CN1193995A - 以可溶性寡糖结合域为基础的分离和浓缩*** - Google Patents

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Abstract

本发明提供分离和/或纯化生物组合物的新的方法。生物组合物包含多糖结合肽,并可完全或部分合成或用重组DNA技术来制备。在该方法中,将含有生物组合物的溶液与结合肽的相形成寡糖混合并诱导相分离。然后分离获得含有生物组合物的相。相分离用相分离诱导剂来诱导,或当寡糖聚合物是热分离聚合物时,可通过将温度升高至聚合物浊点温度以上来诱导。

Description

以可溶性寡糖结合域为基础的分离和浓缩***
技术领域
本发明涉及用聚合物配体对通过亲和相分离来分离和/或浓缩多肽和其它化合物的方法，其中配体与可溶性形成相的寡糖结合。本发明特别涉及一种相分离***的应用，***中包含可溶性寡糖，寡糖对以含有粪肥纤维单孢菌(Cellulomonas fimi)纤维素酶的纤维素结合域作为亲和配体的化合物有亲和性。
发明背景
通过蛋白质在微生物***中表达来生产蛋白质已经成为极有价值的医疗上重要的蛋白质的来源。在发酵工艺设计中重组蛋白质的纯化和回收是主要的考虑因素。尽管可用常规的蛋白质纯化法来分离产物，但是最近，水性两相提取***作为简化大规模纯化蛋白质产物(包括高剂量治疗药物如胰岛素和工业蛋白质如3-氧合类固醇异构酶、醇脱氢酶和果糖磷酸激酶)的手段已有相当高的工业价值。因此，现在有许多种可用于蛋白质纯化和细胞分离的两相***。水性两相***提取为大规模处理重组蛋白质和肽提供了独特的优点，包括高活性得率(即，较大的水性环境使纯化过程中的蛋白质失活最小)、可快速平衡、容易放大，最重要的是连续操作。
水性两相分配***的技术可行性在一些高达100000升规模的***中得到证明。它们是通过在水中加入两种水溶性的但不相容的聚合物或一种水溶性聚合物和一种强电解质来形成的。聚乙二醇(PEG)在许多工业两相***中可作为一种聚合物组分，因为聚乙二醇价格低且有很宽的分子量组分可以采用。分级的葡聚糖，一种有α-1，3支链的α-1，6葡萄糖，通常作为第二种聚合物。然而，也可用其它许多水溶性聚合物，其中包括其它许多糖类聚合物。水性两相***主要含有水，每一相富含一种诱导分离组分且几乎不含另一种。当将来自发酵液的蛋白质和其它生物大分子的混合物加入一个水性两相***中时，每一种蛋白质根据它对于形成两相的组分的相对亲和力、大小、表面化学和净电荷来分配。
常规水性两相***的分配系数较低和选择性较差促使了亲和分配***的发展，它将各种常规分配***的多用途性与亲和配体单一结合的选择性结合在一起。在许多场合，生物特异性配体是与形成相的聚合物，通常是PEG的一端或两端共价结合。相形成时聚合物的强分配使得配体聚集入一个平衡相中。高度不对称的分配与靶蛋白质与配体间的强亲和结合是亲和分离和浓缩的基础。
然而，尽管目前的亲和分配***有一定的工业用途，但是由于每个聚合物链上只有一个或两个配体存在而导致了配体密度较低，因此它们的容量和分辨能力有限。由于聚合物浓度通常小于15％(重量)，因此配体与聚合物化学计量比为1∶1或2∶1的亲和分配***中靶蛋白质的分离系数(与杂质的分离系数有关)在5至50之间。尽管这些分离系数足以满足产物浓度，但在低成本的一步或两步提取过程中它们通常也不能提供所需的产品纯度。典型的亲和分配***也受到产生聚合物-配体共轭物的化学费用的局限。例如，配体与PEG的共轭反应首先需要用更活泼的亲电子试剂如溴化物、氯化物或环氧衍生物来取代末端羟基基团。然后第二步亲核攻击反应将聚合物和配体共价结合。配体聚合物的共轭物也必须设计成对每种待纯化的蛋白质或蛋白质类有特异性。
水性两相分离的一个新的进展是将水性两相***与温度诱导相分离结合起来。至今为止，这些***采用热分离聚合物作为顶相聚合物，葡聚糖或羟基丙基淀粉作为底相聚合物。温度诱导相分离在纯化步骤后，使得可以从生物产物中分离并回收聚合物。这种方式中的该方法有回收热分离聚合物的优点，但也有明显的缺点，即靶蛋白质对热分离聚合物没有独特的强的亲和力。将寡糖结合域技术用于这些两相***可高效亲和分离含有与区域结合的聚合物的相，然后用简单的方法来回收并循环使用聚合物。因此有必要开发快速、廉价、高容量的方法来纯化所需的蛋白质，特别是通用的聚合物-配体共轭物的方法。
相关文献
为回顾形成相寡糖，参见Zaslavsky，“水性两相分配”Aqueous Two-PhasePartitioning，Marcel Dekker，Inc.：New York(1995)；Albertson，P.A.，“细胞颗粒和大分子的分配”Partitioning of Cell Particles and Macromolecules，3rd ed.，Wiley Interscience：New York(1986)；Walter，H.Brooks.D.E.，和Fisher，D.，“水性两相***中的分配”Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems，AcademicPress：orlando，FL(1985)。
下列文献与热分离聚合物有关：Malcolm.和Rowlinson，(1975).Trans.Faraday Sac.，53，921；Bailey和Callard，(1959).“聚合物应用杂志”J.Appl.Polym，1，56；Home等人，“胶体界面学杂志”J.Colloid Interface Sci.，35，77；Saeki等人，J.Chem Soc.Faraday Trans.1，79，975；Fujishige等人(1989)“物理化学杂志”J.Phys.Chem，93，3311；Galeav和Marttiasson，(1993).“微生物酶学技术”EnzymeMicrob.Technol.，15，354；和Chen和Hoffman，(1995).“自然”Nature，373，49。
与内切葡聚糖酶C有关的文献如下。Moser等人，“应用和环境微生物学”Applied and Environmental Microbiology(1989)55：2480-2487；“分子微生物学”Molecular Microbiology(1991)5：1221-1233：Coutinho等人，“分子微生物学”Molecular Microbiology(1992)6：1243-1252；和Coutinho等人，“FEMS微生物学杂志”FEMS Microbiology Letters(1993)113：211-218。对于b-1，4-葡聚糖酶，参见Gilkes等人(1991)“微生物回顾”Microbial Reviews 55：303-315。也参见Miller，Jr.，等人(1995)“纸浆工业生物技术第6次国际会议”Proc.6th Int.Conf.onBiotechnology in the Pulp and Paper Industry，Vienna，Austria.
发明概述
本发明提供水相分离和/或纯化***以及它们的制备和应用方法，***以聚合物-配体共轭物为基础，其中聚合物是寡糖聚合物，待分离和/或纯化的组合物包含与寡糖聚合物结合的配体。配体是与多糖结合的肽(PBP)，它是一段、可与形成相的寡糖聚合物结合的氨基酸序列。组合物通常是发酵液、细胞裂解液、生物液体或其它含有包含与PBP融合的感兴趣的大分子或化学组分的化合物的液体。相分离***包括一个或多个相形成寡糖聚合物和相诱导聚合物、另一种相诱导剂或诱导相分离的方法。方法包括使相分离***与组合物接触，组合物在诱导相分离和组合物分离后分配入寡糖聚合物相。组合物可用低离子强度、高pH的或含有离液序列高的试剂的除去液来从寡糖聚合物中除下。或者，可通过在化合物和多糖结合物间掺入蛋白水解酶的识别序列来用特异性或非特异性蛋白水解酶将化合物从与寡糖聚合物连接的多糖结合物上酶法除下。当用蛋白水解酶时，它可与第二种多糖结合物连接，该多糖结合物对晶体多糖有亲和性而第一种多糖结合物对晶体多糖无亲和性。或者，蛋白水解酶可用后续的从固体多糖上洗脱下来回收。另外，与第二种多糖结合物连接的蛋白水解酶可与不连接多糖连接肽的固体多糖支持物连接。本发明提供分离和/或纯化蛋白质和其它与PBP连接的化合物的应用。
附图简述
图1显示了根据粪肥纤维单孢菌(Cellulomonas fimi)内切葡聚糖酶C(CenC)的纤维素结合域(N1和N2)(Coutinho等人，“分子微生物学”Mol.Microbiol.(1991)5：1221-1233)和CceCelCCE(一种取自纤维分解梭状芽孢杆菌(Clostridiumcellulolyticum)的纤维素酶)(Bagnarda-Tardif等人，“基因”Gene(1992)119：17-28)、MxaEgl(取自黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)的β-1，3-葡聚糖酶)(Quillet等人，“基因”Gene(1995)158：23-29)、SreCell(一种取自网状链霉菌(Streptomyces reticuli)的纤维素酶)(Schlochttermeier等人，“分子微生物学”Mol.Microbiol.(1992)6：3611-3621)，和TfuEl(一种取自褐色热单孢(Thermomonospora fusca)的β-1，4-内切葡聚糖酶)(Lao等人，“细菌”Bacteriol.(1991)173：3397-3407)的假定的纤维素结合域的氨基酸序列排列的共有序列。氨基酸残基用单个字母表示。横线(-)表示留待改善排列的间隙。
图2显示用于在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达PBDN1的pTugA载体的图式。采用pTugA可导致高水平诱导型转录、增强的RNA翻译、便携性、高拷贝数、稳定性和通用性。pTug载体含有可提高拷贝数的从pUC13获得的突变型pMBl ori(Minton等人，Focus(1988)10：56)，和被LacIq强阻抑的高强度诱导型tac启动子(Ptac)。lacIq等位基因被***pTug中以维持Ptac和lacIq之比恒定，保证大肠杆菌宿主中阻抑子有足够的水平。基因10翻译增强子(Oline等人，Gene(1988)73：227)也***pTug载体中。将粪肥纤维单孢菌的内切葡聚糖酶A(CenA)的前导序列***载体中以便从大肠杆菌上清液中回收重组多肽。图2A显示了NcoI-HindIII区的核苷酸和编码的氨基酸序列以及NcoI位点上游区域的核苷酸序列，包括基因10翻译增强子(“gl0”)和CenA前导序列(“leader”)。图2B显示了pTug载体图谱。
图3显示了pTugAS载体的图式。图3A表示SacI-HindIII区的核苷酸和编码的氨基酸序列，以及SacI位点上游区域的核苷酸序列。图3B显示了pTugAS载体图谱。
图4表示pTugEO7K3的构建过程。将pTugA的衍生物pTugK用NcoI完全酶切，pTugK上的抗氨苄青霉素的选择性标记用抗卡那霉素的选择性标记代替。粘性末端用大肠杆菌DNA聚合酶I(Klenow片段)修补成平整末端限制性位点。然后用HindIII完全酶切修饰过的pTugK载体，分离获得4.2kbp的片段。pTZE07(Ong等人，Biotechnol.Bioeng.(1993)42：401-409)用BamHI完全酶切，粘性末端用大肠杆菌DNA聚合物I(Klenow片段)修补成平整末端限制性位点。然后用HindIII完全酶切修饰过的pTZE07载体，分离获得2.1kbp的片段。连接4.2和2.1kbp片段形成pTugE07K3。
图5表示pTugKN1的构建过程。用NheI和HindIII完全酶切pTugE07K3除去含有CBDCex的1.8kbp片段，分离获得4.5kbp的片段。在编码CBDN1的基因片段的5′和3′端用PCR引入合适的限制性位点。相符于成熟CBDN1的N末端(丙氨酸-丝氨酸)，在cbdN1的5′末端用寡核苷酸5′-TTACCTCATATGGCTAGCCCGATCGGGGAGGGAACG-3′引入NheI位点(下划线)作为沉默诱变。在cbdNI的3′末端用寡核苷酸5′-AGAATGAATTCAAGCTTAGAGCTCGACCTCGGAGTC-3′引入HindIII位点。该引物中也包含翻译终止密码子。聚合酶链反应(PCR)混合物(总体积50ml)中含有10-100ng模板DNA(pTZ-JC3)(Coutinho等人，Mol.Microbiol.(1992)6：1243-1252)，25-50pmole(300ng)的引物，2mM MgCl2，6％的二甲亚砜，0.2mM 2′-脱氧核苷5′-三磷酸盐和1单位的TaqDNA聚合酶在50mM，pH8.3的Tris HCl缓冲液中。然后如下进行28次连续的循环：在94℃下变性15秒，在57℃退火1.4分钟，在72℃使引物延伸1.5分钟。得到的CBDN1PCR片段用NheI和HindIII完全酶切，经沉淀纯化0.5kdp的片段。连接4.5kbp和0.5kbp的片段形成pTugKN1。
图6显示了pTugKN1载体。pTugKN1载体通过用抗卡那霉素的选择性标记来代替抗氨苄青霉素的选择性标记(β-内酰胺酶的编码序列)从pTugA载体衍生获得。编码粪肥纤维单孢菌内切葡聚糖酶A(CenA)的前导肽序列用编码粪肥纤维单孢菌外切葡聚糖酶A(CenA)的前导肽的序列代替(Ong等人，“生物工程生物技术”Biotechnol.Bioeng(1993)42：401-409)。
图7显示PBDN1的阴离子交换层析结果。将部分纯化的PBDN1(200ml中有150mg)上样(1ml/min)在阴离子交换柱(MonoQ)上，柱用20mM，pH6.0的磷酸钾缓冲液平衡。在用pH6.0的缓冲液200ml洗柱后，用盐梯度洗脱(600ml，0-1MNaCl，在pH6.0的磷酸钾缓冲液中)回收连接的蛋白质(8ml组分)。PBDN1在300mM盐浓度时从柱中获得(峰1)。杂蛋白连接更加牢固，在更高盐浓度下除去(峰2)。
图8表示在纯化过程中对培养上清液中的PBDN1进行SDS-PAGE分析。在含有12.5％的丙烯酰胺凝胶上分析有pTugKN1(诱导)的JM101培养基上清液(泳道2)、整个培养基悬浮液(细胞和培养液)(泳道3)、培养基上清液中的蛋白质结合后的微晶纤维素(Avicel)组分(泳道4)、上清液与微晶纤维素结合后的流通组分(泳道5)、用水从微晶纤维素洗脱下的组分(泳道6)和在MonoQ纯化后的PBDN1(泳道7和8)。分子量标准(泳道1)如图示。
图9表示用亲和电泳凝胶来分析PBP(PBDN1和PBDN1N2)。在含有13％丙烯酰胺的非变性凝胶上分析纯化牛血清白蛋白(BSA)(泳道1)、PBDN1(泳道2)和PBDN1N2(泳道3)与可溶性寡糖的结合。在多糖((0.1％W/V)羟基乙基纤维素(HEC)或大麦葡聚糖)存在时(+)凝胶上的阻滞和在多糖不存在时(-)它们的迁移来表示结合。木聚糖用作一种不结合的多糖。每个凝胶上每种蛋白质的上样量为5mg。图9A比较了在有(+)和没有(-)大麦β-葡聚糖时的结合情况；图9B比较了在有(+)和没有(-)羟基乙基纤维素时的结合情况，图9C比较了在有(+)和没有(-)桦木木聚糖时的结合情况。
图10显示用于构建pTZ-JC13(图10C)的载体。图10A表示pTZ-JC2，它含有编码整个CenC的基因片段，用于获得编码PBDN1的片段。图10B显示载体pUC18-1.6 cenA_PT，它用于获得CenA编码片段。
图11显示用SDS-PAGE分析CenA和PBDN1-CenA融合蛋白的蛋白水解产物的分析结果。在pH7.0，50ml磷酸盐缓冲液(50mM)中8mg多肽与0(泳道5和9)、0.1(泳道4和8)、0.5(泳道3和7)或1.0单位(泳道2和6)的粪肥纤维单孢菌蛋白水解酶在30℃培育3小时。反应产物在含有12.5％丙烯酰胺的凝胶上进行分析。分子量标准(泳道1)如图示。在蛋白水解除去纤维素结合域后P30与CenA的催化域一致(Gilkes等人，“生物化学杂志”J.Biol.Chem(1988)263：10401-10407)。
图12显示通过示差吸附至纤维素上然后用SDS-PAGE分析未吸附的多肽来分离CenA和PBDN1-CenA的结果。在图12A中，等份的含有25mg(泳道2和3)、100mg(泳道4和5)或250mg(泳道6和7)两种多肽的缓冲液在有细菌微晶纤维素(BMCC(+))或没有细菌微晶纤维素(BMCC(-))下培育。在图12B中，还显示了含有BMCC培育混合物中的未吸附组分的上清液进一步与磷酸溶胀纤维素(PASC(+))培育的结果，同时显示了未加PASC(-)的对照样品的结果。
图13A和13B是固定作用的示意图和融合蛋白的应用。图13A表示了批量生产、纯化和固定融合蛋白。图13B显示了融合蛋白质在用可重复使用的发酵罐-固定柱***来将纤维素性材料水解成葡萄糖的应用。
图14显示两种可除去的标记组合物，以及酶法将可除去的标记从纤维素底物上除下的方法：箭头表示化学物质，空心的方框表示特异性蛋白水解酶的蛋白水解酶切位点，有阴影的方框表示纤维素结合域。
图15显示羟基乙基纤维素与CBDN1在50mM，pH7的磷酸盐缓冲液中在35℃结合的等滴定微量热数据。
图16显示羟基乙基纤维素与Pluronic P105的混合物在50mM，pH7的PBS中在35℃的初步相平衡数据。
图17表示以新的CBDN1融合技术为基础的亲和分配***的示意图。在渗滤除去过量的盐的步骤后，通过在合适的Xa和Xa-CBD融合蛋白表达***的靶蛋白-1处***的Xa因子IQGR特异性识别位点的断裂，靶蛋白可按需从融合构建物上回收获得(参见Assouline等人(1993)Protein Eng.，7：787)。通过在亲和分配步骤后Xa因子的直接断裂来直接回收靶蛋白可简化过程。
图18表示在水中和100mM柠檬酸盐缓冲液中UCON 50-HB-5100的实验性浊点图。对于10°(w/w)的UCON溶液，在二元混合物中相分离在323K时发生，在含有缓冲液的***中则在312K时发生。
具体实施例详述
本发明提供了用于纯化和/或分离与相形成寡糖聚合物结合的组合物的水相分离***。通常，组合物包括与多糖结合的肽(PBP)，它包含对寡糖聚合物有高度亲和力的氨基酸序列，如与多肽或感兴趣的化学物质共轭的多糖的多糖结合域(PBD)。然而，多糖结合肽可包括任何与寡糖聚合物结合的氨基酸序列。本发明也提供了制备PBP的方法；其中PBP可从多糖酶的PBD、多糖结合蛋白或设计成可与多糖结合的蛋白质的结合域衍生获得。PBP可天然产生或人工合成。当PBP是PBD或是从PBD衍生获得时，氨基酸序列通常基本上没有多糖酶的水解酶活性，但仍保留了与底物结合的活性。
