【発明の詳細な説明】
可溶性オリゴ糖結合ドメインに基づく分離及び濃縮システム
緒言
技術分野
本発明は、リガンドが可溶性相形成オリゴ糖に結合するポリマー−リガンド対
を用いた親和性相分離によるポリペプチド及び他の化合物を分離及び/または精
製するための方法に関する。本発明は、親和性リガンドとして、Cellulomonas f
imiセルラーゼを含有する化合物に対する皺性を有する可溶性オリゴ糖を含む相
分離システムの使用によって例示する。
背景
微生物系の発現によるタンパク質の精製は、高価で医学的に重要なタンパク質
の大事な源となっている。組み換えタンパク質の精製及び回収は、発酵プロセス
の設計における主要な問題である。従来の抽出システムは、インシュリン等の高
投与量製剤、及び、3−オキソステロイドイソメラーゼ、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ及びホスホフルクトキナーゼ等の工業的タンパク質といったタンパク質製
品の大規模精製を単純化する手段として多くの工業的興味を集めていた。その結
果として、広範な2相システムが、タンパク質精製及び細胞分離応用の両方にお
いて現在利用されている。水性2相システムは、組み換えタンパク質及びペプチ
ドの大規模処理に対して独特な利点を示し、それらは、高活性収率(例えば、大
量の)、平衡への速い到達、規模拡張の容易さ、及び、最も重要なことだが、連
続的な処理を含む。
水性2相分離システムの技術的可能性は、100,000Lスケールまでの幾
つかのシステムにおいて示されている。それらは、2つの水溶性だが相容性でな
いポリマーまたは水溶性ポリマー及び強電解質のいずれかに水を添加することに
よって形成される。ポリエチレングリコール(PEG)は、その低価格及び広範
−な子量分画での入手しやすさにより、多くの工業的2相システムのポリマー成
分の1つとして役立っている。分別されたデキストラン、a−1,3分枝したa
−1,6グルコ糖類(glucosaccharide)は、第2のポリマーとしてしばしば用い
られている。しかし、多数の炭化水素ポリマーを含む多くの他の水溶性ポリマー
も用いられている。水性2相システムは、主に見ずを含み、各相は分離導入性成
分の1つに富み、他は殆ど含まない。発酵液からのタンパク質及び他の生体高分
子の混合物が2相システムに添加されると、各相のタンパク質分布は、2つの相
形成成分に対するその相対的親和性、そのサイズ、表面化学、及び正味の電荷の
みに基づく。
従来の水性2相システムにおける比較的低い分配係数及び選択性に欠如は、用
途の広い従来の分離システムとリガンドの独特な結合選択性とを結合させた親和
性分離システムの開発の動機付けとなった。殆どの場合、生体特異的(biospecif
ic)リガンドは、通常はPEGである相形成ポリマーの一端又は両端に共有結合
する。次いで、相形成中のポリマーの強力な分配が、リガンドの平衡相の1つへ
の凝縮を生じさせる。リガンドに対する標的タンパク質の強い親和性と結びつい
たこの高度に非対称の分配は、親和性分離及び濃縮の後ろ盾である。
しかし、現在の親和性分離システムは工業的に使用されているものもあるが、
ポリマー鎖当たりに1または2のリガンドしか存在しないことから生ずる低いリ
ガンド密度によって、それらの能力及び解決力が限られている。ポリマー濃度は
通常15重量%未満であるので、リガンド対ポリマーの化学量が1:1〜2:1
の親和性分離システムは、通常5から50の(汚染物に対する)標的タンパク質
分離率を生ずる。これらの分離率(separation factor)は、生成物の濃縮に十分
であるよりも大きいが、コスト効率の良い1又は2段階の抽出工程において望ま
れる生成物純度は得られない。古典的な親和性分離システムも、ポリマー−リガ
ンド接合体の製造に必要とされる化学の費用によって制限される。例えば、PE
Gへのリガンドの接合は、第1に末端ヒドロキシル基の、臭化物、塩化物、エポ
キシド等のより活性な親電子物質による置換を必要とする。次いで、ポリマーと
リガンドの共有結合には第2の親核攻撃反応が必要である。また、リガンドポリ
マー接合体は、精製すべき各タンパク質またはタンパク質の類に選択的に設計し
な
ければならない。
水性2相分離における最近の発展は、水性2相分離を温度誘導相分離と結合さ
せたことである。今日まで、これらのシステムは上相ポリマーとして熱分離性ポ
リマーを、下相ポリマーとしてデキストランまたはヒドロキシプロピルデンプン
の何れかを用いてきた。精製工程に続く温度誘導相分離は、生物学的製品からの
ポリマーの分離及びリサイクルを可能にする。この形態では、プロセスは熱相分
離ポリマーが回収されるという利点を持つが、標的タンパク質が特異的ではなく
熱分離ポリマに強い親和性を持たないという顕著な欠点を有する。これらの2相
システムにオリゴ糖結合ドメイン技術を適用することは、ポリマーを含む相の高
親和性分離と、それに続く簡単なポリマーの回収及びリサイクル方法を可能にす
る。従って、所望のタンパク質のための迅速、低価格、高容量の方法の開発、特
に、包括的なポリマー−リガンド接合体を使用できる方法の開発が望まれる。
関連文献
相形成オリゴ糖の総説としては、Zaslavsky,Aqueous Two-Phase Partitionin
g,Marcel Dekker,Inc.: New York(1995); Albertson,P.A.,Partitioning of
Cell Particles and Macromolecules,3rd ed.,Wiley Interscience: New Yor
k(1986); Walter,H.Brooks,D.E.,and Fisher,D.,Partitioning in Aqueou
s Two-Phase Systems,Academnic Press: Orland,FL(1985)を参照。
次の参考文献は、熱分離ポリマーに関する:Maocolm and Rowlinson,(1957).
