CN1699580A - 一种调控植物组织或器官凋亡的方法及其专用表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种调控植物组织或器官凋亡的方法及其专用表达载体。本发明所提供的调控植物组织或器官凋亡的表达载体，是含有胞嘧啶脱氨酶基因表达盒的植物表达载体，所述胞嘧啶脱氨酶基因表达盒包括植物组织特异性启动子，胞嘧啶脱氨酶基因和终止子。调控植物组织或器官凋亡的方法，是将该调控植物组织或器官凋亡的表达载体导入植物细胞、组织或器官中，筛选得到可表达胞嘧啶脱氨酶基因的转基因植株，利用5－氟胞嘧啶诱导转基因植株的目标组织或器官凋亡。本发明的调控植物组织或器官凋亡的方法，使人们能够根据自己的意愿随时、定向、彻底地除去不需要的植物或作物的某一器官或组织而保留所需要的部分，并且对所保留的所需要的部分不产生负作用。

Description

一种调控植物组织或器官凋亡的方法及其专用表达载体

技术领域

本发明涉及一种调控植物组织或器官凋亡的方法及其专用表达载体。

背景技术

在自然界，植物与其它种类的生物一样，具有自身决定的细胞程序性死亡，例如，落花、落果、落叶等。这些细胞程序性死亡是由生物自身的基因所决定，外界因素，如光、温、湿和生长调节剂等最多只能对其起微量的调节作用，而无法控制这一进程是否发生。在人类利用植物生产人类所需要的产品时，往往需要并且希望能人工控制植物某一特定组织、器官乃至整个个体的生长发育进程，包括死亡。例如，当棉花、玉米和番茄等成熟时，人们希望整株的叶片凋萎脱离，以方便采收，特别是机械采收；人们也希望杨树在春天不产生飞絮、法国梧桐(二球悬铃木)在春夏不产生“飞絮”；为了利用作物的杂种优势，人们希望有稳定而且完全的雄性不育系。但在自然状态下，人们的这种希望仅仅是一种希望，因为棉花、玉米和番茄植株在其果实或种子成熟时仍然有很多叶片处于活跃期，仍然在为植株生产所需的碳水化合物等；杨树和法国梧桐的“飞絮”是它们为了繁衍后代所开的花或结的籽。为了实现控制植物某一特定组织、器官乃至整个个体的生长发育进程，人们在习惯上往往多利用化学剂，例如，用乙烯利使番茄落叶；用化学杀雄剂去雄等。然而，问题是，这些化学剂往往没有选择性，在使目标组织或器官致死的同时，也对其它非目标组织或器官乃至整体都生产毒害或致死作用。例如，化学杀雄剂在杀死花药花粉的同时，也对雌蕊和叶片产生毒害。

为了克服纯化学剂的缺点，人们转向生物技术，特别是基因工程技术。近十几年来，利用基因工程来控制植物某一特定组织、器官乃至整个个体的生长发育和死亡进程取得了长足的进展。Mariani等利用花药绒毡层特异性启动子TA29与细胞毒素酶基因(RNase T1或Barnase)连接构建成嵌合基因，通过农杆菌介导转入烟草和油菜中，细胞毒素酶基因在转基因植株的花药中特异性地表达，将花药的绒毡层细胞杀死，从而获得了雄性不育的植株。Van der Meer等将“花药盒”(anther box)和CaMV 35S启动子串联，然后与CHS(查尔酮合成酶)的反义基因融合构建成花粉特异性表达载体，转化矮牵牛的结果表明：CHS反义基因的花粉特异性表达在抑制CHS合成、导致类黄酮合成受阻的同时，阻断了花粉的发育，造成了雄性不育。根据同样的原理，花药中特异表达反义LAT52和反义Bcpl基因，也得到了雄性不育。药绒毡层特异性表达反义肌动蛋白基因(actin)在转基因番茄和小麦等作物上也获得了雄性不育株。这些成功范例实现了人类定向控制植物某一特定组织、器官乃至整个个体的生长发育和死亡进程的梦想，但还没有实现人们按照自己的意愿随时定向控制植物某一特定组织、器官乃至整个个体的生长发育和死亡进程的梦想。例如，在Mariani等的体系中，获得的转基因植株发育到花药形成时就自己启动细胞毒素基因(RNase T1或Barnase)的表达而杀死花药细胞，人们无法干预。1996年，Kriete等的工作突破了这种限制，初步实现了人们按照自己的意愿随时定向控制植物某一特定组织、器官乃至整个个体的生长发育和死亡进程的梦想。大肠杆菌argE基因的产物为N-乙酰-L-鸟氨酸脱乙酰酶，它可以把非毒性的物质N-乙酰-L-磷丝菌素(N-ac-pt)脱去乙酰基，转化为毒素物质L-磷丝菌素，即PPT(除草剂Basta等的活性成分)。组成型启动子(CaMV35S启动子)与argE基因构成嵌合基因在转基因烟草中表达并不影响其生物学及形态学性状，但当叶面施用外源N-ac-pt时，转基因烟草叶面出现坏死斑；在含有N-ac-pt的培养基上，转基因烟草由于对N-ac-pt的吸收而出现叶面变白，以至整株枯死的现象。他们还将argE基因置于花药特异性启动子TA29的控制之下，转化烟草，在花粉发育时期施用N-ac-pt，转基因植株的花药变空，表现为雄性不育，而不施用N-ac-pt时，转基因植株的花药正常可育。该体系的主要缺点是，用于诱导的非毒性物质N-乙酰-L-磷丝菌素(N-ac-pt)迄今为止仍然没有商品化生产。

胞嘧啶脱氨酶基因(codA)编码胞嘧啶脱氨酶(Cytosine Deaminase，CD)，最早从大肠杆菌(E.coli)中克隆出。在细菌和真菌体内发现有胞嘧啶脱氨酶，但在高等植物细胞和哺乳动物细胞内以及代谢活跃的植物样品等没有发现它的存在(Stougaard等，1993，Plant J，3：755-761；Austin等，1993，Mol.Pharmacol.，43：380-387)。在细菌体内，CD参与核酸的合成代谢。它把5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)脱氨为5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，而5-FU被代谢为5-FUTP(5-氟三磷酸尿苷)和5-FdUTP(5-氟三磷酸脱氧尿苷)。5-FUTP能代替UTP整合到RNA从而抑制rRNA和mRNA的合成。5-FdUTP可抑制胸腺苷酸合成酶(TS)，从而抑制胸腺苷酸的合成，导致dNTP的衰竭从而引起了细胞的DNA合成障碍。也就是说5-FU可以从RNA和DNA分子水平来干扰细胞的存活，因而是细胞毒剂，而其前体药物5-FC则是无毒无害。

codA基因在人体及动物的肿瘤治疗方面的研究在国内外都有很多。在国内，王宝梅等以重组腺病毒ADCD为载体将大肠杆菌codA基因体外转染小鼠红白血病细胞(FBL3)，得到的转基因细胞对5-FC的敏感性显著提高，并对小鼠皮下肿瘤结节的生长有明显的杀伤效果。宋艳斌等用含codA基因的高滴度逆转录病毒感染小鼠T淋巴细胞(T/PCD2)，表达结果表明，外用5-FC浓度大于1μmol/L时，对转基因细胞有显著的杀伤作用，而对未转基因的正常T淋巴细胞基本无毒性，且转基因细胞在加入5-FC后生存时间明显短于未转基因的细胞。陈纲等的结果显示，亚叶酸钙(CF)与5-FC合用，对转codA基因的直肠癌细胞的杀伤作用显著增强。对肺癌、乳腺癌、胶质瘤、淋巴瘤以及***癌等的治疗研究结果也表明，codA/5-FC的联合作用均有一定的疗效。

