JPH11509738A

JPH11509738A - 可溶性オリゴ糖結合ドメインに基づく分離及び濃縮システム

Info

Publication number: JPH11509738A
Application number: JP9511489A
Authority: JP
Inventors: エーハインズ，チャールズ; トウメ，ピーター; ジーキルバーン，ダグラス
Original assignee: ユニバーシティオブブリティッシュコロンビア
Priority date: 1995-07-24
Filing date: 1996-07-24
Publication date: 1999-08-31
Also published as: IL122877A0; BR9609742A; AU718247B2; EP0842264A1; CA2226785A1; AU6680596A; WO1997013841A1; CN1193995A; HUP9802406A2; KR19990035882A; US6174700B1

Abstract

(57)【要約】生物学的成分を分離及び／または精製するための新規な方法が提供される。生物学的成分は、多糖類結合ペプチドを含有し、全体または部分的に組み換えＤＮＡ技術によって調製されうる。この方法では、生物学的成分を含む溶液を、結合ペプチドが結合する相形成オリゴ糖と混合して相分離を導く。次いで生物学的成分を含有する相を単離する。相分離は、相分離誘発剤を用いて、オリゴ糖ポリマーが熱分離性ポリマーであるときは、ポリマーの曇点温度より上に温度を上昇させることによって導かれる。

Description

【発明の詳細な説明】可溶性オリゴ糖結合ドメインに基づく分離及び濃縮システム緒言技術分野本発明は、リガンドが可溶性相形成オリゴ糖に結合するポリマー−リガンド対を用いた親和性相分離によるポリペプチド及び他の化合物を分離及び／または精製するための方法に関する。本発明は、親和性リガンドとして、Cellulomonas f imiセルラーゼを含有する化合物に対する皺性を有する可溶性オリゴ糖を含む相分離システムの使用によって例示する。背景微生物系の発現によるタンパク質の精製は、高価で医学的に重要なタンパク質の大事な源となっている。組み換えタンパク質の精製及び回収は、発酵プロセスの設計における主要な問題である。従来の抽出システムは、インシュリン等の高投与量製剤、及び、３−オキソステロイドイソメラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ及びホスホフルクトキナーゼ等の工業的タンパク質といったタンパク質製品の大規模精製を単純化する手段として多くの工業的興味を集めていた。その結果として、広範な２相システムが、タンパク質精製及び細胞分離応用の両方において現在利用されている。水性２相システムは、組み換えタンパク質及びペプチドの大規模処理に対して独特な利点を示し、それらは、高活性収率（例えば、大量の）、平衡への速い到達、規模拡張の容易さ、及び、最も重要なことだが、連続的な処理を含む。水性２相分離システムの技術的可能性は、１００，０００Ｌスケールまでの幾つかのシステムにおいて示されている。それらは、２つの水溶性だが相容性でないポリマーまたは水溶性ポリマー及び強電解質のいずれかに水を添加することによって形成される。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その低価格及び広範 −な子量分画での入手しやすさにより、多くの工業的２相システムのポリマー成分の１つとして役立っている。分別されたデキストラン、ａ−１，３分枝したａ −１，６グルコ糖類(glucosaccharide)は、第２のポリマーとしてしばしば用いられている。しかし、多数の炭化水素ポリマーを含む多くの他の水溶性ポリマーも用いられている。水性２相システムは、主に見ずを含み、各相は分離導入性成分の１つに富み、他は殆ど含まない。発酵液からのタンパク質及び他の生体高分子の混合物が２相システムに添加されると、各相のタンパク質分布は、２つの相形成成分に対するその相対的親和性、そのサイズ、表面化学、及び正味の電荷のみに基づく。従来の水性２相システムにおける比較的低い分配係数及び選択性に欠如は、用途の広い従来の分離システムとリガンドの独特な結合選択性とを結合させた親和性分離システムの開発の動機付けとなった。殆どの場合、生体特異的(biospecif ic)リガンドは、通常はＰＥＧである相形成ポリマーの一端又は両端に共有結合する。次いで、相形成中のポリマーの強力な分配が、リガンドの平衡相の１つへの凝縮を生じさせる。リガンドに対する標的タンパク質の強い親和性と結びついたこの高度に非対称の分配は、親和性分離及び濃縮の後ろ盾である。しかし、現在の親和性分離システムは工業的に使用されているものもあるが、ポリマー鎖当たりに１または２のリガンドしか存在しないことから生ずる低いリガンド密度によって、それらの能力及び解決力が限られている。ポリマー濃度は通常１５重量％未満であるので、リガンド対ポリマーの化学量が１：１〜２：１の親和性分離システムは、通常５から５０の（汚染物に対する）標的タンパク質分離率を生ずる。これらの分離率(separation factor)は、生成物の濃縮に十分であるよりも大きいが、コスト効率の良い１又は２段階の抽出工程において望まれる生成物純度は得られない。古典的な親和性分離システムも、ポリマー−リガンド接合体の製造に必要とされる化学の費用によって制限される。例えば、ＰＥＧへのリガンドの接合は、第１に末端ヒドロキシル基の、臭化物、塩化物、エポキシド等のより活性な親電子物質による置換を必要とする。次いで、ポリマーとリガンドの共有結合には第２の親核攻撃反応が必要である。また、リガンドポリマー接合体は、精製すべき各タンパク質またはタンパク質の類に選択的に設計しなければならない。水性２相分離における最近の発展は、水性２相分離を温度誘導相分離と結合させたことである。今日まで、これらのシステムは上相ポリマーとして熱分離性ポリマーを、下相ポリマーとしてデキストランまたはヒドロキシプロピルデンプンの何れかを用いてきた。精製工程に続く温度誘導相分離は、生物学的製品からのポリマーの分離及びリサイクルを可能にする。この形態では、プロセスは熱相分離ポリマーが回収されるという利点を持つが、標的タンパク質が特異的ではなく熱分離ポリマに強い親和性を持たないという顕著な欠点を有する。これらの２相システムにオリゴ糖結合ドメイン技術を適用することは、ポリマーを含む相の高親和性分離と、それに続く簡単なポリマーの回収及びリサイクル方法を可能にする。従って、所望のタンパク質のための迅速、低価格、高容量の方法の開発、特に、包括的なポリマー−リガンド接合体を使用できる方法の開発が望まれる。関連文献相形成オリゴ糖の総説としては、Zaslavsky，Aqueous Two-Phase Partitionin g，Marcel Dekker，Inc.: New York(1995); Albertson，P.A.，Partitioning of Cell Particles and Macromolecules，3rd ed.，Wiley Interscience: New Yor k(1986); Walter，H．Brooks，D.E.，and Fisher，D.，Partitioning in Aqueou s Two-Phase Systems，Academnic Press: Orland，FL(1985)を参照。次の参考文献は、熱分離ポリマーに関する：Maocolm and Rowlinson，(1957). Trans．faraday Soc.，53，921; Bailey and Callard，(1959)．J．Appl．Polym .，1，56: Horne，et al.,J．Colloid Interface Sci.，35，77; Saeki，et al. ，J．Chem．Soc.，Faraday Trans.，1，79，975; Fujishige，et al.，(1989)J. Phys．Chem.，93，3311; Galeav and Mattiasson，(1993)．Enzyme Micrib．Tec hnol.，15，354; Chen and Hoffman，(1995)．Nature，373，49。エンドグルカナーゼ(endoglucanase)Ｃに関する参考文献は次のものを含む。M oser，et al.，Applied and Environmental Microbiology(1989)55: 2480-2487; Molecular Microbiology(1991)5: 1221-1233; Coutinho，et al.，Molecular M icrobiology(1992)6: 1243-1252; Coutinho，et al.，FEMS Microbiolog y Letters(1993)113: 211-218。β−１，４−グリカナーゼの総説としては、Gil kes，et al.，(1991)Microbial Reviews 55: 303-315を参照。また、Miller，Jr .，et al.，(1995)Proc．6th Int．Conf．on Biotechnology in the Pulp and P aper Industry，Vienna，Austriaも参照。発明の概要水相分離及び／または精製システム、並びにその調製方法及び使用が提供され、それは、ポリマー−リガンド接合体に基づき、該ポリマーはオリゴ糖ポリマーであり、分離及び／または精製されるべき組成物は、前記オリゴ糖ポリマーに結合するリガンドを有する。このリガンドは、多糖類結合ペプチド（ＰＢＰ）であって、相形成オリゴ糖ポリマーに結合可能であることを特徴とするアミノ酸配列である。組成物は、一般的に発酵液、細胞溶解物、生物学的流体、または、ＰＢＰに融合する目的の高分子又は化学的部位持つ化合物を含有する他の流体である。この相分離システムは、１又はそれ以上の相形成オリゴ糖ポリマー、及び、相誘導ポリマー、他の相誘導剤、または相分離を誘導する手段を含む。この方法は、相分離システムを組成物に接触させてオリゴ糖ポリマー相に分配し、次いで、相分離を誘導して組成物を単離することを含む。組成物は、低イオン強度、高ｐＨ、又は無秩序剤(chaotropic agent)を含む除去溶液でオリゴ糖ポリマーから除去することができる。あるいは、化合物と多糖類結合部位との間にプロテアーゼ認識部位を導入することにより、オリゴ糖ポリマーに結合したままの多糖類結合部位から化合物を酵素的に除去するために、特異的又は非特異的プロテアーゼを用いてもよい。プロテアーゼを用いる場合、結晶性多糖類に対して親相性を持つが、最初の多糖類結合部位は親和性を持たない第２の多糖類結合部位に結合させて提供してもよい。任意に、プロテアーゼは、続いて固体多糖類から溶離させてリサイクルすることもできる。さもなくば、第２の多糖類結合部位に結合したプロテアーゼは、その多糖類結合部位が結合しない固体の多糖類支持体に結合させて提供してもよい。本発明は、ＰＢＰと結合できるタンパク質及び他の化合物の分離及び／または精製のための使用を見出した。図面の簡単な説明図１は、Cellulomonas fimi endoglucanase C(CenC)(Coutinho，et al.，Mol ．Microbiol．(1991)5: 1221-1233)のセルロール結合ドメイン（Ｎ１及びＮ２）及びCceCelCCE（Clostridium cellulolyticumからのセルロース)(Bagnarda-Tard if，et al.，Gene(1992)119: 17-28)、MxaEgl(Myxococcus xanthusからのβ-1,3 -グリカナーゼ)(Quillet，et al.，Gene(1995)158: 23-29)、SreCell(Streptomy ces reticuliからのセルロース)(Schlichttermeier，et al.，NIl．Microbiol． (1992)6:3611-3621)、及びTfuEL(Thermomonospora fuscaからのβ-1,4-エンドヌクレアーゼ)(Lao，et al.，J．Bacteriol.，(1991)173: 3397-3407)の推定セルロース結合ドメインのアミノ酸配列アラインメントに基づくセルロース結合ドメインの共通配列を示す。アミノ酸残基は一文字コードで示す。ダッシュ（−）は、アラインメントの進行中に残った切れ目(gap)を示す。図２は、大腸菌(Escherichia coli.)におけるＰＢＤＮＩの発現に用いるpTugA ベクターの説明図を示す。pTugAを使用した結果、高レベルの誘導可能な転写、ＲＮＡ翻訳の促進、移植性、高コピー数、安定性、及び融通性が得られる。pTug ベクターは、コピー数を向上させるための突然変異pUC13から誘導されたpMB1 or i(Minton，et al.，Focus(1988)10: 56)、LaqIqによって強力に発現される（IPT Gによって）強力かつ高度に誘導可能なｔａｃプロモータ（Ptac）を含む。licIq 対立遺伝子は、lacIqに対するPtacの比率を一定に維持するためにpTugに組み込まれて、E.coliホストに無関係にリプレッサの十分なレベルを確保する。遺伝子１０翻訳促進剤（Olins，et al.，Gene(1988)73: 227）も、pTugベクターに組み込まれている。図２Ａは、NcoI-HindIII領域のヌクレオチド及びコードされるアミノ酸配列、並びに、NcoI部位の上流領域であって、遺伝子１０翻訳促進剤（"g 10"）及びCenAリーダ配列（"leader"）を含むヌクレオチド配列を示す。図２Ｂは、pTugAベクターのマップを示す。図３は、pTugASベクターの説明図を示す。図３Ａは、SacI-NcoIHindIII領域のヌクレオチド及びコードされるアミノ酸配列、並びに、SacI部位の上流領域のヌクレオチド配列を示す。図３Ｂは、pTugASベクターのマップを示す。図４は、pTugE07K3の構造を示す。pTugAの誘導体であるpTugKは、アンピシリン耐性に対する選択的マーカーに換えてカナマイシン耐性に対する選択的マーカーを持ち、NcoIで完全に消化された。付着末端は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）で修正されて平滑末端の制限部位を生じた。修飾したpTugKベクターは、次いで、HindIIIで完全に消化され、4.2kbpの断片が単離された。