相分离***通常包括两相，它们是由于相分离***的组分在混合时的不相容而产生的。***的一种组分是形成相的寡糖，第二种组分是相诱导试剂，如与寡糖聚合物不相容的第二种聚合物，或是强电解质，特别是盐，如硫酸盐或柠檬酸盐，它的高浓度足以诱导相分离。当相形成寡糖是热分离聚合物时，可通过对含有待纯化化合物和相形成聚合物的组合物加热来诱导相分离直至相分离产生。
采用相分配***的步骤包括使含有多糖结合肽的组合物与相分离***接触。相分配***可以预先混合，或组合物的任一组分可以干状形式(如冻干)加入。例如，寡糖聚合物可加入组合物中从而诱导聚合物重新水合并且相分离。在一些应用中，可采用两种以上的相。在组合物充分分配入寡糖聚合物相后可分离相。通过调节***pH、聚合物浓度和分配电解质的加入量可将杂蛋白分配入富含多糖相的量(非亲和作用)减少到最低。通过最优条件的操作，两水相的多级接触可完全或部分(但是充足的)纯化目标组合物。
含有感兴趣的多肽或化学物质的组合物可通过聚合物与能够将包含PBP的组合物洗脱的洗去溶液接触来从聚合物上除下，或者包含PBP的组合物可通过在化合物和PBP间包含一个蛋白水解酶识别位点或化学断裂位点用酶法除下。在后一种方法中，PBP仍与寡糖聚合物结合。识别位点的例子包括那些胶原酶、凝血酶和因子Xa的可被各自相应的酶特异性裂解的识别位点。也可用对例如低pH或溴化氰敏感的化学断裂位点。
为便于除下，特异性裂解酶可以裂解酶复合物的形式提供，其中裂解酶可与有和其它PBP不同的底物结合特性的PBP结合，它可与可溶性寡糖聚合物结合或与其它不是仅有多糖物理结构差异的不同的多糖结合。第二种PBP最好和与第一种PBP不结合的不溶性多糖结合。不溶性多糖可加入含有感兴趣的化合物的混合物中以将裂解酶复合物从溶液中除去。在从溶液分离出后，裂解酶复合物可从不溶性多糖中除去并重新使用。或者，裂解酶复合物可预先与不溶性多糖结合，例如在采取含有感兴趣混合物的化合物流过柱的形式时。
本发明与现用的水相分离***相比还提供了几个优点。寡糖聚合物，包括糖类聚合物如纤维素或其它β-葡聚糖类，如从燕麦或大麦获得的糖类聚合物是很多的、廉价的。而且，各种蛋白质可与糖类聚合物和其它寡糖类特异性结合，可作为本发明的PBP的来源。例如，融合蛋白可制备成含有与糖类结合的蛋白质的糖类聚合物结合部位，以便用本发明的相分离***分离和/或纯化融合蛋白。因此，PBP的应用为亲和分离和/或纯化任何多肽或化学物质提供了通用的方法，即将多肽或化学物质与可结合相形成寡糖聚合物的PBP连接。与寡糖聚合物的PBP选择性结合特别适用于通过单个寡糖聚合物相分离***来纯化和/或分离各种化合物。因此不需要为每种待分离化合物制备单独的相分离***，即为每种化合物制备具体的聚合物配体。同样寡糖与其它相分离采用的聚合物相比有许多结合位点，因此大大提高了聚合物与分配配体结合的容量。
在两相***中用一种或多种热分离聚合物提供的优点是在含有与PBP结合的聚合物的相的高度亲和分离后可用简单的方法来回收和循环使用聚合物。PBP化合物与聚合物特异性牢固结合，但用水或在高pH、室温至生理温度(通常小于40℃，在20℃)下洗脱很容易除去。对于没有蛋白质的化合物，PBP可用通用的蛋白水解酶如蛋白水解酶K在30℃、pH7.0下从化合物中除去。因此PBP提供了一种使化合物与寡糖聚合物连接的方式，使得化合物在以后可被除去。也可获得对相形成寡糖有不同亲和性的突变型PBP或PBD来满足具体的***和/或应用的不同亲和力。如果需要PBP可包括整个多糖酶，它包括有水解活性的蛋白质或当用只含PBP的序列时基本上没有水解活性的蛋白质。后者是所需的，此时底物保持完整性从而可被重复使用。用上述的解吸溶液来处理多糖并不改变多糖的表面结构。另一种方法包括用非特异性蛋白水解酶直接作用在共轭物上来去除PBP共轭物与骨架的结合而不修饰多糖表面。通过在PBP和感兴趣的化合物间引入一个可被特定试剂消除的连接基团，也可单独获得感兴趣的化合物而使PBP仍与寡糖聚合物结合。本***的其它重要优点是它从实验操作到工业操作可按体积线性放大，而且***可进行连续操作。
新的多肽组合物包含有下式的多肽：
        PBP-MR-X                            (1)其中PBD是指多糖酶的底物结合域或其它与多糖底物结合的蛋白质的连续氨基酸序列，它提供了与多糖酶的底物高度亲和结合并且任选地，基本上没有多糖酶活性。PBP至少与结合多糖所需的用于相分离***的氨基酸序列的最小数目一样大，还有一个特点是可与相形成寡糖结合；
MR是中等的区域，可以是一个键、有2至30个碳原子或约2至20个氨基酸的短连接基团。该区域可包括融合蛋白特异性裂解的氨基酸序列，通常是高度特异性的蛋白水解酶如IgA1蛋白水解酶或因子Xa识别的序列；和
X可以是任何感兴趣的肽或化学物质。X的特点是有感兴趣的多肽的整个序列，可以是酶、激素、免疫球蛋白、肽等。
新的多肽组合物包括有下式的多肽：
PBP-Z(2)或
PBP-MR-Z(3)其中：
PBP和MR如上所述；Z是与PBP连接的化学物质。Z只表示种类，并不表示种类的化学计量比。化学计量比可以不同。
PBP可通过各种来源获得，包括本发明中发现有用的寡糖结合酶。本发明中发现两种寡糖有用，(1)相分离***中的寡糖和(2)固相***中所用的寡糖，如用于除去裂解酶的寡糖。相分离***寡糖通常在水性溶液中是可溶的，对于含有PBP和感兴趣的可相分离的化合物的结合有高的亲和性和容量，使得含有多糖结合肽的化合物在一个相内高度富集，通常≥约70％，最好≥80％。下表1是已知的寡糖与另一种聚合物或强电解质形成水性两相***的部分表单。
                    表1
                相形成寡糖无电荷多糖化合物1        有电荷多糖                低分子量
   葡聚糖             葡聚糖羧甲基钠      从纤维素(纤维三糖、纤维
                                           四糖等)衍生获得的糊精
羟丙基葡聚糖          纤维素羧甲基钠      木糖、木二糖、木三糖等
羧甲基葡聚糖        葡聚糖硫酸钠衍生物         麦芽糖糊精和
 麦芽糖糊精             DEAE葡聚糖***半乳聚糖       聚半乳糖醛酸(果胶)
 羟丙基淀粉
  支链淀粉
 甲基纤维素
羟乙基纤维素乙基羟乙基纤维素
羧甲基纤维素
羟丙基纤维素
菲可(Ficoll)
 羧甲基淀粉
 羟乙基淀粉
  支链淀粉
1聚合物可以是原料或纯化过的。
其它可形成两相***的多糖包括：低分子量纤维糖的混合物；脱乙酰壳多糖和其它壳多糖衍生物；所有的水溶性葡聚糖(α、β和/或聚合程度大于3的混合连接物)、修饰的葡聚糖和/或衍生的葡聚糖；谷类β-葡聚糖如大麦或燕麦β-葡聚糖；和甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳糖甘露聚糖、木葡聚糖。
另一类形成两相***的多糖聚合物包括水溶性的两性聚合物，它可在水中热分离。当聚合物的二元水性溶液加热超过它的浊点温度(CPT)时，溶液相分离成两宏观相。一相，通常是底相，富含聚合物，而另一相典型地只含有少量或不含聚合物。已知的有热分离性质的以多糖为基础的聚合物包括甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素、丙基羟乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。然而，基本上任何水溶性的β-1，4-连接的纤维糖应当表现出热分离性质。Johansson等人(1993)，“大分子学”Macromolecules，26，4478；Harris等人，(1991).“生物分离方法”Bioseparations 2，237；Alfred P.A.等人(1992).“生物分离方法”Bioseparations 2，363；和Alfred P.A.等人(1994).“层析学杂志”J.Chromatog.，659，289。其它可热分离的水溶性聚合物包括聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚丙二醇及环氧乙烷和环氧丙烷的线性随机共聚物(商品名为UCON和Pluronic)。
对于固相回收***，可用各种多糖底物。它们包括纤维素、由D-吡喃葡糖单元加入β-1，4-葡糖键和它的酯如纤维素乙酸酯组成的多糖；木聚糖，其中重复的骨架单元是β-1，4-D-吡喃木糖；壳多糖，它与纤维素相似，由β-1，4-连接的N-乙酰，2-氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡糖单元组成。可与多糖结合的酶，如上面列出的，是本发明感兴趣的可与这些底物结合的氨基酸序列的来源。
在下表6中列出了那些与一个或多个可溶/不溶性多糖结合的结合域，它们包括对可溶葡聚糖有亲和力的所有结合域(α、β和/或混合键)。粪肥纤维单孢菌的内切葡聚糖酶CenC的N1纤维素结合域是唯一与可溶性纤维多糖结合的蛋白质并且是与任何可溶多糖结合的蛋白质小类中的一个。同样，表2至5是含有推断的β-1，3-葡聚糖结合域(表2)；含有链球菌葡聚糖结合重复体的蛋白质(Cpl超家族)(表3)；有壳多糖结合域的酶(表4)和淀粉结合域(表5)。
                       表2
含有假定的β-1，3-葡聚糖结合域的蛋白质的总结
    来源(菌株)1            蛋白质          登记号            参考文献2
         I型
    环状芽孢杆菌             GLCAl   P23903/M34503/JQ0420         1(B.circulans)(WL-12)环状芽孢杆菌(IAM 1165)         BglH    JN0772/D1 7519/S67033        2
        II型
   马杜拉放线菌种            XynII          U08894                3(Actinomadura sp.)(F7C)节杆菌种(Arthrobacter sp.)       GLCI           D23668                9
       (YCWD3)溶黄色厄斯考维氏菌属          GLC      P22222/M60826/A39094        4(O.xanthineolytica)R.faecitabidus(YLM-50)         RPI      Q05308/A45053/D10753        5a，b
  R.communis           Ricin              A12892              6
  蓝色链霉菌           XlnA       P26514/M64551/JS07986       7(S.lividans)(1326)
 T.iridentatus         FactorGa           D16622              8
1B.：芽孢杆菌属，O.：厄斯考维氏菌属，R.faecitabidus：Rarobacterfaecitabidus，R.communis：Ricinus communis，S：链霉菌属，T：Tachypleus(Horseshoe Crab)
2参考文献
1)Yahata等人(1990)“基因”Gene 86，113-117；2)Yamamoto等人(1993)“生物学，生物技术和生物化学”Biasci.Biotechnol.Biochem.57，1518-1525；3)Harpin等人(1994)“EMBL数据手册”EMBL Data Library；4)Shen等人(1991)“生物化学杂志”J.Biol.Chem 266，1058-1063 5a)Shimoi等人(1992)“生物化学杂志”J.Biol.Chem.267，25189-25195；5b)Shimoi等人(1992)“生化杂志”J.Biochem 110，608-613；6)Horn等人(1989)专利AI2892；7)Shareck等人(1991)“基因”Gene 107，75-82；8)Saeki等人(1994)“生物化学杂志”J.Biol.Chem.269，1370-1374；9)Watanabe等人(1993)“EMBL数据手册”EMBL Data Library
                  表3
含有链球菌葡聚糖结合重复体(Cpl超家族)的蛋白质的总结
         来源                       蛋白质            登记号          参考文献1
      唐尼链霉菌                     GTF-I            D13858              1(S.downei(sobrinus))(0MZ176)唐尼链霉菌(sobrinus)(MFe28)              GTF-I         P11001/M17391          2
   唐尼链霉菌(MFe28)                 GTF-S     P29336/M30943/A41483       3
    唐尼链霉菌(6715)                 GTF-I     P27470/D90216/A38175       4
      唐尼链霉菌                     DEI              L34406              5
     突变型链霉菌                    GBP           M30945/A37184          6
(S.mutants)(Ingbritt)
  突变型链霉菌(GS-5)                 GTF-B            A33128              7
  突变型链霉菌(GS-5)                 GTF-B     P08987/M17361/B33135       8
     突变型链霉菌                GTF-B3′-ORF     P05427/C33135            8
  突变型链霉菌(GS-5)                 GTF-C     P13470/M17361/M22054       9
突变型链霉菌(GS-5)         GTF-C          无               10
突变型链霉菌(GS-5)         GTF-D      M29296/A45866        11
    唾液链霉菌             GTF-J  A44811/S22726/S28809     12
 (S.salivarius)                       Z11873/M64111
    唾液链霉菌             GTF-K  S22737/S22727/Z11872     13唾液链霉菌(ATCC25975)       GTF-L         L35495            14唾液链霉菌(ATCC25975)       GTF-M         L35928            14肺炎链霉菌(S.pneumoniae)R6     LytA   P06653/A25634/M13812     15
    肺炎链霉菌             PspA       A41971/M74122        16
    噬菌体HB-3             HBL        P32762/M34652        17
    噬菌体Cp-1             CPL-1  P15057/J03586/A31086     18
    噬菌体Cp-9             CPL-9  P19386/M34780/JQ0438     19
    噬菌体EJ-1             EJL           A42936            20
     艰难梭菌              ToxA   P16154/A37052/M30307     21(C.difficile)(VPI 10463)                 X51797/S08638
艰难梭菌(BARTS W1)         ToxA       A60991/X17194        22
艰难梭菌(VPI 10463)        ToxB   P18177/X53138/X60984     23，24
                                          S10317
   艰难梭菌(1470)          ToxB       S44271/Z23277        25，26
诺维氏梭菌(C.novyl)        a-toxin    S44272/Z23280        27
     诺维氏梭菌            α-毒素        Z48636           28醋酪酸梭菌(C.acetobutylicum)   CspA      S49255/Z37723         29
     (NCIB8052)
醋酪酸梭菌(NCIB8052)       CspB           Z50008           30
醋酪酸梭菌(NCIB8052)       CspC           Z50033           30
醋酪酸梭菌(NCIB8052)       CspD           Z50009           30
1参考文献
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                       表    4
             有壳多糖结合域的酶的总结
来源(菌株)               蛋白质         登记号           参考
                                                         文献2
细菌酶
I型气单胞菌属(Aeromonas sp.)      Chi          D31818            1