Trans.faraday Soc.,53,921; Bailey and Callard,(1959).J.Appl.Polym
.,1,56: Horne,et al.,J.Colloid Interface Sci.,35,77; Saeki,et al.
,J.Chem.Soc.,Faraday Trans.,1,79,975; Fujishige,et al.,(1989)J.
Phys.Chem.,93,3311; Galeav and Mattiasson,(1993).Enzyme Micrib.Tec
hnol.,15,354; Chen and Hoffman,(1995).Nature,373,49。
エンドグルカナーゼ(endoglucanase)Cに関する参考文献は次のものを含む。M
oser,et al.,Applied and Environmental Microbiology(1989)55: 2480-2487;
Molecular Microbiology(1991)5: 1221-1233; Coutinho,et al.,Molecular M
icrobiology(1992)6: 1243-1252; Coutinho,et al.,FEMS Microbiolog
y Letters(1993)113: 211-218。β−1,4−グリカナーゼの総説としては、Gil
kes,et al.,(1991)Microbial Reviews 55: 303-315を参照。また、Miller,Jr
.,et al.,(1995)Proc.6th Int.Conf.on Biotechnology in the Pulp and P
aper Industry,Vienna,Austriaも参照。
発明の概要
水相分離及び/または精製システム、並びにその調製方法及び使用が提供され
、それは、ポリマー−リガンド接合体に基づき、該ポリマーはオリゴ糖ポリマー
であり、分離及び/または精製されるべき組成物は、前記オリゴ糖ポリマーに結
合するリガンドを有する。このリガンドは、多糖類結合ペプチド(PBP)であ
って、相形成オリゴ糖ポリマーに結合可能であることを特徴とするアミノ酸配列
である。組成物は、一般的に発酵液、細胞溶解物、生物学的流体、または、PB
Pに融合する目的の高分子又は化学的部位持つ化合物を含有する他の流体である
。この相分離システムは、1又はそれ以上の相形成オリゴ糖ポリマー、及び、相
誘導ポリマー、他の相誘導剤、または相分離を誘導する手段を含む。この方法は
、相分離システムを組成物に接触させてオリゴ糖ポリマー相に分配し、次いで、
相分離を誘導して組成物を単離することを含む。組成物は、低イオン強度、高p
H、又は無秩序剤(chaotropic agent)を含む除去溶液でオリゴ糖ポリマーから除
去することができる。あるいは、化合物と多糖類結合部位との間にプロテアーゼ
認識部位を導入することにより、オリゴ糖ポリマーに結合したままの多糖類結合
部位から化合物を酵素的に除去するために、特異的又は非特異的プロテアーゼを
用いてもよい。プロテアーゼを用いる場合、結晶性多糖類に対して親相性を持つ
が、最初の多糖類結合部位は親和性を持たない第2の多糖類結合部位に結合させ
て提供してもよい。任意に、プロテアーゼは、続いて固体多糖類から溶離させて
リサイクルすることもできる。さもなくば、第2の多糖類結合部位に結合したプ
ロテアーゼは、その多糖類結合部位が結合しない固体の多糖類支持体に結合させ
て提供してもよい。本発明は、PBPと結合できるタンパク質及び他の化合物の
分離及び/または精製のための使用を見出した。
図面の簡単な説明
図1は、Cellulomonas fimi endoglucanase C(CenC)(Coutinho,et al.,Mol
.Microbiol.(1991)5: 1221-1233)のセルロール結合ドメイン(N1及びN2)
及びCceCelCCE(Clostridium cellulolyticumからのセルロース)(Bagnarda-Tard
if,et al.,Gene(1992)119: 17-28)、MxaEgl(Myxococcus xanthusからのβ-1,3
-グリカナーゼ)(Quillet,et al.,Gene(1995)158: 23-29)、SreCell(Streptomy
ces reticuliからのセルロース)(Schlichttermeier,et al.,NIl.Microbiol.
