2.8至8.2.13页。此外，参见Wosnick等，Gene  60：115(1987)。目前采用聚合酶链式反应的技术提供合成大至长1.8千碱基的基因的能力。Adang等，PlantMolec.Biol. 21：1131(1993)；Bambot等，PCR Methods and Applications  2：266(1993)。合成的抗生物素蛋白基因的核苷酸序列可以基于任何已知的抗生物素蛋白编码DNA分子。参见Gope等，见上文。
可以用多种标准技术分析这些克隆，所述技术诸如限制分析、DNA分析、引物延伸分析和DNA序列分析。例如，引物延伸分析或S1核酸酶保护分析可以用来将所克隆基因的推定的转录起始位点定位。Ausubel，第4.8.1-4.8.5页；Walmsley等，“通过S1核酸酶保护测定定量和定性分析外源基因表达”METHODS IN MOLECULARBIOLOGY，第7卷：GENE TRANSFER AND EXPRESSIONPROTOCOLS，Murray(编辑)，第271-281页(Humana Press Inc.1991)。使用本领域技术人员熟知的这些技术和相关技术，分离其它目的基因，并使其克隆和表达。
4.将抗生物素蛋白基因克隆入表达载体中和转基因植株的制备
一旦分离出抗生物素蛋白基因，则用标准方法将其置于表达载体中。参见Sambrook等，见上文。合适表达载体的选择将取决于将表达载体引入宿主细胞的方法。通常，表达载体含有：(1)编码细菌复制起点的原核DNA元件和抗生素抗性基因，以供表达载体在细菌宿主中生长和选择之用；(2)用于***外源DNA序列(例如抗生物素蛋白基因)的克隆位点；(3)控制外源基因转录起始的真核DNA元件，诸如启动子；(4)控制转录物加工的DNA元件，诸如转录终止/多腺甘酸化序列；和(5)编码标记蛋白(例如报道基因)的基因，其中该基因操作性地连接至控制转录起始的DNA元件。或者，所述表达载体可以包含操作性连接至外源DNA序列的编码输出信号序列的DNA序列。在Gruber等，“植物转化载体”，METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGYAND BIOTECHNOLOGY，Glick等(编辑)，第89-119页(CRC Press 1993)中可以找到植物表达载体和报道基因的一般描述。
在本发明的一个优选实施方案中，使用植物遍在蛋白启动子***。植物遍在蛋白启动子是本领域熟知的。参见例如欧洲专利申请0342 926，该申请通过引用结合到本文中。所述遍在蛋白启动子是组成型启动子。
在本发明的另一优选实施方案中，使用诱导型启动子提供抗生物素蛋白表达的诱导型调节。这种诱导型启动子的一个实例是玉米的谷胱甘肽S-转移酶***。参见Wiegand等，PlantMol.Biol. 7：235(1986)。该方法也提供雄性不育系的可逆诱导。因此，可以根据需要，通过激活所述启动子，控制抗生物素蛋白的表达和伴随的雄性不育性。当该启动子未被激活时，抗生物素蛋白不表达，所述植株为雄性可育的。
所述表达可以包括一个选择标记或可筛选标记。从细菌中分离出用于植物转化的许多常用的正选择标记基因，它们编码使选择性化学制剂代谢上解毒的酶，所述化学试剂可以是抗生素或除草剂。其它正选择标记基因编码对所述抑制剂不敏感的改变的靶。
植物转化常用的选择标记基因是新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因，分离自Tn5，当将其置于植物调节信号控制之下时，它赋予对卡那霉素的抗性。Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 80：4803(1983)。另一常用的选择标记是潮霉素磷酸转移酶基因，它赋予对抗生素潮霉素的抗性。Vanden Elzen等，Plant Mol.Biol. 5：299(1985)。赋予对抗生素抗性的细菌来源的其它正选择标记基因，包括庆大霉素乙酰转移酶、链霉素磷酸转移酶、氨基糖苷-3’-腺嘌呤转移酶和博来霉素抗性决定簇。Hayford等，Plant Physiol. 86：1216(1983)；Jones等，Mol.Gen.Genet. 210：86(1987)；Svab等，Plant Mol.Biol. 14：197(1990)；Hille等，Plant Mol.Biol. 7：171(1986)。
用于植物转化的其它正选择标记基因不是来源于细菌。这些基因包括小鼠二氢叶酸还原酶、植物5-烯醇丙酮酸莽草酸酯(enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶和植物乙酰乳酸合酶。Eichholz等，Somatic Cell Mol.Genet. 13：67(1987)；Shah等，Science  233：478(1986)；Charest等，Plant Cell Rep. 8：643(1990)。
用于植物的其它常用的选择标记基因赋予对谷胺酰胺合成酶的除草抑制剂的抗性。Kumada等的欧洲专利申请第0 333 033号和Goodman等的美国专利第4,975,374号公开了谷胺酰胺合成酶基因的核苷酸序列，该基因赋予对诸如膦丝菌素的除草剂抗性。在Leemans等的欧洲专利申请第0 242 246号提供了膦丝菌素乙酰转移酶基因的核苷酸序列。De Greef等，Bio/Technology  7：61(1989)描述了表达编码膦丝菌素乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。
用于植物转化的另一类标记基因需要筛选推定的转化植物细胞，而非根据对诸如抗生素的毒性物质的抗性来直接遗传选择转化细胞。这些基因对定量或显现特定组织中基因表达空间模式是尤其有用的，通常被称为报道基因，因为它们可以与基因或基因调节序列融合，以研究基因表达。
筛选推定的转化细胞常用的基因包括β-葡糖醛酸苷酶(GUS)、β-半乳糖苷酶、荧光素酶和氯霉素乙酰转移酶。Jefferson，Plant Mol.Biol.Rep. 5：387(1987)；Teeri等，EMBO J. 8：343(1989)；Koncz等，Proc.NatlAcad.Sci.U.S.A. 84：131(1987)；De Block等，EMBO J. 3：1681(1984)。鉴别相对稀少的转化事件的另一方法使用了编码玉米(Zea mays)花色素苷色素形成途径的显性组成型调节物。Ludwig等，Science  247：449(1990)。
