JPWO2020045472A1 - トリコデルマ・リーセイの変異株およびそれを用いたタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)配列番号4〜6のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、Trichoderma reeseiの変異株。
(2)前記変異が、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのHSF−type DNA−bindingドメインが欠損する変異である、(1)に記載の変異株。
(3)前記変異が、HSF−type DNA−bindingドメインよりもN末端側の領域での変異に伴うフレームシフト変異である、(2)に記載の変異株。
(4)前記変異が、配列番号4で表されるアミノ酸配列のN末端側から30番目のヒスチジン残基がヒスチジン以外のアミノ酸残基に変異することによるフレームシフト変異である、(3)に記載の変異株。
(5)前記変異が、配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのTLDドメインが欠損する変異である、(1)に記載の変異株。
(6)前記変異が、TLDドメインよりもN末端側の領域での変異に伴うフレームシフト変異である、(5)に記載の変異株。
(7)前記変異が、配列番号5で表されるアミノ酸配列のN末端側から3番目のグルタミン残基がグルタミン以外のアミノ酸残基に変異することによるフレームシフト変異である、(6)に記載の変異株。
(8)前記変異が、配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのF−boxドメイン領域のアミノ酸配列の変異である、(1)に記載の変異株。
(9)前記変異が、F−boxドメイン領域のアミノ酸配列の変異に伴うフレームシフト変異によって生じる配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの欠損である、(8)に記載の変異株。
(10)前記変異が、配列番号6で表されるアミノ酸配列においてN末端側から167番目のアラニン残基がアラニン以外のアミノ酸残基に変異することによるフレームシフト変異である、(9)に記載の変異株。
(11)(1)から(10)のいずれかに記載の変異株を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
(12)(1)から(10)のいずれかに記載の変異株を少なくともラクトースを含む培地で培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
(13)(1)から(10)のいずれかに記載の変異株を培養する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
(14)(1)から(10)のいずれかに記載の変異株を少なくともラクトースを含む培地で培養する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
(15)(13)または(14)に記載のセルラーゼの製造方法によりセルラーゼを製造する工程および前記工程で得られたセルラーゼを用いてセルロース含有バイオマスを糖化する工程を含む、糖の製造方法。
使用するタンパク質濃度測定試薬:Quick Start Bradfordプロテインアッセイ(Bio−Rad製)
測定条件
測定温度:室温
タンパク質濃度測定試薬:250μL
糸状菌の培養液:5μL
反応時間:5分
吸光度:595nm
標準品:BSA。
(β−グルコシダーゼ比活性の測定条件)
基質:p−ニトロフェニル−β−グルコピラノシド(シグマアルドリッチジャパン社製)
反応液:1mMのp−ニトロフェニル−β−グルコピラノシドを含有する50mM酢酸バッファー90μL
酵素希釈液:10μL
反応温度:30℃
反応時間:10分間
反応停止剤:2M炭酸ナトリウム10μL
吸収度:405nm。
基質:p−ニトロフェニル−β−キシロピラノシド(シグマアルドリッチジャパン社製)
反応液:1mMのp−ニトロフェニル−β−キシロピラノシドを含有する50mM酢酸バッファー90μL
酵素希釈液:10μL
反応温度:30℃
反応時間:10分間
反応停止剤:2M炭酸ナトリウム10μL
吸収度:405nm。
基質:p−ニトロフェニル−β−ラクトピラノシド(シグマアルドリッチジャパン社製)
反応液:1mMのp−ニトロフェニル−β−ラクトピラノシドを含有する50mM酢酸バッファー90μL
酵素希釈液:10μL
反応温度:30℃
反応時間:10分間
反応停止剤:2M炭酸ナトリウム10μL
吸収度:405nm。
セルロース含有バイオマスとして、Arbocel(登録商標) B800(レッテンマイヤー社製)または平均粒径100μmに粉末化したバガスを用いた。酵素液としてはTrichoderma reeseiの変異導入前の親株または変異株の培養液を1ml採取して遠心分離し、菌体を除去した上清を回収し、さらに0.22μmのフィルターでろ過したろ液を用いた。