(1992)6:3611-3621)、及びTfuEL(Thermomonospora fuscaからのβ-1,4-エンドヌ
クレアーゼ)(Lao,et al.,J.Bacteriol.,(1991)173: 3397-3407)の推定セル
ロース結合ドメインのアミノ酸配列アラインメントに基づくセルロース結合ドメ
インの共通配列を示す。アミノ酸残基は一文字コードで示す。ダッシュ(−)は
、アラインメントの進行中に残った切れ目(gap)を示す。
図2は、大腸菌(Escherichia coli.)におけるPBDNIの発現に用いるpTugA
ベクターの説明図を示す。pTugAを使用した結果、高レベルの誘導可能な転写、
RNA翻訳の促進、移植性、高コピー数、安定性、及び融通性が得られる。pTug
ベクターは、コピー数を向上させるための突然変異pUC13から誘導されたpMB1 or
i(Minton,et al.,Focus(1988)10: 56)、LaqIqによって強力に発現される(IPT
Gによって)強力かつ高度に誘導可能なtacプロモータ(Ptac)を含む。licIq
対立遺伝子は、lacIqに対するPtacの比率を一定に維持するためにpTugに組み込
まれて、E.coliホストに無関係にリプレッサの十分なレベルを確保する。遺伝子
10翻訳促進剤(Olins,et al.,Gene(1988)73: 227)も、pTugベクターに組み
込まれている。図2Aは、NcoI-HindIII領域のヌクレオチド及びコードされるア
ミノ酸配列、並びに、NcoI部位の上流領域であって、遺伝子10翻訳促進剤("g
10")及びCenAリーダ配列("leader")を含むヌクレオチド配列を示す。図2B
は、pTugAベクターのマップを示す。
図3は、pTugASベクターの説明図を示す。図3Aは、SacI-NcoIHindIII領域の
ヌクレオチド及びコードされるアミノ酸配列、並びに、SacI部位の上流領域のヌ
クレオチド配列を示す。図3Bは、pTugASベクターのマップを示す。
図4は、pTugE07K3の構造を示す。pTugAの誘導体であるpTugKは、アンピシリ
ン耐性に対する選択的マーカーに換えてカナマイシン耐性に対する選択的マーカ
ーを持ち、NcoIで完全に消化された。付着末端は、大腸菌DNAポリメラーゼI
(クレノウ断片)で修正されて平滑末端の制限部位を生じた。修飾したpTugKベ
クターは、次いで、HindIIIで完全に消化され、4.2kbpの断片が単離された。p
TZE07(Ong,et al.,Biotechnol.Bioeng.(1993)42: 401-409)は、BamH
Iで完全に消化され、付着末端は大腸菌DNAポリメラーゼI(クレノウ断片)
で修正されて平滑末端の制限部位を生じた。修飾したpTZE07は、次いで、HindII
Iで完全に消化され、2.1kbpの断片が単離された。4.2及び2.1kbpの断片が結合さ
れてpTugE07K3を与えた。
図5は、pTugKN1の構造を示す。pTugE07K3は、NheI及びHindIIIで完全に消化
され、CBDCexを含む1.8kbpの断片が除去されて、4.5kbpの断片が単離された。CB
DNIをコードする遺伝子断片の5’及び3’末端に適当な制限部位を導入するた
めにPCRが用いられた。成熟CBDNIのN末端(ala-ser)に相当するNheI部位(下
線部)は、オリゴヌクレオチド5'-TTACCTCATATGGCTAGCCCGATCGGGGAGGGAACG-3'を
用いた5’におけるcbdNIのサイレント変異として導入された。HindIII部位は、
オリゴヌクレオチド5'-AGAATGAATTCAAGCTTAGAGCTCCGACCTCGGAGTC-3'を用いてcbd
NIの3’末端に導入された。翻訳的停止コドンも、このプライマーに含まれる。
ポリメラーゼ反応(PCR)混合物は、10-100ngのテンプレートDNA(pTz-JC
3)(Coutinho,et al.,Mol.Microbiol.(1992)6: 1243-1252)、25-50pmole
(300ng)のプライマー、2mMのMgCl2、6%のジメチルスルホキシド、0.2mMの
2’−デオキシヌクレオチド5’−トリホスファート、及び、50mMのTris中の1単
位のTaq DNAポリメラーゼを含んでいた。28回の連続的サイクルを次のように