ｐＴＺＥ０７（Ong，et al.，Biotechnol．Bioeng．(1993)42: 401-409）は、BamH Iで完全に消化され、付着末端は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノウ断片）で修正されて平滑末端の制限部位を生じた。修飾したpTZE07は、次いで、HindII Iで完全に消化され、2.1kbpの断片が単離された。4.2及び2.1kbpの断片が結合されてpTugE07K3を与えた。図５は、pTugKN1の構造を示す。pTugE07K3は、NheI及びHindIIIで完全に消化され、CBD_Cexを含む1.8kbpの断片が除去されて、4.5kbpの断片が単離された。CB D_NIをコードする遺伝子断片の５’及び３’末端に適当な制限部位を導入するためにＰＣＲが用いられた。成熟CBD_NIのＮ末端(ala-ser)に相当するNheI部位（下線部）は、オリゴヌクレオチド5'-TTACCTCATATGGCTAGCCCGATCGGGGAGGGAACG-3'を用いた5’におけるcbdNIのサイレント変異として導入された。HindIII部位は、オリゴヌクレオチド5'-AGAATGAATTCAAGCTTAGAGCTCCGACCTCGGAGTC-3'を用いてcbd NIの３’末端に導入された。翻訳的停止コドンも、このプライマーに含まれる。ポリメラーゼ反応（ＰＣＲ）混合物は、10-100ngのテンプレートＤＮＡ（pTz-JC 3）（Coutinho，et al.，Mol．Microbiol．(1992)6: 1243-1252）、25-50pmole （300ng）のプライマー、2mMのＭｇＣｌ₂、6%のジメチルスルホキシド、0.2mMの 2’−デオキシヌクレオチド5’−トリホスファート、及び、50mMのTris中の1単位のTaq DNAポリメラーゼを含んでいた。２８回の連続的サイクルを次のように実施した：９４℃における１５秒間の変性、５７℃での１．４分間のアニーリング、そして、７２℃における１．５分間のプライマー延長。得られたCBD_NIPCR断片は、NheI及びHindIIIで完全に消化され、0.5kbpの断片が沈降によって精製された。4.5kbpと0.5kbpの断片を結合してpTugKN1を与えた。図６は、pTugKN1ベクターを示す。pTugKN1ベクターは、アンシピリン耐性（β -ラクタマーゼ・コード配列）に選択的なマーカーをカナマイシン耐性に対する選択的マーカーで置換することにより、pTugAベクターから誘導される。C.fimi のエンドヌクレアーゼＡ（CenA）のリーダペプチドをコードする配列は、C.fimi からのエキソヌクレアーゼ(Cex)のリーダペプチドをコードする配列で置換された（Ong，et al.，Biotechnol．Bioeng．(1993)42: 401-409）。図７は、PBD_NIのアニオン交換クロマトグラフィの結果を示す。部分的に精製されたPBD_NI（200ml中150mg）を、20mMのリン酸カリウムバッファで平衡にされたｐＨ６．０のアニオン交換カラム（MonoQ）に配置（1ml/分）した。カラムを2 00mlのバッファｐＨ６．０で洗浄した後、結合したタンパク質を塩勾配（20mMのリン酸カリウムバッファpH6.0中の600ml、0-1MのNaCl）を用いて回収（8ml分画）した。PBD_NIは、300mM塩においてカラムから回収された（ピーク１）。汚染したタンパク質は、より頑強に結合しており、更に高い塩（ピーク２）において回収された。図８は、培養上清からの精製中のPBD_NIのSDS-PAGE分析を示す。JM101収容pTug KN1からの培養上清（誘導された）（レーン２）、全培養上清（細胞及び液）（レーン３）、培養上清でのタンパク質の結合後のAvicel分画（レーン４）、上清のAvicel への結合の後のフロースルー分画（レーン５）、AvicelからＨ₂Ｏで溶離した分画（レーン６）、及び、MonoQ精製の後のPBD_NIを、12.5%アクリルアミドを含むゲル上で分析した。分子量標準物質（レーン１）は示した通りである。図９は、PBP（PBD_NI及びPBD_NIN2）の分析のための親和性電気泳動ゲルを示す。精製したウシ血清アルブミン(BSA)（レーン１）、PBD_NI（レーン２）、及びPBD_N1N2 （レーン３）の、可溶性オリゴ糖に対する結合を、13%のアクリルアミドを含む天然ゲル中で分析した。オリゴ糖の不存在（−）でのゲルにおける泳動に比較した、多糖類（(0.1% w/v)ヒドロキシエチルセルロース(HEC)または大麦グルカン）の存在（＋）するゲルにおける妨害は結合性を示す。非結合性多糖類としてキシランを用いた。5mgの各タンパク質を各ゲルに配置した。図９Ａは、大麦β−グルカンの存在（＋）及び不存在（−）での結合を比較する。図９Ｂは、ヒドロキシエチルセルロースの存在（＋）及び不存在（−）での結合を比較している。図９Ｃは、シラカンバ木(birchwood)キシランの存在（＋）及び不存在（−）での結合を比較している。図１０は、pTZ-JC13（図１０Ｃ）の構成において用いられるベクターを示す。図１０Ａは、PBD_NIをコードする断片を得るために用いられる、全CenCをコードする遺伝子断片を含むpTZ-JC2を示す。図１０Ｂは、CenAをコードする断片を得るのに用いられるベクターpUC18-1.6 cenA_-PTを示す。図１１は、CenA及びPBD_NI-CenA融合タンパク質からのタンパク質分解生成物の SDS-PAGE分析を用いた分析結果を示す。各タンパク質の8mgを、50mlのリン酸バッファ、pH7.0(50mM)中で、０（レーン5及び9）、０．１（レーン4及び8）、０．５（レーン 3及び7）、または１．０（レ-ン2及び6）単位のC.fimiプロテアーゼの存在下で、３０℃で３時間インキュベートした。分子量マーカー（レーン1）は示したとおりである。P30は、セルロール結合ドメインのタンパク質分解的除去の後のCenAの触媒ドメインに対応する（Gilkes，etal.，J.Biol.Chem．(1988)263: 10401-104 07）。図１２は、セルロースへの差示吸着、それに続くSDS-PAGEを用いた非吸着ポリペプチドの分析によるCenA及びPBD_N1-CenAの分離の結果を示す。図１２Ａにおいて、25mg(レーン2及び3)、100mg(レーン4及び5)、または250mg(レーン6及び7)の両方のポリペプチドを含むアリコートを、細菌微結晶セルロースの存在下（BMCC(+)）または細菌微結晶セルロースの不存在下（BMCC(-)）でインキュベートした。図１２Ｂでは、BMCCインキュベーション混合物からの非吸着分画を含む上清を、リン酸膨潤セルロース（PASC(+)）とともにさらにインキュベートした。非添加の対照用サンプル（PASC(-)）の結果も示した。図１３Ａ及び１３Ｂは、融合タンパク質の固定化及び使用の模式図である。図１３Ａは、融合タンパク質の給餌バッチ生成、精製、及び固定化を示す。図１３Ｂは、再利用可能な発酵−固定化カラム装置を用いたセルロール材料のグルコースへの加水分解のための融合タンパク質の使用を示す。図１４は、２つの脱離可能ラベル組成物及びセルロース物質からの脱離可能ラベルの酵素的脱離のための手段を示す。矢印は化学的部位を示し、四角形は特異的プロテアーゼのプロテアーゼ切断部位、斜線を付した四角形はセルロース結合ドメインを示す。図１５は、ｐＨ７かつ３５℃における50mMリン酸バッファ溶液中でのCBD_N1に対するヒドロキシセルロースの結合についての、等温的艇微少熱量分析データを示す。図１６は、３５℃かつｐＨ７における50mMのＰＢＳ中でのヒドロキシエチルセルロース及びPluronic P105の混合物に関する予備相平衡データを示す。図１７は、新規なCBD_N1-融合技術に基づく親和性分離システムの模式図を示す。過剰の塩を除去するための透析過程の後、必要ならば、因子Ｘａ及び因子Ｘａ −ＣＢＤ融合タンパク質の好適な発現システムのための、標的タンパク質(Assou line，et al.，(1993)Protein Eng.，7: 787)に対して１位に挿入された因子Ｘａに対するIQGR特異的認識部位における切断により標的タンパク質を融合構造体から回収することができる。プロセスを単純化するために、親和性分配過程の直後に因子Ｘａ切断による標的タンパク質の直接回収を用いることができる。図１８は、水中及び100mMクエン酸バッファ中でのUCON 50-HB-5100に関する実験的曇点ダイアグラムを示す。１０°(w/w)UCON溶液について、２成分混合物では323Kで相分離が起こり、バッファ含有システムでは312Kで起こった。特別な実施態様の説明相形成オリゴ糖ポリマーに結合する組成物の精製及び／または分離に用いることのできる水性相分離システムが提供される。一般に、この組成物は、目的とするポリペプチドまたは化学的部位に接合した、多糖類結合ドメイン(PBD)等の、オリゴ糖ポリマーに高親和性を有するアミノ酸配列を含有する多糖類結合ペプチド(PBP)を含む。しかし、多糖類結合ペプチドは、オリゴ糖ポリマーに結合する任意のアミノ酸配列を含むことができる。ＰＢＰを調製する方法も提供され、ＰＢＰは、多糖類のＰＢＤ、多糖類結合タンパク質の結合ドメイン、または多糖類に結合できるように設計され加工されたタンパク質から誘導することができる。ＰＢＰは、天然でも合成でもよい。ＰＢＰがＰＢＤまたはＰＢＤから誘導された場合、アミノ酸配列は一般に、多糖類の加水分解酵素活性を実質的に欠くが、基質結合活性は保持している。相分離システムは、一般的に、相分離システム成分の、成分の混合の際における非相容性によって生成される２つの相を含む。システムの一方の成分は相形成オリゴ糖であり、第２の成分は、オリゴ糖ポリマーと相容しない第２のポリマー、特に硫酸塩、クエン酸塩等の強電解質といった相誘導剤であり、相分りっを誘導するのに十分に高い濃度で存在する。例えば、相形成オリゴ糖が熱分離性ポリマーである場合、相分離は、生成すべき化合物と相形成ポリマーとを含む組成物を、相分離が生ずる温度まで加熱することにより誘導することができる。相分離システムを用いる過程は、多糖類結合ペプチドを含む組成物と相分離システムとを接触させることを含む。相分離システムは既に混合されたものでもよく、組成物は何れかの成分を乾燥形態（例えば親油化）に添加してもよい。一例として、オリゴ糖ポリマーが組成物に添加され、それによりポリマーを再水和して相分離を誘導する。幾つかの応用では２以上の相を用いることができる。組成物をオリゴ糖ポリマー相に分配するのに十分な時間の後、相が分離する。汚染タンパク質の多糖類豊富相への分配（非親和性）は、システムのｐＨ、ポリマー濃度、及び分配電解質を調節することによって最小にする。操作の最適条件下では、２つの水性相の多段階接触に次いで、標的組成物の完全又は部分的（しかし十分な）精製が提供される。対象となるポリペプチド又は化学的部位を含む組成物は、ＰＢＰを含む組成物をポリマーから溶離することのできる除去溶液にポリマーを接触させることによりポリマーから取り外すことができ、または、ＰＢＰを含む組成物は、化合物とＰＢＰとの間にプロテアーゼ認識部位又は化学的切断部位を含むことにより酵素的に除去することができる。後者の除去方法では、ＰＢＰはオリゴ糖ポリマーに結合したままとなる。認識部位の例は、対応する酵素で特異的に切断されるコラゲナーゼ、トロンビン、及び因子Ｘａを含む。例えば、低ｐＨ又はシアノゲンブロミドに選択的な化学的切断部位も用いることができる。切断を容易にするため、特異的切断酵素を切断酵素接合体として提供することができ、この切断酵素はＰＢＰに結合しており、ＰＢＰとは異なる基質結合性を有し、可溶性オリゴ糖ポリマーに結合し、または同じ多糖類の全く異なる物理的形状ではなく異なる多糖類に結合する。好ましくは、この第２のＰＢＰは、第１のＰＢＰが結合しない不溶性多糖類に結合する。不溶性多糖類は、対象とする化合物を含む混合物に添加して、切断酵素接合体を溶液から除去することができる。溶液からの分離に続いて、切断酵素複合体は、不溶性多糖類から取り除いて再利用することができる。あるいは、切断酵素複合体は、不溶性多糖類に既に結合した形態、例えば、対象とする化合物を含む混合物を通過させるカラムの形態で提供できる。本発明は、今日使用されている水相分離システムに勝る幾つかの利点を有する。オート麦又は大麦から得られるような、セルロース及び他のβ−グルカンなどの炭化水素を含むオリゴ糖ポリマーは、豊富であり安価である。さらに、炭化水素ポリマー及び他のオリゴ糖類に特異的に結合する種々のタンパク質が、本発明のＰＢＰの源として使用できる。一例として、本発明の相分離システムを用いた融合タンパク質の分離及び／または精製手段として炭化水素に結合する炭化水素ポリマー結合部分を含む融合タンパク質が調製できる。即ち、ＰＢＰの使用により、相形成オリゴ糖ポリマーに結合できるＰＢＰに結合することにより、任意のポリペプチドまたは化学的部位の分離及び／または精製のための一般的手段が提供される。オリゴ糖ポリマーからのＰＢＰの選択的結合は、単一のオリゴ糖ポリマー相分離システムを用いることにより、広範な化合物の精製及び／又は単離に特に好ましいものにする。分離すべき各化合物について別々の相分離システムを調製すること、即ち、各化合物に特異的なポリマー−リガンドを調製する必要がない。また、オリゴ糖は用いられている他の相分離用ポリマーに比較して多くの結合部位を有するので、分配用リガンドに結合するポリマーの容量がかなり増大する。２相分離システムにおける１またはそれ以上の熱分離ポリマーの使用は、ＰＢＰが結合するポリマーを含む相の高親和性分離と、それに続くポリマーを回収及びリサイクルするための簡単な方法というさらなる利点を与える。ＰＢＰ化合物は、ポリマーに特異的かつ強力に結合するが、高いｐＨにおいて、室温から生理学的温度、一般的には４０℃未満、通常は２０℃の領域で水で溶離することにより容易に除去することができる。非タンパク質化合物では、ＰＢＰは、３０℃、ｐＨ７．０においてプロテアーゼＫ等の一般的プロテアーゼを用いたタンパク質分解によって化合物から除去することができる。即ち、ＰＢＰは、化合物をオリゴ糖ポリマーに結合させる手段を提供し、化合物は後に取り外される。相形成オリゴ糖に種々の親和性を持つ突然変異ＰＢＰ又はＰＢＤも、特別なシステム及び／または応用に必要な親和性を変化させるために得られる。必要ならば、ＰＢＰは、加水分解活性を持つタンパク質を含むポリサッカリダーゼ酵素全体までを含んでもよく、ＰＢＰのみを含む配列が用いられる加水分解活性を実質的に含まなくてもよい。後者は、基質の一体性を保持し、再利用できるべきである場合に望ましい。