(No10S-24)环状芽孢杆菌(WL-12)         ChiA1   P20533/M57601/A38368    2   环状芽孢杆菌(WL-12)            ChiD          P27050/D10594              3Janthinobacterium lividum         Chi69             U07025                 4
   灰色链霉菌                 蛋白酶            A53669                 5(Streptomyces griseus)            C
      II型
  豚鼠气单胞菌                 Chi              U09139                 6(Aeromonas cavia)(K1)Alteromonas sp(0-7)             Chi85    A40633/P32823/D13762           7加利福尼亚Autographa(C6)          NPH-         P41684/L22858              8
                               128
   粘质沙雷氏菌                ChiA  A25090/X03657/L01455/P07254       9(Serratia marcescens)
      III型少孔根霉菌(Rhizopus              Chi1  P29026/A47022/D10157/S27418       10oligosporus)(IFO8631)少孔根霉菌(IFO8631)             Chi2  P29027/A47022/D10158/S27419       10
    酿酒酵母菌                 Chi          S50371/U17243              11(Saccharomyces cerevisiae)
 酿酒酵母菌(DBY939)            Chi1         P29028/M74069              12
 酿酒酵母菌(DBY918)            Chi2       P29029/M7407/B41035          12
      植物酶
     Hevein超家族
大蒜(Allium sativum)           Chi               M94105                13
 Amaranthus caudatus           AMP-1b       P27275/A40240             14，15
 Amaranthus caudatus           AMP-2b       S37381/A40240             14，15拟南芥(Arabidopsis thaliana)       ChiB       P19171/M38240/45511          16
     (CV.colombia)
       拟南芥                  PHPc              U01880                17胜利油菜(Brassica napus)        Chi               U21848                18
      胜利油菜                 Chi2          Q09023/M95835             19
  Hevea brasiliensis           Hevid        P02877/M36986/            20，21
                                             A03770/A38288
 大麦(Hordeum vulgare)         Chi33             L34211                22番茄(Lycopersion esculentum)        Chi9       Q05538/Z15140/S37344       23红花烟草(Nicotiana tabacum)         CBP20e          S72424               24
      红花烟草                  Chi              A21091               25
      红花烟草                  Chi     A29074/M15173/S20981/S19855   26
     (cv.Havana)
    红花烟草(FB7-1)             Chi            JQ0993/S0828           27
  红花烟草(cv.Samsun)           Chi              A116119              28
  红花烟草(cv.Havana)           Chi        P08252/X16939/S08627       27
   红花烟草(cv.BY4)             Chi     P24091/X51599/X64519//S13322  26，27，
                                                                      29
  红花烟草(cv.Havana)           Chi         P29059/X64518/S20982      26
稻(Oryza sativum)(IR36)         ChiA               L37289             30
          稻                    ChiB         JC2253/S42829/Z29962     31
          稻                    Chi          S39979/S40414/X56787     32
     稻(cv.Jaonicum)            Chi                X56063             33
     稻(cv.Jaonicum)            Chi1         P24626/X54367/S14948     34
          稻                    Chi2              P25765/S15997       35
    稻(cv.Japonicum)            Chi3               D16223             32
          稻                    ChiA             JC2252/S42828        30
          稻                    Chi1               D16221             32
        稻(IR58)                Chi                U02286             36
          稻                    Chi                X87109             37
  豌豆(Pisum sativum)           Chi               P36907/X63899       38
       (cv.Birte)
     豌豆(cv.Alcan)             Chi2               L37876             39
  Populus trichocarpa           Chi       S18750/S18751/X59995/P29032 40Populus trichocarpa(H11-11)        Chi                U01660             41菜豆(Phaseolus vulgaris)         Chi       A24215/S43926/Jq0965/P36361 41
       (cv.Saxa)
      菜豆(cv.Saxa)             Chi       P06215/M13968/M19052/A25898 43，44，
                                                                      45黑接骨木(Sambucus nigra)         PR-3f              Z46948            46
 黑麦(Secale cereale)           Chi                 JC2071            47马铃薯(Solanum tuberosum)         ChiB1           U02605                   48
      马铃薯                  ChiB2           U02606                   48
      马铃薯                  ChiB3        U02607/S43317               48
      马铃薯                  ChiB4           U02608                   48马铃薯(cv.Maris Piper)          WIN-1g   P09761/X13497/S04926           49马铃薯(cv.Maris Piper)          WIN-2g   P09762/X13497/S04927           49小麦(Triticum aestivum)          Chi         S38670/X76041                50
       小麦                   WGA-1h P10968/M25536/S09623/S07289      51，52
       小麦                   WGA-2h P02876/M25537/S09624             51，53
       小麦                   WGA-3h P10969/J02961/S10045/A28401      54美洲榆(Ulmus americana)           Chi             L22032                   55
     (NPS3-487)大荨麻(Urtica dioica)            AGLi           M87302                   56
Vigna unguiculata             Chi1            X88800                   57
(cv.Red caloona)
NHP：细胞核多角体病毒内切壳多糖酶样序列
Chi：壳多糖酶
b抗微生物肽，chevein前体样肽，dhevein，e壳多糖结合蛋白，f病理性(patogenesis related)蛋白，g伤口诱导型(wound-induced)蛋白，h麦胚凝集素，凝集素
1壳多糖结合域的参考文献
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                           表 5
                  含有淀粉结合域的酶的归纳
来源(菌株)                       酶                   登记号          参考文献5泡盛曲霉(A.awarori)               AMYG           P23176/D0042/JT0479      1，2(kawachi变种)黑色曲霉(A.niger)(T21)              AMYG                   S73370            3黑色曲霉-泡盛曲霉                 AMYG1/G2      P04064/A90986/A29166/X     4，5，67，8，9
                                                00712/X00548 K02465米曲霉(A.oryzae)                 AMYG(GLAA)    P36914/JQ1346/D01035/S     10，11
                                                    75274/D01108
 A.Shirousamii                  AMYG(GLA)      P22832/JQ0607/D10460      12芽孢杆菌(Bacillus sp.)              AMYa         P17692/M33302/D90112/S     13
     (B1018)                                            09196
芽孢杆菌(TS-23)                 a-AMY                   U22045           14
芽孢杆菌(1-1)                   CGT                P31746/S26399         15
芽孢杆菌(6.63)                  CGT            P31747/X66106/S21532      16
芽孢杆菌(17-1)                  CGT            P30921/M28053/A37208      17
芽孢杆菌(38-2)                  CGT           P09121/M19880/D00129/S     18，19
                                                        24193
芽孢杆菌(1011)                  CGT            P05618/A26678/M17366      20芽孢杆菌(DSM5850)                CGT                     A18991           21
芽孢杆菌(KC201)                 CGT                     D13068           15，22蜡状芽孢杆菌(SPOII)               b-AMY          A48961/P36924/S54911      23
 环状芽孢杆菌                   CGT            P30920/X68326/S23674      24
(B.circulans)(8)环状芽孢杆菌(251)        CGT                X78145               25
地衣形芽孢杆菌          CGTA        P14014/X15752/S15920        26
(B.Licheniformis)
  软化芽孢杆菌          CGTM(CDG1)  P04830/X5904/S31281         27(B.macerans)(IFO 3490)
  软化芽孢杆菌          CGT               M12777                28
   (IAM 1243)
  软化芽孢杆菌          CGT(CDG2)       P31835/S26589           29
   B.ohbensis           CGT             P27036/D90243           30
嗜热脂肪芽孢杆菌        AMYMb      P19531/M36539/S28784        31(B.stearothermophilus)
嗜热脂肪芽孢杆菌        CGT        P31797/X59042/S26588/X       32
      (NO2)                          59043/X59404/S31284
  罗尔氏伏革菌          AMYG2              D49448               33(C.rolfsii)(AHU 9627)
  D.discoideum          ORF             S15693/X51947           34灰色腐质霉(H.grisea)       GLA1                M89475              35(var.thermoidea)H.resinae(ATCC20495)        GAMP       Q03045/X68143/X67708/S       36-38
                                         31422/S33908肺炎克雷白氏杆菌         CGT         P08704/M15264/A29023        39(K.pneumoniae)(M5A1)
 粗糙链孢霉             GLA-1      P14804/X67291/S13711/S1      40，41(N.crassa)(74-OR23-1A)                       3710/S36364
 嗜糖假单胞菌           MTAC       P22963/X16732/S05667        42(P.saccharophila)
  (LAMI504)
  假单胞菌              AMF-1d      D10769/JS063/D01143        43(Pseudomonas sp.)