所述表达载体可以包含操作性连接至编码肽输出信号序列的DNA序列的抗生物素蛋白基因。参见Hones和Robinson，见上文。制备所述载体，使得将信号序列融合至成熟抗生物素蛋白蛋白序列的N末端，使得可以进行正常的细胞加工，以准确切割所述蛋白分子，产生成熟的活性抗生物素蛋白。在一个特别优选实施方案中，信号序列是大麦α淀粉酶信号序列。Rogers，J.Biol.Chem. 260：3731-3738(1985)。
可以将含有抗生物素蛋白基因的表达载体引入原生质体中，或引入完整的组织，诸如未成熟胚和分生组织，或引入愈伤组织培养物中，或引入分离的细胞中。最好将表达载体引入完整的组织中。例如Miki等，“将外源DNA引入植物的方法”，METHODS IN PLANTMOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY，Glick等(编辑)，第67-88页(CRC Press，1993)和Phillips等，“细胞/组织培养和体外操作”，CORN AND CORN IMPROVEMENT，第3版，Sprague等(编辑)，第345-387页(American Society ofAgronomy，Inc等，1988)提供了培养植物组织的一般方法。
将表达载体引入植物组织的方法包括植物组织直接感染根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或与根癌土壤杆菌一起协同培养。Horsch等，Science  227：1229(1985)。解除武装(disarmed)的Ti质粒用作外源DNA序列的载体。可以用例如欧洲专利申请116 718号(1984)和第270 822号(1988)中描述的方法进行转化。优选的Ti质粒载体在边界序列之间含有所述外源DNA序列，或所述外源DNA序列至少位于右边界序列上游。
采用诸如直接基因转移(参见例如PCT申请WO 85/01856和欧洲专利申请275 069)、体外原生质体转化(例如美国专利第4,684,611号)、植物病毒介导的转化(例如欧洲专利申请第067 553号和美国专利第4,407,956号)和脂质体介导的转化(例如美国专利第4,536,475号)的方法，可以用其它类型的载体转化植物细胞。Fromm等，Bio/Technology 8：833(1990)和Gordon-Kamm等，The Plant Cell  2：603(1990)提供了玉米转化的合适方法。Christou等，Trends in Biotechnology  10：239(1992)和Lee等，Proc Nat’l Acad.Sci.USA  88：6389(1991)描述了用于转化水稻的标准方法。可以采用类似于玉米或水稻转化技术的方法转化小麦。此外，Casas等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA  90：11212(1993)描述了转化高粱的方法，而Wan等，Plant Physiol. 104：37(1994)描述了转化大麦的方法。
一般而言，对于单子叶植物的转化，特别是诸如水稻、玉米、高粱、大麦或小麦的谷类的转化，最好使用直接转移法。合适的直接转移法包括微弹介导的传递、DNA注射、电穿孔等。参见例如Gruber等，见上文，Miki等，见上文，和Klein等，Bio/Technology  10：268(1992)。更优选用生物发射装置，采用微弹介导的传递将表达载体引入单子叶植物的组织中。
5.雄性不育的调节
A.雄性不育植株的产生
为了按照本发明诱导雄性不育性，构建一种表达载体，其中编码抗生物素蛋白的DNA序列操作性地连接至调节植物组织中基因转录的DNA序列。上文描述了表达载体的一般需要。为了通过表达抗生物素蛋白得到雄性不育性，最好不仅仅以瞬时方式表达抗生物素蛋白，而是以在成熟植株(adult plant)的较晚发育阶段表达的方式，将该表达载体引入植物胚胎组织。例如，用提供染色体外繁殖的植物病毒载体得到有丝***的稳定性。
通过将表达载体序列整合入宿主染色体中，提供获得有丝***稳定性的优选方法。通过将表达载体微弹传递至植物组织，或采用上述其它标准方法，可以提供这种有丝***的稳定性。参见例如Fromm等，Bio/Technology  8：833(1990)，Gordon-Kamm等，The Plant Cell  2：603(1990)和Walters等，Plant Molec.Biol. 18：189(1992)。
最好由非特异性刺激植物组织中基因表达的组成型启动子，控制引入植物组织后所述抗生物素蛋白基因的转录。适用于此目的的组成型启动子的一个实例是遍在蛋白启动子，如上文所述。
也可以由以组织特异性方式刺激基因表达的启动子控制抗生物素蛋白基因的转录。特别优选的花药特异性启动子是从玉米近交B73系分离出的5126启动子。5126启动子刺激从四分孢子至早单核小孢子期的花药表达外源基因。
另一合适的花药特异性启动子是也从B73系分离出的SGB6启动子。SGB6启动子可以诱导在小孢子发育的四分孢子期至中单核小孢子期的花药绒毡层细胞中表达外源基因。
或者，可以采用花药框和核心启动子的组合，提供花药特异性基因表达。特别优选的花药框是5126花药框，它包含以下核苷酸序列：
5′GCGGCCGCGG ATCCGCTCAT CTGCTCGGTA CCAACCAGCC
   CGCCGGCGCC TAGGCGAGTA GACGAGCCAT GGTTGGTCGG
   TTTCCTATTA CCATGCACAG ATCT3′    [5EQ ID NO：4]
   AAAGGATAAT GGTACGTGTC TAGA‘
另一合适的花药框位于由SGB6转录起始位点上游核苷酸583-490限定的94个碱基对的DNA片段内。所述94个碱基对的SGB6花药框的核苷酸序列为：
(-583)ACAGTTCACT AGATATGCAT GATCTTTAAC AATTGCTGCT
      TGTCAAGTGA TCTATACGTA CTAGAAATTG TTAACGACGA
      GGATTGTGCG GTTTCTTTTG GCACAAATGG CATGAACAGA
      CCTAACACGC CAAAGAAAAC CGTGTTTACC GTACTTGTCT