上記のような多糖類の脱離溶液での処理は、多糖類の表面構造を変化させない。マトリクスからＰＢＰ接合体を取り外す非特異的プロテアーゼの使用を含む代替的方法は、接合体に直接作用し、多糖類表面は変えない。ＰＢＰと対象化合物との間に、特異的試薬によって切断される結合基を導入することにより、ＰＢＰはオリゴ糖ポリマーに結合させたまま、対象とする化合物のみを得ることができる。このシステムの他の鍵となる利点は、実験室的プロトコールから商業的プロトコールに容量を線形的に比例させること、及び、システムが連続的プロセスとして進行できることを含む。新規なポリペプチド組成物は、次式で表されるものを含む。ＰＢＰ−ＭＲ−Ｘ（１）ここで：ＰＢＤは、ポリサッカリダーゼの基質に高親和性を与え、任意にポリサッカリダーゼ活性を実質的に欠いていてもよい多糖類または多糖類基質と結合する他のタンパク質の基質結合領域からのアミノ酸の連続的配列として特徴づけられる。ＰＢＰは、少なくとも多糖類に結合し相分離システムで用いるのに必要な最小数のアミノ酸であり、相形成オリゴ糖に結合できることを更に特徴とする。ＭＲは、中間領域であり、結合であってもよく、２から３０の炭素原子の短い結合基または２から約２０のアミノ酸を有してもよい。この領域は、融合タンパク質の特異的切断を与えるアミノ酸配列、通常は、IgA1プロテアーゼまたは因子Ｘａ等の高い特異性のタンパク質分解酵素に認識されるものに相当する配列を含んでもよい。Ｘは、対象とする任意のペプチド又は化学的部位である。Ｘは、対象ポリペプチドの配列全部までを持つことを特徴都市、酵素、ホルモン、イムノグロブリン、ペプチド、等であってもよい。新規なポリペプチド組成物は、次式で表されるものを含む。ＰＢＰ−Ｚまたは（２）ＰＢＰ−ＭＲ−Ｚ（３）ここで：ＰＢＰ及びＭＲは上記の定義通りであり、Ｚは、ＰＢＰに結合された化学的部位である。Ｚは、単に部位を表し、この部位の化学量は示していない。化学量は変化しうる。ＰＢＰは、本発明で用いられることが見出されたオリゴ糖に結合する酵素を含む種々の源から得ることができる。２タイプのオリゴ糖が本発明で用いられることが見出され、（１）相分離システムにおけるオリゴ糖、及び（２）切断酵素の除去に用いられるような固相システムで用いられるオリゴ糖である。相分離システムのオリゴ糖は、一般的に、水溶液に可溶であり、ＰＢＰ及び相分離できる対象化合物を含む組成物に高い親和性及び結合する能力を持つという特徴を有し、多糖類結合ペプチドを含む化合物を高度に豊富化、一般的に≧70%、好ましくは ≧80%とする。下記の表１は、他のポリマーまたは強電解質とともに水性２相システムを形成することが知られたオリゴ糖類の一部のリストである。２相システムを形成すると思われる他の多糖類は、低分子量セロ多糖類(cello saccharide)；キトサン及び他のキチン誘導体；全ての水溶性グルカン（α、β 、及び／又は混合した結合かつ＞３の重合度を持つもの）、修飾グルカン、及び／または誘導グルカン；大麦またはオート麦β−グルカンなどの穀物β−グルカン；及び、マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、キシログルカンを含む。２相システムを形成する多糖類ポリマーの他の群は、水中で熱分離する水溶性両極性ポリマーを含む。ポリマーの２成分水溶液が、その曇点温度(CPT)を超えて加熱されると、溶液層は２つの巨視的相に分離する。一方の相は、通常は下相であるが、重いポリマー豊富なものであり、他方の相は典型的にはポリマーを殆ど含まない。熱分離性を示すことが知られている多糖類ベースのポリマーは、メチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、プロピルヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロールを含む。しかし、実質的に全ての水溶性β−１，４−結合セロ多糖類は、熱分離性を示すと思われる。 Jo hansson，et al.，(1993)．Macromolecules，26，4478; Harris，et al.，(1991 ).Bioseparations，2，237; Alfred P.A.，et al.，(1992)．Bioseparations，2 ,363; 及びAlfred P.A.，et al.，(1994)．J.Chromatog.，659，289。熱分離する他の水溶性ポリマーは、プロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコール、及びエチレンオキシドとプロピレノキシドの直鎖状ランダムコポリマー（商品名UCON及びPluronic）を含む。固相回収システムでは、種々の多糖類基質が興味深い。これらは、セルロース、例えば酢酸セルロース等のβ−１，４−グルコシド結合によって結合したＤ− グルコピラノース単位からなる多糖類化合物；繰り返し骨格単位がβ−１，４− Ｄ−キシロピラノースであるキシラン；β−１，４−結合したＮ−アセチル、２ーアミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース単位からなる点でセルロースに類似したキチンを含む。上に挙げた様な多糖類に結合できる酵素は、本発明において、それらの基質に結合できるアミノ酸配列の源として興味深い。下記の表６は、可溶性グルカン（α、β及び／または混合結合）に親和性を有する全ての結合ドメインを含む１またはそれ以上の可溶性／不溶性多糖類に結合する結合ドメインを列挙する。C.fimiのエンドグルカナーゼCenAからのＮ１セルロース結合ドメインは、可溶性セロ多糖類に結合することが知られている唯一のタンパク質であり、任意の可溶性多糖類に結合することが知られているタンパク質の小さな組(small set)の一つである。また、表２から５に挙げたのは、推定 β−１，３−グルカン結合ドメイン（表２）；連鎖球菌(streptcoccal)グルカン結合配列(repeat)（Cplスーパーファミリー）を含むタンパク質（表３）；キチン結合ドメインを持つ酵素（表４）；及びデンプン結合ドメイン（表５）を含有するタンパク質の例である。興味深い結合特性及び特異性を持つ新たなＰＢＰは、種々の異なる実験方法および方法論を用いて多様な手法で同定及びスクリーニングすることができる。これらは、ＮＭＲスペクトル（Zhu，et a;.，Biochemistry(1995)34:，Gehring,et a al.，Biochemistry(1991)30: 5524-5531）、ＵＶ差分スペクトル（Belshaw，e t al.，Eur．J．Biochem．(1993)211: 717-724）、蛍光（滴定）スペクトル（Mi ller，et al.，J．Biol．Chem．(1983)258: 13665-13672）、ＵＶまたは蛍光ストップド・フロー分析（De Boeck，et al.，Eur．J．Biochem．(1985)149: 141- 415）等のスペクトル（滴定）方法、親和性電気泳動（Mimura，et al.，J．chro matography(1992)597: 345-350）または固定化モノまたはオリゴ糖類上の親和性クロマトグラフィ等の親和性方法、濁度または比濁分析（Knibbs，et al.，J．B iol．Chem．(1993)14940-14947）を含む析出又は凝集分析、競合阻害アッセイ（定量的IC50の決定を含むものまたは含まないもの）、及び、示差または等温滴定熱分析（Sigurskjoid，et al.，J．Biol．Chem．(1992)267: 8371-8376; Sigurs kjoid，et al.，Eur．J．Biol．(1994)225: 133-141）、熱的ＣＤまたは蛍光スペクトルを用いたオリゴ糖の存在下または不存在下での（溶融）相対的タンパク質安定性アッセイ等の種々の物理的又は物理化学的方法を含む。定性的及び（結合または解離定数、IC50値、熱力学的パラメータ等の定量的）分析ともに、これらの方法で実施することができる。可溶性オリゴ糖ポリマーに高い親和性及び低い親和性を有する両方のＰＢＰの同定が興味の対象であり、例えば、ＰＢＰ含有化合物を豊富に含むオリゴ糖ポリマー相の分配及び／または単離に続くオリゴ糖ポリマーの除去の容易性を向上させるといった特別な応用によっては、高い親和性よりも低い親和性の方が有用である。ＰＢＰは、残りの酵素からＰＢＰをはさみ切ることによる酵素の単離及び精製に従って得られる。相分離システムでの使用のために、ＰＢＰは可溶性相形成オリゴ糖への結合についてスクリーニングされる。ＮＭＲ単独、ＮＭＡ／熱分析、親和性電気泳動単独、親和性電気泳動／競合アッセイ、及び結合等温線を含む多くの方法の任意のものがスクリーニングのために使用できる。等温滴定マイクロ熱分析(ITC)を用いた結合平衡測定が好ましい。結合平衡測定における等温滴定マイクロ熱分析(ITC)の利点は、結合等温線が反応熱の実験によって決定されるので、結合定数に加えてエンタルピー（及びエントロピー）が直接見積もれるという事実から導かれる。即ち、１回のマイクロ熱滴定により、結合等温線に従って結合エネルギーの完全な特徴付けが得られる（Haynes，et al.，J．Colloid I nterface Csi.，(1994)169: 313; Colloids & Surfaces，(1994)2: 517）。一般的に、相分離のために、可溶性オリゴ糖に対するＰＢＰの結合についてのＫａは、少なくとも弱い抗体−抗原相互作用の範囲、例えば、³１０³Ｍ、好ましくは１０４Ｍ、最も好ましくは１０⁶Ｍである。ＰＢＰのオリゴ糖に対する結合が発熱または吸熱であるとき、低温において、結合は各々増加または減少し、分配過程の温度調節手段を提供する。オリゴ糖ポリマー−ＰＢＰ対の決定に加えて、相分離手段である、オリゴ糖ポリマーとともに用いられる相分離システムの第２の成分の評価をする必要もある。相分離手段は、他のポリマー、または、十分な量の相誘導剤、一般的には塩、通常は硫酸塩又はクエン酸塩等の強電解質、または、物理変化、例えばセロ糖類ポリマーが熱分離性を持つ場合の温度などである。古典的なデキストラン／ＰＥＧシステムに匹敵する特性を持つがコストの低い分離システムを形成できるポリマー対の例は、デキストラン／ＰＥＧと同様に炭化水素とポリ（オキシ-エーテル）との非相容性に基づくものを含めて多数ある（Skuse，et al.，Enzyme Micr ob．Technol．(1992)14: 785参照）。これらの例は、ヒドロキシプロピルデンプン（Tjerneld，et al.，Enzyme Microb．Technol．(1986)8: 417）、マルトデキストリン（Szlag，et al.，ACS Symposium Series(1990)419: 38-52）、ヒドロキシプロピルセルロース（Skuse，et al.，Enzyme Nicrob．Technol．(1992)14: 785）、及びカルボキシメチルセルロース()を含み、それらは全てＰＥＧと分離システムを形成するのに良好に用いられている。システム、及び／または、安定した２相分離システムが形成される全ポリマー濃度、または、ポリマー及び他の相誘導剤濃度を決定するためのHaynes等の方法（Fluid Phase Equilibria(1989)53: 463）を用いた誘導手段を改善するため、選択された第１及び第２の成分の組み合わせの相平衡データが得られる。一般に、ＰＢＰ接合体は約10mMから約1Mのイオン強度緩衝媒質中、中性ｐＨで、相形成オリゴ糖に結合する。結合は、相分離システムの成分によって、４℃から少なくとも７０℃の温度で行われる。結合は、実質的に即座に起こり、温度は臨界的ではない。一度ＰＢＰ接合体が相形成オリゴ糖に結合すると、それはその相内に分配される。相分離システムの成分及び特別な応用のための最適な多党類結合ドメインが同定されると、ＰＢＰは、ホスト細胞に、適切な多糖類結合部位をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構造体を形質転換することによって調製される。「多糖類結合部位」なる語は、少なくともポリサッカリダーゼまたは多糖類結合タンパク質の多糖類結合領域の機能性部分を含むアミノ酸配列を意味する。「機能性部分」は、対象とするオリゴ糖ポリマーのに結合するアミノ酸配列を意味する。好ましくは、対象とするタンパク質をコードするＤＮＡがＰＢＰＤＮＡ配列に結合(ligate )する。式（１）の組成物をコードする融合遺伝子、またはＰＢＰＤＮＡ配列のみが、真核細胞または原核細胞のホスト細胞において発現される。ＰＢＰのみが調製された場合、必要ならば、発現され単離された多糖類結合ペプチドは、対象とする化合物、即ち、タンパク質又は化学的部位と接合できる。セルラーゼ遺伝子などのポリサッカリダーゼ遺伝子及び多糖類結合タンパク質のための遺伝子の単離に用いられた技術は、合成、ゲノムＤＮＡからの単離、c ＤＮＡからの調製、または擦れ等の組み合わせを含めてこの分野で知られている（USPN 5,137,819、5,202,247及び5,340,731参照）。可溶性オリゴ糖に結合する幾つかのポリペプチド結合ドメインのための配列は知られている（図１参照）。種々のポリサッカリダーゼ及び多糖類結合タンパク質をコードするＤＮＡは知られている。遺伝子を操作する多くの技術が良く知られており、制限、消化、切除、結合、in vitro突然変異、プライマー修正、リンカー及びアダプターの採用などを含む（Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold S pring Harbor LAboratory，Cold Spring Harbor，Nwe York，1989）。一般的に、所望のＤＮＡを得るための方法は、所望の特性を有するポリサッカリダーゼまたは多糖類結合タンパク質を発現する生物からの遺伝子ライブラリの作製を含む。ドナー微生物のゲノムは、単離され、BamHI等の適当な制限酵素で切断される。得られた断片は、対応する制限酵素で予め切断されたベクター分枝に結合される。適当なベクターの例は、pBR322であり、それは制限エンドヌクレアーゼBamHIで切断できる。ポリサッカリダーゼのアミノ酸配列も、ｃＤＮＡまたはポリサッカリダーゼ遺伝子またはポリペプチド結合タンパク質遺伝子に対するドナー細胞として対象細胞からのｍＲＮＡまたはＤＮＡから調製された遺伝子ライブラリをスクリーニングするためのプローブの設計に使用できる。