糖化反応の緩衝液として1M 酢酸ナトリウムバッファー100μL、雑菌の繁殖防止として50g/L エリスロマイシン溶液2μL、糖化対象物として、Arbocel(登録商標) B800(レッテンマイヤー株式会社製)または平均粒径100μmに粉末化したバガスをそれぞれ0.1g用いた。また、酵素液は、Arbocel(登録商標) B800を用いたフラスコ培養に得られた酵素液は150μL、ラクトースを用いたフラスコ培養により得られた酵素液は300μL、5Lジャーファーメンター培養により得られた酵素液は、タンパク質濃度で0.8mgになるようそれぞれ添加し、計1mLになるよう滅菌水でメスアップしたものを2mLチューブに入れた。50℃の温度条件で24時間糖化反応を行い、糖化物を遠心分離した上清を糖化液として回収し、回収した糖化液の10分の1量の1N NaOH溶液を添加して、酵素反応を停止させた。反応停止後の糖化液中のグルコース濃度を下記に示すUPLCで測定した。
グルコースは、ACQUITY UPLC システム(Waters)を用いて、以下の条件で定量分析した。グルコースの標品で作製した検量線をもとに、定量分析した。
カラム:AQUITY UPLC BEH Amide 1.7μm 2.1×100mm Column
分離法:HILIC
移動相:移動相A:80%アセトニトリル、0.2%TEA水溶液、移動相B:30%アセトニトリル、0.2%TEA水溶液とし、下記グラジエントに従った。グラジエントは下記の時間に対応する混合比に到達する直線的なグラジエントとした。
開始条件:(A99.90%、B0.10%)、開始2分後:(A96.70%、B3.30%)、開始3.5分後:(A95.00%、B5.00%)、開始3.55分後:(A99.90%、B0.10%)、開始6分後:(A99.90%、B0.10%)。
検出方法:ELSD(蒸発光散乱検出器)
流速:0.3mL/min
温度:55℃。
(変異株の作製方法)
配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したTrichoderma reeseiの変異株は、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする配列番号1で表される遺伝子を選択マーカーとしてアセトアミド、選択マーカー遺伝子としてアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ(AmdS)遺伝子(amdS)と置き換えることで破壊する。配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損させるため、配列番号13で表される遺伝子配列からなるDNA断片を作製し、当該DNA断片をTrichoderma reesei ATCC66589株に形質転換して、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したTrichoderma reeseiの変異株を作製する。この方法により、配列番号1で表される塩基配列が欠損したTrichoderma reeseiの変異株が得られる。amdSを含むDNA配列の上流および下流に、上記の配列番号1で表される塩基配列からなるDNA断片を導入するために、Trichoderma reesei QM9414株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製する。
前述の方法に従って取得したTrichoderma reeseiの変異株をTrichoderma reesei 変異株Iとして、以下のタンパク質製造試験並びにタンパク質濃度およびセルラーゼ比活性測定の実験に用いた。
(変異株の作製方法)
配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したTrichoderma reeseiの変異株は、配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする配列番号2で表される遺伝子を選択マーカーとしてアセトアミド、選択マーカー遺伝子としてアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ(AmdS)遺伝子(amdS)と置き換えることで破壊する。配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損させるため、配列番号18で表される遺伝子配列からなるDNA断片を作製し、当該DNA断片をTrichoderma reesei ATCC66589株に形質転換して、配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したTrichoderma reeseiの変異株を作製する。この方法により、配列番号2で表される塩基配列が欠損したTrichoderma reeseiの変異株が得られる。amdSを含むDNA配列の上流および下流に、上記の配列番号2で表される塩基配列からなるDNA断片を導入するために、Trichoderma reesei QM9414株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製する。
前述の方法により取得したTrichoderma reeseiの変異株をTrichoderma reesei 変異株IIとして、以下のタンパク質製造試験並びにタンパク質濃度およびセルラーゼ比活性測定の実験に用いた。