  (KO-8940)司徒茨氏假单胞菌         AMYPc      P13507/M24516/A32803        44
(P.stutzeri)(MO-19)
灰色链霉菌(S.griseus)    AMY   P30270/X57568/S14063    45
     (IMRU 3570)淤泥链霉菌(S.limosus)      AML   P09794/M18244/B28391    46
  (微白黄链霉菌
 (S.albidoflavus))紫色链霉菌(S.violaceus)    AML   P22998/M25263/JS0101    47
  (委内瑞拉链霉菌
  (S.venezuela))
  (ATCC15068)弯曲热单孢(Th.curvata)     TAMe P29750/X59159/JH0638    48
   (CCM3352)Th.thermosulfurogenes      AMYA  P26827/X54654/X54982/S  49
  (DSM3896/EMI)f                   17298/S37706Th.thermosulfurogenes      AMYB  P19584/M22471/A31389    50
   (ATCC 33743)
  a原淀粉消化淀粉酶，b麦芽糖孔蛋白α-淀粉酶，c形成麦芽糖四糖的淀粉酶(1，4-α-四麦芽糖水解酶)，d形成麦芽糖五糖的淀粉酶，e热稳定α-淀粉酶，fClostridium thermosulfurogenes前体。
AMYG、GAM和GLA：葡糖淀粉酶，AMY或AML：α-淀粉酶，CGT：β-环糊精糖基转移酶或环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶，ORF：开放读框
A.：曲霉属(Aspergillus)，B.：芽胞杆菌属(Bacillus)，C.：伏革菌(Corticium)，D.：Dictiostelium，H.grisea：灰色腐质酶(Humicola grisea)，H.resinea.Hormoconisresinae(Amorphotheca resinae)，K.：克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)，N.：链胞霉属(Neurospora)，S.：链霉菌属(Streptomyces)，Th.curvata：弯曲热单胞(Thermomonospora curvata)，Th.：热厌氧菌(Thermoanaerobacter)
5淀粉结合域的参考文献
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用各种不同的实验技术和方法通过各种方式可鉴定并筛选出有所需结合特征和特异性的新的PBP。它们包括光谱(滴定)方法如：NMR光谱法(Zhu等人“生物化学”Biochemistry(1995)34：，Gehring等人“生物化学”Biochemistry(1991)30：5524-5531)、UV示差谱(Belshaw等人“欧洲生物化学杂志”Eur.J.Biochem.(1993)211：717-724)、荧光(滴定)光谱(Miller等人J.Bio1.Chem.(1983)258：13665-13672)、UV或荧光停流分析(De Boeck等人Eur.J.Biochem.(1985)149：141-415)，亲和方法如亲和电泳(Mimura等人J.Chromatography(1992)597：345-350)或在固定的单糖或寡糖上的亲和层析，沉淀或凝聚分析包括比浊或浊度分析(Knibbs等人J.Biol.Chem.(1993)14940-14947)、竞争性抑制测定法(有或没有定量的IC50测定)，和各种物理或物理化学方法如示差扫描或等温滴定量热法(Sigurskjold等人J.Biol.Chem.(1992)267：8371-8376；Sigurskjold等人Eur.J.Biol.(1994)225：133-141)或在寡糖存在或不存在下用热圆二色性谱或荧光光谱比较蛋白质稳定性的测定法。用这些方法可进行定性或定量分析(缔合或解离常数、IC50值、热力学参数等)。鉴定对可溶性寡糖聚合物有较高或较低结合亲和力的PBP是所需的；根据具体的应用，有较低而不是较高的结合亲和力的PBP可使例如在分配和/或分离富含包含PBP的化合物的寡糖聚合物相后更易除去寡糖聚合物。
                           表    6
                       多糖结合域的来源结合域                       发现有结合域的蛋白质纤维素结合域     β-葡聚糖酶(微晶纤维素酶、CMC酶、纤维糊精酶)
                      外切葡聚糖酶或纤维生物水解酶
                              纤维素结合蛋白
                                  木聚糖酶
                           混合的木聚糖酶/葡聚糖酶
                                    酯酶
                                  壳多糖酶
                              β-1，3-壳多糖酶
                         β-1，3-(β-1，4)-葡聚糖酶
                              (β-)甘露糖醇酶
                            β-葡糖苷酶/半乳糖苷酶
                             纤维素合成酶(未确定)淀粉/麦芽糖糊精                      α-淀粉酶2，3结合域                               β-淀粉酶4’5
                                   支链淀粉酶
                                 葡糖淀粉酶6，7
                环糊精葡糖转移酶8-10(环麦芽糖糊精葡聚糖转移酶)
                              麦芽糖糊精结合蛋白质11葡聚糖结合域                       (链球菌)糖基转移酶12
                               葡聚糖蔗糖酶(未确定)
                              梭状芽孢杆菌毒素13，14
                                    葡糖淀粉酶6
                                  葡聚糖结合蛋白β葡聚糖结合域                    β-1，3-葡聚糖酶15，16
                        β-1，3-(β-1，4)-葡聚糖酶(未确定)
                              β-1，3-葡聚糖结合蛋白17壳多糖结合域                              壳多糖酶
                                      壳二糖酶
                            壳多糖结合蛋白(也见纤维素结合域)
                                      Heivein
1)Gilkes等人“微生物进展回顾”Adv.Microbiol.Reviews，(1991)303-315；2)Sogaard等人，“生物化学杂志”J.Biol.Chem.(1993)268：22480；3)Weselake等人“谷类化学”Cereal Chem.(1983)60：98；4)Svensson等人J.(1989)264：309；5)Jespersen等人J.(1991)280：51；6)Belshaw等人“欧洲生物化学杂志”Eur.J.Biochem.(1993)211：717；7)Sigurskjold等人，“欧洲生物化学杂志”Eur.J.Biochem.(1994)225：133；8)Villette等人，“生物技术应用及生物化学”Biotechnol.Appl.Biochem.(1992)16：57；9)Fukada等人，“生物学，生物技术和生物化学”Biosci.Biotechnol.Biochem.(1992)56：556；10)Lawson等人，“分子生物学”J.Mol.Biol.(1994)236：590；11)Sharff等人，“生物化学”Biochemistry(1992)31：10657；12)Lis等人，“应用环境微生物学”Appl.Environ.Microbiol.(1995)61：2040；13)von Eichel-Streiber等人，“细菌杂志”J.Bacteriol.(1992)174：6707；14)von Eichel-Streiber等人，“分子基因学”Mol.Gen Genet.(1992)233：260.15)Klebl等人，“细菌杂志”J.Bacteriol.(1989)171：6259；16)Watanabe等人，“细菌杂志”J.Bacteriol.(1992)174：186；17)Duvic等人，“生物化学杂志”J.Biol.Chem.(1990)265：9327
PBP在酶分离和纯化后可通过将PBP从剩余的酶上切下来获得。为用于相分离***，筛选PBP结合到可溶的相形成寡糖上。可用任何一种筛选方法，包括单用NMR、NMA/量热法、单用亲和电泳、亲和电泳/竞争性测定法、和结合等温法。最好用等温滴定微量热法(ITC)进行结合平衡的研究。结合平衡研究中等温滴定微量热法(ITC)的优点是由于结合等温线是通过反应热实验来确定的；因此，除了缔合常数外可直接估计出焓值(和熵值)变化。因此，单个微量热法提供结合能量与等温线的全部特征(Haynes等人，“胶体界面杂志”J.Colloid Interface Sci.，(1994)169：313；Colloids & Surfaces，(1994)2：517)。
通常用于相分离时，PBP与可溶性寡糖结合的Ka至少在弱抗体-抗原反应值的范围内，即3103M、较佳为104M、最佳为106M。如果PBP与寡糖的结合是放热的或吸热的，那么在较低温度下的结合将分别增强或减弱，它为分配步骤提供了一种温度调节的方法。
除了要确定寡糖聚合物-PBP配对外，还需要评价相分离***中和寡糖聚合物合用的第二种组分，即相分离方法。相分离方法可以是另一种聚合物，或足够量的相诱导试剂(通常是强电解质如盐，盐通常是硫酸盐或柠檬酸盐)或物理上的变化，如当纤维糖聚合物有热分离性质时的温度变化。可形成有类似经典的葡聚糖/PEG***性质，但成本较低的聚合物配对的例子，包括那些如葡聚糖/PEG***一样以糖类与聚氧醚间的不相容性为基础的配对有许多(见Skuse等人，“酶微生物技术”Enzyme Microb.Technol.(1992)14：785)。例子包括羟丙基淀粉(Tjerneld等人，“酶微生物技术”Enzyme Microb.Technol.(1986)8：417)、麦芽糖糊精(Szlag等人，ACS Symposium Series(1990)419：38-52)、羟丙基纤维素(Skuse等人，“酶微生物技术”Enzyme Microb.Technol.(1992)14：785)和羧甲基纤维素(Albertsson，“细胞颗粒和大分子的分配”Partition ofCell Particles and Macromolecules，Wiley Interscience(1971))，它们均可与PEG形成分配***。
为开发一个***，需要获得相平衡数据以选择第一和第二组分的组合和/或用Haynes等人(“液相平衡数据”Fluid Phase Equilibria(1989)53：463)方法决定总的聚合物浓度、或聚合物和另一种相诱导剂的浓度，根据它们可形成稳定的两相分配***。通常，PBP共轭物在中等pH下在中等离子强度的缓冲液(约10mM至1M)中与相形成寡糖结合。根据相分离***内的组分，结合可在4至至少70℃下进行。结合基本上是瞬时的，且温度并不重要。一旦PBP共轭物与相形成寡糖结合，它就分配入那个相中。
一旦确定了相分离***的组分和最适于具体应用的多糖结合物质，PBP可通过将包含编码合适的多糖结合物的DNA构建物键转化入宿主细胞中来制备。术语“多糖结合肽”指至少包含多糖酶或多糖结合蛋白的多糖结合域的官能部分的氨基酸序列。“官能部分”指可与所需寡糖聚合物结合的氨基酸序列。较佳地，编码所需蛋白质的DNA与PBP DNA序列连接。式(1)的编码组合物的融合基因或单独的PBP DNA序列在宿主细胞如真核细胞或原核细胞中表达。如果要单独制备PBP，表达并分离得到的多糖结合肽可与感兴趣的化合物即蛋白质或化学物质进行共轭反应。
分离多糖酶基因如纤维素酶基因和多糖结合蛋白的基因的技术是该领域已知的，包括从基因组DNA合成、分离、从cDNA制备或它们的组合(见USPN5,137,819，5,202,247和5,340,731)。与可溶性寡糖结合的一些多肽结合域的序列是已知的(见图1)。编码各种多糖酶和多糖结合蛋白的DNA也是已知的。各种基因操作技术是熟知的，包括限制、酶切消化、重新分段、连接、体外诱变、引物修补、用接头和衔接头等(见Sambrook等人，“分子克隆实验手册”Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York，1989)。
通常，获得所需DNA的方法包括从表达有所需性质的多糖酶或多糖结合蛋白的生物中制备基因组文库。用合适的限制性酶如BamHI来分离切割供体微生物的基因组。将获得的片段***由相容的限制性酶预先切开的载体分子中。一个合适的载体例子是质粒pBR322，它被限制性酶BamHI切开。
多糖酶的氨基酸序列也可设计成探针以从感兴趣的供体细胞中筛选出从mRAN或DNA制备的cDNA或基因组文库中的多糖酶基因或多糖结合蛋白基因。通过采用多糖酶cDNA或结合蛋白cDNA或它们的片段作为杂交探针，可容易地克隆其它微生物中发现的结构相关基因。特别注意的是用寡核苷酸探针从表达多糖酶活性的微生物中分离基因，该寡核苷酸探针以从具有独立的多糖酶催化和结构域的生物中获得的基因核苷酸序列为基础(参见例如，Shoseyev等人Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)(1992)89：3483-3487)。