ポリサッカリダーゼｃＤＮＡ又は結合タンパク質ｃＤＮＡ又はそれらの断片を用いることにより、他の微生物に見られる構造的に関連した遺伝子が容易にクローニングできる。特に考慮されるのは、ポリサッカリダーゼの触媒及び結合ドメインが分離している生物から得られる遺伝子のヌクレオチド配列に基づくオリゴ糖ブローブを用いた、ポリサッカリダーゼ活性を発現する生物からの遺伝子の単離であるが、他の多糖類結合タンパク質も使用できる（例えば、Shoseyev，et al.，Proc．Nat'l．Acad．Sci.．(USA) (1992)89: 3483-3487参照）。ポリサッカリダーゼまたは多糖類結合タンパク質の結合ドメインについての共通配列を用いて開発したプローブは特に興味深い。今日までに特性化されている C.fimiからのβ-１，４-グリカナーゼは、エンドヌクレアーゼＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ（各々、CenA、CenB、CenC及びCenD）、エキソセロビオヒドロラーゼＡ及びＢ（各々、CbhA及びCbhB）、及びキシラナーゼＡ及びＤ（各々、Cex及びXylD）である（Wong，et al.，(1986)Gene，44: 315; Meinke，et al.，(1991)J．Bacterio l.，173: 308; Coutinho，et al.，(1991)Mol．Microbiol．5: 1221; Meinke，e t al.，(1993)bactriol.，175: 1910; Meinke，et al.，(1994)Mol．Microbiol. ，12: 413; Shen，et al.，Biochem．J．in press; O'Neill，et al.，(1986)Ge ne，44: 325; 及びMillward-Sadler，et al.，(1994)Mol．Microbiol.， 11: 375参照）。全ては種々の複雑度を有するモジュラータンパク質（図１）であるが、２つの特徴が共通している：独立して機能することのできる触媒ドメイン(CD)及びセルロース結合ドメイン(CBD)である（MillWard-Sadler，et al.，(1 994)MOl．Microbiol.，11: 375; Gilkes，et al.，(1988)J．Biol．Chem.，263: 10401; Meinke，et al.，(1991)J.Bacteriol.，173: 7126; 及びCoutinho，et al.，(1992)Mol．Microbiol.，6: 1242参照）。４つの酵素、CenB、CenD、CbhA 及びCbhB、フィブロネクチン・タイプＩＩＩ(Fn3)配列(repeat)が、ＣＤのＮ末端をＣ末端ＣＢＤから分離している。酵素のＣＤはグリコシドヒドロラーゼの６つのファミリーから来る（Henrisaat(1991)Biochem．J.，280: 309; 及びHenris aat，et al.，(1993)Biochem．J.，293: 781参照）；全ての酵素は、ファミリーＩＩまたはＣＢＤからのＮ−又はＣ−末端を有する（Tomme，et al.，Adv．Micr ob．Physiol.，in press参照）；CenCは、そのＮ−末端にファミリーＩＶからのタンデムＣＢＤを有する；CenB及びXylDは、各々、ファミリーＩＩＩ及びＩＩからの第２の内部ＣＢＤを有する。Cex及びXylDは明らかにキシラナーゼであるが、XylDではなくCeXはセルロースに低活性しか持たない。にもかかわらず、幾つかの他の細菌キシラナーゼと同様に（Gilbert，et al.，(1993)J．Gen．Microbi ol.，139: 187参照）、それらはＣＢＤを有する。類似のシステムは、関連する細菌から得られる（Wilson(1992)Crit．Rev．Biotechnol.，12: 45; 及びHazlew ood，et al.，(1992)J．Appl．Bacteriol.，72: 244参照）。C.fimiは、おそらく他のβ-１，４-グリカナーゼを生成する。無関係な細菌である、例えば、Clos tridium thermocellumは、２０又はそれ以上のβ-１，４-グリカナーゼを生成する（Beguin，et al.，(1992)FEMS Microbiol．Lett.，100: 523）。結合ドメインの共通配列の例は、図１に示したセルロース結合ドメインの共通配列であり、エンドグルカナーゼＣＮ１結合ドメインによって例示される。プローブは、全配列よりかなり短くできるが、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１４のヌクレオチド長でなければならない。より長いオリゴ糖類も有用であり遺伝子の全長まで、好ましくは５００未満、より好ましくは２５０末満のヌクレオチド長である。ＲＮＡ又はＤＮＡプローブが使用できる。一般に、結合ドメインは、結合領域と少なくとも４０％の相同性を示し()、可溶性β-１，４-グルカンと³１０³ＭのＫａで結合するようにヌクレオチドでコードされる。アミノ酸比較の分析は、PC/Gene（IntelliGenetics，Inc.）のプログラムを用いて実施できる。多重配列アライメント及び系統樹の作成にPCLUSTALも使用できる。使用において、プローブは検出可能な方法（例えば、³²Ｐ、³Ｈ、ビオチンまたはアビディン(avidin)）でラベルされ、遺伝子が探索される生物からの一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡとともにインキュベートされる。ハイブリダイゼーションは、一本鎖または二本鎖（ハイブリダイズした）ＤＮＡ（又はＤＮＡ／ＲＮＡ）が（典型的にはニトロセルロース紙を用いて）分離された後にラベルによって検出される。オリゴヌクレオチドで好適に用いられるハイブリダイゼーション技術は、当業者には周知である。プローブは、通常は特定を容易にするために検出可能なラベルと共に用いられるが、非ラベルのオリゴヌクレオチドも、ラベル化プローブの前駆体としても、二本鎖ＤＮＡ（またはＤＮＡ／ＲＮＡ）の直接検出のために供される方法で用いるのにも有用である。従って、「オリゴヌクレオチドプローブ」なる語は、ラベル化及び非ラベル化形態の両方を意味する。ポリサッカリダーゼまたは多糖類結合タンパク質のＰＢＰを単離するために、幾つかの遺伝子的方法が用いられる。一つの方法は、遺伝子の一部を除去し、次いでフレーム内に残った遺伝子−ベクター断片を融合して切り詰めたタンパク質をコードする変異遺伝子を得るために制限酵素を用いる。他の方法は、ＤＮＡの５’及び３’末端から外的に、又は、遺伝子内の制限されたキャップから内的にヌクレオチドを全体的に削除するために、Bal31等のエキソヌクレアーゼの使用を含む。遺伝子欠失方法は、短縮されたタンパク質分子をコードする変異遺伝子をもたらし、それは基質又は多糖類結合能力を評価される。結合活性の評価に適した基質は、上記の表２に挙げたものを含む。多糖類結合領域をコードするヌクレオチド配列が同定されると、ｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡの何れかとして種々の方法で操作されて、発現生成物が上記式（１）で表されるような構造を有する組成物が調製される。ヌクレオチド配列は、対象とするポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と融合させてもよい。成分ポリペプチドの三次元構造が保持されるのが特に望ましい。断片の源及び所望のポリペプチドの長さによって、制限は、キメラポリペプチドを構成するのに用いられる合成遺伝子に設計してもよい。可能ならば、制限部位は、ポリペプチドのアミノ酸配列を不変のまま保持する。しかし、新たな制限部位が、タンパク質の活性は変化させずにアミノ酸配列を変化させる場合もある。発現カセットの構成の間、ＤＮＡの種々の断片が通常は適当なクローニングベクターでクローニングされ、ＤＮＡの増幅、ＤＮＡの修飾、又は配列、リンカー等の結合又は除去による操作を可能にする。通常は、ベクターは細菌中で少なくとも比較的高いコピー数で複製が可能である。グラム陰性菌、特に大腸菌(E.col i)でクローニングするための多くのベクターが既に入手可能であり、pBR322、pT Z、pUC等のようなベクターを含む。クローニングベクターは、ホスト細菌中で効率的な複製システム機能を持つことを特徴とする。クローニングベクターは、少なくとも１つの独特な制限部位、通常は複数の独特な制限部位を持ち、多数の制限部位を有していてもよい。さらに、クローニングベクターは、形質転換体(transformant)の選択のための１またはそれ以上のマーカーを有するであろう。これらのマーカーは、通常は、抗生物質、重金属、毒ァ等の細胞毒剤に対する抵抗性、栄養要求性ホストの相補性、またはファージに対する免疫性を提供する。ベクター及びカセットの適当な制限により、好ましくは末端の修飾により、張出しにおけるチューイング・バック(chewing back)または充填により、平滑末端を提供するために、リンカーの添加により、テイリング (tailing)により、ベクターの発現カセット又はその成分への結合及び接合のために相補的末端が提供されうる。カセットの作製におけるＤＮＡの各操作の後、プラスミドはクローニングされて単離され、必要ならば、特別なカセット成分が分析されて正しい配列が得られているかが確認される。操作の性質によって、所望の配列がプラスミドから摘出されて他のベクターに導入されるか、または、必要ならば、プラスミドは制限され発現カセット成分が操作される。幾つかの例では、ベクターが異なる複製システムを要求する異なるホストで複製できるシャトルベクターが用いられる。これは、２つのホストで機能的なさらなるマーカーを必要としてもしなくてもよい。そのようなマーカーが必要な場合、これらはベクター中に導入可能で、プラスミド含有カセットでは、必要ならば、２つの複製システム及びマーカーが一方のホストから他方に輸送されてもよい。選択のために、任意の有用なマーカーが使用できる。望ましくは、ネオマイシンまたはテトラサイクリン耐性が興味深い。しかし、選択用マーカーは極めて便利であるが、形質転換された細胞のスクリーニングのための他の方法が当業者には知られており、例えば、形質転換された細胞は、それらが作製する特異的な生成物によってスクリーニングされ；所望の生成物は免疫学的又は酵素的方法によって決定してもよい。次いで、融合タンパク質をコードするＤＮＡは、発現を供する種々の方法によって操作できる。細菌についての、例示的な転写調節領域またはプロモータは、ラムダ左及び右プロモータ、trp及びlacプロモータ、Tacプロモータ等を含む。転写調節領域は、例えば、成長媒質中の滋養剤または発現生成物の存在又は不存在、温度などで、融合遺伝子の発現時間を変化させることのできる調節配列をさらに含んでもよい。例えば、融合遺伝子の発現は、バクテリオファージラムダＰＬプロモータ、バクテリオファージラムダＯＬオペレータ及び温度感受性リブレッサを用いて温度によって調節される。プロモータの調節は、リブレッサとオペレータの相互作用を通して達成される。好ましいプロモータは、強いグルコース -抑制非感受性Tacプロモータである。高レベル発現ベクターの例は、Graham等， (1995)Gene 158: 51-54に記載されている。発現カセットは、適当な細胞性ホストにおけるエピソーム維持のための複製システム内に含まれていてもよく、複製システム無しで提供されてもよく、ホストゲノムと一体化できる。ＤＮＡは、形質転換、カルシウムリン酸析出されたＤＮＡの使用、細胞をウイルスに接触させることによるトランスフェクト、ＤＮＡの微小注入等の周知の方法でホストに導入できる。融合タンパク質ＤＮＡが適当なホストに導入されると、ホストは成長して融合タンパク質を発現できる。微生物ホストを用いてもよく、例えば、大腸菌等の細菌、Saccaromyces，特にS．Cerevisiae，Streptomyces，Bacillus Pichiapastor is，又はBHK及びCHO等の哺乳類細胞といった真核細胞を含む。組み換え生成物は、野生タイプ又は他のグリコシレーションを有するグリコシル化でも非グリコシル化でもよい。グリコシル化の量は、部分的に、特別なペプチド、及び、それが生成される生物に依る。即ち、大腸菌細胞における生成物の発現は、非グリコシル化生成物を生じ、昆虫細胞での生成物の発現は一般的に、哺乳類細胞における生成物の発現よりグリコシル化が少ない。酵母での発現は、高度なグリコシル化をもたらす。生成物がホスト細胞中に保持された誘導タンパク質の単離のために、細胞が収穫され、溶解され、生成物が分離され、相分離システムを用いて単離及び／または精製される。幾つかの例では、構造遺伝子のリーディングフレームより上流及びその中に、融合タンパク質の分泌を促すシグナル配列（分泌リーダ）を供するのが望ましい。例示的な分泌リーダは、ペにシリナーゼ、イムノグロブリン、Ｔ −細胞レセプター、外膜タンパク質などの分泌リーダを含む。正しいリーディングフレームにおける融合により、融合タンパク質が媒質中に分泌される。しかし、大腸菌などの細菌発現系では、かなりの分画が細胞外媒質に漏出する（Ong，e t al.，Biotech．Bioeng．(1993)42: 401）。生成物が分泌される場合、滋養媒質及び相分離システムを用いて単離された生成物を回収することができる。活性タンパク質を精製するために、タンパク質を再び折り重ねることを可能にできる。相分離システムは、生物学的流体、発酵液、細胞溶解液、または精製及び相分離を誘導すべき生物学的化合物の他の源と組み合わせることができる。ＰＢＰを含む成分のオリゴ糖相への分配に従って水性混合物を分離及び／または精製するために、相は分離され、ＰＢＰを含む組成物は種々の方法のうち任意の方法でポリマー相から分離される。これらは、分離したオリゴ糖相の、異なる相誘導ポリマーまたはＰＢＰを含む組成物を抽出する塩との接触；例えば、酸または塩基、尿素、エタノール、DMSOなどの分離剤をオリゴ糖相に添加することによる化学的及び物理的条件の変化；結合反応が発熱または吸熱であるときは、結合親和性が低下するのに十分な量の温度変化；並びに、ＰＤＰ-オリゴ糖ポリマーからの対象化合物を持つことを含む。切断が用いられる場合、対象とするタンパク質又は化学的部位は、多糖類結合領域と対象タンパク質又は化学的部位との間に存在する配列に特異的はプロテアーゼを用いることにより多糖類結合領域から容易に切断され、ＰＢＰはオリゴ糖ポリマーに結合したまま残される。好ましくは、このプロテアーゼは、その残部が対象とするポリペプチドのＰＢＰからの切断を誘発するような形態で提供される。