在植物上，codA基因主要用作转基因植物研究的一种选择标记基因。Helmi等将组成型codA基因转入烟草，转基因烟草耐受5-FC的能力明显比未转基因的对照低：未转codA基因的烟草叶盘在含5-FC 1000mg/L的分化培养基上都生长良好，而转codA基因的烟草叶盘在250mg/L的分化培养基上只有20％可以分化再生。Babwah等发现，野生型芸薹的子叶、胚轴、真叶和根在5-FC 1600mg/L上生长16天都没有显著的影响，而转组成型codA基因的芸薹植株则对培养基中的5-FC就非常敏感。Dai等发现野生型水稻的幼胚和种子在含5-FC分别为500mg/L和1.5g/L的培养基上正常生长或正常萌发，而在含有5-FU分别为25mg/L和50mg/L的培养基上则停止发育或停止萌发。他们将codA基因转入水稻，转基因植株的子代有3/4对5-FC敏感。Prasad等在榨菜上的结果表明，导入的codA基因在子一代可以稳定表达。codA基因作为选择标记基因还被转入拟南芥和日本山茶莲等植物，其在转基因植物中的表达效率可以通过T-DNA的非同源性重组来提高。

上述结果表明，植物，特别高等植物，尽管自身因为没有codA基因或codA基因不表达而对外源5-FC不敏感，但是对外源5-FU却非常敏感。这暗示，5-FU也可以从RNA和DNA分子水平来干扰植物细胞的存活。外源codA基因在植物体内不仅能正确表达，而且表达产物-胞嘧啶脱氨酶(CD)能将外源无毒的5-FC在体内转化成有毒的5-FU，从而赋予转基因细胞、组织、器官乃至个体对无毒的5-FC的敏感性。

发明内容

本发明的目的是提供一种可用于定时定向调控植物组织或器官凋亡的表达载体。

本发明所提供的调控植物组织或器官凋亡的表达载体，是含有胞嘧啶脱氨酶基因表达盒的植物表达载体，所述胞嘧啶脱氨酶(codA)基因表达盒包括植物组织特异性启动子，胞嘧啶脱氨酶基因和终止子。

所述胞嘧啶脱氨酶基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID No.2；

2)编码胞嘧啶脱氨酶的核苷酸序列；所述胞嘧啶脱氨酶具有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID No.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有胞嘧啶脱氨酶活性的蛋白质；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中的SEQ ID No.2由1824个碱基组成，其编码序列为自5’端第1位-1824位碱基，编码具有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸残基序列的胞嘧啶脱氨酶。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

所述高严谨条件可为在2×SSPE(或2×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜。

所述组织特异性启动子是能驱动基因(内源和外源)编码区在植物的特定组织或器官表达而在其它组织和器官都不表达的启动子。所述植物组织特异性启动子可为花药或花粉特异性启动子、花丝特异性启动子、花瓣特异性启动子、子房特异性启动子、花柱特异性启动子、柱头特异性启动子、叶片特异性启动子、种子或胚特异性启动子或根特异性启动子等。

所述花药或花粉特异性启动子包括TA29、A3、A8、AG、Amb aI、BA42、BA112、BA158、Bcp1、Bp4B、Bp4C、Bp19、BetVI、BetvIII、ca55、CDPK、ChiA、ChiB、ChsA、Def A、E1、E2、F2s、13#、17#、G10、KBG41、LAT52、LAT59、Lol P1、Lol Pib、Lec6、MS2、Osg6B、P2、SF1、SF2、SF3、SF5、SF6、SF9、SF16、SF18、SF19、TA13、TA20、TA32、TA56、T72、Tap2、TUA1或Zm13启动子等；所述花丝特异性启动子包括TSJT1等；所述花瓣特异性启动子包括(cell-wall)P4等；所述子房特异性启动子包括TRRP-F1，iaaH.DefH-9等；所述花柱特异性启动子包括SA2-Rnase、Chi2：1、SIs、SLG-13和Sp4等；所述柱头特异性启动子包括ARC1和ARClBoler等；所述种子或胚特异性启动子包括Napin B、Gtl、Lea(LEA)、REP-2、BCSP666、nad6、oleosin、AB13、Fus3、KCS和Vp1等；所述的叶片特异性启动子包括psbA、Osppc和St-LS1等；所述根特异性启动子包括HRGP、PRP1、PRP2、Lec、WGA和RB7等。

所述花药特异性启动子优选为TA29。

所述终止子包括Nos终止子，Ocs终止子(章鱼碱合成酶基因的终止子)和花椰菜花叶病毒(CaMV)35s终止子。

用于构建所述调控植物组织或器官凋亡的表达载体的出发载体可为Ti类质粒载体和病毒载体，优选为Ti类质粒载体。

所述Ti类质粒载体优选为目前通用或商品双元载体，如pCAMBIA3301，pBI101，pBI121，pBIN19等。

为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入可选择性标记(GUS基因、GFP和荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记基因(如抗卡那霉素基因NPT II、NPT I和NPT III，抗潮霉素基因hpt等)或除草剂抗性基因(如，bar、PAT、bxn、aroA、EPSPS等)。

所述调控植物组织或器官凋亡的表达载体优为p3dAJM。

本发明的第二个目的提供一种定时定向调控植物组织或器官凋亡的方法。

本发明所提供的调控植物组织或器官凋亡的方法，是将上述调控植物组织或器官凋亡的表达载体导入植物细胞、组织或器官中，筛选得到可表达胞嘧啶脱氨酶基因的转基因植株，利用5-氟胞嘧啶诱导转基因植株的目标组织或器官凋亡。

所述5-氟胞嘧啶的使用时期为目标凋亡组织或器官发育期前7-14天；优选的使用时期为目标凋亡组织或器官发育期前7天。

所述目标凋亡组织或器官为花药时，所述5-氟胞嘧啶的使用时期为花药绒毡层形成前7-14天。

所述被调控的植物可为自花授粉或常自花授粉的单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物包括小麦、水稻、高梁、谷子和玉米；所述双子叶植物包括烟草、油菜、大白菜、小白菜、甘蓝、番茄、黄瓜、甜瓜、西瓜、辣椒和棉花。

所述5-氟胞嘧啶的适宜使用浓度为对非目标调亡组织或器官不产生毒害的最高浓度，可为100-350mM。对于双子叶植物(烟草)，5-氟胞嘧啶的使用浓度为100-200mM时效果较好，对于单子叶植物，5-氟胞嘧啶的使用浓度为为250-350mM时效果较好。

本发明的调控植物组织或器官凋亡的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本发明通过调控植物组织或器官凋亡的表达载体实现胞嘧啶脱氨酶基因的定向表达，通过5-氟胞嘧啶实现定时诱导组织或器官凋亡。

本发明的调控植物组织或器官凋亡的方法，使人们能够根据自己的意愿随时、定向、彻底地除去不需要的植物或作物的某一器官或组织而保留所需要的部分，并且对所保留的所需要的部分不产生负作用。如，在番茄和棉花上，可以将叶片特异性启动子控制的codA基因导入，在转基因番茄或棉花成熟时，通过施用上述的无毒诱导剂(5-FC)来杀死叶片，而保留番茄或棉花果及其植株，从而方便采收，特别是机械采收。而经典的去叶片的方法则多利用具有植物毒性的全身性的化学物质。例如，在番茄上，施用乙烯利能除去叶片，但也同时促进和刺激了果实的后熟，缩短了果实的储藏寿命和货架寿命。本发明的具体实施例中建立了一种新的化学调节性雄性不育/保持兼用系植物的培育方法及由此产生的杂交种子生产的“两系”法。两系法则可省去繁殖保持系及保持系与不育系杂交的操作程序，打破恢保关系的限制，可以大大地提高配组自由度，是一种前景广阔杂交育种方法。当人们需要植物或作物为雄性不育时，可以施用无毒的5-FC，定向“杀死”花药花粉；当人们需要植物或作物为雄性可育时，或人们不需要雄性不育时，不施用5-FC就可以了。而在经典的杂交种子生产时，通常必须要三系(雄性不育系、保持系和恢复系)配套，这无形中增加了育种工作的时间和资金，并且三系法可利用的亲本有限，配组不自由。现有的两系法存在雄性育性稳定性问题，到目前为止，两系法中的不育系与保持系兼得性多数依靠“光敏”或“温敏”来调节，这就导致其不育系的育性对环境敏感，容易受外界环境因素的影响以及不育系的起点温度漂移，容易造成自花授粉结实从而降低杂交种子的纯度。按照本发明方法及本发明实施例中已经建立的“两系法”则是通过人工施用或不施用化学剂来调节，不受环境因素的影响，因此，不存在育性稳定性的问题。