実施した:94℃における15秒間の変性、57℃での1.4分間のアニーリン
グ、そして、72℃における1.5分間のプライマー延長。得られたCBDNIPCR断
片は、NheI及びHindIIIで完全に消化され、0.5kbpの断片が沈降によって精製さ
れた。4.5kbpと0.5kbpの断片を結合してpTugKN1を与えた。
図6は、pTugKN1ベクターを示す。pTugKN1ベクターは、アンシピリン耐性(β
-ラクタマーゼ・コード配列)に選択的なマーカーをカナマイシン耐性に対する
選択的マーカーで置換することにより、pTugAベクターから誘導される。C.fimi
のエンドヌクレアーゼA(CenA)のリーダペプチドをコードする配列は、C.fimi
からのエキソヌクレアーゼ(Cex)のリーダペプチドをコードする配列で置換され
た(Ong,et al.,Biotechnol.Bioeng.(1993)42: 401-409)。
図7は、PBDNIのアニオン交換クロマトグラフィの結果を示す。部分的に精製
されたPBDNI(200ml中150mg)を、20mMのリン酸カリウムバッファで平衡にされ
たpH6.0のアニオン交換カラム(MonoQ)に配置(1ml/分)した。カラムを2
00mlのバッファpH6.0で洗浄した後、結合したタンパク質を塩勾配(20mMの
リン酸カリウムバッファpH6.0中の600ml、0-1MのNaCl)を用いて回収(8ml分画
)した。PBDNIは、300mM塩においてカラムから回収された(ピーク1)。汚染し
たタンパク質は、より頑強に結合しており、更に高い塩(ピーク2)において回
収された。
図8は、培養上清からの精製中のPBDNIのSDS-PAGE分析を示す。JM101収容pTug
KN1からの培養上清(誘導された)(レーン2)、全培養上清(細胞及び液)(レーン
3)、培養上清でのタンパク質の結合後のAvicel分画(レーン4)、上清のAvicel
への結合の後のフロースルー分画(レーン5)、AvicelからH2Oで溶離した分画(レーン
6)、及び、MonoQ精製の後のPBDNIを、12.5%アクリルアミドを含むゲル上で
分析した。分子量標準物質(レーン1)は示した通りである。
図9は、PBP(PBDNI及びPBDNIN2)の分析のための親和性電気泳動ゲルを示す
。精製したウシ血清アルブミン(BSA)(レーン1)、PBDNI(レーン2)、及びPBDN1N2
(レーン3)の、可溶性オリゴ糖に対する結合を、13%のアクリルアミドを含む天然
ゲル中で分析した。オリゴ糖の不存在(−)でのゲルにおける泳動に比較した、
多糖類((0.1% w/v)ヒドロキシエチルセルロース(HEC)または大麦グルカン)の
存在(+)するゲルにおける妨害は結合性を示す。非結合性多糖類としてキシラ
ンを用いた。5mgの各タンパク質を各ゲルに配置した。図9Aは、大麦β−グル
カンの存在(+)及び不存在(−)での結合を比較する。図9Bは、ヒドロキシ
エチルセルロースの存在(+)及び不存在(−)での結合を比較している。図9
Cは、シラカンバ木(birchwood)キシランの存在(+)及び不存在(−)での結
合を比較
している。
図10は、pTZ-JC13(図10C)の構成において用いられるベクターを示す。
図10Aは、PBDNIをコードする断片を得るために用いられる、全CenCをコード
する遺伝子断片を含むpTZ-JC2を示す。図10Bは、CenAをコードする断片を得
るのに用いられるベクターpUC18-1.6 cenA-PTを示す。
図11は、CenA及びPBDNI-CenA融合タンパク質からのタンパク質分解生成物の
SDS-PAGE分析を用いた分析結果を示す。各タンパク質の8mgを、50mlのリン酸バ
ッファ、pH7.0(50mM)中で、0(レーン5及び9)、0.1(レーン4及び8)、0.5(レーン
3及び7)、または1.0(レ-ン2及び6)単位のC.fimiプロテアーゼの存在下で
、30℃で3時間インキュベートした。分子量マーカー(レーン1)は示したとおり
である。P30は、セルロール結合ドメインのタンパク質分解的除去の後のCenAの
触媒ドメインに対応する(Gilkes,etal.,J.Biol.Chem.(1988)263: 10401-104
07)。
図12は、セルロースへの差示吸着、それに続くSDS-PAGEを用いた非吸着ポリ