一例として、プロテアーゼが、対象ポリペプチドに結合した第１の多糖類結合部位とは異なった基質特異性を持ち及び／または異なる結合特性を持つ第２の多糖類結合部位に結合している切断酵素複合体としての切断プロテアーゼが調製できる（Assuline，et al.，(1993)Protein Engineering，6: 787-792; Assouli ne，et al.）。即ち、対象とする組み換えタンパク質からの結合ドメインの切断は溶液内で行うことができ、次いで、切断酵素複合体は、第１の多糖類結合部位が結合しない多糖類基質に結合させることによって除去できる。あるいは、切断酵素複合体は、第１の多糖類結合部位が結合しない多糖類マトリクス上に固定化することができる（Assouline，et al.，(1993)同上; Assouline，et al.，（＿）同上）。対象とする組み換えタンパク質又は化学的部位は、ポリマーに結合したままの汚染ＰＢＰを含むことなく、オリゴ糖ポリマーから分離される。また、ＰＢＰ複合体のＰＢＰ部分を完全に減成するために非特異的プロテアーゼを用いることもでき、即ち、例えば、約50mg/mlのプロテアーゼＫで、３７℃において２０分間処理することにより、オリゴ糖ポリマーから分離することができる。Di r等，(1991)Bio/Technology，9: 1096-1099。幾つかの例では、融合タンパク質自身が対象であってもよく、従って、融合タンパク質の成分を分離するのではなく、オリゴ当ポリマーから取り外されるのが融合タンパク質であってもよい。融合タンパク質をオリゴ糖ポリマーから脱離させるために、低イオン強度の緩衝液又は水、あるいはアルカリｐＨの緩衝液またはカオトロピック塩が必要とされる。脱離のための温度は臨界的ではないが、一般的には１０℃−４０℃の範囲であり、通常は室温、即ち約２０℃である。結合した融合タンパク質は、水で繰り返し洗浄するか、連続水流で希釈する。一般的に、pH9.5の炭酸塩バッファまたは6MのグアニジンＨＣｌが、この脱離過程に使用される。希水酸化ナトリウム（約0.1M）が、好ましい処理である場合もある。接着性を変えて水で脱離可能、又は必要なら不可能にするために、ＰＢＰの性質を変化させてもよい。マトリクスへの脱離媒質の適用は、オリゴ糖ポリマーからの融合タンパク質の放出を起こす。基質からの放出に続くＰＢＰ接合体の単離のために、種々の技術が使用できる。例えば、上記のように、多糖類表面を、ＰＢＰ接合体を含まない脱離溶液で洗浄することができる。ＰＢＰ接合体は、例えば、ｐＨのイオン強度を変化させて、ＰＢＰ接合体をイオン交換媒体または第２の多糖類マトリクスに再吸着させることにより脱離溶液から分離できる。親和性相分離システムは、多くの用途がある。これらは、混合物中の成分の濃縮、混合物中の成分の精製を含み、精製は２倍、一般的には２０倍以上であり、８０から９０％の精製も含む。精製倍数(fold purification)は、汚染物の除去に対する特異的活性ｋ等の増加で測定される。幾つかの応用では、この方法は、細胞分離及び／または特別な細胞タイプの豊富化についても使用できる。例えば、幹細胞の個体数は、細胞を細胞表面の炭化水素残基に結合するＰＢＰのみ、または、特異的な結合対、例えばレセプターリガンド、例えばペプチドホルモン又は他のホルモンであって、第２の成員、即ちレセプターが細胞表面に存在する結合対の第１の成員が融合するＰＢＰに接触させることによって豊富化できる。使用できる他のリガンドは、抗−ＣＤ３４等の抗体、及びＩＬ−２等のサイトカインを含む。親和性相分配に続いて、細胞は、例えばトリプシンを用いて、分離されたオリゴ糖ポリマー相から放出される。親和性相分離システムの剪断力は、他の細胞分離方法よりかなり小さく、分離された細胞の損傷を少なくできる。この技術の他の用途は、抽出の生体変換、即ち、特に生成物がフィードバックして酵素反応の阻害剤となる酵素的過程における反応生成物の分配方法を含む。そのようなシステムでは、酵素は酵素活性が保持されるようにＰＢＰに結合している。酵素の基質は、自然にオリゴ糖ポリマー相に分配されるものまたはＰＢＰに結合するものであり、生成物は、生成物が基質より疎水性であるときのように、オリゴ糖ポリマー相に保持されず第２の成分に分配されるものである。このシステムの第２の成分は、次いで除去され生成物が回収される。抽出生体変換システムで用いられる酵素反応の例は、トリグリコシレーション、例えばβ-１，４- 結合したオリゴ糖甘味料のためのもの；混合エステル交換、例えば低級脂肪酸の高級脂肪酸への変換のためのもの、及び、グリセロール生成、ペプチド合成のためのものを含む。ＰＢＰを保持する主体組成物は、ＰＢＰの基質への吸着が強力かつ特異的であるので、多糖類支持体上の対象化合物の固定化手段として用いられる。固定化されたシステムは、例えば、診断アッセイ用固体状試薬、酵素、抗体断片、ペプチドホルモンなどを含む試薬の調製；クリアランス比率の減少に結びついた薬物であって、セルロースが例えばカルボキシメチルセルロース等の可溶物、又は、微結晶セルロース（アビセル）等の固体支持体のいずれかであり、薬物がインターロイキン２等のポリペプチドであるもの；例えば、カルボキシメチルセルロースに結合し、同じセルロース支持体に結合する、例えば輸送すべき薬物の免疫特異性を向上させるアジュバントとともに用いられる薬物輸送（ドラッグ・デリバリー）；染料結合、例えば、塗料または染料の多糖類、例えばセルロース表面への結合；例えば、紙及び布（コットン）への印刷；例えば、木片の処理のためのリグナーゼ等の酵素の標的化、例えば木材パルプの漂白のための、ポルフィリンの標的化に対して、加水分解または相乗効果を与えること；例えばBt毒素や他の抗微生物剤等の殺虫剤の植物表面への結合などの農業用途；例えば、有機体の根表面への結合などの窒素固定；持続的肥沃剤放出；及び持続的殺菌剤放出における用途が見出された。これらは、海水環境などの高い塩濃度の条件下でも、海水に露出された表面の抗腐食のために使用でき、新鮮な水への移行が融合タンパク質を除去する。この方法で精製できる生物学的物質の例は、インターロイキン２、因子Ｘ、リグニナーゼ、及びＴＰＡ、あるいは、ＰＢＰと融合できる任意の他のペプチド及びタンパク質を含む。他の例は、（真核細胞又は原核細胞または組織培地からの）培養液、生物学的流体、組織抽出物、細菌、真菌、植物、動物、魚、及び家禽を含む細胞溶解液からの抽出物、特に精製されたタンパク質等を含む。一般的に、混合物は、この親和性分離システムを適用する前に、細胞破片を取り除くために浄化される。以下の実施例は例示のために提供され、何ら限定するものではない。実施例略語ｐＮＰＣ＝ｐ-ニトロフェニル-β-D-グルコシド；ＨＰＡ＝ハイド・パウダー・アクスレ(hide powder axure) ｇＣｅｎＡ及びｇＣｅｘ＝ C.fimiからのCenA及びCexのグリコシル化形態；ｎｇＣｅｎＡ及びｎｇＣｅｘ＝組み換え大腸菌からのCenA及びCexの非グリコシル化形態；ＲＰＣ＝逆相クロマトグラフィ；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ＝ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ａ-Ｐｒｏ／Ｔｈｒ＝合成Cex Pro/Thrボックスに対して検出されたラビット抗血清；ＰＭＳＦ＝フェニル−メチルスルホニルフルオリド。生物学的培地寄託以下の寄託を、American Type Culture Collection(ATCC),12301 Park Lawn D rive，Rockville，Maryland 20852に行なった。大腸菌C600におけるプラスミドp cEC-2上でクローニングした遺伝子CenAの誘導体を、1986年4月23日に寄託し、AA TCC寄託番号６７１０１が与えられた。プラスミドpEC-1上でクローニングした遺伝子Cexの誘導体を、1986年5月27日に寄託し、AATCC寄託番号６７１２０が与えられた。大腸菌JM83、pUC12-1.1cexを、1986年4月23日に寄託し、AATCC寄託番号６７１０２が与えられた。pTugA（寄託番号Ｌ２４１９３）、pTugAS（寄託番号Ｌ２４３６７）、C.fimi CenA（寄託番号Ｍ１５８２３）、C.fimi CenC（寄託番号Ｘ５７８５８）の全ヌクレオチド配列は、GenBankに寄託された。材料 KlucelまたはHPCは、Aqualonから供給される。HPCは、セルロース分子から誘導され、セルロース-２-ヒドロキシプロピルエーテルとして知られている。 NatrosolまたはHFCは、Aqualonから供給される。HECは、ヒドロキシエチル側鎖を有する変性セルロースポリマーであり、セルロース-２-ヒドロキシエチルエーテルとして知られている。HECは、白色の非イオン性パウダーである。HECは、次の商品名で市販されている：Alcoramnosan/Liporamnosan(Vevy);Tylose H シリーズ (Hoechst Celanese/Colorants & Surf.)。 Bermocoll EまたはEHECは、Berol Nobel ABから供給される。EHECは、エチルセルロースのエチレングリコールエーテルである。EHECは、Aqualonから、Aqual on EHECなる商品名で市販されてもいる。ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)は、Sigmaから供給される。HPMC は、メチルセルロースのプロピレングリコールＥ−足るであり、メチルヒドロキシプロピルセルロースとしても知られている。HPMCは、次の商品名で市販されてもいる:Banecel/Culminal HPMC(Aqualon); Viscontran MHPC(Henkel)。デキストランは、Pharmacia Biotechから供給される。 Pluronicは、BASFから供給される。Pluronicは、エチレンオキシドとプロピレンオキシドのブロックコポリマーである。Pluronicの固体形態（F-シリーズ）及びペースト形態（P-シリーズ）の両方が用いられる。実施例１ＣＢＤ_N1の単離プラスミドの保持及び組み換えタンパク質の生成のためのホスト細胞として、大腸菌JM101（SupE，thi-1，Δ(tac-proAB)，［F'traD36,proAB,tacIqZΔM15］( Yanish-Perron，et al.，Gene(1985)33: 103-119）を用いた。培地を、液体トリプトン−酵母抽出物−リン酸塩媒質(TYP)中またはルリア液(Luria broth)（カナマイシン(100mg/ml)を添加したLB寒天）上で、３０℃で成長させた。 pTguKN1（図５参照）を宿した大腸菌JM101株の終夜培地を、1ml当たり100mgのカナマイシンを添加したTYPで５００倍に希釈し、2.0-3.0の最適密度になるまで３０℃で成長させた。PBD_N1生成は、イソプロピル-１-チオ-β-Ｄ-ガラクトピラノシド(IPTG)を、最終濃度が0.1mMとなるまで添加することによって誘発し、細菌は３０℃で１８時間さらにインキュベートした。培地上清を、13000xgで１０分間遠心分離（４℃）して浄化し、細胞を除去した。PBD_N1の精製に、以下のようにセルロース上の親和性クロマトグラフィを用いた。浄化した培地上清を、微結晶セルロース(Avicel)(50mgL^-1)で、随時攪拌してPBD_N1を結合させながらインキュベート（４℃）した。セルロース懸濁液を、ブフナー漏斗上でガラスフィルタ(W hatman GF/A)を通して濾過し、pH7.0の50mMリン酸カリウム中の1MのＮＡＣｌ溶液で簡単に洗浄した。結合したPBD_N1は、水で脱離し、限外濾過で濃縮した。部分的に精製されたPBD_N1は、次いで、pH6.0の20mMリン酸カリウムバッファで平衡されたアニオン交換かラム(MonoQ)に入れ、1ml/分の速度で作動させた。タンパク質はカラムに緊密に結合し、塩勾配（0-1N NaCl，pH6.0）で除去した（図７参照）。PBD_N1は、300mMの塩で回収された（図７、ピーク１）。汚染タンパク質は、より緊密に結合し、より高い塩濃度で除去された（図７、ピーク２）。実施例２親和性電気泳動による、CBD_N1及びCBD_N1N2に結合した HEC、大麦β-グルカン及びキシランの分析 HEC及び大麦β-グルカン等のDP³15を持つ可溶性多糖類へのCBD_N1及びCBD_N1N2 の結合を特定及び評価するために、親和性電気泳動（Miura，et al.，(1992)J． Chromatography 597: 345-350）を用いた。元の連続円板電気泳動方法を不連続方法に換えた。BioRad電気泳動システムの同じプレートに、一方は多糖類（0.1% w/v）、他方はリガンドを含まない２つの無垢のゲルを順次調製した。これにより、可溶性多糖類の有または無における分析が、同条件で行われること、及び、観察される効果（結合グルカンの存在における阻害）が異常な電気泳動的移動の結果ではないことが確保される。各ゲルの負の対照としてBSAを用いた。タンパク質（各5mg）を、ゲル上に載せた。電気泳動は、pH8.2-8.8で２から３時間、４ ℃において、天然条件下で行った。CBD_N1及びCBD_N1N2は、HEC及び大麦β-グルカンと強く相互作用し、その結果、オリゴ糖類を含むゲル（＋）におけるそれらの移動は、β-グルカンの存在しないゲルでの移動に比較して、顕著に阻害された（図９Ａ及び９Ｂ参照）。CBD_N1及びCBD_N1N2は、キシランへの親和性は示さず、この繰り管の存在するゲルにおいて、存在しないゲルでの移動に比較して阻害された移動は観察されなかった（図９Ｃ参照）。Ｎ１及びＮ１Ｎ２は、各々、CBD_N ₁ 及びCBD_N1N2を表す。実施例３ CBD_N1及びCBD_N1N2−融合タンパク質に関するオリゴ糖結合定数の等温滴定マイクロ熱分析測定親和性分離システムに好適なリガンドの組を特定することを目的として、広範な水溶性オリゴ糖に対するCBD_N1の結合熱力学を測定するのに、マイクロ熱分析( microcalorimetry)を用いた。データを下記の表７に示す。図１５は、３５℃でｐＨ７における、50mMのPBS中のヒドロキシエチルセルロース(HEC)に結合するCB D_N1ついて、Calorimetry Sciences Corp．のmodel 4200 ITCを用いて測定した可逆的結合等温線データを示す。CBD_N1は、HECに強く結合し、弱い抗原−抗体相互作用の範囲の平衡結合定数を持つ。