附图说明

图1为质粒pdAJM的部分结构示意图

图2为含有codA基因表达盒的载体pUATA的构建与结构示意图

图3为含有codA基因表达盒的5-FC诱导性花药特异性凋亡植物表达载体p3dAJM的构建与结构示意图

图4为转p3dAJM烟草植株的PCR检测

图5为转codA基因烟草的Southern杂交图谱

图6为150mM 5-FC调控转p3dAJM烟草植株和对照植株一次的花粉萌发率比较

图7为150mM 5-FC调控转p3dAJM烟草植株二次的花粉萌发结果比较

图8为150mM 5-FC调控转p3dAJM植株E-2株系三个单株一次，二次，三次的花粉萌发比较

图9为转p3dAJM小麦分化苗的PCR检测

图10为5-FC调控的转p3dAJM小麦花药大小的变化

图11为5-FC调控的转p3dAJM小麦和未转基因小麦花粉的I₂-KI染色

图12为5-FC调控的转p3dAJM小麦和未转基因小麦的小穗比较

图13为5-FC调控的转p3dAJM小麦和未转基因小麦与未经5-FC调控的转p3dAJM小麦和未转基因小麦的幼穗比较

图14为5-FC调控的转p3dAJM小麦和未转基因小麦的成熟穗的比较

图15为转p3dAJM小麦T₁代幼胚在含PPT3.0(mg/L)的培养基上的分化

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

T₀表示由愈伤组织得到的转基因植株及其无性系，T₁表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株和无性系。

实施例1、含有codA基因表达盒的5-FC诱导性花药特异性凋亡植物表达载体p3dAJM的构建

根据GenBank登记号为S56903.1的codA基因序列，设计5’端引物dA1，未端加Bam HI识别位点；设计3’端引物dA2，未端加Sac I识别位点。引物序列如下：

dA1：5’-GGA TCC ATG TCG AAT AAC GCT TTA CAA ACA A-3’(31nt)

dA2：5’-GAG CTC TCA ACG TTT GTA ATC GAT GGT TTC TGG C-3’(34nt)。

以大肠杆菌株系JM101基因组DNA为模板，经PCR扩增得到了预期的约1.3Kb的目标片段。回收此片段，并将其连接到pUCm-T(上海生工公司)载体上，构建成pdAJM(图1，Ei：EcoRI，Sa：SacI，Kp：KpnI；Nd：Nde I；Cl：ClaI；Ev：EcoRV；Nc：NcoI；Nt：NotI；Ps：PstI；Bg：BgII I；Bh：BamHI；Xh：XhoI；Xb：XbaI；S1：Sal I；Pa：PaeI；Hd：HindIII)。用Bam HI和Sac I对pdAJM进行酶切，结果切出了约1.3Kb的目标带和3.0Kb的载体带。说明1.3Kb的目标片段正确地连接到pUCm-T载体上，即pdAJM构建正确。测序结果表明扩增出的片段全长1284bp(SEQ ID No.2)，编码427个氨基酸，氨基酸序列详见SEQ ID No.1。克隆片段的核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列与GenBank登记号为S56903.1和AE000140.0的序列除了第一个氨基酸编码(翻译起始编码)为植物识别的ATG外均有100％的同源性。该片段的核苷酸序列已经在GenBank注册，登记号为AY331712。

从pdAJM质粒中用Sac I和Bam HI双酶切取下大约1.28kb的小片段，连接到经Sac I和Bam HI消化的克隆载体pG729上得到pGTA。其中，pG729是在pGEM-7(购自Promega公司)中***TA29启动子得到的，具体方法如下：根据Mariani等(1990，Nature，347：737-741)的方法从烟草品种NC89中克隆TA29启动子，在其5’和3’端分别加入Kpn I和Bam HI酶切位点，将克隆的TA29***经过Kpn I和Bam HI双酶切的pGEM-7，形成pG729。pGTA质粒用Sac I和Kpn I双酶切，取下大约1.58kb(TA29+codA)的小片段，***到用Sac I和KpnI消化的pUAN质粒(pUAN含增强子APS和终止子nos，按照杨晓东，2001，北京，中国农业大学硕士论文“花药特异性启动子的克隆和人工雄性不育基因表达载体的改良”第53页的方法构建)，得到pUATA(图2)。pUATA用Sac I和Bam HI和KpnI三酶切鉴定，结果切出1.28kb(codA基因)、450bp(APS基因)以及大约300bp(TA29启动子)三条目标带和一条2.95kb的载体带。酶切鉴定结果表明，含有codA基因表达盒的pUATA构建正确。

pUATA质粒用Xba I和Eco RI消化，取出2294bp的小片段，连接到经过Xba I和Eco RI双酶切的通用双元植物表达载体pCAMBIA3301(澳大利亚CAMBIA)上，得到codA基因化学诱导性组织特异凋亡基因表达盒的植物表达载体p3dAJM(图3)。分别用Sac I和Bam HI双酶切和Sac I和Bam HI和Kpn I三酶切p3dAJM，Sac I和Bam HI酶切得到1.28kb(codA)和750bp(APS+TA29)的目标带和12kb的载体带；Sac I和Bam HI和Kpn I三酶切得到1.28kb(codA)、450bp(APS)、大约300bp(TA29启动子)三条目标带和一条12kb的载体带。该酶切鉴定结果表明，含有codA基因表达盒的5-FC诱导性花药特异性凋亡植物表达载体p3dAJM构建正确。

实施例2、利用含有codA基因表达盒的5-FC诱导性花药特异性凋亡植物表达载体p3dAJM调控烟草的雄性育性

1、农杆菌的转化与鉴定

用所构建的p3dAJM转化农杆菌株系EHA105。农杆菌感受态细胞的制备(CaCl₂法)与转化(冻熔法)按照《分子克隆》(Sambrook等，2001)进行。转化的农杆菌的鉴定方法如下：挑取在含抗生素利福平(Rif)25mg/L的YEB固体培养基上长出的单菌落，经含抗生素利福平(Rif)25mg/L的YEB液体培养基振荡培养12小时，小量碱液法(Sambrook等，2001)提取质粒DNA；质粒用Sac I和Bam HI双酶切，切出1.28kb(codA)和750bp(APS+TA29)的目标带和12kb的载体带。酶切结果说明，质粒载体p3dAJM已经转化到农杆菌株系EHA105中。

挑取携带植物表达载体p3dAJM的农杆菌EHA105单菌落，接种于5ml含Rif 20mg/L YEB液体培养基中，28℃振荡培养10小时，按1∶50的体积比稀释到含Rif 20mg/L的新鲜YEB液体培养基中，继续培养至OD600值0.6-0.8。5000rpm离心5min，收集菌体，用1/2MSO液体培养基(1/2MS矿质营养成分)洗涤菌体一次，并将其稀释到离心前菌液5倍体积的1/2MSO液体培养基中，准备侵染用。

选取30天苗龄的烟草品种“NC89”无菌苗，在无菌条件下，切下成熟叶片，用直径6mm的打孔器取叶圆盘；将取下的叶盘投入上述准备好的菌液中，15分钟后，取出叶盘，置于再生培养基(MS+BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L+肌醇0.1g/L+蔗糖3％+琼脂粉7g/L，pH5.8)上于25℃暗培养2天。然后接种到含有羧苄青霉素(Carb)500mg/L和膦化麦黄酮(PPT)1.25mg/L的再生培养基上。侵染叶盘不断膨大，10天后长出绿色愈伤，继代后，抗性愈伤很快分化出小芽，而对照叶盘(未被侵染叶盘)则保持原有大小并黄化死亡。当抗性芽长到1-1.5cm时，将其切下，转到含有PPT 5.0mg/L和Carb 200mg/L的生根培养基(MS+IAA 0.5mg/L+肌醇0.1g/L+蔗糖3％+琼脂粉7g/L，pH5.8)上10天左右开始生根，2-3周后得到正常生根的抗性植株。