      GTAATCCGGG ACGC(-490) [SEQ ID NO：5]
或者，从玉米G9启动子得到一个合适的花药框，它在发育的减数***至四分孢子期刺激基因表达。G9花药框包含以下核苷酸序列：
5‘ GCGGCCGCGG ATCCTGGCTG GATGAAACCG ATGCGAGAGA
    CGCCGGCGCC TAGGACCGAC CTACTTTGGC TACGCTCTCT
    AGAAAAAAAA ATTGTTGCAT GTAGTTGGCG CCTGTCACCC
    TCTTTTTTTT TAACAACGTA CATCAACCGC GGACAGTGGG
    AACCAAACCA GTAGTTGAGG CACGCCCTGT TTGCTCACGA
    TTGGTTTGGT CATCAACTCC GTGCGGGACA AACGAGTGCT
    TCACGAACGT AGATCT3′  [SEQ ID NO：6]
    AGTGCTTGCA TCTAGA
可以如上所述，通过合成寡核苷酸获得5126、SGB6和G9花药框。本领域技术人员会识别到，可以进行缺失分析定位所公开花药框内的一种或多种另外的花药特异性调节序列。这类花药框的“功能片段”也可以用来以花药特异性方式调节抗生物素蛋白基因表达。
优选的核心启动子得自5126核心启动子、SGB6核心启动子、G9核心启动子和花椰菜花叶病毒35S核心启动子。
特别优选核心启动子是5126核心启动子，它包含以下核苷酸序列：
5′AGATCTAAGT AAGGTATATA TGTGCATAGT CTCCTAATTC
   TCTAGATTCA TTCCATATAT ACACGTATCA GAGGATTAAG
   TTCATCTTCA ACCTCTAGCT GATTGATCTC TGGTATTTAC
   AAGTAGAAGT TGGAGATCGA CTAACTAGAG ACCATAAATG
   CACTCTTTCC TTCCTTCCTT CCTTCAATTC TAAATACCAC
   GTGAGAAAGG AAGGAAGGAA GGAAGTTAAG ATTTATGGTG
   AAATCAAAGT TGCTTTGCCA TG3′      [SEQ ID NO：7]
   TTTAGTTTCA ACGAAACGGT AC
SGB6核心启动子由SGB6基因转录起始位点上游的约38个核苷酸组成。合适的SGB6核心启动子具有以下核苷酸序列：
5′ATCTCACCCT ATTAATACCA TGCTGACGAG
   TAGAGTGGGA TAATTATGGT ACGACTGCTC
   CCAATAGC   3′        [SEQID NO：8]
   GGTTATCG
得自G9基因的合适核心启动子包含的核苷酸序列为：
5′AGATCTCTAT AAAACACGCA GGGACTGGAA AGCGAGATTT
   TCTAGAGATA TTTTGTGCGT CCCTGACCTT TCGCTCTAAA
   CACAGCTGAA AGCAGCCAAA ACGCAGAAGC TGCACTGCAT
   GTGTCGACTT TCGTCGGTTT TGCGTCTTCG ACGTGACGTA
   ACATCGAGCT AACTATCTGC AGCCATG3′ [SEQ ID NO：9]
   TGTAGCTCGA TTGATAGACG TCGGTAC
5126、SGB6和G9核心启动子的功能片段也提供了合适的核心启动子。以上描述了获得这类功能片段的方法。
可以采用包含得自一种基因的花药框和得自第二种基因的花药特异性启动子的嵌合调节元件，延伸抗生物素蛋白基因表达的发育窗口。例如SGB6调节序列刺激从发育的四分孢子至中单核期表达基因，而G9调节序列刺激在减数***至发育的四分孢子期期间表达基因。另外，SGB6花药框和G9启动子的组合刺激在减数***至发育的中单核期转录外源基因。因此，花药框和花药特异性启动子的各种组合对于本发明特别有用。
也可以使用病毒核心启动子。合适的病毒核心启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)核心启动子、玄参花叶病毒核心启动子等。Gruber等，见上文。所述病毒核心启动子最好是CaMV 35S核心启动子或其变异体。
为了选择转化细胞，所述表达载体含有一个选择标记基因，诸如除草剂抗性基因。例如这种基因可以赋予对膦丝菌素、草甘膦、磺酰脲、莠去净或咪唑啉酮的抗性。所述选择标记基因最好是bar基因或编码膦丝菌素乙酰转移酶的pat基因。在Leemans等的欧洲专利申请第0-242-246号(1987)和White等，Nucleic Acids Res. 18：1062(1990)中，可以找到bar基因的核苷酸序列。Wohlleben等，Gene  70：25(1988)公开了pat基因的核苷酸序列。bar或pat基因的表达赋予对诸如草铵膦(其中以Basta和Ignite出售)和双丙氨膦(以Herbi-ace和Liberty出售)。
所述表达载体可以含有在组成型启动子或花药特异性启动子控制下的编码抗生物素蛋白的DNA序列、以及含有在组成型启动子控制下的所述选择标记基因。或者，可以通过“共转化”胚性组织，将所述选择标记基因在单独的选择表达载体中传递至宿主细胞中。
B.在F1杂种中恢复雄性育性
可以用上述方法产生雄性不育植株，以在近交系之间的大规模定向杂交中产生F1杂种。如果所述转基因雄性不育植株的所有***均不含有所述重组抗生物素蛋白基因，则一定比例的F1杂种将具有雄性可育表现型。另一方面，如果所述重组抗生物素蛋白基因存在于转基因雄性不育植株的所有***中，则F1杂种将具有雄性不育表现型。因此，可能最好使用雄性育性恢复***来提供雄性可育F1杂种的生产。当收获的产品为种子时，这种育性恢复***在自花受精物种中具有特殊价值。
通常提出的在转基因雄性不育植株系中恢复育性的方法需要产生第二转基因植物“恢复”系。例如，如上所述，使由于表达芽孢杆菌RNA酶引起的雄性不育的转基因植株与表达芽孢杆菌RNA酶抑制剂的雄性可育植株杂交。Mariani等，Nature  357：384(1992)。