CPD_N1に結合する大麦β-グルカンは、これらの条件で更に強い（Ka＝85,500M^-1）。両方のオリゴ糖について、CPD_N1結合は、親和性分離システムに現在使用されている殆ど全てのＰＥＧベースの親和性リガンド（例えば、Chibacron blue-PEG，Procion red-PEG，dinitrophenyl-PEG，二酢酸-PEGよりさらに緊密である。これらの相対的に高い結合親和性は、単一のオリゴ糖鎖が多数のCPD_N1融合タンパク質に結合する能力と組み合わされて、この親和性分離システムにおいて容量(capacity)及び選択性の両方が高くなることを示唆している。Ｎ１結合の熱力学の要旨を下記の表８に示す。CPDN1のHEC及びβ -グルカンへの結合は共に強い発熱であり、結合が低温で増加すること、及び、温度低下が分配過程に温度上昇が溶離過程に使用できることを示している。実施例４ HEC及びPluronic P105の混合物の相平衡分析３５℃でｐＨ７における50mMのPBS中のHEC及びPluronic P105（ポリ（エチレングリコール）-ポリ（プロピレングリコール）コポリマー）の混合物について、Heynes等（Fluid Phase Equibria，(1989)53: 463）の方法を用いて相平衡データを得た。図１６に示すように、約3%(wt/wt)のPluronic P105及び2%のHECを超える任意の全ポリマー濃度において、安定な２相分離システムが形成され、かなり大きな範囲の２相組成物及び親和性分配に有用な平衡連結線長を与える。実施例５オリゴ糖ポリマーからのCBDN1の好適な溶離条件の等温滴定マイクロ熱分析測定温度、塩濃度、及び、エチレングリコールまたは尿素などの共溶媒のタイプ及び濃度の関数として平衡解離定数を測定することによる、PBP_N1−炭化水素複合体の水素結合構造を分解させるために設計される好適な溶離条件を決定するために、ITCも用いられた。実施例６ CenC CBD遺伝子断片とC.fimiエンドヌクレアーゼＡ(CenA)遺伝子断片との融合体を含む発現ベクターの構築及び融合タンパク質の特性化ベクターの構築プラスミドpTZ-JC2（図１０Ａ参照）は、Smal及びHindIIIで完全に消化された。3.9kbpの断片が回収された。プラスミドpUC18-1.6 CenA_PT（図１０Ｂ参照）は、HpaI及びHindIIIで完全に消化されて1.1kbpの断片が回収された。これらの3 .9kbp及び1.1kbpの断片は、次いで、結合されて、pTZ-JC13（図１０Ｃ）を与えた。このベクターを、大腸菌JM101の形質転換に用いる。融合タンパク質の酵素的特性化 pTZ-JC13のコードされた発現生成物（融合タンパク質）は、元のCenA及びその単離した触媒ドメインp30との比較における、アビセル、細菌性微結晶セルロース(BMCC)及びリン酸膨潤セルロース(PASC)に対する触媒活性について特性化された。特異的活性は、固定量の基質から固定したアッセイ条件下で精製される可溶性還元糖の量で決定した。還元糖は、熱分析アッセイで測定し、グルコース標準を用いて決定した。ポリペプチドの濃度は、Coonasiie Brilliant Blue G-250（ Gilkes，et al.，(1988)J．Biol．Chem.，263: 10401-10407)の結合によって決定した。融合タンパク質のタンパク質分解に対する感受性の評価融合タンパク質の使用における主な考慮点は、タンパク質分解に対する耐性を含む種々の条件下でのポリペプチドの安定性である。融合タンパク質の、リンカー配列無しにおけるタンパク質分解に対する感受性は、C.fimiプロテアーゼで評価された。C.fimiプロテアーゼによる融合タンパク質の切断は、SDS-PAGEによってモニターされた（図１２参照）。融合タンパク質の安定性は、CenAの安定性と比較された。プロテアーゼ濃度とタンパク質分解条件は、結果を最適化するために変化させた。融合タンパク質の結合特性の評価：示差吸着分析異なるセルロース異形に対するPBD-融合タンパク質の親和性を決定するために、種々のセルロースマトリクスに対する結合が、結合分画のSDS-PAGE分析によって単純に評価される。この分析は、PBD_N1は非結晶セルロース(PASC)に結合するが、結晶セルロース(BMCC)には結合しないことを示した。これらの異なる結合特性は、一方の成分の他方の存在下での選択的除去の可能性を与える。第１段階で BMCCを添加してCenAを除去する。第１段階の後に溶液中に残ったPBD-融合タンパク質は、次いでPASCへの吸着によって除去される（図１２）。セルロース濃度に対する種々のタンパク質成分の濃度は、アッセイの間に広く変化させ、セルロースの不飽和、飽和及び過飽和の影響を評価した。この選択的除去または異なる成分の結合は、融合タンパク質の加工及び精製における使用について重要な意味を持つ。そのようなプロセスは、融合タンパク質からのPBDのタンパク質分解的除去を含む一方、CBD-プロテアーゼを用いて多糖類に結合して対照化合物を遊離させる。プロテアーゼは、次いで、そのセルロース(例えば、BMCC)への結合によって除去され、純粋な化合物が放出される。実施例７オリゴ糖ポリマーベースの親和性相分離を用いたベロ細胞の分離を媒介する二官能性融合タンパク質の生成及び精製細胞株、細胞列、及び成長条件化学物質は、HPLCの分析等級であった。組み換えＤＮＡ実験は、アンシピリン（Behringer Mannheim GmbH，Mannheim，独国）を100mg/mlで添加したLB媒質中における大腸菌JM101中で、３７℃で行った。高レベル発現実験及び大規模タンパク質製造は、アンシピリン（100mg/ml）を添加したTYP媒質（1リットル当たり、16 gトリプシン、16g酵母抽出物、5g NaCl、2.5gK₂HPO₄）中、３７℃で成長させた大腸菌R1360で行った。細菌媒質成分は、Difco Laboratories(Detroit，MI)からのものである。振動フラスコ培地の振動速度は、250rpmに設定した。培地は、0. 15mMのイソプロピル-Ｄ-チオガラクトシド（IPTG，Sigma Chemical Co.，St.Lou is，MO）で誘発した。接着実験に用いたベロ（アフリカミドリザル、kidney-ATC C CCL81）細胞は、Ｔフラスコ中の、10%のNCS（Gibco BRL）を添加したDMEMまたはDMEM/F12媒質（Gibco BRL，Gaitherburg，MD）中で、３７℃かつ5%のＣＯ₂で保持した。組み換えＤＮＡ技術全ての組み換えＤＮＡ操作は既に述べたように行った（Sanbrook（1989）同上）。二本鎖ＤＮＡは、アルカリ溶解法で調製した。ＤＮＡ制限及び修飾酵素は、操作者の推薦に従って用いた。ＤＮＡ断片は、寒天ゲル電気泳動によって分離した。大きなＤＮＡ断片は、GeneClean_TM(Bio101，La Jolla，CA)を用いて単離した。小さなＤＮＡ断片（100bp未満）は、液体窒素法で単離した。凍結した反応性大腸菌が、全ての形質転換に用いられた。オリゴデオキシヌクレオチドは、AB I 380A ＤＮＡ合成機（Applied Biosystems，Foster City，CA）で合成し、C18 カートリッジクロマトグラフィで精製した。オリゴデオキシヌクレオチドのアニーリングは、配列バッファ（40mM Tris-HClまたはpH 7.5，20mM MgCl₂，50mM Na Cl）中、７４℃で１０分間実施し、次いで４℃で除冷した。ＤＮＡは、修飾Ｔ₇ ＤＮＡポリメラーゼジ（Sanger，et al.，Proc.Nat'l Acad．Sci．USA(1977)74: 5463-5467）を用いたデオキシ鎖停止法によって配列した。ポリペプチド分析ポリペプチドは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(S DS-PAGE)によって分解した。ゲルをCoomassie Brilliant Blue R250（BioRad，R ichmond，CA）で染色した；ImageQuant^TMソフトウェアを備えた走査光度計（Com puting Densitometer，Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA）を用いてバンドを定量化した。純粋なCBP^N1/RGD標準を、純粋なCBD/RGD（Scopes．Anal．Biochem ．(1974)59: 277-282）に対して決定された励起係数を用いて280nmにおいて決定した。ウェスタンブロットは、初期抗体としてラビット抗-CenA血清を、第２の抗体としてセイヨウワサビペルオキシダーゼ（Gibco BRL）に接合したヤギ抗-ラビット血清用いて実施した。オリゴ糖結合アッセイこれは、実施例２と同様に実施した。 CBP_N1/RGDの大規模製造及び精製 CBD_N1は、Wierzba，et al.，Biotechnol．and Bioeng．(1995)47: 147-154に記載されているようにして生成したが、CBD_N1に対するコード配列は、R1360/pTZ 18U-CBD/RGD構造体におけるアルロマナーゼfimiエンドヌクレアーゼＡ(CenA)のセルロース結合ドメイン(CBD)をコードする配列に置き換えた。この構造を含む大腸菌をアンピシリン（100mg/ml）及びIPTG（0.15mM）を添加したTYP媒質中、1 2-L発酵器中で、３７℃で成長させた。細胞は、31,000gの遠心分離（Shaples-St okes Division，Pennwalt Corp.，Warminster，PA）により培養媒質から分離した。培養媒質及び細胞分画中のCBD_N1/RGDは、実施例４に示したようなHECとPluc tonic piosの混合物を用いた親和性相分離を用いて別々に精製した。培養媒質は、GF/Cガラスフィルタ（Whatman International，Maidstone，UK）を通して濾過し、細胞残物を除去した。培養媒質を相分離システムに添加した。他の水性２相分離システム（例えば、Joshi，et al.，Bioseparations，(1990)11: 311）の方法論に従うと、分離がCBD_N1融合のHECへの結合によって極めて促進されるという重大な相違がある。図１７は、システムの模式図であり、培養上清又は細胞抽出液からのCBD_N1-融合タンパク質の親和性抽出が、市販のGraesserタイプ接触器（殆どの大規模分離システムで採用されている）または混合器−沈殿器バター(mix er-settler batter）（Haynes，PhD Thesis，University of California at Bar keley(1991)）の何れかで起こる。CBD_N1-融合タンパク質を含む炭化水素豊富な抽出相は、生成物のバック抽出のために第２の混合器−沈殿器バターに輸送される一方、ポリ（オキシ-エーテル）豊富な相は非相溶性塩で剥奪され、次いで親和性接触器にリサイクルされる（Haynes，et al.，AIChE J.，(1991)37: 1401）。結合した標的タンパク質を含む炭化水素豊富な抽出相に、通常は硫酸塩又はクエン酸塩である塩を十分に添加することにより、相分離が生ずる（Walter，et al.，Pa rtitioning in Aqueous Two-Phase Systems，Academic Press(1985)）。リガンド-タンパク質複合体の解離、即ち、生成物回収の簡単な手段を導く相分離には、2M以上の塩濃度が必要である。CBDN1及びHECの間の強い発熱結合は、解離が、温度の温和な上昇または水素結合分解性共溶媒の添加の何れかを通しても達成しうることを示している。過剰な塩は、透析濾過(diafiltration)または他の脱飽和(desatting)方法によって除去できる。懸濁液は、４℃で終夜、温和に攪拌した。溶離液は、1-dDカットオフ膜（Amicon Division，W.R．Grace & Co.，Bever ly，HA）を用いた限外濾過により濃縮して（50nM GdmC1未満まで）dH₂Oと交換した。CBD_N1/RGD溶液（5から12mg/ml）は、濾過滅菌（0.2mm）して−２０℃で保存した。大腸菌細胞は、50mMリン酸カリウムバッファ（pH7.0）で洗浄し、3mMのEDTAを添加した150mLの同バッファ中に再懸濁し、50mLのFrech pressure cell(SLM Ins truments，Urbana，IL)中で破壊した。細胞抽出液にフェニルメチルスルホニルフルオリド(1mM)及びペプスタインＡ(1mM)を添加してタンパク質分解を最小限にした。細胞残物は、４℃において、17,400gで３０分間遠心分離することによって除去した。上清を、相分離システムに添加し、発酵液について上述したように、CBD_N1/RGDを精製した。細胞分離アッセイ細胞は、トリプシン及びEDTAでディッシュから剥離し、0.01%のダイズトリプシン阻害剤(sigma)を含むDMEM媒質で１度洗浄し、阻害剤無しのDMEM媒質で２回洗浄した。全部で４×１０⁶の洗浄した細胞は、血清を含まない培養媒質中のCBD_N1 である。３７℃で１時間インキュベートした後、結合したCBD_N1/RGDを持つ細胞を、親和性相分離システムに添加した。HEC相の分離の後、HECから細胞を放出させるためにトリプシンを添加し、遠心分離により細胞を回収した。細胞の生存は、トリパンブルー(trypan blle)排除を用いて検査した。実施例８アビセルに固定化したβ-グルコシダーゼ融合タンパク質を用いたセロビオースからのグルコースの生成この方法は、エンドグルカナーゼ−エキソグルカナーゼの共インキュベートと、それに続く、得られたセロビオース混合物のβ-グルコシダーゼが固定化されたアビセルカラムへのチャンネリングを用いる（図１３Ｂ参照）。この方法は以下の通りである。発酵容器では、エンドグルカナーゼとエキソグルカナーゼの両方が、減成すべきセルロース材料を含む媒質に添加される。酵素は、固定した時間だけ反応させ、媒質に可溶なセロビオースを生成する。費やされた全媒質と酵素は、まずアビセルカラムを通し、エンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼの両方を固定化及び濃縮する。セロビオースを含む溶離液は、固定化したβ-グルコシダーゼPBD_Cexを具備する第２のアビセルカラムに通し、セロビオースをグルコース単位に加水分解する。エンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼは、第１のカラムから溶離によって再生される。