2、转基因烟草的组织化学和分子检测分析

(1).PPT抗性苗的GUS染色结果

将已经生根的烟草PPT抗性植株的整株和部分叶片按照Jefferson等(1987，EMBO J，6：3901-3907)的方法进行GUS染色，脱色后转基因植株根、茎、叶都呈现不同程度的蓝色，而未转基因的对照株则完全白化无蓝色。表明报告基因GUS已经整合到烟草基因组中并得到正确表达。

(2).GUS阳性苗的PCR扩增

对GUS染色的阳性苗进一步进行分子检测。用目标基因codA两端的特异性引物dA1和dA2(dA1：5’-GGA TCC ATG TCG AAT AAC GCT TTA CAA ACA A-3’；dA2：5’-GAG CTC TCA ACG TTT GTA ATC GAT GGT TTC TGG C-3’)进行PCR扩增，结果如图4所示，GUS阳性株均扩增得到大小为1.28kb的目标带，而未转化的对照烟草在相应位置则没有扩增出此目标片段。这一结果初步表明目标基因codA已整合到烟草基因组中。图4中，M：λDNA(Hin dIII和Eco RI)双酶切marker；泳道1：质粒对照p3dAJM，目的片段为1.28kb(箭头所指)，泳道2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16：GUS阳性植株，扩出1.28kb的带，泳道11：未转基因植株对照。

(3).GUS和PCR阳性苗的Southern杂交检测

通过Southern分析来检验基因组的整合情况。

用Sac I和Bam HI于37℃过夜消化转基因烟草和未转基因烟草的基因组DNA(10μg)。通过电泳法0.7v/cm在0.8％琼脂糖凝胶上分离酶切后的DNA 16-20小时，DNA用向上毛细管转移法转移到一带正电荷的尼龙膜上(BoehringerMannheim，Germany)。用内切酶Bam HI和Sac I从p3dAJM上切下约1.28kb的codA片段，以此作为模板，利用地高辛DNA标记试剂盒(Roche)所带的DIG-标记dNTP和酶，对上述模板DNA进行标记。以标记好的单链DNA作为探针，按照地高辛DNA标记试剂盒所叙述的方法，将制备好的探针与上述尼龙膜杂交，并用碱性磷酸酶标记地高辛抗体(Anti-Digoxigenin-AP，alkaline phosphotase)(购自Roche公司)进行检测。结果如图5所示，阳性对照质粒出现一条很明显的1.28kb的杂交带，但同时还有其他的弱带；转基因烟草植株呈现阳性，出现一条1.28kb的杂交带，而未转基因的对照植株NC89则无杂交带出现。用Eco RI单酶切转基因植株基因组DNA，也出现杂交带(见图5)。此结果表明，嵌合codA基因确实已经整合到烟草的基因组中。图5中，泳道1，质粒对照(经Sac I和Bam HI酶切的p3dAJM)；泳道2，3，4，6，7为转基因烟草；泳道5，8为未转基因烟草对照。

3、codA基因表达盒在转基因烟草中的功能分析

(1).转基因植株的移栽

将GUS染色、PCR和Southern杂交均呈阳性的转codA基因的烟草植株在三角瓶中开口炼苗一周，移入花盆，在温室中培养，第一周套袋保湿，之后去袋并进行常规管理。

(2).化学诱导剂5-FC对烟草植株不致死最高浓度的选择

选取长势大小基本相同的烟草5株，其中3株为NC89未转基因苗(NC89-1、NC89-2和NC89-3)，2株为转基因的抗性苗(L-1-1，L-5-1)，选取接近中部的完整的完全伸展开的3片叶子，取对称叶片的一半涂抹不同浓度(0.0-500mM)的5-FC，每50mM为一个浓度梯度，另一半作为对照。涂抹后每天进行观察，连续观察8天。从中选出不杀死烟草叶片的最高5-FC浓度，此后采用该浓度进行整株喷施，检测其对整株的作用效果。

用50-500mM的5-FC涂抹野生型烟草NC89和转基因烟草的叶片，处理后1-8天观察叶片的反应，结果如表1和图6所示。

表1.5-FC涂抹烟草NC89以及转基因植株的叶片反应情况统计

NC89-1(18叶)	7叶		450**	250**	250**	200**	150*	100*	100*
										8叶		300**	250*	250***	200**	150*	150**	150**
	9叶		350**	300**	200**	200**	200**	200**	200**
										NC89-2(21叶)	9叶	500***	350**	300***	200*	200*	150*	100*	100*
10叶	500**	300***	200**	150**	150**	150**	150**	150**
									11叶			400**	250**	200**	150*	150*	150*	150*
NC89-3(17叶)	9叶	500**	400**	200**	200**	200*	200**	150*											150*
									10叶			200**	200**	200*	200***	150*	150*
	11叶			200**	200***	150*	150**	150**										150**
									L-1-1(22叶)	8叶	500***	400*	350**	350**	350**	350***	300**		300**
9叶			500**	200**	200**	200**	200**	200**
										10叶			350**	350**	300**	250*	250*	200*
L-5-1(19叶)	7叶		500**	500**	500***	400*	400**	400**											400**
									8叶			250*	350*	250**	150**	150**	150**
	9叶			250*	250**	200**	200**	250**										250**

说明：数字---可引起叶片局部伤害的最低浓度；*--表示微黄，**--有小死斑，***--有较大的死斑，****--有大的坏死斑。空者--没有反应，叶片的位置是从下向上数，括号内的数目是指涂抹时叶片的数目(设有清水对照)。

表1表明，一般在大于150mM浓度的5-FC才可以完全杀死涂抹部位，并使周围组织黄化。当然不同生长状态的植株和涂抹不同部位的叶片对5-FC的敏感程度是不完全相同的，有的植株耐受5-FC的程度更高一些，达到300mM，而有的植株在150mM处就使组织有少许损伤。

综合涂抹的所有植株的情况，选用150mM进行转基因烟草的育性调控。经过全株喷施150mM的5-FC处理，烟草植株均正常生长。说明这一浓度的5-FC本身不会对烟草产生毒害作用，喷施不会使烟草黄化或死亡。

(3)转基因植株的雄性育性调控

根据codA基因表达盒的设计原理，转基因植株需经过适当浓度的5-FC诱导处理，5-FC进入植物体内，在花药中在胞嘧啶脱氨酶的作用下，转化为毒性产物5-FU，引起DNA合成障碍，导致花粉败育。试验中除了对转基因植株(L-1-1，L-5-1，E-2-1，E-2-2，E-3-2，E-2-3，E-6-2和L-5-2)的5-FC处理之外，还设计了转基因植株不处理(nCK，n为株系号)、非转基因植株不处理(CK0)和非转基因植株5-FC处理(CK1)三个对照。5-FC处理植株从开花前7天开始每隔5天喷施一次5-FC(150mM)，选择同一株系号的不同植株分别喷施1-3次，这期间对花粉活力进行连续检测。

花粉活力检测方法：取含苞待放的花朵(花药未开散)，挑取其中的花粉，置于花粉萌发培养基(蔗糖：10％，硼酸：100mg/L，琼脂：0.5％，pH：5.6)上，室温暗处培养4-5小时显微镜下观察，记录正常萌发和不萌发或萌发后畸形的花粉数目。

经过150mM的5-FC处理，转基因植株和对照植株在花药形态和花粉活力等各方面有着显著的差异。

1).用150mM的5-FC喷施一次转基因植株和各种对照植株，花粉萌发率如表2和图6所示。

表2.一次喷施150mM的5-FC对转codA基因烟草株系花粉活力的影响

注：*：时间是指从喷药后算起，开花期取花粉检测的时间(天)；CK0：未转基因烟草，不用5-FC处理；CK1：未转基因烟草，用5-FC处理；nCK：转基因烟草，不用5-FC处理。