在本发明的情况下，类似的方法需要产生表达导向抗生物素蛋白mRNA的核酶或表达反义抗生物素蛋白的转基因植株恢复系。例如，可以设计核酶，以表达导向mRNA分子中某些靶序列的内切核酸酶活性。例如Steinecke等，EMBO J. 11：1525(1992)用核酶得到了在烟草原生质体中对新霉素磷酸转移酶基因表达的高达100％的抑制。新近，Perriman等，Antisense Res.& Devel. 3：253(1993)用表达修饰的锤头核酶的载体，抑制烟草原生质体中氯霉素乙酰转移酶活性。在本发明的正文中，抗生物素蛋白mRNA提供了核酶的合适的靶RNA分子。
可以利用含有编码反义RNA的核苷酸序列的表达载体，以相似方式恢复育性。反义RNA分子结合至靶mRNA分子，导致翻译的杂交扣留。Paterson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA  74：4370(1987)。在本发明正文中，合适的反义RNA分子具有与抗生物素蛋白mRNA互补的序列。在本发明的一个优选实施方案中，所述反义RNA在诱导型启动子的控制之下。激活该启动子则使得雄性育性恢复。
在再一替代方法中，可以构建表达载体，其中表达载体编码的RNA转录物能够促进RNA酶P介导的抗生物素蛋白mRNA分子的切割。按照该方法，可以构建外部指导序列，以将内源核酶RNA酶P导向抗生物素蛋白mRNA，所述mRNA随后被细胞核酶切割。Altman等的美国专利第5,168,053号；Yuan等，Science  261：1269(1994)。所述外部指导序列最好包含与抗生物素蛋白mRNA互补的10-15个核苷酸的序列和3’-NCCA核苷酸序列，其中N最好为嘌呤(出处同前)。由于在所述mRNA和所述互补外部指导序列之间形成碱基对，因此所述外部指导序列的转录物结合至靶mRNA类，由此促进RNA酶P在位于碱基配对区的5’端的核苷酸处切割mRNA(出处同前)。
在恢复雄性育性的一个替代方法中，转基因雄性不育植株除含有一个表达载体，该表达载体除含有操作性连接至抗生物素蛋白基因的启动子外，也含有原核调节元件。产生在所述启动子控制下表达原核多肽的转基因雄性可育植株。在F1杂种中，所述原核多肽结合至所述原核调节序列，抑制抗生物素蛋白的表达。
例如，可以按照本发明用LexA基因/LexA操纵基因***调节基因表达。参见美国专利第4,833,080(“所述’080专利)和Wang等，Mol.Cell.Biol. 13：1805(1993)。更具体地讲，所述雄性不育植株的表达载体将含有LexA操纵基因序列，而雄性可育植株的表达载体将含有LexA抑制基因的编码序列。在F1杂种中，LexA抑制基因将结合至LexA操纵基因序列，抑制抗生物素蛋白基因的转录。
例如，通过合成含有熟知的LexA操纵基因序列的DNA片段，可以获得LexA操纵基因DNA分子。参见例如所述’080专利和Garriga等，Mol.Gen.Genet. 236：125(1992)。通过合成编码LexA抑制基因的DNA分子，可以获得LexA基因。以上讨论了基因合成技术，例如Garriga等(见上文)描述了LexA基因序列。或者，可以从美国典型培养物保藏中心保藏号为67758的质粒pRB500，获得编码LexA抑制基因的DNA分子。
本领域技术人员可以用原核调节***容易地设计其它雄性育性恢复策略，所述原核调节***诸如Lac抑制基因/Lac操纵子***或trp抑制基因/trp操纵子***。
恢复育性的又一方法利用抗生物素蛋白对生物素的高亲和性，向发育中的植株喷散生物素溶液。所述生物素溶液可以包含最小量的诸如DMSO的有机助溶剂，以确保完全溶解生物素。然而，所述生物素溶液可以不含有有机助溶剂。可以早至花粉发育的减数***期开始喷散。也可以在花粉发育较晚时期开始喷散。一般以固定时间间隔重复喷散，直至观察到花粉散布。喷散之间的间隔可在1-7天间变化。在本发明的一个优选实施方案中，每3-5天重复喷散。
6.具有所需谷粒性状的杂种种子的产生
用本发明的雄性不育植株系，可以有利地产生具有一种或多种所需谷粒或种子性状的杂种种子。使携带抗生物素蛋白基因的转基因系作为雄性不育母本，与携带一种或多种所需谷粒或种子性状的雄性可育传粉植株杂交。雄性可育传粉植株系控制所需谷粒或种子性状的基因最好是纯合的。用该方法产生具有所需谷粒或种子性状的杂种种子并将其收获。雄性不育亲本与携带一种或多种所需谷粒或种子性状的基因的雄性可育传粉植株系杂交，这种产生杂种种子的方法有时被称为顶交法。参见例如美国专利第5,196,636，该专利通过引用结合到本文中。
杂交制备本发明杂种种子的雄性不育系和雄性可育系可以是杂种、近交系或综合系的任何亲和组合。用上述方法，产生携带操作性连接至组成型或诱导型启动子的抗生物素蛋白基因的转基因系。所述雄性不育系可以携带一个或多个拷贝的抗生物素蛋白基因。
通过用任何一种上述方法抑制雄性不育性，可以使携带抗生物素蛋白基因多种转基因雄性不育系自交。例如，可以设计核酶，以表达导向所述抗生物素蛋白mRNA分子中某些靶序列的内切核酸酶活性。编码所述核酶的基因操作性地连接至诱导型启动子。用诱导物处理所述雄性不育植株，表达核酶，抗生物素蛋白mRNA失活导致雄性育性的恢复。或者，通过使用编码反义RNA的核苷酸序列恢复育性。反义RNA分子结合至靶mRNA分子，导致翻译的杂交扣留。在本发明正文中，合适的反义RNA分子的序列与抗生物素蛋白mRNA互补。在本发明的一个优选实施方案中，所述反义RNA在诱导型启动子控制之下。该启动子的激活则使得雄性育性恢复。
在另一替代方法中，在所述雄性不育植株中产生能够促进RNA酶P介导的抗生物素蛋白mRNA分子的切割的RNA转录物。按照该方法，构建外部指导序列，以将内源核酶RNA酶P导向抗生物素蛋白mRNA，抗生物素蛋白mRNA随后被细胞核酶切割。由于在所述mRNA和所述互补的外部指导序列之间形成碱基对，所述外部指导序列转录物结合至靶mRNA，由此促进RNA酶P在位于所述碱基配对区的5’端的核苷酸处切割mRNA。
在恢复雄性育性的又一方法中，产生含有表达载体的转基因雄性不育植株系，所述表达载体除含有操作性连接至抗生物素蛋白基因的启动子序列外，也含有原核调节元件。产生转基因系，所述转基因系含有抗生物素蛋白基因与操作性连接至诱导型启动子的编码原核基因的基因。所述转基因植株系用诱导物处理，以产生结合至原核调节序列的原核多肽，抑制抗生物素蛋白的表达，并恢复雄性育性。
恢复育性的再一方法利用抗生物素蛋白对生物素的高亲和性。向转基因雄性不育系喷散生物素溶液。生物素结合至抗生物素蛋白并使其失活，由此恢复雄性育性。一般正当花粉发育的减数***期开始时，向转基因雄性不育系喷散生物素，尽管可以在较晚时开始喷散。在一个优选实施方案中，通过向所述植株喷散生物素，得到对雄性不育性的抑制。