両方のカラムは、精製及び酵素的変換のために数回再利用できる。実施例９ CBD_N1-アルカリホスファターゼ融合タンパク質発現カセットの調製 TNphoAは、大腸菌アルカリホスファターゼ遺伝子であるphoAから、そのシグナル配列('phoA)を差し引いたものを含むトランスポゾンTn5の誘導体である。正しいリーディングフレームにおける発現された遺伝子への転位挿入は、PhoA融合タンパク質を生成する。標的遺伝子がタンパク質輸送シグナルを含む場合、これらは、融合タンパク質の直接分泌が可能である。この分泌は、酵素が細胞外に分泌されたときにのみ存在するアルカリホスファターゼ活性によって検出できる。Tn phoAは、多重クローニング部位を持つプラスミドにおけるC.fimi CBD_N1コード配列とのphoA遺伝子融合体の生成に用いられる。対象とするタンパク質をコードする遺伝子は、多重クローニング部位(mcs)にクローニングされ、融合タンパク質として発現される。遺伝子生成物は、HEC-Pluronic IOS CBD_N1での親和性相分離によって生成される。遺伝子融合体の調製及び分析 CBD_N1との遺伝子融合を生成するために、TnphoAでの転移的突然変異が用いられた。CBDN1を含むプラスミドはpTugK_N1である（図５及び６参照）。転移現象は、トランスポゾンITnohoA-1(Gutierrez，et al.，J．Mol．Biol．( 1987)195: 289-297)を含む欠陥ラムダ相を持つ大腸菌CC118(pTugK_N1)の感染によって媒介される。大腸菌CC118はphoA遺伝子に欠失を含む。CBD_N1を持つフレームのCBD_N1コード領域への転移的挿入は、細胞外媒質を標的とするCBDN1-phoA融合タンパク質を生成する。カナマイシン（トランスポゾン−誘導）及びアンシピリン耐性について選ばれたコロニーは、色原体基質５-ブロモ-４-クロロ-３-インドリルホスファート(XP)上で、アルカリホスファターゼについてスクリーニングされた。PhoA＋コロニーからのプラスミドＤＮＡが形質転換され、上記のように選択されスクリーニングされた。PhoA＋コロニーは、Congo red（Greenwood，et al.，FEBS Letters（1984）2: 259-263）で染色されたカルボキシメチルセルロース(CMC)プレート上でエンドグルカナーゼ活性をスクリーニングされた。所望のペプチドは、PhoA+、EngA-、及びアンシピリン及びカナマイシン耐性である。プラスミドＤＮＡは、PhoA+、EngA-コロニーから単離され、CBD_N1に正しい方向でTnphoA挿入を有するコロニーに対する制限消化及び寒天ゲル電気泳動で分析された。これらのクローンの幾つかは、フレーム外挿入を持ち、融合体のタンパク質生成物を見るときに明らかになる。CBD_N1-PhoA融合タンパク質は、HEC等の可溶性オリゴ糖への結合について分析された。TnphoAの正確な挿入位置は、鎖停止法を用いたＤＮＡ配列形成によって決定した。融合タンパク質の精製融合タンパク質を含む透明な大腸菌細胞抽出液を、融合タンパク質のHECポリマーへの結合を促進する、バッファ中のHEC-pluranic 105親和性相分離システムに適用した。HEC相をPluranic 105相から分離した後、温度を上げることにより融合タンパク質を解離させ、融合タンパク質を回収した。回収した分画を、アルカリホスファターゼ活性についてアッセイし、酵素ピークをイオン交換又はゲル濾過クロマトグラフィでさらに精製した。精製条件を変化させ、アルカリホスファターゼ活性の回収を最適化した。パラメータ（±標準誤差を加えた）は、両逆数形態でプロットした吸着データから計算した。Ｋａ及びａについての値は、実施例３Ｃに詳述したように、［No ］＝101mmol格子残基・ｇセルロース^-1を用いて計算した。アビセル、BMCC及び再生セルロース(RC)を含むセルロースに対するPBPCex及びキチンの吸着及び相対的親和性は、USSN5,340,731の図１５及び１６に示した。USSN5,340,731の図１７は、多糖類の少なくともPBPが、例えば染料又は色素等のタンパク質又は歯学的部位のような対象リガンドに結合したハイブリッドタンパク質を含む本発明の組成物に対するCEB_Cexの結合に対する洗剤添加の影響を示している。セルロースからの２つの異なる脱離可能なラベル改組(recomposition)の酵素的脱結合の例を図１４に示した（上記）。実施例１０単一熱分離ポリマーシステム一つの部類の親和性濃縮及び分離システムは、CBD_N1又は他の可溶性多糖類結合ドメインが親和性を有する単一の熱分離性多糖類を用いる。この属(ファミリー)の多糖類は、メチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、プロピルヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む。これらのシステムは、培養中に培養上清に外生成される可溶性オリゴ糖結合ドメインを含む融合／ハイブリッドタンパク質の結合及び分離、または、細胞溶解、浸透圧ショック等に従う可溶性オリゴ糖結合ドメインを含む細胞内融合／ハイブリッドタンパク質の結合及び分離のいずれにも用いられる。いずれにシステムでも、プロセスは以下の通りである：熱分離性多糖類を、露出された融合タンパク質を含む培養上清または溶解液に、流動点(current point)温度より低温で添加する。この熱分離性多糖類と培養上清又は溶解液を混合し、多糖類の流動点温度より上に達するまで温度を徐々に上昇させる。残りの溶液中にポリマー豊富な相が形成されたとき、ポリマー豊富相を回収し、融合タンパク質を多糖類から溶離することができる。このとき、残りの溶質を全て含有する残りの溶液は廃棄できる。このプロセスは、４つの過程に分けられる：熱分離性多糖類の、オリゴ糖結合タンパク質又はオリゴ糖結合ドメインを含む任意の融合タンパク質を含有する水溶液への添加及びポリマの前記タンパク質への接触並びに結合；混合条件下でのＣＰＴを超える温度への序序の昇温；水豊富及びポリマー豊富相の分離を誘発するためのＣＰＴを超える温度における混合の排除（これは、重力静置または遠心分離による促進によっても達成できる）；及び（標的タンパク質を含む）ポリマー豊富相の回収並びに標的とするオリゴ糖結合タンパク質又はオリゴ糖結合ドメインを含む融合タンパク質の溶離。実施例１１１又はそれ以上の熱分離性ポリマーを含む親和性水性２相システム CBD_N1に親和性を有する１又はそれ以上の熱分離性ポリマーを含む水性２相システムを作製する（以下の表参照）。これらのシステムは、ドメインが結合するポリマーを含む相の高い親和性分離を可能にし、次いでポリマーは簡単な方法によって回収及びリサイクルできる。 CBD_N1及び他のオリゴ糖結合タンパク質に結合できる４つの異なるセルロースベースのポリマーを、２つの非セルロースポリマーと組み合わせて用い、多数の新規な水性２相システムを形成した。形成された水性２相システムの特性は、以下に議論する。 Pluronic−Klucelシステム８つの異なるPluronicを、３つの等級のKluelとともに用いた。用いたPluroni cは、F68、F77、F108、P84、P103、P104、P105及びP123である。Klucelの等級は、Klucel H、l及びMであった。 Pluronic F68-Klucel H：各ポリマーを少なくとも13%（全重量％）含む溶液から２相システムを形成した。 Pluronic F68−Klucel L：各ポリマーを少なくとも13%（全重量％）含む溶液から２相システムを形成した。 Pluronic F68−Klucel M：12%(w/w)を超えるポリマー濃度で相分離が観察された。 Pluronic F77−Klucel H：各ポリマー9%の範囲の溶液で相分離が観察された。上相は透明で下相は濁っていた。 Pluronic F77−Klucel L：各ポリマー10%(w/w)の範囲の濃度の溶液で相分離が観察された。 Pluronic F77−Klucel M：各ポリマーを少なくとも10%（全重量％）含む溶液から２相システムを形成した。 Pluronic F108−Klucel H：各ポリマーを少なくとも10%（全重量％）含む溶液から２相システムを形成した。 Pluronic F108−Klucel L：各ポリマーを少なくとも10%（全重量％）含む溶液から２相システムを形成した。 Pluronic F108−Klucel M：各ポリマーを少なくとも9%（全重量％）含む溶液から２相システムを形成した。 Pluronic P103−Klucel H：約6.5%のPluronic及び7.1%のKlucelの濃度について分離が観察された。 Pluronic P104−Klucel H：4.1%のPluronic及び3.8%のKlucelの濃度について分離が観察された。 Pluronic P105−Klucel H：4.5%のPluronic及び2.8%のKlucelの濃度について相分離が観察された。低濃度での２相システムは粘稠ではなかった。 Pluronic P105−Klucel L：5.0%のPluronic及び3.5%のKlucelの濃度で分離が起こった。この範囲の溶液での２相システムは粘稠ではなかった。４０℃より上では相熱分離は低かった。 Pluronic P105−Klucel M：低くても、3.9%のPluronic及び2.5%のKlucelの濃度で相分離が観察された。下相は、３８℃で粘稠となって濁った、 Pluronic P123−Klucel H：5.6%のPluronic及び4.0%のKlucelの濃度で２相システムが形成された。デキストラン(Dextran)−Natrosolシステム３つの等級のDextranを、３つの等級のNatrosolとともに用い、新規な水性２相システムを形成した。Dextranの等級は、T40、T70及びT50の等級を含み、Natr osolの等級は、250 HR、250 LR及び250 MRを含む。 Dextran T40−Natrosol 250 LR：各ポリマー10%の範囲の濃度の溶液から水性２相システムを形成した。 Dextran T70−Natrosol 250 LR：約5.2%のDextran及び5.0%のNatrosolの溶液から水性２相システムを形成した。 Dextran T500−Natrosol 250 LR：両方のポリマー5.3%の溶液から水性２相システムを形成した。 Plironic−デキストラン(Dextran)システム４つの等級のDextranを、４つの等級のPluronicとともに用い、本発明に有用な新規な水性２相システムを形成した。用いたDextranの等級は、T40、T500及び T2000である。用いたPluronicは、F68、F77、F108及びP105を含む。低ポリマー濃度及び低粘度の点から、試験した殆どの組み合わせについて、優れた相分離特性が観察された。 Pluronic F68−Dextran T40：各ポリマー約9.0%の濃度で相分離が観察された。 Pluronic F68−Dextran T70：各々7.0%及び5.9%のPluronic及びDextranの濃度について相分離が観察された。 Pluronic F68−Dextran T500：各ポリマー約6.8%の濃度で水性２相システムが形成された。 Pluronic F68−Dextran T2000：各ポリマー約9.0%の濃度で水性２相システムが形成された。 Pluronic F77−Dextran T40：10.0%のPluronic及び9.2%のDextranの濃度において水性２相システムが形成された。 Pluronic F77−Dextran T70：各ポリマー約8.2%の濃度の溶液で相分離が起こった。 Pluronic F77−Dextran T500：両方のポリマーについて7.0%の濃度で水性２相システムが形成された。 Pluronic F77−Dextran T2000：両方のポリマーについて10.7%の濃度で相分離が観察された。 Pluronic F108−Dextran T40：各ポリマー約7.0%の濃度で水性２相システムが形成された。 Pluronic F108-Dextran T70：7.0%の範囲の濃度で水性２相システムが形成された。 Pluronic F108−Dextran T500：3.9%のPluronic及び3.4%のDextranの濃度において相分離が起こった。 Pluronic F108−Dextran T2000：3.4%のPluronic及び3.9%のDextranの範囲の濃度において水性２相システムが形成された。 Pluronic F105−Dextran T40：各ポリマー8.0%の範囲の濃度で水性２相システムが形成された。 Pluronic F105−Dextran T70：6.3%の濃度のPluronic及びDextranにおいて水性２相システムが形成された。 Pluronic F105−Dextran T500：各ポリマー6.0%よりやや低い濃度で分離が起こった。 Pluronic F105−Dextran T2000：各ポリマー6.0%の範囲の濃度で相分離が起こった。 Klucel−デキストラン(Dextran)システム３つの等級のKucelを、４つの等級のDextranと組み合わせて用い、新規な水性２相システムを形成した。Klucelの等級は、Klucel H、 L及びMであった。Dextr anの等級は、T40、T70、T500及びT2000であった。 Klucel H−Dextran T40：各々6.8%及び8.3%の濃度のKlucel及びDextranにおいて、水性２相システムが形成された。 Klucel H−Dextran T70：各ポリマー6.8%の濃度で、水性２相システムが形成された。 Klucel H−Dextran T500：3.0%より僅かに大きな濃度で、相分離が起こった。 Klucel H−Dextran T2000：3.2%の範囲の濃度で、相分離が観察された。 Klucel L−Dextran T40：4.0%より大きな濃度の溶液で、相分離が観察された。 Klucel L−Dextran T70：各ポリマー3.6%の濃度で、水性２相システムが形成された。 Klucel L−Dextran T500：3.9%の濃度で分離が観察された。 Klucel L−Dextran T2000：3.5%のKlucel及び3.1%のDextranの濃度で、相分離が観察された。 Klucel M−Dextran T40：3.1%より僅かに大きな濃度で水性２相システムが形成された。 