表2和图6表明，未转基因植株不管用(CK1)或不用(CK0)150mM的5-FC处理，自处理后的第5天至第30天取样，其花粉的萌发率都在80％以上。转基因植株不用5-FC处理(nCK)时，其相应的花粉萌发率也都在80％以上。当转基因植株用150mM的5-FC处理后，株系L-5-1自第13天后，花粉萌发率显著下降，一直到第24天。其中的第14天至第19天下降最明显，花粉萌发率为40％以下，即下降了一半；株系L-1-1自处理后，第10天花粉的萌发率显著下降，一直持续到第21天。其中，处理后的第11天至第17天花粉的萌发率在40％以下，第14-16天的萌发率还不到30％；株系E-2-1自处理后第9-19天，花粉萌发率下降显著，特别是从第11天至第17天，花粉萌发率在30％以下，其中有2天(第14-15天)在20％以下，不到同时期对照株系的1/4。

从表2还可以看出，用150mM的5-FC处理的效果在处理后的第9-10天才明显可见，其作用可以持续13天左右，但以处理的第14-17天最为明显(图6)。

2).150mM的5-FC隔5天二次喷施，转基因植株及其各种对照株系花粉的萌发率如表3和图7所示。

表3.二次喷施150mM的5-FC对转codA基因烟草花粉活力的影响

20	24.26	25.14	22.41	29.45	90.4	86.5	84.56
								21	31.42	24.67	20.79	30.41	79.4	88.3	81.63
22	32.76	29.34	26.45	28.79	80.2	91.54	80.12
								23	37.62	34.81	19.2	32.86	83.3	87.5	80.97
24	25.46	50.13	24.13	30.91	82.3	87.26	85.23
								25	27.4	60.4	21.43	25.98	84.7	80.42	84.91
26	21.83	65.4	19.58	31.76	79.8	86.4	78.46
								27	18.95	69.2	16.52	38.42	80.9	82	90.56
28	37.95	79.43	29.52	49.85	87.1	89.13	87.46
								29	42.56	83.57	46.53	68.52	90.7	84.65	82.13
30	47.24	88.49	48.95	71.34	88.1	82.76	80.23
								31	50.96	82.15	69.37	80.42	82.3	88.63	80.96
32	54.26	80.32	78.84	86.94	84.7	85.48	86.45
								33	57.94	85.67	86.48	82.58	79.8	81.03	88.15
34	55.2	81.5	83.47	88.32	86.21	88.04	85.49

注：*：时间是指从第一次喷药算起，取花粉检测的时间(天)，两次施药的时间相隔5天。

表3和图7表明，二次处理，观察的4个转基因株系的花粉萌发率自第一次处理后的第10天至第27天，花粉的萌发率都在40％以下(株系E-3-2的至第24天)，而此时的各对照花粉萌发率均在80％以上。株系E-2-2自处理后的第12-14天的萌发率仅为12.4-17.8％，第17-20天在30％以下，以后在40％以下，直到第34天仍在56％以下。

比较一次喷施与二次喷施5-FC的花粉萌发率，可以看出，二次比一次显著的降低了转基因植株株系的花粉萌发率，而且这种降低持续的天数延长近10天(图7)。

3).对于同一转基因株系(E-2)的三个单株，喷施一、二和三次150mM的5-FC之后的花粉萌发率进行了比较分析，结果如表4和图8。

表4不同次数喷施150mM的5-FC，对转codA基因株系E-2各单株花粉萌发率的影响

6
				7	85.1
8	70.5		68.52
				9	46.5		67.34
10	34.9	28.27	30.58
				11	29.8	17.8	21.46
12	28.1	12.4	16.48
				13	24.3	17.8	18.37
14	16.7	17.35	20.54
				15	19.2	32.7	27.69
16	27.9	34.01	22.15
				17	29.7	22.12	26.87
18	37.5	25.1	30.4
				19	50.6	29.12	28.19
20	64.3	24.26	33.42
				21	58.6	31.42	27.81
22	64.9	32.76	29.03
				23	71.9	37.62	30.56
24	76.5	25.46	25.38
				25	80.3	27.4	32.67
26	79.1	21.83	28.49
				27	87.9	18.95	22.63
28	84.6	37.95	28.47
				29	85.6	42.56	30.32
30	84.3	47.24	34.53
				31		50.96	38.96
32		54.26	46.59
				33		57.94	50.47
34		55.2	67.48

*：时间(天)是从最初喷药的时间开始算起，同一株系的三棵苗子的花粉萌发率的纵向比较。

表4和图8表明，自第一次喷施后的第9-10天开始，花粉的萌发率开始显著下降。喷一次(E-2-1)显著下降的作用时间持续大约7-8天，而以第一次喷后的第11-16天的效果最为显著，花粉发芽率在17-30％之间。喷二次时(E-2-2)，花粉的萌发率自第一次喷后的第10天至第28天，一直在40％以下，而喷一次时的第19天，花粉萌发率已经上升到50％以上。喷二次时，花粉萌发率最低时段出现在第一次喷后的第11-14天，都在20％以下。这一作用持续4天，然后逐渐减弱，故花粉萌发率有所上升，在22-35％左右，至到第28天。喷施三次(E-2-3)，其效果与喷施二次没有显著的差异，只不过维持低水平的花粉萌发率的时间更长一些(至第31天)。

从表4还可以看出，单株E-2-1和E-2-3喷后第7-9天花粉萌发率就有46.5-85.1％之间，此后才开始显著下降(图8)，可能由于起始喷施时间偏晚。

4、转基因T₁代的雄性育性调控

(1)转基因T₁代的获得

收集饱满的野生型NC89植株的种子，放入1.5ml离心管(Eppendorf管)中，用70％酒精消毒20秒，0.1％HgCl₂消毒3分钟，无菌水洗涤5次，放入含不同浓度PPT的种子萌发培养基(1/2MS)中，暗处培养7天，后置于光下培养30天，统计NC89种子的萌发情况，并找出致使NC89种子萌发后黄化死亡的最低PPT浓度(3.0mg/L，表5)，作为转基因T₀代植株种子(T₁)的发芽选择浓度。

收集饱满的转基因T₀代植株的种子，做同样的消毒处理，转入含有上述选择浓度PPT的种子萌发培养基上，暗处培养7天，置于光下培养30天，统计T₁代的萌发情况(表5)。

表5.转codA基因的烟草T₁与对照植株的种子在不同浓度的PPT培养基上的成苗率

说明：成苗率是指萌发后的绿苗数与接种的总数目(绿苗+黄化苗+未萌发种子)的比值。

表5表明，在PPT 3.0mg/L或以上时，未转基因对照(NC89-1，NC89-2)的种子完全不能成苗(成苗率为0％)，而转基因(L-1，E-2，E-8)T₁的成苗率在60-65％。

(2)T₁代苗的GUS染色

将在选择浓度PPT(3.0mg/L)的培养基中得到的T₁代苗洗净根部培养基，将整株和部分叶片按照上述方法进行GUS染色，脱色后转基因植株根、茎、叶都呈现不同程度的蓝色，而未转基因的对照株则完全白化无蓝色。

(3)转基因T₁代植株的功能分析

待T₁代苗长到5cm左右高时，移入花盆，在温室中培养，第一周套袋保湿，之后去袋并进行常规管理。在T₁代植株开花前10天喷施150mM 5-FC，然后每5天喷一次，共喷3次，开花时检测花粉活力。在检测的3个株系共7个单株中，花粉发芽率在25-30％的只有1个单株，其余的都在20％以下，其中株系T1E-8的2个单株的花粉发芽率都在10％以下，达到育种学上的完全雄性不育。而未调控的转基因植株、调控和未调控的未转基因对照植株的花粉发芽率都在85％以上。

实施例3、利用植物表达载体p3dAJM调控小麦的雄性育性

选取普通小麦(Triticum aestivum L.)半冬性栽培品种—“扬麦158”。取开花后12-16天的幼嫩种子，用0.1％的HgCl₂消毒10分钟，无菌水冲洗4-5次，每次5分钟，然后于超净工作台上剥取幼胚待用。

培养基与培养条件：(单位为mg/L；除特别说明外，含3％蔗糖和7g/L琼脂)