按照本发明的方法用以生产具有一种所需谷粒或种子性状的杂种种子的雄性不育系和雄性可育传粉系，为近交系、杂种系、综合自然传粉系或遗传材料。用熟练植物育种者熟知的任一方法，产生所述近交系、杂种系、综合自然传粉系或遗传材料。参见例如J.M.Poehlman，BREEDING FIELD CROPS，第3版(Van Nostrand和Reinhold，NewYork，NY，1987)，该文献通过引用结合到本文中。进行选定近交系和/或杂种系之间的测交，以评估特殊配合力。鉴别商业可接受的组合。
选择一种雄性可育传粉系，该系(1)携带一种或多种所需谷粒或种子性状的基因和(2)与待与其杂交的雄性不育系亲和。控制所选定谷粒性状或种子性状的基因可以是显性的，使得该性状在杂种种子中容易地表达。然而，控制所选定谷粒性状或种子性状的基因也可以是隐性的。在控制所述谷粒或种子性状的基因是隐性的情况下，分别繁育携带该隐性基因的所述雄性不育系和雄性可育传粉系。在控制目的谷粒或种子性状的基因是隐性的情况下，所述雄性不育系和传粉者的所述基因最好均为纯合的，使得所需表现型在通过杂交产生的所有种子中表达。因此，所述雄性不育系和雄性可育传粉系可以各携带在后代种子中控制一个谷粒或种子性状的基因。通过传统育种法和/或遗传工程技术，将所需谷粒或种子性状的基因引入所述雄性不育系或雄性可育传粉系中。
所需谷粒或种子性状为显著影响经济类型、萌发或抗病性的种子的营养或生理特征。所需谷粒或种子性状包括诸如油、蛋白质和淀粉含量以及蛋白质品质和淀粉类型的这类特征。用本发明的方法产生可用于不同市场的专门化种子或谷粒类型。例如，高油玉米用来代替加入牲畜饲料的动物脂肪。高直链淀粉玉米用来制备胶粘剂、可降解塑料膜和包装材料。来自蜡质玉米的淀粉用于许多不同的食品中，诸如汤和布丁。
雄性可育传粉系可以携带影响淀粉和蛋白质特性的一种或多种基因。影响淀粉和蛋白质特性的基因包括但不限于含糖(su)、直链淀粉伸展物(amylose-extender)(ae)、脆的(bt)、暗淡(du)、粉质(fl)、不透明(o)、角质(h)、皱缩(sh)和蜡质(wx)。参见例如Hannah等，Sci.Hortic. 55：177-197(1993)。已经特征鉴定了得自ae、du、wx、ae和aewx纯合隐性的玉米植株的淀粉的性质。参见Brockett等，Starch/Starke  40：175-177(1988)和美国专利第5,516,939号。
或者，可以用影响淀粉含量的基因转化传粉系。例如，可以用编码ADP葡萄糖焦磷酸化酶的细菌基因转化雄性可育传粉系，该酶在存在抑制所述植物酶的代谢物的情况下有活性。所得种子的淀粉含量较高。参见Sivak等，J.of Environ.Polymer Degradation  3(3)：145-152(1995)。
传粉系可以携带影响脂肪酸含量的一种或多种基因。例如，fanl基因控制大豆低亚麻脂肪酸。Hammond等，Crop Sci. 231：192(1993)。fas基因控制大豆的高硬脂酸含量。Graef等，Crop Sci. 25：1076(1985)。fap1和fap2基因分别控制大豆的低棕榈酸含量和高棕榈酸含量。Erickson等，Crop Sci. 18：544(1988)。
可以用影响种子油含量的基因转化传粉系。例如，传粉系可以携带编码硬脂酰-酰基载体蛋白(硬脂酰-ACP)去饱和酶的基因，该酶催化种子油生物合成中的第一个去饱和步骤。硬脂酰-ACP去饱和酶基因可以操作性地连接至种子特异性启动子。用硬脂酰-ACP去饱和酶基因转化的诸如向日葵、玉米、canola或大豆的植株，产生改变的硬脂酸水平，可以用以产生含水平修饰或改变的饱和和不饱和脂肪酸的种子油。参见例如美国专利第5,443,974号。
或者，传粉系可以携带抑制在所述谷粒或种子性状的生物合成途径中靶基因表达的反义基因。例如，传粉系携带抑制硬脂酰-ACP去饱和酶表达的反义基因。所述反义基因可以操作性地连接至种子特异性启动子。用硬脂酰-ACP去饱和酶反义基因转化的植株在种子中产生提高的硬脂酸水平。参见例如Knutzon等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA  89：2624-2628(1992)。
按照顶交法在种子生产大田中种植的雄性不育亲本种子和雄性可育传粉亲本种子的比率，取决于每种亲本的遗传学并且可以改变，以使产量最佳化。雄性不育亲本与雄性可育传粉亲本之比的范围为约6∶1至约9∶1。雄性不育亲本与雄性可育传粉亲本之比优选约8∶1。雄性不育亲本与雄性可育传粉亲本之比最优选约9∶1。
参考以下实施例，将更容易理解由此一般描述的本发明，提供述实施例是为了说明，而不是限制本发明。
实施例1：通过高组成型表达抗生物素蛋白制备雄性不育转基因玉米
在欧洲专利申请第0 442 174A1中，已经描述了产生转基因玉米植株的方法，该申请通过引用结合到本文中。以下简述该方法。
PHI5168是一种载体，携带在遍在蛋白启动子控制下的抗生物素蛋白基因，也含有PINII终止子序列，用该质粒产生转基因玉米植株。图1显示了PHI5168的构建。PHI610是一种表达载体，携带在双35S启动子控制下的bar基因，也含有PINII终止子序列，将其与抗生物素蛋白构成物一起共转化，使得可以通过用双丙氨膦处理转化混合物来选择转基因植株。PHI610的结构示于图2。按照Green等， Molecular Genetics of Plants and Animals，Downey等编辑，Academic Press，NY，20，147(1983)的方法，将这两种表达载体转化入得自II型胚胎发生培养物的胚胎发生悬浮培养物。在补充2 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)和30g/L蔗糖的Murashige等，Physio.Plant  15：453(1962)中所述的Murashige和Skoog(“MS”)培养基中维持培养物。在该试验前7天，使悬浮培养物通过710微米筛，并将滤液在MS培养基中维持。