用多糖酶或多糖结合蛋白的结合域的共有序列来制备探针是特别有用的。至今从粪肥纤维单孢菌获得的β-1，4-葡聚糖酶有内切葡聚糖酶A、B、C和D(分别为CenA、CenB、CenC、CenD)，外切纤维生物水解酶A和B(分别为CbhA和CbhB)和木聚糖酶A和D(分别为Cex和XylD)(参见Wong等人(1986)“基因”Gene，44：315；Meinke等人(1991)“细菌杂志”J.Bacteriol.，173：308；Coutinho等人，(1991)“分子微生物学”Mol.Microbiol.5：1221；Meinke等人，(1993)“细菌”Bacteriol.，175：1910；Meinke等人，(1994)“分子微生物学”Mol.Microbiol.，12：413；Shen等人，“生物化学杂志”Biochem.J.，in Press；O′Neill等人(1986)“基因”Gene，44：325；和Millward-Sadler等人，(1994)“分子微生物学”Mol.Microbiol.，11：375)。所有模型蛋白的复杂程度不同(图1)；但有两个共同的特征：即有独立功能的催化域(CD)和纤维素结合域(CBD)(参见Millward-Sadler等人，(1994)“分子微生物学”Mol.Microbiol.，11：375；Gilkes等人，(1988)“生物化学杂志”J.Biol.Chem.，263：10401；Meinke等人，(1991)“细菌杂志”J.Bacteriol.，173：7126；和Coutinho等人，(1992)“分子微生物学”Mol.Microbiol.，6：1242)。在四种酶CenB、CenD、CbhA和CbhB中，纤连蛋白型III(Fn3)重复体将N端CD和C端CBD分开。酶的CD来自糖苷水解酶家族的其中六个(参见Henrissat(1991)“生物化学杂志”Biochem.J.，280：309；和Henrissat等人，(1993)“生物化学杂志”Biochem.J.，293：781)；所有的酶均有家族II或CBD的N端或C端CBD(参见Tomme等人，“微生物生理学进展”Adv.Micro.Physiol.，in press)；CenC的N端有家族IV的串联CBD；CenB和XylD各有第二个家族III和II的内部CBD。Cex和XylD很明显都是木聚糖酶；然而Cex，而不是XylD，对纤维素的活性较低。因此和其它细菌木聚糖酶一样(参见Gilbert等人(1993)“基因微生物学杂志”J.Gen.Microbiol.，139：187)，它们均有CBD。用相关细菌可产生类似的***(参见Wilson(1992)Crit.Rev.Biotechnol.，12：45；和Hazlewood等人，(1992)“应用细菌杂志”J.Appl.Bacteriol.，72：244)。粪肥纤维单孢菌可产生其它β-1，4-葡聚糖酶。不相关的细菌例如嗜热纤维梭状芽孢杆菌(Clostridiumthermocellum)可产生二十或更多种β-1，4-葡聚糖酶(参见Beguin等人，(1992)“FEMS微生物学杂志”FEMS Microbiol.Lett.，100：523)。
典型的结合域共有序列是图1所示的纤维结合域的共有序列，其代表性是内切葡聚糖酶CN1结合域。探针可以比整个序列短的多，但核苷酸长度应至少是10，较好至少为14。也可用更长的寡核苷酸直至全长基因，其核苷酸长度较佳的应不超过500，更佳应不超过250。可用RNA或DNA探针。通常，这样确定的核苷酸编码的结合部分与结合域至少有40％是同源的(包括允许适当的保守性取代、更佳排列的空隙等)，它与可溶性β-1，4-葡聚糖结合反应的Ka是3103M。氨基酸比较分析可用PC/Gene(IntelliGenetics，Inc)的程序来进行。PCLUSTAL可用于多种序列排列和产生***树。
在使用中，探针通常用可被检测的方式(例如用32P、3H、生物素或亲和素)来标记，并与发现有基因的生物的单链DNA或RNA培育。在单链和双链(杂交的)DNA(或DNA/RNA)分离(通常用硝化纤维素膜)后用标记来检测杂交反应。适用于寡核苷酸的杂交技术是该领域技术人员熟知的。尽管通常探针可用可被检测的标记来使鉴定更容易，但也可用未标记的寡核苷酸，它可作为标记探针的前体，也可用于直接检测双链DNA(或DNA/RNA)。因此。术语“寡核苷酸探针”指标记过以及未标记的形式。
为分离多糖酶和多糖结合蛋白的PBP可用几种遗传方法。一种方法是用限制性酶除去部分基因，然后使剩余的基因-框架中的载体片段融合，以获得编码截短蛋白质的突变基因。另一种方法是用外切核酸酶如Bal31来人为地从DNA的5′端或3′端外切或在基因内的限制性缺口内切。这些基因缺失方法形成了编码可评价底物或多糖结合能力的截短蛋白质分子的突变基因。用于评价和结合活性的合适的底物包括上表2中列出的。
一旦确定了编码多糖结合域的核苷酸序列，无论是cDNA还是染色体DNA，就可用各种方法来制备表达有上述式(1)结构的表达产物的组合物。核苷酸序列可与编码所需多肽的DNA序列融合。很希望能保留组分多肽的三维结构。根据所需多肽的片段来源和长度，限制性方法可设计合成的基因来构建嵌合的多肽，如果可以，限制性位点可不改变多肽的氨基酸序列。然而，在一些情况下加入新的限制性位点可产生改变的氨基酸序列而不改变蛋白质的活性。
在构建表达盒(expression cassette)时，通常是将DNA的各种片段克隆入合适的克隆载体中，从而可进行DNA的扩增、DNA的修饰或***或取出序列、接头或其它的操作。通常，载体可在细菌内至少以相当高的拷贝数进行复制。有许多载体可用于克隆入革兰氏阴性细菌特别是大肠杆菌中，它们包括载体如pBR322、pTZ、pUC等。克隆载体的特征是在宿主细菌中有有效的复制***。
克隆载体有至少一个单限制性位点，通常可有多个单限制性位点，而且也可包括多限制性位点。此外，克隆载体可含有一个或多个标记以用于选择转化体。标记通常提供了对细胞毒性试剂如抗生素、重金属、毒素等的抗性、对营养缺陷型宿主的补充或对噬菌体的免疫性。通过载体和盒的适当限制性酶切，通过端的切除或填补修饰末端，加入接头或加尾适当将末端修饰成平头，可提供互补末端来将表达盒或其组分连接并***载体中。
在产生盒的每次DNA操作后，对质粒克隆、分离并按需分析特定盒组分的序列以保证获得合适的序列。根据操作的特征，所需的序列可从质粒中切出并引入不同的载体中，或质粒可按需进行限制性酶切并操作表达盒组分。
在一些例子中，当载体可在不同的宿主细胞中复制，并需要不同的复制***时，可用一种穿梭载体。它需要或不需要其它的在两种宿主中起作用的标记。当需要这些标记时，载体中可包括它们，其中含有盒、两套复制***和标记的质粒可按需从一个宿主传递至另一个宿主。任何有用的标记可用于选择。最好选择对新霉素或四环素有抗性的标记。然而，尽管很需要选择标记以便于筛选，但是其它筛选转化细胞的步骤是该领域技术人员已知的，例如转化细胞可根据它们产生的特异性产物来筛选；所需的产物的合成可用免疫法或酶法来测定。
编码融合蛋白的DNA可用各种操作来进行表达。描述的细菌的转录调节区或启动子包括乳糖启动子、λ左和右启动子、色氨酸和乳糖启动子、Tac启动子等。转录调节区还可包括调节序列，调节序列使融合基因表达时间可以调节，生长培养基中的营养物或表达产物有或没有、温度等。例如，融合基因的表达可用温度通过含有噬菌体λPL启动子、噬菌体λOL操纵子和温度敏感的阻抑子的调节序列来调节。启动子的调节是通过阻抑子和操纵子间的反应来实现的。较佳的启动子是对葡萄糖阻抑不敏感的强Tac启动子。高水平表达载体的例子在Graham等人(1995)“基因”Gene158：51-54中有所描述。
表达盒可与复制***一起在合适的细胞宿主中但保持独立或可没有复制***而是整合入宿主细胞基因组中。DNA可用已知技术，如用磷酸钙沉淀的DNA转化、使细胞和病毒接触的转染、将DNA微量注射入细胞中等方法来引入宿主中。
一旦融合蛋白的DNA被引入合适的宿主中后，可使宿主生长并表达融合蛋白。可用微生物宿主包括，例如，细菌如大肠杆菌，真核细胞如酵母属，特别是酿酒酵母菌、链霉菌属、芽孢杆菌、巴斯德毕赤氏酵母，或哺乳动物细胞如BHK和CHO。重组的产物可以是糖基化的或非糖基化的，有野生型或其它糖基化形式。糖基化的量部分取决于特定肽的序列以及产生它的有机体。因此，在大肠杆菌中的表达形成了非糖基化的产物，产物在昆虫细胞中的表达通常形成比在哺乳动物细胞中产物的表达较少的糖基化。在酵母中的表达可形成超糖基化。
为分离融合蛋白，当产物留在宿主细胞中时，收获并水解细胞，并用相分离***分离和/或纯化产物。在一些例子中，希望在结构基因的上游和阅读框架中可提供信号序列(分泌型前导序列)，它可提供融合蛋白的分泌。描述的分泌型前导序列包括青霉素酶、免疫球蛋白、T细胞受体、外膜蛋白等的分泌型前导序列。通过融合入合适的阅读框架可使融合蛋白分泌入培养基。然而，在细菌表达***如大肠杆菌中，有明显的组分进入胞外的培养基中(Ong等人“生物技术生物工程”Biotech.Bioeng.(1993)42：401)。当产物分泌时，可收集营养物培养基并用相分离***来分离产物。为生成活性的蛋白质，需要使蛋白质再次折叠。
相分离***与生物液体、发酵液、细胞裂解液或其它来源的待纯化和诱导相分离的生物化合物合用。为分离和/或纯化水性混合物中的组分，在含有PBP的组合物分配入寡糖相后，可以用多种方法中的任一种来分离相和含有从聚合物相解离下的PBP的组合物。它们包括使分离的寡糖相与不同的可提取含有PBP的组合物的相诱导聚合物或盐接触；改变化学和/或物理条件，如在分离的寡糖相中加入解离试剂如酸、碱、尿素、乙醇、DMSO等，或当确定了结合反应是放热或吸热后，充分改变温度使结合亲和力降低；从PDP寡糖聚合物中获得所需的化合物。
当采用切割时，所需的蛋白质或化学物质很容易用对多糖结合域和所需蛋白或化学物质间的序列有特异性的蛋白水解酶来从多糖结合域上切下而使PBP结合在寡糖聚合物上。较佳地，蛋白水解酶是以在所需多肽切下后易从PBP上除去的形式提供的。例如，切割的蛋白水解酶可制成切割酶的复合物，其中蛋白水解酶与第二种多糖结合物结合，后者的底物特异性和/或结合特性与第一种与所需多肽结合的多糖结合物不同(Assouline等人(1993)“蛋白质工程”Protein Engineering 6：787-792；Assouline等人)。因此结合域从所需重组蛋白上断裂下来可在溶液中进行，然后切割酶复合物可通过与第一种多糖结合物不结合的多糖底物结合来除去。或者，切割酶复合物可固定在不与第一种多糖结合物结合的多糖骨架上。(参见Assouline等人(1993)同上；Assouline等人(＿)同上)所需的蛋白质或化学物质从寡糖聚合物上解离下来，且不含杂的PBP(仍与聚合物结合)。或者可用非特异性蛋白水解酶完全降解PBP复合物的PBP部分，从而通过例如用蛋白水解酶K在约50mg/ml的浓度下在约37℃处理约20分钟来使它从寡糖聚合物上释放下来(Dir等人(1991)“生物/技术”Bio/Technology，9：1096-1099)。
在一些情况下，融合蛋白本身是所需的，因此可将融合蛋白从寡糖聚合物上除下而不是将融合蛋白的组分分离下来。为去除融合蛋白和寡糖聚合物的结合，需要用低离子强度的缓冲液或水或碱性pH或离液盐的缓冲液。尽管解吸温度不是关键的，并通常在10℃至40℃内，但是通常室温是较佳的，即在约20℃。在水中重复清洗结合的融合蛋白或用连续水流稀释。通常，pH9.5的碳酸盐缓冲液或6M的盐酸胍可用于该解吸步骤。在一些情况下最好用稀的氢氧化钠(约0.1M)进行处理。对PBP的天然特性进行修饰来改变它的粘附性质，以使它可以或如所需的不能被水解吸。对骨架用解吸介质可使融合蛋白从寡糖聚合物上解离下来。为在从底物解离后分离PBP-共轭物可采用各种技术。例如可用上述的解吸液洗去多糖表面的PBP-共轭物。通过改变解吸液的离子强度(pH)使PBP-共轭物重新吸附在离子交换介质或第二种多糖骨架上来分离PBP-共轭物。
亲和相分离***有许多应用。它们包括浓缩混合物中的一个组分、纯化混合物中的组分，其中纯化倍数为2倍，通常大于20倍，并且纯度可达80％至90％。纯化倍数可根据杂质的除去、比活的增加和K等来测定。在一些应用中，这种方法也可用于细胞分离和/或特定细胞类型的富集。例如干细胞种群可通过使细胞单独接触与细胞表面糖类残基结合的PBP来富集，或接触融合入特异性结合配对体的一种中，例如受体配体如肽激素或其它激素而另一种特异性结合配对体即受体在细胞表面上。其它可用的配体包括抗体，如抗CD34和细胞因子如IL-2。在亲和相分配后，细胞可用例如胰蛋白酶来从分离的寡糖聚合物相中解离下来。亲和相分配***中的剪切力比其它细胞分离方法要小的多，从而对分离细胞的伤害也小的多。
技术的其它应用包括抽提生物转化，即分配反应产物的方法，特别是在酶法过程中产物是酶反应的反馈抑制剂时。在该***中，酶与PBP结合，从而可保持酶活。酶的底物可自然分配入寡糖聚合物相或与PBP结合，产物则不留在寡糖聚合物相中而是分配入第二组分中，例如当产物的疏水性比底物更强时。然后可取出***的第二组分并回收产物。可用抽提生物转化***的酶反应例子包括转糖基反应，如用于制备β-1，4-连接的寡糖增甜剂；混合转酯化反应，如用于将低碳脂肪酸转化成高碳脂肪酸以及产生甘油；和肽合成。本发明的含有PBP的组合物可用来在多糖支持物上固定感兴趣的化合物。因为PBP可强且特异性吸附其底物。
固定化***的应用有例如，制备固态的用于诊断测定的试剂，试剂包括酶、抗体片段、肽激素等；当纤维素是可溶的如羧甲基纤维素或固体支持物如微晶纤维素(Avicel)而药物是多肽如白介素2时，结合药物可降低清除速度；药物输递，例如与羧甲基纤维素结合并与结合在同一纤维素支持物上的佐剂合用，例如来提高待输递药物的免疫特异性；染料结合，例如将颜料或染料连接到多糖如纤维素表面上；印刷在如纸和布(棉花)上；提供水解或协和作用，例如寻靶酶如木质素酶以处理木条，寻靶卟啉如用于漂白木浆；在农业上的应用如将杀虫剂如Bt毒素或其它抗微生物剂结合到植物表面上；用于固氮，如将有机体结合到根表面上；持续肥料的释放；和持续杀真菌剂的释放。它们可在高盐浓度如海洋环境中使暴露在海水中的表面防污，然后转置到新鲜水中除去融合蛋白。
可用这种方法纯化的生物物质的例子包括白介素2、因子X、木质素酶和TPA或任何其它可融合入PBP的多肽或蛋白质。其它例子包括培养液(来自原核细胞或真核细胞或组织培养基)、生物液体、组织提取物、细胞裂解物(包括细菌、真菌、植物、动物、鱼、和家畜)的抽提物，特别是纯化的蛋白质等。通常，混合物在用于亲和分配***前先进行澄清以除去细胞碎片。
下面提供例子来进行描述而无限制意义。
例子
缩写
pNPC＝对-硝基苯酚-β-D-纤维素二糖苷；
HPA＝皮粉axure；
gCenA和gCex＝粪肥纤维单孢菌的CenA和Cex的糖基化形式；
ngCenA和ngCex＝重组大肠杆菌的CenA和Cex的非糖基化形式；
RPC＝反相层析；
SDS-PAGE＝十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；
α-Pro/Thr＝抗合成Cex Pro/Thr盒的兔型抗血清；
PMSF＝苯基甲基磺酰氟化物。
生物培养物保藏