愈伤组织诱导培养基：MS+2.4-D2.0+KT0.5                    pH5.8

高渗培养基：MS+2.4-D2.0+KT0.5+甘露醇0.4M                 pH5.8

恢复培养基：MS+2.4-D2.0+KT0.5+carb150-500                pH5.8

诱导愈伤组织筛选培养基：MS+2.4-D2.0+KT0.5+carb150-500+PPT5.0

                                                         pH5.8

分化筛选培养基：MS+VB₁0.5+CuSO₄0.5+KT0.5+carb150-500+PPT1.5-3.0

                                                         pH5.8

生根筛选培养基：1/2MS+NAA1.0+PPT3.0-5.0+2％蔗糖+7g/L琼脂

                                                         pH5.8

培养条件：温度25±1℃，光暗周期16(光照)/8hr(黑暗)

—、p3dAJM转化小麦的愈伤组织

可用农杆菌法或基因枪法转化小麦愈伤组织。

1.农杆菌法侵染小麦愈伤组织

用所构建的p3dAJM转化农杆菌株系LBA4404。农杆菌感受态细胞的制备(CaCl₂法)与转化(冻熔法)按照《分子克隆》(Sambrook等，2001)进行。转化的农杆菌的鉴定方法如下：挑取在含抗生素利福平(Rif)25mg/L的YEB固体培养基上长出的单菌落，经含抗生素利福平(Rif)25mg/L的YEB液体培养基振荡培养12小时，小量碱液法(Sambrook等，2001)提取质粒DNA；质粒用Sac I和Bam HI双酶切，切出1.28kb(codA)和750bp(APS+TA29)的目标带和12kb的载体带。酶切结果说明，质粒载体p3dAJM已经转化到农杆菌株系LBA4404中。

(1).愈伤组织的诱导与前处理

选取开花12-15天的小穗，剥取种子，在超净工作台上70％的乙醇消毒30秒，无菌水洗一次，再用0.1％HgCl₂消毒10分钟，无菌水冲洗4-5遍，每次5分钟。仔细剥取幼胚，将幼胚置于愈伤组织诱导培养基上，25±2℃暗处培养。10-20天后产生的淡黄色、鲜嫩的愈伤组织。在转化前4-6小时转移至含0.4M的甘露醇的高渗培养基上，用于农杆菌的转化。

(2).农杆菌的培养及活化

从YEB培养基中挑取少量带有目标基因的植物表达载体的农杆菌LBA4404接种于5ml含Str(链霉素)100mg/l和Kan(卡那霉素)50mg/L的YEB液体培养基中，28℃振荡培养10小时，按1∶50的体积比稀释到含Str 100mg/L和Kan 50mg/L的新鲜YEB液体培养基中，继续培养至OD600值大约为0.6-0.8，待侵染。

(3).侵染幼胚愈伤组织

挑取淡黄色、幼嫩的小麦幼胚愈伤组织置于活化好的农杆菌菌液中。侵染1-2小时后取出愈伤组织用无菌、干燥的滤纸和吸水纸吸干，然后将愈伤组织转入共培养培养基(MS基本培养基)上，2-3天转入恢复培养基，继续暗培养7-10天左右，转入诱导愈伤组织筛选培养基上，培养2-4周，转入分化筛选培养基，光下分化培养。20天后将再生出的绿苗移至生根培养基上，生根培养的同时进行春化处理(0-4℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培养)，15天后移至新鲜生根培养基中，25±2℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培养。

2.基因枪法转化小麦愈伤

(1).质粒的提取和纯化

将p3dAJM通过CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α。将含有p3dAJM的大肠杆菌DH5α加入100mg LB液体培养基(含Amp 50mg/L)中，于37℃，振荡培养(200rpm)至OD值为0.5-0.6时，按照QIAGEN-tip100试剂盒的说明提取质粒。

(2).微弹制备

基本按说明书进行。称取50mg直径为1μm的金粉颗粒放入灭菌的离心管中，加入1ml无水乙醇振荡悬浮，放置过夜。5000rpm离心3分钟，去上清，收集金粉，无菌水冲洗3-4次至乙醇完全除去，最后加入1ml无菌水制成浓度为50mg/ml的金粉悬液。用前吸取50μl金粉悬液移至Eppendorf管中，加入5μg质粒DNA，充分震荡；然后分别加入2.5M CaCl₂50μl和0.1M亚精胺20μl，并充分混匀；静置2分钟后用140μl的70％乙醇洗涤；12000rpm离心2分钟，弃上清，加140μl 100％乙醇洗涤；12000rpm离心2分钟，弃上清，加入90μl 100％乙醇，4℃保存备用。

(3).愈伤组织的前处理

愈伤组织在转化前4-6小时转移至含0.4M的甘露醇的高渗培养基上，集中在直径5cm的培养基的中央(直径2cm的范围内)，用于基因枪的转化。

(4).基因枪轰击

轰击使用PDS-1000/He型基因枪。打开电源，将消毒过的可裂圆片装入固定盖，旋紧。取微弹悬浮液10μ|均匀涂抹在消过毒的微弹载体中心区域，自然风干，然后于阻挡网一并装入发射装置中。将待转化的材料放在样品板上(转化材料与微弹之间的距离为7cm)，关上轰击室，按VAC键抽真空，当真空度为27-28Pa时，将VAC键转到HOLD位置，按FIRE键使氮气压力达到可裂膜的压力(1000-1100psi)时进行轰击。

(5).植株再生与筛选

将轰击12小时后的幼胚愈伤组织移至不加渗透压调节剂和选择压的愈伤组织诱导培养基上，继续暗培养两周后移至分化筛选培养基，25±2℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培养；20天后将再生出的绿苗移至生根培养基，生根培养的同时进行春化处理(0-4℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培养)，春化处理15天后移至新鲜生根培养基中，25±2℃，16hr(光照)/8hr(黑暗)培养。

3、农杆菌法转化愈伤和分化苗的GUS染色

农杆菌侵染小麦幼胚愈伤组织7天后，对愈伤组织进行GUS染色，有25％的愈伤组织能染成蓝色，而未侵染的对照愈伤则不能被染色(表6)。

表6.农杆菌法转化小麦愈伤的GUS染色

名目	总数	蓝色数	蓝色率(％)
				侵染过愈伤组织	44	11	25
未侵染的愈伤组织	28	0	0

愈伤组织在经过恢复、诱导、筛选培养后，最终转入分化筛选培养基上分化出苗，取出部分抗性苗进行GUS染色，结果染出深浅不等蓝色，而对照无蓝色。抗性苗在生根培养基上正常生根，而对照扬麦158则在生根培养基上不生根，黄化死亡。生根后的小麦移苗到温室，转基因植株在株高，株叶，形态方面与对照植株没有差异。

从侵染的650块愈伤组织中，有8块愈伤组织的再生苗能被GUS染色，由此计算，转化频率为1.23％。

4、基因枪法转化愈伤组织的GUS染色

用基因枪轰击350块愈伤组织，其中6块愈伤组织的再生苗能被GUS染色，转化频率约为1.71％

二、转基因小麦的PCR检测

用目标基因codA两端的特异性引物dA1和dA2进行PCR扩增，结果GUS阳性株可以扩增得到大小为1.28kb的目标带，而未转化的对照小麦在相应位置则没有扩增出此目标片段(图9)。图9中，泳道1：λDNA经Hind III和EcoRI双酶切分子量标记(虚线箭头所指1.375Kb)；泳道2：载体p3dAJM对照，目的片段为1.28Kb(实线箭头所指)；泳道3-6：转codA基因小麦PPT抗性植株，其中，泳道4，6为GUS阳性植株；泳道7：未转基因小麦对照。

三、诱导剂5-FC对扬麦158叶片最高非致死致伤浓度的筛选

用叶片涂抹法对转基因植株(dA-10，L158-20，L158-11)和未转基因植株(扬麦158-1，扬麦158-2，扬麦158-3，扬麦158-4)进行5-FC的耐受性试验，5-FC的浓度为150-500mM，从处理后的第一天进行观察，叶片有反应的5-FC的浓度如表7。