通过在Buchner漏斗(Whatman 614号)上真空过滤，从悬浮培养物收获细胞，将100ml(鲜重)细胞置于3.3 cm培养皿中。将细胞分装到0.5ml新鲜培养基中，以形成细胞薄层。将未盖盖的培养皿置于Biolistics Inc.(Geneva，NY)制造的粒子枪装置的样品室中。用真空泵将室内压力降至0.1大气压，以减少空气摩擦使微粒减速。用平均直径约1.2微米的钨粒子(GTE Sylvania Precision Materials Group，Towanda，Pennsylvania)轰击细胞。通过在1.5ml Eppendorf管中，将5μl pH7.7 TE缓冲液中的DNA溶液(1μg DNA/100 lambda)加入含50 mg钨粒子/ml蒸馏水的25μl悬浮液中，将PHI5168和PHO610的相同的混合物装载到微粒上。粒子变得聚集，并在管中沉淀。
在560R(培养基)(基于N6、具有1mg/ml双丙氨膦的培养基)中培养含有外源基因的转化植物细胞的培养物4-8周。该培养基选择表达bar基因的田包。
然后，在胚胎发生培养物中诱导形成胚胎，并将所述细胞萌发为植株。顺序使用两种培养基，以萌发在愈伤组织维持培养基上观察到的体细胞胚。将愈伤组织首先转移至含有5.0 mg/L吲哚乙酸(IAA)的培养基中10-14天，而愈伤组织继续增殖。愈伤组织负载为50mg/培养皿，以使每单位物质量的回收率最佳化。
然后，将愈伤组织从“成熟”培养基转移至含有IAA水平(1mg/L)低于第一培养基的第二培养基。此时，培养物置于光照下。萌发的体细胞胚的特征为具有延伸有连接根入口(connecting root access)的绿苗。然后将体细胞胚再转移至培养管(150×25mm)中的培养基10-14天。此时，植株高约7-10cm，具有足够的大小和活力以锻炼适应温室条件。
为了锻炼再生植株，从无菌容器中取出待转移至生长室的植株，从根部中洗去固化琼脂培养基。将小植株置于生长室的市售的盆栽混合物中，所述生长室具有下雾化装置，用于将相对湿度维持在100％左右，而不使植株根过度湿润。在下雾室中3-4周后，植株足够强壮，可以移植到大田条件下。
通过观察雄性不育性，分析大田中的植株。然后通过PCR和DNA印迹进一步分析选定植株存在抗生物素蛋白基因的情况，用标准方法通过ELISA分析抗生物素蛋白的表达。
通过PCR分析了94株植株，其中53株发现为可育的，41株为不育的。将每株植株的育性与经PCR检测的抗生物素蛋白基因的存在相比，发现所述基因的存在和植株不育性之间的相关性为98％。通过DNA印迹，详细分析5株植株抗生物素蛋白基因存在的情况。DNA印迹分析显示3株植株含有抗生物素蛋白基因。所有这3株植株均显示不育性。不具有抗生物素蛋白基因的2株植株完全可育。因此，在抗生物素蛋白基因的存在和雄性不育性之间的相关性为100％。
实施例2：使用含有带有抗生物素蛋白编码DNA序列的双元载体的土壤杆菌菌株，产生雄性不育转基因大豆植株
在美国专利申请系列第07/920,409号(该申请通过引用结合到本文中)中描述了产生转基因大豆植株的方法。通过暴露于玻璃钟罩内放出的氯气，将先锋(Pioneer)变种943 1的大豆( Glycine  max)种子表面消毒。通过将3.5ml盐酸(34-37％w/w)加至100ml次氯酸钠(5.25％w/w)产生气体。在体积约1立方英尺的容器中暴露16-20小时。表面消毒的种子室温贮存于培养皿中。通过在按照Gambourg的1/10强度琼脂固化的无植物生长调节物的培养基(具有基本有机物的B5基础培养基，Sigma Chemical Catalog No.G5893，0.32 gm/L蔗糖；0.2％(重量/体积)2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)(3.0mM))中种植，并于28℃、16小时日长和约20μEm-2 S-1的冷白荧光光照下培养，使种子萌发。3或4天后，制备种子用于协同培养。去除种皮，在子叶下去除3-4mm延长的胚根。
根癌土壤杆菌菌株LBA4404带有含抗生物素蛋白基因的修饰的双元质粒，在含有1μg/ml四环素的基本A培养基中使该菌株的过夜培养物生长至对数期，将其合并，读取550nm下的光密度测量值。将足够体积的培养物置于15ml/锥形离心管中，使得沉淀时，含109细胞/ml的每管收集1-2×1010细胞。以6,000×g离心10分钟进行沉淀。离心后，弃去上清液，将管置于室温下直至需要接种，但时间不多于1小时。
分批进行接种，使得每个平板的种子用新重悬浮的土壤杆菌沉淀处理。将细菌沉淀单独重悬浮于20ml接种培养基中，所述培养基含有3.2g/L B5盐(G5893)、2.0％w/v蔗糖、45μM 6-苄基氨基嘌呤(BAP)、0.5μM吲哚丁酸(IBA)、100μM乙酰丁香酮(AS)，用10 mM MES缓冲至pH 5.5。通过涡旋混合得到重悬浮液。然后，将接种物倾至含所制备种子的培养皿中，用手术刀片使子叶节变细。通过将种子通过苗端纵向切为两半，保存两片完整的子叶，达到这一点。然后，一手术刀片将其橇开，分成两半苗端。用手术刀片沿对称轴重复划，使子叶节变细。小心不要将外植体完全切至轴面(axial side)。在大致5分钟内制备外植体，然后于室温无搅拌下与细菌一起温育30分钟。30分钟后，将外植体转移至用0.2％w/v Gelrite(Merch&Company Inc.)固化的相同培养基的培养皿中。近轴面向上包埋外植体，与培养基表面齐平并在22℃、约20μEm-2 S-1的冷白荧光灯下培养3天。
3天后，将外植体移至液体反选择培养基，该培养基含3.2g/l B5盐(G5893)、2.0％w/v蔗糖、5μM BAP、0.5μM IBA、200μg/ml万古霉素、500μg/ml头孢氨噻肟，用3mM MES缓冲至pH 5.7。在恒定的缓慢旋转搅拌下，于室温下在每个培养皿中洗涤外植体4天。更换反选择培养基4次。
然后，将外植体挑至琼脂糖固化的选择培养基上，该培养基含3.2g/l B5盐(G5893)、2.0％w/v蔗糖、5.0μM BAP、0.5μM IBA、50μg/ml硫酸卡那霉素、100μg/ml万古霉素、30μg/ml头孢氨噻肟、30μg/ml替卡西林-克拉维酸，用3 mM MES缓冲至pH 5.7。用0.3％w/v Seakem琼脂糖固化选择培养基。将外植体近轴面向下包埋在该培养基中，于28℃、60-80μEm-2 S-1的冷白荧光灯下以16小时日长培养。
2周后，再用液体培养基在旋转式振荡器上洗涤外植体。在含有50μg/ml硫酸卡那霉素的反选择培养基中过夜洗涤。第二天，将外植体挑到琼脂糖固化的选择培养基。将它们近轴面向下包埋在培养基中，再培养2周。