(変異株の作製方法)
配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したTrichoderma reeseiの変異株は、配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする配列番号3で表される遺伝子を選択マーカーとしてアセトアミド、選択マーカー遺伝子としてアセトアミドを分解することができるアセトアミダーゼ(AmdS)遺伝子(amdS)と置き換えることで破壊する。配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能を欠損させるため、配列番号22で表される遺伝子配列からなるDNA断片を作製し、当該DNA断片をTrichoderma reesei ATCC66589株に形質転換して、配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損したTrichoderma reeseiの変異株を作製する。この方法により、配列番号3で表される塩基配列が欠損したTrichoderma reeseiの変異株が得られる。amdSを含むDNA配列の上流および下流に、上記の配列番号3で表される塩基配列からなるDNA断片を導入するために、Trichoderma reesei QM9414株の遺伝子配列と相同的な部分を付加するように変異導入用プラスミドを作製する。
前述の方法に従って取得したTrichoderma reeseiの変異株をTrichoderma reesei 変異株IIIとして、以下のタンパク質製造試験並びにタンパク質濃度およびセルラーゼ比活性測定の実験に用いた。
(前培養)
実施例1〜3で作製するTrichoderma reeseiの変異株の胞子をそれぞれ1.0×107/mLになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液2.5mLを表1に示した1Lバッフル付フラスコへ入れた250mLの前培養培地へ接種させ、振盪培養機にて28℃、120rpmの条件にて72時間培養を行う。コントロールとして、Trichoderma reesei ATCC66589株を用い、以下同様の実験操作を行う。
Arbocel(登録商標) B800を表2で示した本培養培地に添加し、5Lジャーファーメンター(バイオット社)を用い、深部培養検討を行う。
本培養開始40時間目に、表3で示した液糖培地を1日につき本培養液へ250mLずつ添加し続ける。
実施例1〜3で作製するTrichoderma reeseiの変異株の本培養液を、培養開始より経時的に各時点で20mLの培養液を採取する。採取した培養液の1部は、15,000×g、4℃の条件下で10分間遠心分離を行い、上清を得る。その上清を0.22μmのフィルターでろ過し、そのろ液をセルラーゼ溶液として、以下の実験に用いる。
経時的に採取した実施例1〜3の培養液のタンパク質濃度を、参考例1の条件で、測定する。その結果、Trichoderma reesei ATCC66589株と比較して、実施例1〜3で作製したTrichoderma reeseiの変異株は、相対値で培養液中のタンパク質濃度が高くなる。
経時的に採取した実施例1〜3の培養液を酵素液として、参考例2の条件で、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、セロビオハイドラーゼの比活性をそれぞれ測定する。比活性は、405nmの吸光度の増加を測定し、1分間あたり1μmolの基質を遊離する活性を1Uとして算出する。その結果、Trichoderma reesei ATCC66589株と比較して、実施例1〜3で作製したTrichoderma reeseiの変異株培養液における上記3種類の比活性は高くなる。
実施例1〜3で作製したTrichoderma reesei 変異株I〜IIIのそれぞれの胞子を、1.0×107/mLになるように生理食塩水で希釈し、その希釈胞子溶液0.1mLを表4に示したArbocel(登録商標) B800またはラクトースが含まれる50mLバッフル付フラスコへ入れた10mLのフラスコ培地へ接種させ、振盪培養機にて28℃、120rpmの条件にて120時間培養を行った。
フラスコ培養開始120時間後に1mL培養液を採取した。培養液を15,000×g、4℃の条件下で10分間遠心分離を行い、上清を得た。その上清を0.22μmのフィルターでろ過し、そのろ液を以下の各種実験に用いた。
Arbocel(登録商標) B800を用いたフラスコ培養では、Trichoderma reesei ATCC66589株を培養した培養液に含まれるタンパク質濃度を1とした場合、Trichoderma reesei 変異株I、変異株II、変異株IIIの培養液に含まれるタンパク質濃度の相対値は全て1.1であり、変異株のタンパク質製造能は親株よりも向上することを確認した。
Arbocel(登録商標) B800を用いたフラスコ培養では、Trichoderma reesei ATCC66589株を培養した培養液のセルラーゼの各種比活性を1とした場合、β−グルコシダーゼ比活性は、Trichoderma reesei 変異株I:1.1、変異株II:1.2、変異株III:1.1であり、β−キシロシダーゼ比活性は、Trichoderma reesei 変異株I、II、III共に1.1であり、セロビオハイドロラーゼ比活性も、変異株I、II、III共に1.1であり、セルラーゼの各種比活性も向上するという予想外の効果が得られることを確認した。