表7野生型小麦与转基因小麦叶片对5-FC浓度的耐受性(单位mM)

注：方格内数字是表示在这一时间可以使叶片凋亡的最低5-FC浓度，空格为没有明显反应。*--表示黄化，**--表示有坏死斑。

从表7中可以看出，5-FC涂抹小麦叶片7天以后，涂抹点叶片的变化基本没有明显的改变。5-FC在300mM以上，造成了叶片明显的伤害。因此以下实验选用300mM的5-FC来喷施全株作育性调节。

四、转基因小麦雄性育性的化学调控

1.转化株的花器官的解剖结构观察

在植株长到4-6节高时用300mM的5-FC喷施全株一次，小麦营养生长正常。在小麦抽穗的过程中，小心拨开内外麸，观察雄蕊的发育情况，结果发现，有L-13，L-11，L-19，L-20，dA-4，dA-10，dA-20这7个GUS阳性株系出现雄蕊发育不良现象(图10)，花药小而淡黄。图10中，左侧花药为未转基因植株未调控(对照)的花药；右侧花药为转基因植株调控的花药。

2.转化株花粉的碘-碘化钾染色

转p3dAJM小麦植株经过化学诱导后花粉的碘-碘化钾(I₂-KI)染色结果如表8。表8表明，转基因株6个株号(dA-10-3，dA-10-4，dA-20-1，dA-8-1，L-158-19，L-158-3)降低了约20％，dA-10-2的花粉染色率比对照少将近30％(图11)，这些株号均为GUS阳性株。图11中，左侧图片为未转基因经5-FC调控的对照株的花粉；右侧图片为转基因株调控株的花粉。

雄蕊发育不良或花粉I₂-KI染色蓝色率低的麦穗一般伴随有花药短小皱缩，花丝缩短，花药内花粉含量较少等形态学改变，如果不进行人工授粉，(株号L-13，L-20)，在后期的生长发育的过程中则出现内、外稃张开，颖壳开放，最后则不产生或产生很少几粒种子(图12，13，14)。图12表明，5-FC调控的转p3dAJM小麦的小穗(A)与5-FC调控的未转基因小麦的小穗相比，内、外稃张开，颖壳开放。图13表明，5-FC调控的转p3dAJM小麦的幼穗(A)的小穗张开，内、外稃张开，颖壳开放，显示出典型的雄性不育的特征，而5-FC调控的未转基因小麦的幼穗(B)、未经5-FC调控的转p3dAJM小麦的幼穗(C)和未经5-FC调控的未转基因小麦的幼穗(D)则，小穗抱轴，内、外稃密闭，颖壳不开。图14表明，5-FC调控的转p3dAJM小麦的成熟穗(A)瘦瘪，没有种子，而未转基因小麦的成熟穗(B)则肥硕，有36粒以上的饱满种子。

表8.转p3dAJM小麦花粉的碘-碘化钾染色

L158-19	74.26	74.31	67.6	60.25	#
						L158-3	79.28	70.16	64.26	60.38	#

注：*：CK(1-3)是野生型的扬麦158的种子苗。#：GUS阳性。

3、T₁代幼胚在分化筛选培养基上的分化

为了加快转基因小麦的繁殖循环，可以用幼胚培养加抗性筛选。筛选压以野生型扬麦158的幼胚愈伤在0-5mg/L PPT上的芽分化情况来确定(表9)。

表9野生型扬麦158的幼胚愈伤在含不同浓度的PPT分化筛选培养基上的分化(分化30天)

表9表明杀死扬麦158幼胚的最低有效浓度是PPT 3.0mg/L。根据这一结果，以下试验用PPT 3.0mg/L筛选转基因T₁代幼胚苗。

取所有转p3dAJM株号的T₁代幼胚愈伤，置于含PPT 3.0mg/L的分化筛选培养基上，分化30天后，芽分化率如表10，其分化状态照片如图15。

表10转p3dAJM小麦T₁代幼胚愈伤组织在PPT 3.0mg/L的分化筛选培养基上分化(分化30天)

株号	愈伤总数	分化愈伤数	分化率(％)
				L-3	31	22	38.71
L-6	34	25	44.11
				L-11	25	17	68
L-13	16	11	31.25

L-19	15	11	73.33
				L-20	8	6	62.5
dA-4	23	9	39.13
				dA-6	28	15	53.57
dA-8	38	20	42.1
				dA-10	19	8	31.58
dA-20	18	7	33.33

表10表明转基因(转p3dAJM)植株小麦幼胚在含PPT 3.0mg/L的分化筛选培养基上的分化率都在30％以上，远比未转基因的(表9)分化率高。转基因植株小麦幼胚分化率最高的是L-19，为73.33％，是对照(野生型)扬麦158幼胚分化的14.7倍。分化率最低的是L-13，为31.25％，是对照愈伤组织的6.25倍。

表10也显示，不同的转基因植株，其幼胚愈伤对PPT 3.0mg/L的抗性有较大的差别，这可能与导入的PPT抗性基因(bar)的拷贝数、***位置及其分离有关。

PPT抗性苗在进行生根培养的同时进行春化处理(0-4℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培养)，春化处理15天后移至新鲜生根培养基中，25±2℃，光暗周期16hr(光照)/8hr(黑暗)培养。当苗高大约5-6cm时，移栽到温室。

当苗长出新叶后，取其新叶，进行GUS染色，阳性苗再进行PCR确认。对经过PCR确认者，按照前述方法进行雄性育性的化学调控(300mM 5-FC)，每隔4天1次，共3次。开花时用碘-碘化钾(I₂-KI)对花粉活力进行检测，花粉活力低于10％的植株套袋，成熟时检查单穗结实率。结果表明，55-60％的植株的花粉活力在20％以下，40-45％在10％以下。在套袋自交的15株中，仅有5株能产生1-5粒种子，而且种子很瘪。