在选择培养基上1个月后，相对白化的非健康组织背景，可见到作为绿色扇形面再生组织的转化组织。弃去无绿色扇形面的外植体，将具有绿色扇形面的外植体转移至延伸培养基，该培养基含有3.2g/lB5盐(G5893)、2％w/v蔗糖、3.3μM IBA、1.7μM赤霉酸、100μg/ml万古霉素、30μg/ml头孢氨噻肟和30μg/ml替卡西林-克拉维酸，用3mM MES缓冲至pH 5.7。延伸培养基用0.2％w/v Gelrite固化。将绿色扇形面近轴面向上包埋，并如上进行培养。在该培养基上进行培养，每2周转移至新鲜培养皿上。当苗长0.5 cm时，将它们于基部切下，置于13×100ml试管中的生根培养基中。生根培养基由3.2g/l B5盐(G5893)、15g/l蔗糖、20μM烟酸、900mg/L焦谷氨酸(PGA)和10μMIBA组成。用3mM MES将生根培养基缓冲至pH 5.7，用0.2％w/vGelrite固化。10天后，将苗转移至无IBA或PGA的相同培养基。苗生根，并在这些试管中保持在与上述相同的环境条件下。
当根系充分建立时，将小植株转移至无菌土壤。温度、光周期和光强保持与上述相同。
用ELISA证实并定量测定了转基因大豆植株中抗生物素蛋白的表达，通过PCR和DNA印迹证实了所述基因的存在。在连续世代中用这些相同方法评估了表达的稳定性。发现不育性问题与大豆中抗生物素蛋白的表达相关。
实施例3：通过表达抗生物素蛋白制备雄性不育向日葵植株
用编码抗生物素蛋白的表达盒产生转基因向日葵植株和种子。将编码抗生物素蛋白的DNA序列***表达盒中，使其处于遍在蛋白启动子控制之下。然后，用EcoR1位点将该表达盒亚克隆入诸如PHI 5765的双元载体中。然后，将所述双元载体转移入根癌土壤杆菌辅助菌株申。
用微粒轰击后的土壤杆菌菌株LBA4404转化向日葵植株，所述微粒轰击如Bidney等，PlantMol.Biol. 18：301(1992)所述。简而言之，将先锋向日葵系SMF-3的种子除壳并表面消毒。使种子于26℃黑暗中，在用水湿润的滤纸上吸涨18小时。取出子叶和胚根(root radical)，在374BGA培养基(MS盐、Shephard维生素、40mg/L硫酸腺嘌呤、3％蔗糖、1.a％phytagar pH 5.6加0.5mg/L BAP、0.25mg/L IAA和0.1mg/LGA)上培养分生组织外植体。24小时后，去除初生叶，以暴露顶端分生组织，将外植体顶端圆顶向上，置于含水琼脂的60mm×20mm培养皿中央的2cm圆圈内。用悬浮于TE缓冲液的钨粒子或结合含抗生物素蛋白基因的表达载体的粒子轰击外植体2次。分生组织外植体在374BGA培养基上，在26℃光照下再协同培养72小时，
在72小时协同培养后，将土壤杆菌处理的分生组织转移至374培养基(具有1％蔗糖且无BAP、IAA或GA3的374BGA)并补充250μg/ml头孢氨噻肟。让小植株在16小时日长和26℃的培养条件下再发育2周，发育为绿色或白化。将小植株转移至含卡那霉素的培养基上，让其生长。如实施例2所述，证实并定量测定植株中抗生物素蛋白的存在。发现雄性不育性的存在与植株表达抗生物素蛋白相关。
尽管以上涉及特别优选的实施方案，但应该理解，本发明不限于此。本领域技术人员会认识到，可以对所公开的实施方案进行各种修改，这种修改属于本发明范围，本发明的范围由以下权利要求限定。本说明书中提及的所有出版物和专利申请均代表本发明涉及领域的技术人员的水平。

Claims (43)

1.分离的DNA分子，包含操作性连接至编码链霉抗生物素蛋白的核苷酸序列的花药特异性启动子。
2.表达载体，包含权利要求1的分离的DNA分子。
3.权利要求2的表达载体，其中编码信号序列的核苷酸序列操作性连接至所述编码链霉抗生物素蛋白的核苷酸序列。
4.权利要求3的表达载体，其中所述信号序列是大麦α-淀粉酶信号序列。
5.产生转基因雄性不育植株的方法，包括：向植物细胞引入表达载体，所述表达载体包含操作性连接至链霉抗生物素蛋白基因的植物相容启动子和编码信号序列的核苷酸序列；并且由所述细胞再生转基因植株，其中所述植物相容启动子控制所述基因的表达，藉此所述链霉抗生物素蛋白基因的表达引起所述转基因植株的雄性不育性。
6.权利要求5的方法，其中所述信号序列是大麦α-淀粉酶信号序列。
7.权利要求5的方法，其中所述植物相容启动子是花药特异性启动子。
8.权利要求5的方法，其中植物相容启动子是组成型启动子。
9.权利要求8的方法，其中组成型启动子是遍在蛋白启动子。
10.  用链霉抗生物素蛋白基因产生雄性可育杂种植株的方法，包括以下步骤：
(a)产生第一亲本雄性不育植株，所述植株包含操作性连接至链霉抗生物素蛋白基因的植物相容启动子和编码信号序列的核苷酸序列的DNA分子，其中所述链霉抗生物素蛋白的表达引起雄性不育性；
(b)产生表达第一外源基因的第二转基因亲本植株；和
(c)使所述第一亲本雄性不育植物与所述第二转基因亲本植物异花受精，产生杂种植株，
其中所述杂种植株表达所述第二外源基因，并且其中所述第二外源基因的产物减少链霉抗生物素蛋白在所述杂种植株中的表达，藉此产生雄性可育杂种植株。
11.权利要求10的方法，其中所述植物相容启动子是组成型启动子。
12.权利要求10的方法，其中所述组成型启动子是遍在蛋白启动子。
13.权利要求10的方法，其中所述信号序列是大麦α-淀粉酶信号序列。
14.权利要求10的方法，其中所述植物相容启动子是花药特异性启动子。
15.权利要求10的方法，其中第二外源基因选自：反义基因、核酶基因和外部指导序列基因。
16.权利要求15的方法，其中所述反义基因包括链霉抗生物素蛋白mRNA序列。
17.权利要求15的方法，其中所述核酶基因包括链霉抗生物素蛋白mRNA序列。
18.权利要求15的方法，其中所述外部指导序列基因包括链霉抗生物素蛋白mRNA序列。
19.权利要求10的方法，其中第一亲本雄性不育植株的所述DNA分子还包含操作性连接至所述植物相容启动子的LexA操纵基因，并且其中所述第二外源基因为LexA抑制基因。
20.产生具有所需谷粒性状的种子的方法，包括以下步骤：
(a)产生雄性不育的第一亲本植株，所述植株包含操作性连接至链霉抗生物素蛋白基因和植物相容启动子的编码信号序列的核苷酸序列；
(b)产生雄性可育的第二亲本植株，所述植株携带控制所述所需谷粒性状的基因；
(c)使所述第一亲本植物与所述第二亲本植物异花受精，产生具有所述谷粒性状的杂种种子；和
(d)收获所述种子。
21.权利要求20的方法，其中所述第一亲本植株为杂种植株。