参考例3で記載した手法に従い、Trichoderma reesei 変異株I、変異株IIおよび変異株IIIのフラスコ培養開始から120時間目の培養液をセルラーゼとして用いて、セルロース含有バイオマスの糖化反応試験を行った。セルロース含有バイオマスとして、Arbocel(登録商標) B800または粉末バガスを用いた。
Trichoderma reesei QM9414株の経代株であるQM9414−A株に対し、遺伝子変異処理を行って変異株であるQM9141−B株を取得した。遺伝子変異処理は、QM9414−A株の胞子を表1に示す前培養培地1mLあたり1.0×105胞子になるよう接種し、前培養培地15mLを半日培養した後に遠心分離を行い、胞子を回収した。そして、回収した胞子をトリスーマレイン酸バッファー(pH6.0)にて10mLの胞子溶液になるよう懸濁し、そこへトリスーマレイン酸バッファー(pH6.0)で1.0g/Lになるよう溶解させたNTG溶液を0.5mL添加し、28℃、100分間、遺伝子変異処理を行った。遺伝子変異処理した胞子は、遠心分離にて回収した後に、トリスーマレイン酸バッファー(pH6.0)で3回洗浄し、最終的にトリスーマレイン酸バッファー(pH6.0)10mLにて懸濁したものを遺伝子変異処理胞子とした。続いて遺伝子変異処理胞子を、結晶セルロースを添加して調製した寒天培地へ添加し、コロニー周囲に生じるセルラーゼによる結晶セルロース分解領域であるハロの大きさを指標とし、ハロの大きかったQM9414−B株を選抜した。
実施例5で取得した変異株のQM9414−B株について、実施例4に記載の(前培養)、(本培養)、(本培養途中における液糖の添加)および(培養液の採取)に準じて培養を行い、参考例1の条件でタンパク質濃度を測定した。コントロールには親株であるQM9414−A株を用いてQM9414−B株と同様に培養し、参考例1の条件でタンパク質濃度を測定した。
Claims (15)
- 配列番号4〜6のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの機能が欠損または低下する変異を有する、Trichoderma reeseiの変異株。
- 前記変異が、配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのHSF−type DNA−bindingドメインが欠損する変異である、請求項1に記載の変異株
- 前記変異が、HSF−type DNA−bindingドメインよりもN末端側の領域での変異に伴うフレームシフト変異である、請求項2に記載の変異株。
- 前記変異が、配列番号4で表されるアミノ酸配列のN末端側から30番目のヒスチジン残基がヒスチジン以外のアミノ酸残基に変異することによるフレームシフト変異である、請求項3に記載の変異株。
- 前記変異が、配列番号5で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのTLDドメインが欠損する変異である、請求項1に記載の変異株。
- 前記変異が、TLDドメインよりもN末端側の領域での変異に伴うフレームシフト変異である、請求項5に記載の変異株。
- 前記変異が、配列番号5で表されるアミノ酸配列のN末端側から3番目のグルタミン残基がグルタミン以外のアミノ酸残基に変異することによるフレームシフト変異である、請求項6に記載の変異株。
- 前記変異が、配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのF−boxドメイン領域のアミノ酸配列の変異である、請求項1に記載の変異株。
- 前記変異が、F−boxドメイン領域のアミノ酸配列の変異に伴うフレームシフト変異によって生じる配列番号6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの欠損である、請求項8に記載の変異株。
- 前記変異が、配列番号6で表されるアミノ酸配列においてN末端側から167番目のアラニン残基がアラニン以外のアミノ酸残基に変異することによるフレームシフト変異である、請求項9に記載の変異株。
- 請求項1から10のいずれかに記載の変異株を培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
- 請求項1から10のいずれかに記載の変異株を少なくともラクトースを含む培地で培養する工程を含む、タンパク質の製造方法。
- 請求項1から10のいずれかに記載の変異株を培養する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
- 請求項1から10のいずれかに記載の変異株を少なくともラクトースを含む培地で培養する工程を含む、セルラーゼの製造方法。
- 請求項13または14に記載のセルラーゼの製造方法によりセルラーゼを製造する工程および前記工程で得られたセルラーゼを用いてセルロース含有バイオマスを糖化する工程を含む、糖の製造方法。
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