                              序列表

<160>2

<210>1

<211>427

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>1

Met Ser Asn Asn Ala Leu Gln Thr Ile Ile Asn Ala Arg Leu Pro Gly

1               5                   10                  15

Glu Glu Gly Leu Trp Gln Ile His Leu Gln Asp Gly Lys Ile Ser Ala

            20                  25                  30

Ile Asp Ala Gln Ser Gly Val Met Pro Ile Thr Glu Asn Ser Leu Asp

        35                  40                  45

Ala Glu Gln Gly Leu Val Ile Pro Pro Phe Val Glu Pro His Ile His

    50                  55                  60

Leu Asp Thr Thr Gln Thr Ala Gly Gln Pro Asn Trp Asn Gln Ser Gly

65                  70                  75                  80

Thr Leu Phe Glu Gly Ile Glu Arg Trp Ala Glu Arg Lys Ala Leu Leu

                85                  90                  95

Thr His Asp Asp Val Lys Gln Arg Ala Trp Gln Thr Leu Lys Trp Gln

            100                 105                 110

Ile Ala Asn Gly Ile Gln His Val Arg Thr His Val Asp Val Ser Asp

        115                 120                 125

Ala Thr Leu Thr Ala Leu Lys Ala Met Leu Glu Val Lys Gln Glu Val

    130                 135                 140

Ala Pro Trp Ile Asp Leu Gln Ile Val Ala Phe Pro Gln Glu Gly Ile

145                 150                 155                 160

Leu Ser Tyr Pro Asn Gly Glu Ala Leu Leu Glu Glu Ala Leu Arg Leu

                165                 170                 175

Gly Ala Asp Val Val Gly Ala Ile Pro His Phe Glu Phe Thr Arg Glu

            180                 185                 190

Tyr Gly Val Glu Ser Leu His Lys Thr Phe Ala Leu Ala Gln Lys Tyr

        195                 200                 205

Asp Arg Leu Ile Asp Val His Cys Asp Glu Ile Asp Asp Glu Gln Ser

    210                 215                 220

Arg Phe Val Glu Thr Val Ala Ala Leu Ala His His Glu Gly Met Gly

225                 230                 235                 240

Ala Arg Val Thr Ala Ser His Thr Thr Ala Met His Ser Tyr Asn Gly

                245                 250                 255

Ala Tyr Thr Ser Arg Leu Phe Arg Leu Leu Lys Met Ser Gly Ile Asn

            260                 265                 270

Phe Val Ala Asn Pro Leu Val Asn Ile His Leu Gln Gly Arg Phe Asp

        275                 280                 285

Thr Tyr Pro Lys Arg Arg Gly Ile Thr Arg Val Lys Glu Met Leu Glu

    290                 295                 300

Ser Gly Ile Asn Val Cys Phe Gly His Asp Asp Val Phe Asp Pro Trp

305                 310                 315                 320

Tyr Pro Leu Gly Thr Ala Asn Met Leu Gln Val Leu His Met Gly Leu

                325                 330                 335

His Val Cys Gln Leu Met Gly Tyr Gly Gln Ile Asn Asp Gly Leu Asn

            340                 345                 350

Leu Ile Thr His His Ser Ala Arg Thr Leu Asn Leu Gln Asp Tyr Gly

        355                 360                 365

Ile Ala Ala Gly Asn Ser Ala Asn Leu Ile Ile Leu Pro Ala Glu Asn

    370                 375                 380

Gly Phe Asp Ala Leu Arg Arg Gln Val Pro Val Arg Tyr Ser Val Arg

385                 390                 395                 400

Gly Gly Lys Val Ile Ala Ser Thr Gln Pro Ala Gln Thr Thr Val Tyr

                405                 410                 415

Leu Glu Gln Pro Glu Ala Ile Asp Tyr Lys Arg

            420                 425

<210>2

<211>1284

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>3

atgtcgaata acgctttaca aacaattatt aacgcccggt taccaggcga agaggggctg     60

tggcagattc atctgcagga cggaaaaatc agcgccattg atgcgcaatc cggcgtgatg    120

cccataactg aaaacagcct ggatgccgaa caaggtttag ttataccgcc gtttgtggag    180

ccacatattc acctggacac cacgcaaacc gccggacaac cgaactggaa tcagtccggc    240

acgctgtttg aaggcattga acgctgggcc gagcgcaaag cgttattaac ccatgacgat    300

gtgaaacaac gcgcatggca aacgctgaaa tggcagattg ccaacggcat tcagcatgtg    360

cgtacccatg tcgatgtttc ggatgcaacg ctaactgcgc tgaaagcaat gctggaagtg    420

aagcaggaag tcgcgccgtg gattgatctg caaatcgtcg ccttccctca ggaagggatt    480

ttgtcgtatc ccaacggtga agcgttgctg gaagaggcgt tacgcttagg ggcagatgta    540

gtgggggcga ttccgcattt tgaatttacc cgtgaatacg gcgtggagtc gctgcataaa    600

accttcgccc tggcgcaaaa atacgaccgt ctcatcgacg ttcactgtga tgagatcgat    660

gacgagcagt cgcgctttgt cgaaaccgtt gctgccctgg cgcaccatga aggcatgggc    720

gcgcgagtca ccgccagcca caccacggca atgcactcct ataacggggc gtatacctca    780

cgcctgttcc gcttgctgaa aatgtccggt attaactttg tcgccaaccc gctggtcaat    840

attcatctgc aaggacgttt cgatacgtat ccaaaacgtc gcggcatcac gcgcgttaaa    900

gagatgctgg agtccggcat taacgtctgc tttggtcacg atgatgtctt cgatccgtgg    960

tatccgctgg gaacggcgaa tatgctgcaa gtgctgcata tggggctgca tgtttgccag   1020

ttgatgggct acgggcagat taacgatggc ctgaatttaa tcacccacca cagcgcaagg   1080

acgttgaatt tgcaggatta cggcattgcc gccggaaaca gcgccaacct gattatcctg   1140

ccggctgaaa atgggtttga tgcgctgcgc cgtcaggttc cggtacgtta ttcggtacgt   1200

ggcggcaagg tgattgccag cacacaaccg gcacaaacca ccgtatatct ggagcagcca   1260

gaagccatcg attacaaacg ttga                                          1284

Claims (12)

1、调控植物组织或器官凋亡的表达载体，是含有胞嘧啶脱氨酶基因表达盒的植物表达载体，所述胞嘧啶脱氨酶基因表达盒包括植物组织特异性启动子，胞嘧啶脱氨酶基因和终止子。

2、根据权利要求1所述的调控植物组织或器官凋亡的表达载体，其特征在于：所述胞嘧啶脱氨酶基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中的SEQ ID No.2；

2)编码胞嘧啶脱氨酶的核苷酸序列；所述胞嘧啶脱氨酶具有序列表中SEQ IDNo.1的氨基酸残基序列或将序列表中SEQ ID No.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有胞嘧啶脱氨酶活性的蛋白质；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；

4)与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

3、根据权利要求2所述的调控植物组织或器官凋亡的表达载体，其特征在于：所述植物组织特异性启动子为花药或花粉特异性启动子、花丝特异性启动子、花瓣特异性启动子、子房特异性启动子、花柱特异性启动子、柱头特异性启动子、叶片特异性启动子、种子或胚特异性启动子或根特异性启动子。

4、根据权利要求3所述的调控植物组织或器官凋亡的表达载体，其特征在于：所述花药或花粉特异性启动子包括TA29、A3、A8、AG、Amb aI、BA42、BA112、BA158、Bcp1、Bp4B、Bp4C、Bp19、BetVI、BetvIII、ca55、CDPK、ChiA、ChiB、ChsA、DefA、E1、E2、F2s、13#、17#、G10、KBG41、LAT52、LAT59、Lol P1、Lol Pib、Lec6、MS2、Osg6B、P2、SF1、SF2、SF3、SF5、SF6、SF9、SF16、SF18、SF19、TA13、TA20、TA32、TA56、T72、Tap2、TUA1或Zm13启动子；所述花丝特异性启动子包括TSJT1；所述花瓣特异性启动子包括(cell-wall)P4；所述子房特异性启动子包括TRRP-F1，iaaH.DefH-9；所述花柱特异性启动子包括SA2-Rnase、Chi2∶1、SIs、SLG-13和Sp4；所述柱头特异性启动子包括ARC1和ARC1Boler；所述种子或胚特异性启动子包括Napin B、Gtl、Lea(LEA)、REP-2、BCSP666、nad6、oleosin、ABI3、Fus3、KCS和Vpl；所述的叶片特异性启动子包括psbA、Osppc和St-LS1；所述根特异性启动子包括HRGP、PRP1、PRP2、Lec、WGA和RB7。

5、根据权利要求4所述的调控植物组织或器官凋亡的表达载体，其特征在于：所述花药特异性启动子为TA29。

6、根据权利要求1-5中任一所述的调控植物组织或器官凋亡的表达载体，其特征在于：所述终止子包括Nos终止子，Ocs终止子和CaMV 35s终止子。

7、根据权利要求5所述的调控植物组织或器官凋亡的表达载体，其特征在于：所述调控植物组织或器官凋亡的表达载体为p3dAJM。

8、一种调控植物组织或器官凋亡的方法，是将权利要求1-7中任一所述的调控植物组织或器官凋亡的表达载体导入植物细胞、组织或器官中，筛选得到可表达胞嘧啶脱氨酶基因的转基因植株，利用5-氟胞嘧啶诱导转基因植株的目标组织或器官凋亡。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述5-氟胞嘧啶的使用时期为目标凋亡组织或器官发育期前7-14天；优选的使用时期为目标凋亡组织或器官发育期前7天。

10、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述目标凋亡组织或器官为花药，所述5-氟胞嘧啶的使用时期为花药绒毡层形成前7-14天。

11、根据权利要求8或9或10所述的方法，其特征在于：所述被调控的植物是自花授粉或常自花授粉的单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物包括小麦、水稻、高梁、谷子和玉米；所述双子叶植物包括烟草、油菜、大白菜、小白菜、甘蓝、番茄、黄瓜、甜瓜、西瓜、辣椒和棉花。

12、根据权利要求8或9或10所述的方法，其特征在于：所述5-氟胞嘧啶的使用浓度为100-350mM。

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