22.权利要求20的方法，其中所述谷粒性状选自油、蛋白质和淀粉的含量。
23.权利要求20的方法，其中所述第一和第二亲本植株选自玉米、大豆、canola和向日葵。
24.权利要求10或20的方法，其中所述植物相容启动子序列为包含选自以下花药框的花药特异性启动子序列：
(a)具有SEQ ID NO：4核苷酸序列的DNA分子；
(b)具有SEQ ID NO：5核苷酸序列的DNA分子；
(c)具有SEQ ID NO：6核苷酸序列的DNA分子；
(d)具有启动子活性的(a)、(b)或(c)的功能片段。
25.权利要求24的方法，其中所述花药框具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列，并且其中所述花药特异性启动子还包含选自以下的核心启动子：
(a)CaMV 35S核心启动子；
(b)具有SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA分子；
(c)具有SEQ ID NO：8核苷酸序列的DNA分子；
(d)具有SEQ ID NO：9核苷酸序列的DNA分子；和
(e)具有启动子活性的(b)、(c)或(d)的功能片段。
26.权利要求24的方法，其中所述花药框具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列，并且其中所述花药特异性启动子还包含选自以下的核心启动子：
(a)CaMV 35S核心启动子；
(b)具有SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA分子；
(c)具有SEQ ID NO：8核苷酸序列的DNA分子；
(d)具有SEQ ID NO：9核苷酸序列的DNA分子；和
(e)具有启动子活性的(b)、(c)或(d)的功能片段。
27.权利要求23的方法，其中所述花药框具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列，并且其中所述花药特异性启动子还包含选自以下的核心启动子：
(a)CaMV 35S核心启动子；
(b)具有SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA分子；
(c)具有SEQ ID NO：8核苷酸序列的DNA分子；
(d)具有SEQ ID NO：9核苷酸序列的DNA分子；和
(e)具有启动子活性的(b)、(c)或(d)的功能片段。
28.产生转基因雄性不育植株的方法，包括：向植物细胞引入表达载体，所述表达载体包含操作性连接至链霉抗生物素蛋白基因的组织特异性启动子和编码信号序列的核苷酸序列；并且由所述细胞再生转基因植株，其中所述启动子控制所述基因的表达，藉此所述链霉抗生物素蛋白基因的表达引起所述转基因植株的雄性不育性。
29.权利要求28的方法，其中所述信号序列是大麦α-淀粉酶信号序列。
30.权利要求28的方法，其中所述组织特异性启动子包括花药特异性启动子。
31.被赋予雄性不育性的植株恢复育性的方法，所述植株表达一种DNA分子，所述DNA分子包含操作性连接至抗生物素蛋白基因的植物启动子和编码信号序列的核苷酸序列，所述方法包括用生物素溶液喷洒所述植株。
32.权利要求31的方法，其中所述信号序列是大麦α-淀粉酶信号序列。
33.产生具有所需谷粒性状的种子的方法，包括以下步骤：
(a)产生雄性不育的第一亲本植株，所述植株包含操作性连接至组织特异性启动子序列的编码链霉抗生物素蛋白的核苷酸序列；
(b)产生雄性可育的第二亲本植株，所述植株携带控制所述所需谷粒性状的基因；
(c)使所述第一亲本植物与所述第二亲本植物异花受精，产生具有所述谷粒性状的杂种种子；和
(d)收获所述种子。
34.权利要求33的方法，其中所述第一和第二植株选自玉米、大豆、canola和向日葵。
35.权利要求34的方法，其中所述第一和第二植株是玉米。
36.权利要求34的方法，其中所述第一和第二植株是大豆。
37.权利要求34的方法，其中所述第一和第二植株是向日葵。
38.权利要求33的方法，其中所述启动子序列为包含选自以下花药框的花药特异性启动子序列：
(a)具有SEQ ID NO：4核苷酸序列的DNA分子；
(b)具有SEQ ID NO：5核苷酸序列的DNA分子；
(c)具有SEQ ID NO：6核苷酸序列的DNA分子；
(d)具有启动子活性的(a)、(b)或(c)的功能片段。
39.权利要求38的方法，其中所述花药框具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列，并且其中所述花药特异性启动子还包含选自以下的核心启动子：
(a)CaMV 35S核心启动子；
(b)具有SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA分子；
(c)具有SEQ ID NO：8核苷酸序列的DNA分子；
(d)具有SEQ ID NO：9核苷酸序列的DNA分子；和
(e)具有启动子活性的(b)、(c)或(d)的功能片段。
40.权利要求38的方法，其中所述花药框具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列，并且其中所述花药特异性启动子还包含选自以下的核心启动子：
(a)CaMV 35S核心启动子；
(b)具有SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA分子；
(c)具有SEQ ID NO：8核苷酸序列的DNA分子；
(d)具有SEQ ID NO：9核苷酸序列的DNA分子；和
(e)具有启动子活性的(b)、(c)或(d)的功能片段。
41.权利要求38的方法，其中所述花药框具有SEQ ID NO：6的核苷酸序列，并且其中所述花药特异性启动子还包含选自以下的核心启动子：
(a)CaMV 35S核心启动子；
(b)具有SEQ ID NO：7核苷酸序列的DNA分子；
(c)具有SEQ ID NO：8核苷酸序列的DNA分子；
(d)具有SEQ ID NO：9核苷酸序列的DNA分子；和
(e)具有启动子活性的(b)、(c)或(d)的功能片段。
42.权利要求33的方法，其中所述谷粒性状选自油、蛋白质和淀粉的含量。
43.权利要求33的方法，其中所述第一亲本植株是杂种植株。
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