下列保藏物由美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 Park Lawn Drive，Rockville，Maryland 20852保藏。在大肠杆菌C600中质粒pcEC-2上的克隆基因CenA的衍生物在1986年4月23日保藏，ATCC登记号为67101。在质粒pEC-1上的克隆基因Cex的衍生物于1986年5月27日保藏，ATCC登记号为67120。大肠杆菌JM83，pUC12-1.1cex于1986年4月23日保藏，ATCC登记号为67102。pTugA(登记号为L24193)、pTugAS(登记号为L24367)、粪肥纤维单孢菌CenA(登记号为M15823)和粪肥纤维单孢菌CenC(X57858)的全长核苷酸序列保藏于GenBank中。
材料
Klucel或HPC由Aqualon提供。HPC从一种纤维素分子衍生获得，也称作纤维素2-羟丙基醚。
Natrosol或HEC由Aqualon提供。HEC是含有羟乙基侧链的修饰过的纤维素聚合物，也称作纤维素2-羟乙基醚。HEC是白色非离子型粉末。HEC也以下列商品名出售：Alcoramnosan/Liporamnosan(Vevy)、Tylose H系列(HoechstCelanese/Colorants & Surf)。
Bermocoll E或EHEC由Berol Nobel AB提供。EHEC是乙基纤维素乙二醇醚。EHEC也由Aqualon以Aqualon EHEC的商品名出售。
羟丙基甲基纤维素(HPMC)由Sigma提供。HPMC是甲基纤维素的丙二醇醚，也称作甲基羟丙基纤维素。HPWC也以下列商品名出售：Benecel/Culminal HPMC(Aqualon)；Viscontran MHPC(Henkel)。
葡聚糖由Pharmacia Biotech提供。
Pluronics由BASF提供。Pluronic是乙烯氧化物和丙烯氧化物的嵌段共聚物。Pluronics的固体形态(F系列)和浆状形态(P系列)均可采用。
实施例1
CBDN1的分离
用大肠杆菌JM101(SupE，thi-1，Δ(tac-ProAB)，[F′traD36，ProAB，tacIqZΔM15](Yanish-Perron等人“基因”Gene(1985)33：103-119)作为宿主菌株来保养质粒并生产重组蛋白质。培养物在30℃下在液体胰化蛋白冻-酵母提取物-磷酸盐培养基(TYP)或Luria肉汤(LB琼脂，补充入卡那霉素(100mg/ml))。
将含有pTugKN1(见图5)的大肠杆菌菌株JM101的过夜培养物用补加100mg卡那霉素的TYP稀释500倍，并在30℃下生长至最优密度2.0-3.0。加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至最终浓度为0.1mM诱导PBDN1的生成，并使细菌在30℃下再培育18小时。培养基上清液用13000Xg离心10分钟来澄清，并弃去细胞。如下步骤用纤维素亲和层析来纯化PBDN1。将澄清的培养物上清液在4℃与微晶纤维素(AVciel)(50mg/L)培育，并不时搅拌以使PBDN1结合。将纤维素悬浮液通过玻璃过滤器(Whatman GF/A)在布氏漏斗上过滤，并用含1MNaCl的pH7.0的50mM磷酸钾粗洗。用水解吸结合的PBDN1并用超滤浓缩。然后将部分纯化的PBDN1上样于预先用20mM，pH6.0的磷酸钾缓冲液平衡的阴离子交换柱(MonoQ)上，操作流速为1ml/min。蛋白质牢固地结合在柱上，并用盐梯度(0-1N NaCI，pH6.0)除去(见图7)。PBDN1在300mM盐中回收(峰1，图7)。杂蛋白的结合更牢，可用更高盐浓度除去(峰2，图7)。
实施例2
用亲和电泳分析与CBDN1和CBDN1N2结合的HEC、大麦β-葡聚糖和木聚糖
用亲和电泳(Mimura等人(1992)“层析杂志”J.Chromatography597：345-350)鉴定和评价CBDN1和CBDN1N2与可溶性多糖如HEC和大麦β-葡聚糖以DP3 15的结合。原来连续碟式电泳用不连续方法代替。在BioRad电泳***的同一盘中，制备两个相邻的非变性凝胶，一个含有多糖(0.1％ w/v)，另一个不含有配体。这就保证了在有或没有多糖时的分析基本上是在相同条件下进行的，而且观察的结果(在有结合葡聚糖时的阻滞)不是异常电泳迁移的结果。在每种凝胶中用BSA作为负对照。凝胶上蛋白质的上样量均为5mg。电泳在4℃、非变性条件pH8.2-8.8下进行2至3小时，CBDN1和CBDN1N2与HEC和大麦β葡聚糖强烈反应，因此与在不含β-葡聚糖(-)的凝胶中的迁移相比，它们在含有这些寡糖(+)的凝胶中的迁移受到严重阻滞(见图9A和9B)。CBDN1和CBDN1N2对木聚糖没有亲和力，而且与不含葡聚糖的迁移相比，在含有葡聚糖的凝胶中没有发现阻滞(见图9C)。N1和N1N2分别指CBDN1和CBDN1N2。
实施例3
CBDN1和CBDN1-融合蛋白的寡糖结合常数的等温滴度微量热测定法
用微量热法可测定CBDN1与各种水溶性寡糖的结合热力学，从而可确定适于亲和分配***的配体。这些数据列在下表7内。图15表示用CalorimetrySciences Corp.的4200ITC型来测定CPDN1与羟乙基纤维素(HEC)在35℃、50mM PBS、pH7下的结合的可逆结合等温数据。CPDN1与HEC强结合，平衡结合常数在弱的抗体-抗原反应的范围内。在这些条件下，大麦β-葡聚糖与CPDN1的结合更强(Ka＝85500M-1)。CPDN1对于这两种寡糖的结合和现在用于亲和分配***的几乎所有的以PEG为基础的亲和配体(如Cibacron Blue-PEG，Procion red-PEG，二硝基苯基PEG，二乙酸-PEG)一样牢固或更佳牢固。这种相当高的结合亲和性，以及单寡糖链可结合多个CPDN1融合蛋白的性质表明该亲和分配***的容量和选择性均很高。下表8提供了N1结合热力学归纳。CPDN1和HEC及大麦β-葡聚糖的结合反应是剧烈放热的，这表示结合在较低温度下将增加，因此在分配步骤中可降低温度，而在洗脱步骤中可升高温度。
实施例4
HEC和Pluronic P105混合物的相平衡分析
根据Haynes等人(“液相平衡”Fluid Phase Equilibria，(1989)53：463)的方法获得HEC和Pluronic P105(聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物)的混合物在50mMPBS、35℃、pH7下相平衡数据。如图16所示，在任何总聚合物浓度高于3％(重量/重量)的Pluronic P105和2％ HEC中可形成稳定的两相分配***，这使得有很大范围的两相组合和平衡连接线长度可用于亲和分配。
          表    7
   来自粪肥纤维单孢菌的内切葡聚糖酶
        的CBDN1的结合特异性配体           与CBDN1的结合α  检测方法可溶性配体葡萄糖             -                NMR纤维二糖           -                NMR
纤维三糖          +/-    NMR/量热法
纤维四糖          ++     NMR/量热法
纤维五糖          +++    NMR/量热法
纤维六糖          +++    NMR/量热法甲基纤维素(MC)      ++     亲和电泳羧甲基纤维素(CMC)     +      亲和电泳/竞争性测定乙基羟乙基纤维素    ++     亲和电泳
(EHEC)羟乙基纤维素(HEC)   +++    亲和电泳/竞争性测定羟丙基甲基纤维素    +++    亲和电泳
(HPMC)
大麦β-葡聚糖     +++    量热法/亲和电泳/竞争性
                               测定
燕麦β-葡聚糖     +++    量热法/亲和电泳
脱乙酰壳多糖      +/-    亲和电泳
葡甘露聚糖        +      亲和电泳
甘露聚糖          -      亲和电泳
木聚糖            -      亲和电泳/竞争性测定
***半乳糖      -      亲和电泳
淀粉(支链淀粉)    -      亲和电泳
葡聚糖T70         -      亲和电泳
海带多糖          -      亲和电泳
不溶性配体磷酸溶胀纤维素(PASC)  +++    结合等温线
微晶纤维素        +      结合等温线细菌微晶纤维素(BMCC)  -      结合等温线
动物纤维素        +/-    结合等温线
壳多糖            +/-    结合等温线
直链淀粉          -      结合等温线
交联葡聚糖        +/-    结合等温线
芙苓聚糖          -      结合等温线
表    8在35℃ N1结合热力学归纳
    NMR                        等温滴定微量热法
  配体           Ka                               Ka            DH0         -TDS0(M-1)                           (M-1)       (Kcal/mol)    (Kcal/mol)
  纤维三糖    180±50纤维四糖    4200±700纤维五糖    34000±7500纤维六糖   51000±18000大麦β葡聚糖    n.m.HEC         n.m.     n，m.            --         --4100±500      -6.4±0.2    1.4±0.117900±3100    -6.8±0.2    0.86±0.125200±3900    -6.9±0.2    0.79±0.185500±4400    -7.3±0.1    0.48±0.167000±3900    -7.2±0.1    0.50±0.1
实施例5
用等温滴定微量热法测定CBDN1从寡糖聚合物上洗脱下的合适条件
ITC也可通过测定随温度、盐浓度和类型及助溶剂如乙二醇或尿素浓度(设计成破坏PBPN1糖类复合物有利的氢键结构)变化的平衡解离常数来决定合适的洗脱条件。
实施例6
含有cenC CBD基因片段和粪肥纤维单孢菌内切葡聚糖酶A(cenA)基因片段的融合体的表达载体的构建和融合蛋白的特征
载体的构建
用SmaI和HindIII完全酶切质粒pTZ-JC2(见图10A)。获得3.9kbp的片段。用HpaI和HindIII完全酶切质粒pUC18-1.6 cenA_PT(见图10B)获得1.1kbp的片段。连接3.9和1.1kbp的片段连接形成pTZ-JC13(见图10C)。载体用来转化大肠杆菌JM101。
融合蛋白的酶特征
与原来的CenA与它分离出的催化域p30相比，由pTZ-JC13编码的表达产物(融合蛋白)对微晶纤维素(Avicel)、细菌微晶纤维素(BMCC)和磷酸溶胀纤维素(PASC)有催化活性。在固定的测定条件下通过由固定底物量产生的可溶性还原糖的量来测得比活。还原糖的量用比色法及葡萄糖标准来测定。多肽的浓度用与考马斯亮蓝G-250的结合来测定(Gilkes等人(1988)“生物化学杂志”J.Biol.Chem.263：10401-10407)。
评价融合蛋白对蛋白水解降解的灵敏度
在用融合蛋白时的主要考虑因素是多肽在各种条件下的稳定性，包括对蛋白水解的抗性。用粪肥纤维单孢菌蛋白水解酶在没有接头序列时评价融合蛋白对蛋白水解的灵敏度。用粪肥纤维单孢菌蛋白水解酶裂解融合蛋白用SDS-PAGE来检测(见图12)。比较融合蛋白和CenA的稳定性。改变蛋白水解酶的浓度和蛋白水解条件使结果最优。
评价融合蛋白的结合特性；示差吸附分析
为确定PBD-融合蛋白对不同纤维素同系物的亲和性，对结合部分用SDS-PAGE分析即可评价它与各种纤维素骨架的结合情况。测定表明PDBN1与非晶型纤维素(PASC)结合而不与微晶纤维素(BMCC)结合。然而CBDCenA却对这两种纤维素物质均有亲和性。它们不同的结合特征就提供了在一种存在时除去另一种的方法的可能性。第一步加入BMCC除去CenA。在第一步后PBD融合蛋白保留在溶液中，然后通过吸附到PASC上来除去(见图12)。在评价纤维素不饱和、饱和和过饱和的影响的测定中，与纤维素浓度对应的各种蛋白质组分的浓度可以不同。
这种选择性除去或结合不同的组分在处理和纯化融合蛋白时很重要。这种方法可包括当融合蛋白结合在多糖上时用CBD-蛋白水解酶可从融合蛋白中蛋白水解除去PBD生成所需的化合物。然后利用蛋白水解酶与纤维素(如BMCC)的结合除去蛋白水解酶获得纯净的化合物。
实施例7
用寡糖聚合物相为基础的亲和相分配介导Vero细胞分离的双功能融合蛋白的制备和性质
细菌菌株、细胞系和生长条件
化学试剂是HPLC分析级的。在37℃、补加入100mg/ml的氨苄青霉素(Boehringer Mannheim GmbH，Mannheim，Germany)的LB培养基中使大肠杆菌生长来重组DNA。在37℃、补加入氨苄青霉素(100mg/ml)的TYP培养基(每升有16g胰化蛋白冻、16g酵母提取物、5gNaCl、2.5gK2HPO4)中生长的大肠杆菌R1360内进行高水平表达研究和大规模蛋白质的生产。细菌培养基组分是来自Difco Laboratories(Detroit，MI)。摇瓶培养的摇动速度设定为250rpm。用0.15mM的异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG，Sigma Chemical Co.，Louis，Mo)诱导培养。用于吸附研究的Vero(非洲绿猴，肾-ATCC CCL81)细胞维持在37℃、有补加入10％ NCS(Gibco BRL)的DMEM或DMEM/F12培养基(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)和5％ CO2的T型摇瓶中。
重组DNA技术
所有的重组DNA工作如前所述进行(Sambrook(1989)同上)。用碱性裂解法制备双链DNA。DNA限制性酶和修饰酶根据生产商的建议使用。用琼脂糖凝胶电泳来分离DNA片段。用GeneCleanTM(Biol01，La Jolla，CA)来分离DNA片段。用液氮法来分离小的DNA片段(小于100bp)。冷冻的感受态大肠杆菌细胞可用于所有的转化反应。用ABI 380A DNA合成仪(Applied Biosystems，FosterCity，CA)来合成寡脱氧核苷酸并用C18柱层析来纯化。在74℃、测序缓冲液(40mM Tris-HCl或pH7.5，20mM MgCl2，50mM NaCl)中使寡脱氧核苷酸退火，然后缓慢冷却至4℃。用改进型T7 DNA聚合物酶通过双脱氧链终止法来对DNA测序(Sanger等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA(1977)74：5463-5467)。