Klucel M-Dextran T70：3.5%の範囲の濃度で、相分離が観察された。 Klucel M−Dextran T500：3.5%のポリマー濃度で、相分離が観察された。 Klucel M−Dextran T2000：4.0%より低い濃度で水性２相システムが形成された。 HPMC−デキストラン(Dextran)システム SigmaのHPMCを、５つの異なる等級のDextranとともに用い、新規な水性２相システムを形成した。用いたDextranの等級は、T40、T70、T500、T2000及びデキストラン硫酸ナトリウム(Sodium Dextran Sulpate)である。 HPMC−Dextran T40：各ポリマー3.0%より低い濃度で相分離が観察された。 HPMC−Dextran T70：3.8%のHPMC及び4.6%のDextranのポリマー濃度で分離が観察された。 HPMC−Dextran T500：3.4%より低い濃度で相分離が起こった。 HPMC−Dextran T2000：4.0%に近い濃度で分離が起こった。 HPMC−Sodium Dextran Sulfate：2.9%のHPMC及び4.1%のデキストラン硫酸ナトリウムのポリマー濃度から分離が起こった。 HPMC−Pluronicシステム SigmaのHPMCを、５つ等級のPluronicとともに用い、新規な水性２相システムを形成した。Pluronicは、P-シリーズから用い、P84、P103、P104、P105及びP123を含む。 HPMC−Pluronlc P84：6.3%のHPMC及び7.8%のPluronicの濃度で相分離が観察された。この濃度で、上相は透明であり、この溶液が相境界に近いことは殆ど示さない。 HPMC−Pluronic P103：4.0%より低い濃度で水性２相システムが形成された。 HPMC−Pluronic P104：3.6%の範囲の濃度の溶液で分離が起こった。 HPMC−Pluronic P105：5.5%の範囲のポリマー濃度で相分離が観察された。 HPMC−Pluronic P123：5.5%のHPMC及び6.4%のPluronicの濃度で相分離が起こった。実施例１２セルロースベースのポリマーとCBDとの相互作用の親和性電気泳動分析４つのセルロースベースのポリマーに対して、この分子と、Cellulomonas fim i CenCのセルロース結合ドメイン(CBD_N1)のＮ末端との間の相互作用を決定するために親和性電気泳動分析を用いた。CBD_N1及びCBD_N2は、４つのセルロースベースポリマー全てに対して別々に試験された。対照として、セルロース分子に結合しないウシ血清アルブミン(BSA)を用いた。結果を以下にまとめる。 Klucel(HPC) ｐＨ７において、Klucel H及びKlucel Lと、CBD_N1及びCBD_N1N2の間の強い結合性相互作用が観察され、その結果、ゲル上の泳動で全てが失われた（図９参照）。 Natrosol(HEC) NatrosolとCBD_N1及びCBD_N1N2との強い結合が観察された（図９参照）。 Bermocoll E(EHEC) ２つの等級のBermocoll EのCBD_N1及びCBD_N1N2とについて、結合性相互作用を研究した。電気泳動アッセイによる測定によれば、両方のポリマーは、CBD_N1及びC BD_N1N2のいずれかに強く結合した。ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC) HPMCは、電気泳動アッセイによる測定によれば、CBD_N1及びCBD_N1N2のいずれかに強く結合した。現在の親和性分離システムは、ポリマー鎖当たりに１または２のリガンドが存在することからもたらされる低いリガンド密度によるそれらの容量及び溶解力によって制限されている。ポリマー濃度は通常１５重量％未満であり、１：１または２：１というリガンド対ポリマーの化学量を持つ親和性分離システムは、通常５から５０の（汚染物に対する）標的タンパク質分離因子(separation factor) を有する。これらの分配因子は、生成物の濃縮には十分以上であるが、常に所望の純度を、１又は２段階の抽出プロセスでコスト効率よく提供するとは限らない。また、古典的な親和性分離システムは、ポリマーリガンド接合体を調製するのに必要な化学物質の高価さによっても制限される。これらのコスト及び容量的制限は、相形成ポリマーの一つのモノマー単位が親和性リガンドとして供される場合に除去できる。CBD_N1の種々の水溶性セルロース基質への精妙な選択的結合は、組み換えタンパク質の連続的精製のための新たな、コスト効率の良い、高い応用性を持つ親和性分離システムを与える。CBD_N1の標的タンパク買又はペプチドへの発生学的結合は、センチモル量の電解質の存在下で可溶性炭化水素に結合し、融合相手の生物学的活性を保持する融合をもたらす。本明細書で挙げた全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者のレベルを示す。全ての刊行物及び特許出願は、ここに、個々の刊行物及び特許出願各々が、特別にかつ個々に、参考文献として取り入れるべきことが示されているのと同じように、その同一内容の参考文献として取り入れられる。以上、本発明を詳細に説明したが、当業者が、添付する請求の範囲の精神又は範囲から離れることなく、本発明に多くの変化又は修飾を施すことができることは言うまでもない。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年８月２１日【補正内容】請求の範囲１．混合物中の他の成分から多糖類結合ペプチドを含有する化合物を精製する方法であって、前記混合物及び前記化合物に結合する相形成オリゴ糖ポリマーを含む溶液の相分離を導いて、前記化合物が前記オリゴ糖ポリマーを含む相に分配されるようにし、前記オリゴ糖ポリマー相を回収し、前記化合物を前記オリゴ糖から解離させることによって、前記混合物に比較して精製された前記化合物の溶液を得ることを含んでなる方法。２．相分離が、相分離誘発剤を用いて導かれる請求項１記載の方法。３．前記オリゴ糖ポリマーが熱分離性ポリマーであり、相分離が、前記溶液を相分離が生ずる温度まで加熱することによって導かれる請求項１記載の方法。４．前記オリゴ糖ポリマーが、β−１，４−グリカンである請求項１記載の方法。５．前記β−１，４−グリカンが、セルロースである請求項４記載の方法。６．前記セルロースが、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルセルロースからなる群から選択される請求項５記載の方法。７．前記多糖類結合ペプチドが、ポリサッカリダーゼまたは多糖類結合タンパク質の多糖類結合ドメインから導かれる請求項１記載の方法。８．前記ポリサッカリダーゼがセルロースである請求項７記載の方法。９．混合物の他の成分からポリペプチドを精製する方法であって、第１の成分としての水性溶液に可溶であり前記ポリペプチドが結合する相形成オリゴ糖ポリマーと、第２の成分としての相分離誘発剤とを有する相分離システムと前記混合物とを所定条件下で接触させることにより、前記ポリペプチドを前記オリゴ糖ポリマーを含有する相に分配し、ただし、前記ポリペプチドは多糖類結合ペプチドを含み、前記オリゴ糖ポリマー相を回収し、前記化合物を前記オリゴ糖から解離させることによって、前記混合物に比較して精製された前記化合物の溶液を得ることを含んでなる方法。１０．前記ポリペプチドが、多糖類結合ペプチドと高分子とを含んでなる融合ポリペプチドである請求項９記載の方法。１１．前記融合ポリペプチドが、前記多糖類結合ペプチドと前記高分子との間にプロテアーゼ認識配列を有する請求項１０記載の方法。１２．前記プロテアーゼ認識配列が、前記多糖類結合ペプチドとは異種構造である請求項１１記載の方法。１３．第１の成分としての多糖類結合ペプチドが１０³Ｍから１０⁷ＭのＫａで結合する相形成オリゴ糖ポリマーと、第２の成分としての相分離誘発剤とを含有してなり、前記第１及び第２の成分が、各々相分離を導くのに十分な量存在し、前記第１の成分が、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、及びメチルセルロースからなる群から選択される２相分離システム。１４．前記多糖類結合ペプチドが、C．finiエンドグルカナーゼＣから導かれる請求項１３記載の２相分離システム。１５．前記多糖類結合ペプチドがＣＢＤ_N1である請求項１４記載の２相分離システム。１６．多糖類結合ペプチドと２相分離システムとを含み、前記２相分離システムが、第１の成分としての多糖類結合ペプチドが１０³Ｍから１０⁷ＭのＫａで結合する相形成オリゴ糖ポリマーと、第２の成分としての相分離誘発剤とを含有してなり、前記第１及び第２の成分が、各々相分離を導くのに十分な量存在する組成物。１７．前記第２の成分が、ポリエチレングリコールポリマー、デキストラン、及び、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのコポリマーからなる群から選択される請求項１３記載の２相分離システム。１８．多糖類結合ペプチドを含む化合物を、混合物の他の成分から精製するための組成物の使用方法であって、前記組成物が、可溶性オリゴ糖類に結合するが結晶性セルロースには結合しないセルロース結合ドメインを含む方法。１９．前記結合ドメインがＣＢＤ_N1である請求項１８記載の方法。２０．混合物から多糖類結合ペプチドを含有する化合物を分離する方法であって、前記混合物を、水性媒体に可溶であり前記化合物に結合する熱分離性のβ−１，４−を結合したオリゴ糖ポリマーとともに、相分離が起こる温度まで加熱して、前記化合物が分配されたオリゴ糖ポリマー相を得、前記混合物の他の成分から精製された前記化合物を含む前記オリゴ糖ポリマー相を回収することを含んでなる方法。２１．第３の成分として、前記オリゴ糖ポリマーに結合する多糖類結合ペプチドを含む組成物を含有する請求項１３記載の２相分離システム。２２．不溶性多糖類に結合する多糖類結合ペプチドを含んでなる切断酵素複合体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者トウメ，ピーターカナダ国ブリティッシュコロンビアＶ６Ｌ１Ｘ２ヴァンクーヴァーダブリュトゥウェンティエイスアヴェニュ 2930 (72)発明者キルバーン，ダグラスジーカナダ国ブリティッシュコロンビアＶ６Ｓ１Ｔ４ヴァンクーヴァーダブリュトゥウェンティナインスアヴェニュ 3728

Claims

【特許請求の範囲】１．混合物中の他の成分から多糖類結合ペプチドを含有する化合物を精製する方法であって、前記混合物及び前記化合物に結合する相形成オリゴ糖ポリマーを含む溶液の相分離を導いて、前記化合物が前記オリゴ糖ポリマーを含む相に分配されるようにし、前記オリゴ糖ポリマー相を回収し、前記化合物を前記オリゴ糖から解離させることによって、前記混合物に比較して精製された前記化合物の溶液を得ることを含んでなる方法。２．相分離が、相分離誘発剤を用いて導かれる請求項１記載の方法。３．前記オリゴ糖ポリマーが熱分離性ポリマーであり、相分離が、前記溶液を相分離が生ずる温度まで加熱することによって導かれる請求項１記載の方法。４．前記オリゴ糖ポリマーが、β−１，４−グルカンである請求項１記載の方法。５．前記β−１，４−グルカンが、セルロースである請求項４記載の方法。６．前記セルロースが、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルセルロースからなる群から選択される請求項５記載の方法。７．前記多糖類結合ペプチドが、ポリサッカリダーゼまたは多糖類結合タンパク質の多糖類結合ドメインから導かれる請求項１記載の方法。８．前記ポリサッカリダーゼがセルロースである請求項７記載の方法。９．混合物の他の成分からポリペプチドを精製する方法であって、第１の成分としての水性溶液に可溶であり前記ポリペプチドが結合する相形成オリゴ糖ポリマーと、第２の成分としての相分離誘発剤とを有する相分離システムと前記混合物とを所定条件下で接触させることにより、前記ポリペプチドを前記オリゴ糖ポリマーを含有する相に分配し、ただし、前記ポリペプチドは多糖類結合ペプチドを含み、前記オリゴ糖ポリマー相を回収し、前記化合物を前記オリゴ糖から解離させることによって、前記混合物に比較して精製された前記化合物の溶液を得ることを含んでなる方法。１０．前記ポリペプチドが、多糖類結合ペプチドと高分子とを含んでなる融合ポリペプチドである請求項９記載の方法。１１．前記融合ポリペプチドが、前記多糖類結合ペプチドと前記高分子との間にプロテアーゼ認識配列を有する請求項１０記載の方法。１２．前記プロテアーゼ認識配列が、前記多糖類結合ペプチドとは異種構造である請求項１１記載の方法。１３．第１の成分としての多糖類結合ペプチドが１０³Ｍから１０⁷ＭのＫａで結合する相形成オリゴ糖ポリマーと、第２の成分としての相分離誘発剤とを含有してなり、前記第１及び第２の成分が、各々相分離を導くのに十分な量存在する２相分離システム。１４．前記多糖類結合ペプチドが、C．fimiエンドグルカナーゼＣから導かれる請求項１３記載の２相分離システム。１５．前記多糖類結合ペプチドがＣＢＤ_N1である請求項１４記載の２相分離システム。１６．前記第１の成分が、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロースからなる群から選択される請求項１３記載の２相分離システム。１７．前記第２の成分が、ポリエチレングリコールポリマー、デキストラン、及び、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのコポリマーからなる群から選択される請求項１３記載の２相分離システム。１８．可溶性オリゴ糖類には結合するが、結晶性セルロースには結合しないセルロース結合ドメイン。１９．前記結合ドメインがＣＢＤ_N1である請求項１８記載のセルロース結合ドメイン。２０．混合物から多糖類結合ペプチドを含有する化合物を分離する方法であって、水性媒体に可溶であり前記化合物に結合する熱分離性β−１，４−を結合したセロ糖類ポリマーを含む前記混合物を、相分離が起こる温度まで加熱して、前記化合物が分配されたセロ糖類ポリマー相を得、前記混合物の他の成分から分離された前記化合物を含む前記セロ糖類ポリマー相を回収することを含んでなる方法。２１．第３の成分として、前記オリゴ糖ポリマーに結合する多糖類結合ペプチドを含む組成物を含有する請求項１３記載の２相分離システム。２２．不溶性多糖類に結合する多糖類結合ペプチドを含んでなる切断酵素複合体。