多肽测定
用十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)来分离多肽。凝胶用考马斯亮蓝R250(BioRad，Richmond，CA)来染色；用装有ImageQuantTM软件的扫描密度计(计算密度机，Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)定量分析条带。每个凝胶中含有纯的CBPN1/RGD标准。纯的CBPN1/RGD纯制品浓度通过在280nm测定纯CBD/RGD消光系数来测定(Scopes，Anal.Biochem.(1974)59：277-282)。用兔抗CenA血清作为基本抗体和与辣跟过氧化物(Gibco BRL)共轭的羊抗兔血清作为次级抗体来进行Western印迹法。
寡糖结合测定
这在实施例2中有所描述。
大规模生产和纯化CBPN1/RGD
如Wierzba等人(Biotechnol.and Bioeng.(1995)47：147-145)描述的方法产生CBDN1，只是在R1360/pTZ18U-CBD/RGD构建物中，编码CBDN1的序列用编码粪肥纤维单孢菌内切葡聚糖酶A(CenA)的纤维素结合域(CBD)的序列代替。含有构建物的大肠杆菌在37℃、有补加入氨苄青霉素(100mg/ml)和IPTG(0.15mM)的TYP培养基的12L发酵罐(Chemap AG，Volketswil，Switzerland)中生长。在31000g下离心(Sharples-Stokes Division，Pennwalt Corp.，Warminster，PA)分离细胞。培养基和细胞组分中的CBDN1/RGD分别用HEC和plucronic pios的混合物通过如实施例4所述的亲和相分配法来纯化。培养基通过GF/C玻璃纤维过滤器(Whatman International，Maidstone，UK)来过滤除去细胞碎片。将培养基加入相分离***中。根据用于其它水性两相分配***的方法(如Joshi等人，“生物分离技术”Bioseparations，(1990)11：311)，重要的区别是通过CBDN1融合物与HEC的结合大大加强了分离。图17是该***的示意图，其中培养基上清液或细胞抽提物中的CBDN1-融合蛋白的亲和提取物在商业Graesser型浓缩器(用于许多大规模分配***)或混合沉降粉碎器(Haynes，博士论文，加利福尼亚大学，Berkeley(1991))中产生。将含有CBDN1-融合蛋白的糖类富集提取相泵入第二个混合沉降粉碎器中反萃取产物，而富含聚(氧醚)的相用不相容的盐反萃取，然后循环至亲和接触器中(Haynes等人，AIChE J.，(1991)37：1401)。将足够量的盐，通常是硫酸盐或柠檬酸盐加入含有结合靶蛋白的富含糖类的提取相中，从而形成相分离(见Walter等人，“水性两相***的分配”Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems，Academic Press(1985))。相分离所需的2M和更高的盐浓度通常使得配体-蛋白质复合物解离，因此，这是一种简单的产物回收的方法。CBDN1和HEC的强放热结合表明解离也可通过适当升高温度或加入破坏氢键的共溶剂来实现。用渗滤或其它脱盐方法来除去过多的盐。悬浮液在4℃下缓慢搅拌过夜。用1-dD截断膜(Amicon Division，W.R.Grace&Co.，Beverly，MA)通过超滤浓缩和与dH2O交换。对CBDN1/RGD溶液(5至12mg/ml)过滤除菌(0.2mm)并保藏在-20℃。
大肠杆菌细胞用50mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)清洗，重新悬浮在150mL相同的补加入3mM EDTA的缓冲液中，在50ml French细胞压力器(SLMInstruments，Urbana，IL)上破裂。在细胞抽提物中加入苯基甲基磺酰氟化物(1mM)和胃蛋白酶抑制剂A(1mM)以使蛋白水解程度最小。在4℃，17400g下离心30分钟来除去细胞碎片。在上清液中加入链霉素硫酸盐(Sigma)(1.5％w/v)。在4℃下过夜后，在4℃、17400g下离心30分钟后收集沉淀。将上清液加入亲和分配***中，并如上所述对培养基肉汤的CBDN1/RGD进行纯化。
细胞分离测定
从有胰蛋白酶和EDTA的培养基皿中取出细胞，用含有0.01％大豆胰蛋白酶抑制剂的DMEM培养基(Sigma)洗一次，再用没有抑制剂的DMEM培养基洗两次。CBDN1放在无血清培养基中至洗过的细胞总数为4×106。在37℃培育1小时后，将结合CBDN1/RGD的细胞加入亲和相分配***中。在分离HEC相，加入胰蛋白酶将细胞从HEC上解离下，并离心收集细胞。用台酚蓝排阻来测定细胞活力。
实施例8
用固定在微晶纤维素上的β-葡糖苷酶融合蛋白来从纤维糖上产生葡萄糖
该过程是使内切葡聚糖酶-外切葡聚糖酶与纤维糖共同培育，并将后续获得的纤维糖混合物分流入固定有β-葡糖苷酶的微晶纤维素柱中(见图13B)。方法如下。在一个发酵容器中，将适当比例的内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶加入含有待降解的纤维素物质的培养基中。使酶反应在一固定的时间内以产生可溶于培养基的纤维二糖。首先将整个消耗的培养基和酶通过固定并浓缩内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的微晶纤维素柱。将含有纤维二糖的洗脱液分流入第二根固定有β-葡糖苷酶PBDCex融合蛋白的微晶纤维素柱上，然后使纤维二糖水解成葡萄糖单元。通过洗脱再生第一根柱上的外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶。两根柱可重复使用数次以进行纯化和酶转化。
实施例9
CBDN1-碱性磷酸酶融合蛋白表达盒的制备
TNphoA是含有大肠杆菌碱性磷酸酶基因phoA而无其信号肽序列(′phoA)的Tn5转座子的衍生物。PhoA融合蛋白可通过在正确的阅读框架处转座***表达基因来形成。如果靶基因含有蛋白质排出信号，那么它们可直接分泌融合蛋白。仅当酶分泌入外周质时分泌物才可检测到有碱性磷酸酶活性。TnphoA可用于在由多个克隆位点的质粒上与粪肥纤维单孢菌CBDN1编码序列形成phoA基因融合。编码感兴趣的蛋白质的基因可克隆入多个克隆位点(mcs)并作为融合蛋白表达。基因产物产物可在HEC-Pluronic IOS CBDN1中用亲和相分配来纯化。
基因融合物的制备和分析
TnphoA的转座诱变可用来制得与CBDN1融合的基因。含有CBDN1的质粒是pTugKN1(见图5和6)。
转座通过含有转座子lTnphoA-1的缺陷型λ噬菌体的感染来介导(Gutierrez等人，“分子生物学”J.Mol.Biol.(1987)195：289-297)。大肠杆菌CC118的phoA基因中有缺失。CBDN1转座***框内CBDN1编码序列将生成寻靶胞外介质的CBDN1-PhoA融合蛋白。在显色底物5-溴-4-氯-3吲哚基磷酸盐(XP)上在选出的有卡那霉素(转座子衍生获得)和氨苄青霉素抗性的菌落中筛选出有碱性磷酸酶活性的。重新转化来自PhoA+菌落的质粒DNA并如上进行选择和筛选。在用刚果红染色的羧甲基纤维素(CMC)平板上筛选有内切葡聚糖酶活性的PhoA+菌落(Greenwood等人FEBS Letters(1984)2：259-263)。希望得到的表型是PhoA+，EngA-和对氨苄青霉素和卡那霉素有抗性。
用限制性酶切从PhoA+，EngA-菌落中分离得到质粒DNA，并用琼脂糖凝胶电泳对TnphoA***CBDN1正确取向的菌落进行分析。在观察融合的蛋白质产物时，很明显这些克隆中的一些有框外***。测定CBDN1-PhoA融合蛋白与可溶性寡糖如HEC的结合情况。通过用链终止法对DNA测序可测得TnphoA***的确切位置。
融合蛋白的纯化
将含有融合蛋白的澄清大肠杆菌细胞抽提物施用于HEC-pluronic 105亲和分配***，***的缓冲液可促进融合蛋白与HEC聚合物的结合。在分离HEC相和pluronic105相后，升高温度解吸融合蛋白并收集融合蛋白。测定收集组分的碱性磷酸酶活性，酶峰进一步用离子交换或凝胶过滤层析纯化。纯化条件可以不同以回收碱性磷酸酶活性。
根据双倒数形式表示的吸附数据计算参数(±累计标准误差)。如实施例3，C所述的，用[No]＝101mmol晶格残基/g纤维素计算Ka和α值。USSN 5,340,731的图15和16表示了PBPCex以及壳多糖对纤维素(包括微晶纤维素、BMCC和再生纤维素(RC))的吸附和相对亲和力。USSN 5,340,731的图17表示加入的去垢剂对CEBCex与本发明的组合物(包含杂交蛋白质，其中至少多糖的PBP与感兴趣的配体如蛋白质或化学物质如颜料或染料连接)的结合的影响。酶法去除两种不同的可去除标记重组合物与纤维素的结合的例子列在图14中。
实施例10
单热分离聚合物***
有一类亲和浓缩和分离***采用单种对CBDN1或其它可溶性多糖结合域有亲和性的热分离多糖。这种多糖族的成员包括甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素、丙基羟乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。这些***可用来结合分离含有可溶性寡糖结合域的融合/杂交蛋白质(在培养时分泌至培养基上清液中)，或在细胞裂解、渗透压休克等后结合和分离含有可溶性寡糖结合域的胞内融合/杂交蛋白质。在两种***中，方法如下：在低于当前温度的温度下将热分离多糖加入含有暴露融合蛋白的培养基上清液或水解液中。混合热分离多糖和培养基上清液或裂解物，缓慢升高温度直至高于多糖的当前温度。当剩余溶液中富含聚合物相形成时，可回收富含聚合物的相，融合蛋白可从多糖上洗脱下来。然后剩余的含有剩余溶解物的溶液可以弃去。
方法分为四步：将热分离多糖加入含有多糖结合蛋白或任何含有多糖结合蛋白的融合蛋白的水性溶液中，使聚合物和所述蛋白质接触并结合；在混合条件下缓缓将温度升高至超过CPT的温度；在高于CPT的温度下消除混合，使得可以分离富含水和富含聚合物的两相(这可通过重力沉降来实现或通过离心来加强；回收富含聚合物的相(它含有靶蛋白)并洗脱靶寡糖结合蛋白或含有寡糖结合蛋白的融合蛋白。
实施例11
含有一种或多种热分离聚合物的亲和水性两相***
这里汇编了含有一种或多种对CBDN1有亲和性的热分离聚合物的水性两相***(见下表)。这些***可进行高度亲和分离成含有聚合物的相，然后与区域结合的聚合物可用简单的方法来回收循环使用。
将以四种不同纤维素为基础的可与CBDN1和其它寡糖结合蛋白结合的聚合物与其它两种非纤维素类聚合物合用，形成许多新的水性两相***。制成的水性两相***的性质将在下面进行讨论。
Pluronic-Klucel***
八种不同级别的Pluronics与三种级别的Klucel合用。所用的Pluronics包括F68、F77、F108、P84、P103、P104、P105和P123。所用的Klucel的级别是Klucel H、1和M。Pluronic F68-Klucel H  两相***由含有各种聚合物至少10％(总重量百分数)
                   的溶液形成。Pluronic F68-Klucel L  两相***由含有各种聚合物至少13％(总重量百分数)
                   的溶液形成。Pluronic F68-Klucel M  在聚合物浓度大于12％(w/w)时发现相分离。Pluronic F77-Klucel H  溶液在每种聚合物为9％时发现相分离。上相是澄清
                   的而下相是混浊的。Pluronic F77-Klucel L  溶液的每种聚合物的浓度为10％(w/w)时发现相分
                   离。Pluronic F77-Klucel M  两相***由含有各种聚合物至少10％(总重量百分数)
                   的溶液形成。Pluronic F108-Klucel H 两相***由含有各种聚合物至少10％(总重量百分数)
                   的溶液形成。Pluronic F108-Klucel L 两相***由含有各种聚合物至少10％(总重量百分数)
                   的溶液形成。Pluronic F108-Klucel M 两相***由含有各种聚合物至少9％(总重量百分数)
                   的溶液形成。Pluronic F103-Klucel H 在浓度约为6.5％Pluronic和7.1％Klucel时发现分离。Pluronic F104-Klucel H 在浓度约为4.1％Pluronic和3.8％Klucel时发现分离。Pluronic F105-Klucel H 溶液在4.5％Pluronic和2.8％Klucel的浓度下发现相分
                   离。低浓度的两相***并不粘稠。Pluronic F105-Klucel L 当浓度为5.0％Pluronic和3.5％Klucel时产生分离。在
                   该范围内的两相溶液不粘稠。下相在高于40℃的温度
                   下热分离。Pluronic F105-Klucel M 在低达3.9％Pluronic和2.5％Klucel的浓度下发现有相
                   分离。下相在高于38℃的温度下变得粘稠混浊。Pluronic F123-Klucel H 在浓度为5.6％Pluronic和4.0％Klucel时形成两相系
                   统。
葡聚糖-Natrosol***
三个级别的葡聚糖与三个级别的Ntrosol形成一系列新的水性两相***。葡聚糖的级别包括T40、T70和T500，而Natrosol的级别包括250HR、250LR和250MR。葡聚糖T40-Natrosol250LR    溶液每种聚合物浓度为10％时形成水性
                       两相***。葡聚糖T70-Natrosol250LR    溶液含5.2％葡聚糖和5.0％Natrosol形成
                       水性两相***。葡聚糖T500-Natrosol250LR   溶液每种聚合物为5.3％时形成水性两相
                       ***。
Pluronic-葡聚糖***
四个级别的葡聚糖与四个级别的Pluronic合用形成一系列新的本发明有用的水性两相***。葡聚糖的级别包括T40、T50和T2000。所用的Pluronic包括F68、F77、F108和P105。大多数聚合物的组合在低聚合物浓度和低粘度下发现有非常好的相分离性质。Pluronic F68-葡聚糖T40     每种聚合物浓度为9.0％时发现相分
                      离。在这些浓度下两相***的澄清的且
                      不粘稠。Pluronic F68-葡聚糖T70    Pluronic和葡聚糖的浓度分别为7.％和
                      5.9％时发现相分离。Pluronic F68-葡聚糖T500   每种聚合物浓度为6.3％时形成水性两
                      相***。Pluronic F68-葡聚糖T2000  每种聚合物浓度为9.0％时形成水性两
                      相***。Pluronic F77-葡聚糖T40    Pluronic和葡聚糖浓度为10.0％和9.2％
                      时形成水性两相***。Pluronic F77-葡聚糖T70    溶液中各种聚合物浓度为约8.2％时产
                      生相分离。Pluronic F77-葡聚糖T500   各种聚合物浓度为约7.0％时产生相分
                      离。Pluronic F77-葡聚糖T2000  各种聚合物浓度为约10.7％时发现相分
                      离。Pluronic F108-葡聚糖T40   各聚合物浓度为约7.0％时形成水性两
                      相***。Pluronic F108-葡聚糖T70   各聚合物浓度为约7.0％时形成水性两
                      相***。Pluronic F108-葡聚糖T500  Pluronic和葡聚糖浓度分别为3.9％和
                      3.4％时产生相分离。Pluronic F108-葡聚糖T2000 Pluronic和葡聚糖浓度分别为3.4％和
                      3.9％时产生相分离。Pluronic P105-葡聚糖T40   各聚合物浓度为约8.0％时形成水性两
                      相***。Pluronic P105-葡聚糖T70   Pluronic和葡聚糖浓度为6.3％时形成水
                      性两相***。Pluronic P105-葡聚糖T500  各聚合物浓度各自稍低于6.0％时产生
                      分离。Pluronic P105-葡聚糖T2000 各聚合物浓度为6.0％时产生相分离。
Klucel-葡聚糖***
三个级别的Klucel与四个级别的葡聚糖合用形成一系列新的水性两相***。所用的Klucel的级别包括Klucel H、L和M。所用的葡聚糖的级别包括葡聚糖T40、T70、T700和T2000。Klucel H-葡聚糖T40    Klucel和葡聚糖的浓度分别为6.8％和
                  8.3％时形成水性两相***。Klucel H-葡聚糖T70    各聚合物的浓度为6.8％时形成水性两
                  相***。Klucel H-葡聚糖T500   在稍高于3.0％的浓度下产生相分离。Klucel H-葡聚糖T2000  浓度为3.2％时发现有相分离。Klucel L-葡聚糖T40    溶液浓度大于4.0％时发现相分离。Klucel L-葡聚糖T70    每种聚合物浓度均为3.6％时形成水性
                  两相***。Klucel L-葡聚糖T500   浓度为3.9％时发现分离。Klucel L-葡聚糖T2000  Klucel和葡聚糖浓度分别为3.5％和
                  3.1％时发现相分离。Klucel M-葡聚糖T40    在浓度稍高于3.1％时形成水性两相系
                  统。Klucel M-葡聚糖T70    浓度为约3.5％时发现相分离。Klucel M-葡聚糖T500   聚合物浓度为3.5％时发现有相分离。Klucel M-葡聚糖T2000  浓度低于4.0％时形成水性两相***。
HPMC-葡聚糖***
用Sigma的HPMC和五个不同级别的葡聚糖形成一系列新的水性两相***。所用的葡聚糖的级别包括葡聚糖T40、T70、T500、T2000和葡聚糖硫酸钠。HPMC-葡聚糖T40    各聚合物浓度低于3.0％时发现相分
              离。HPMC-葡聚糖T70    HPMC和葡聚糖浓度分别为3.8％和
              4.6％时发现分离。HPMC-葡聚糖T500   溶液浓度低于3.4％时发现相分离。HPMC-葡聚糖T2000  浓度接近4.0％时产生分离。HPMC-葡聚糖硫酸钠 HPMC和葡聚糖硫酸钠浓度分别为
              2.9％和4.1％时产生分离。
HPMC-Pluronic***
用Sigma的HPMC和五个级别的Pluronic形成一系列新的水性两相***。Pluronic是P系列，包括Pluronic P84、P103、P104、P105和P123。HPMC-Pluronic P84     HPMC和Pluronic浓度为6.3％和7.8％时发现相
                  分离。在该浓度下，上相是澄清的且很少，这表
                  明该溶液与相界接近。HPMC-Pluronic P103    在浓度低于4.0％时形成水性两相***。HPMC-Pluronic P104    溶液浓度为约3.6％时产生分离。HPMC-Pluronic P105    聚合物浓度为约5.5％时发现相分离。HPMC-Pluronic P123    HPMC和Pluronic浓度分别为5.5％和6.4％时产
                  生相分离。
实施例12
亲和电泳测定纤维素为基础的聚合物和CBD间的反应
在四种纤维素为基础的聚合物上进行亲和电泳分析以测定分子和粪肥纤维单孢菌CenC的纤维素结合域(CBDN1)的N末端间的任何反应。在四种纤维素为基础的聚合物上分别测试CBDN1和CBDN1N2。用不与纤维素分子结合的牛血清白蛋白(BSA)作对照。结果归纳在下面。
Klucel(HPC)
在pH7时发现Klucel H和Klucel L与CBDN1和CBDN1N2间有强结合反应从而导致凝胶上的迁移损失。(见图9)。
Natrosl(HEC)
发现CBDN1和CBDN1N2与Natrosol间有强结合(见图9)。
Bermocoll E(EHEC)
研究两个级别的Bermocoll E与CBDN1和CBDN1N2间的结合反应。如电泳测定两种聚合物均与CBDN1和CBDN1N2强结合。
羟丙基甲基纤维素(HPMC)
电泳测定测得HPMC与CBDN1或CBDN1N2间有强结合。
当前的亲和分配***由于每个聚合物链上只有一个或两个配体而配体密度很低，从而在容量和分辨能力上有局限性。由于聚合物浓度通常低于15％(重量)，因此配体与聚合物化学计量比为1∶1或2∶1的亲和分配***通常产生的靶蛋白分离系数(相对于杂质的分离系数)在5至50之间。这些分离系数可满足足够的产物浓度，但是总是不能在低成本的一步或两步提取过程中提供所需的产物浓度。经典的亲和分配***也受到生产聚合物配体共轭物的化学花费的局限。如果相形成聚合物的单体单元用作亲和配体时，可除去这些成本和容量的局限性。CBDN1和各种水溶性纤维素底物间的灵敏的选择性的结合提供了用于连续纯化或重组蛋白质的新的、低成本的、高度灵活的亲和分配***。CBDN1和靶蛋白或肽的基因连锁形成了一种融合体，它可在厘摩尔量的电解质存在时与水溶性糖类牢固结合并保持融合部分的生物活性。
本说明书中提及的所有公开和专利申请表明了本发明所属领域技术人员的水准。尽管每个个人公开或专利申请是根据文献特别单独指出的，但是所有的公开和专利申请在这里以相同程度参照引证。
本发明已完全描述，它对该领域普通技术人员是显而易见的，他们可在不脱离附加权利要求的范围内作许多改进和变动。
权利要求书
按照条约第19条的修改
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述蛋白水解酶识别序列与所述多糖结合肽异源。
13.一种两相分配***包括：
相形成寡糖聚合物作为第一组分，它与多糖结合肽以Ka为103M至107M的值结合，相分离诱导剂作为第二组分，其中所述第一和第二组分均以足够的量存在以诱导相分离。
14.根据权利要求13所述的两相分配***，其中所述多糖结合肽从粪肥纤维单孢菌内切葡聚糖酶C衍生获得。
15.根据权利要求14所述的两相分配***，其中所述多糖结合肽是CBDN1。
16.根据权利要求13所述的两相分配***，其中所述第一组分选自羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羧甲基纤维素和甲基纤维素。
17.根据权利要求13所述的两相分配***，其中所述第二组分选自聚乙二醇聚合物、葡聚糖和环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物。
18.一个与可溶性寡糖结合但不与微晶纤维素结合的纤维素结合域。
19.根据权利要求18所述的纤维素结合域，其中所述结合域是CBDN1。
20.一种分离包含来自混合物的多糖结合肽的化合物的方法，所述方法包括：
对所述有可溶于水性溶液的与所述化合物结合的热分离β-1，4-连接的纤维糖的混合物加热至发生相分离的温度，并获得所述化合物分配入的纤维糖聚合物相；
收集所述包含从所述混合物其它组分分离获得的化合物的纤维糖聚合物相。
21.根据权利要求13所述的两相分配***，包括一种组合物作为第三组分，它包含与所述寡糖聚合物结合的多糖结合肽。
22.一种裂解酶复合物，包含与不溶性多糖结合的多糖结合肽。

Claims (20)

1.一种纯化包含来自混合物的其它组分的多糖结合肽的化合物的方法，所述方法包括：
诱导包含所述混合物和与所述化合物结合的相形成寡糖聚合物的溶液的相分离，使所述化合物分配入含有所述寡糖聚合物的相中；
收集所述的寡糖聚合物相；和
将所述化合物从所述寡糖聚合物上解离下来，从而获得包含与所述混合物相比纯化的所述化合物的溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中相分离是用一种相分离诱导剂来诱导的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡糖聚合物是热分离聚合物，且相分离是通过将所述溶液加热至发生相分离的温度来诱导。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述寡糖聚合物是β-1，4-葡聚糖。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述β-1，4-葡聚糖是纤维素。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述纤维素选自羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素和羟丙基纤维素。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述多糖结合肽从多糖酶或多糖结合蛋白的多糖结合域衍生获得。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述多糖酶是纤维素酶。
9.一种纯化来自混合物的其它组分的多肽的方法，所述方法包括：
使所述混合物与相分离***在一定条件下接触，***有可溶于水性溶液的与所述多肽结合的相形成寡糖聚合物作为第一组分，以及相分离诱导剂作为第二组分，从而使所述多肽分配入包含所述寡糖聚合物的相中，其中所述多肽包含多糖结合肽；
收集所述寡糖聚合物相；和
将所述多肽从所述寡糖聚合物上解离下来，从而获得包含与所述混合物相比纯化的所述多肽的溶液。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述多肽是包含所述多糖结合肽和大分子的融合多肽。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述融合多肽在所述多糖结合肽和所述大分子间包含一种蛋白水解酶识别序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述蛋白水解酶识别序列与所述多糖结合肽异源。
13.一种两相分配***包括：
相形成寡糖聚合物作为第一组分，它与多糖结合肽以Ka为103M至107M的值结合，相分离诱导剂作为第二组分，其中所述第一和第二组分均以足够的量存在以诱导相分离。
14.根据权利要求13所述的两相分配***，其中所述多糖结合肽从粪肥纤维单孢菌内切葡聚糖酶C衍生获得。
15.根据权利要求14所述的两相分配***，其中所述多糖结合肽是CBDN1。
16.根据权利要求13所述的两相分配***，其中所述第一组分选自羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、乙基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素和甲基纤维素。
17.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二组分选自聚乙二醇聚合物、葡聚糖和环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物。
18.一个与可溶性寡糖结合但不与微晶纤维素结合的纤维素结合域。
19.根据权利要求18所述的纤维素结合域，其中所述结合域是CBDN1。
20.一种分离包含来自混合物的多糖结合肽的化合物的方法，所述方法包括：
对所述有可溶于水性溶液的与所述化合物结合的热分离β-1，4-连接的纤维糖的混合物加热至发生相分离的温度，并获得所述化合物分配入的纤维糖聚合物相；
收集所述包含从所述混合物的其它组分分离获得的化合物的纤维糖聚合物相。
CN96196571A 1995-07-24 1996-07-24 以可溶性寡糖结合域为基础的分离和浓缩*** Pending CN1193995A (zh)

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US08/505,860 1995-07-24

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