ペプチドの分析によるCenA及びPBDN1-CenAの分離の結果を示す。図12Aにおい
て、25mg(レーン2及び3)、100mg(レーン4及び5)、または250mg(レーン6及び7)の両方のポ
リペプチドを含むアリコートを、細菌微結晶セルロースの存在下(BMCC(+))ま
たは細菌微結晶セルロースの不存在下(BMCC(-))でインキュベートした。図1
2Bでは、BMCCインキュベーション混合物からの非吸着分画を含む上清を、リン
酸膨潤セルロース(PASC(+))とともにさらにインキュベートした。非添加の対
照用サンプル(PASC(-))の結果も示した。
図13A及び13Bは、融合タンパク質の固定化及び使用の模式図である。図
13Aは、融合タンパク質の給餌バッチ生成、精製、及び固定化を示す。図13
Bは、再利用可能な発酵−固定化カラム装置を用いたセルロール材料のグルコー
スへの加水分解のための融合タンパク質の使用を示す。
図14は、2つの脱離可能ラベル組成物及びセルロース物質からの脱離可能ラ
ベルの酵素的脱離のための手段を示す。矢印は化学的部位を示し、四角形は特異
的プロテアーゼのプロテアーゼ切断部位、斜線を付した四角形はセルロース結合
ドメインを示す。
図15は、pH7かつ35℃における50mMリン酸バッファ溶液中でのCBDN1に
対
するヒドロキシセルロースの結合についての、等温的艇微少熱量分析データを示
す。
図16は、35℃かつpH7における50mMのPBS中でのヒドロキシエチルセ
ルロース及びPluronic P105の混合物に関する予備相平衡データを示す。
図17は、新規なCBDN1-融合技術に基づく親和性分離システムの模式図を示す
。過剰の塩を除去するための透析過程の後、必要ならば、因子Xa及び因子Xa
−CBD融合タンパク質の好適な発現システムのための、標的タンパク質(Assou
line,et al.,(1993)Protein Eng.,7: 787)に対して1位に挿入された因子X
aに対するIQGR特異的認識部位における切断により標的タンパク質を融合構造体
から回収することができる。プロセスを単純化するために、親和性分配過程の直
後に因子Xa切断による標的タンパク質の直接回収を用いることができる。
図18は、水中及び100mMクエン酸バッファ中でのUCON 50-HB-5100に関する実
験的曇点ダイアグラムを示す。10°(w/w)UCON溶液について、2成分混合物で
は323Kで相分離が起こり、バッファ含有システムでは312Kで起こった。
特別な実施態様の説明
相形成オリゴ糖ポリマーに結合する組成物の精製及び/または分離に用いるこ
とのできる水性相分離システムが提供される。一般に、この組成物は、目的とす
るポリペプチドまたは化学的部位に接合した、多糖類結合ドメイン(PBD)等の、
オリゴ糖ポリマーに高親和性を有するアミノ酸配列を含有する多糖類結合ペプチ
ド(PBP)を含む。しかし、多糖類結合ペプチドは、オリゴ糖ポリマーに結合する
任意のアミノ酸配列を含むことができる。PBPを調製する方法も提供され、P
BPは、多糖類のPBD、多糖類結合タンパク質の結合ドメイン、または多糖類
に結合できるように設計され加工されたタンパク質から誘導することができる。
PBPは、天然でも合成でもよい。PBPがPBDまたはPBDから誘導された
場合、アミノ酸配列は一般に、多糖類の加水分解酵素活性を実質的に欠くが、基
質結合活性は保持している。
相分離システムは、一般的に、相分離システム成分の、成分の混合の際におけ
る非相容性によって生成される2つの相を含む。システムの一方の成分は相形成
オリゴ糖であり、第2の成分は、オリゴ糖ポリマーと相容しない第2のポリマー
、特に硫酸塩、クエン酸塩等の強電解質といった相誘導剤であり、相分りっを誘
導するのに十分に高い濃度で存在する。例えば、相形成オリゴ糖が熱分離性ポリ
マーである場合、相分離は、生成すべき化合物と相形成ポリマーとを含む組成物
を、相分離が生ずる温度まで加熱することにより誘導することができる。
相分離システムを用いる過程は、多糖類結合ペプチドを含む組成物と相分離シ
ステムとを接触させることを含む。相分離システムは既に混合されたものでもよ
く、組成物は何れかの成分を乾燥形態(例えば親油化)に添加してもよい。一例
として、オリゴ糖ポリマーが組成物に添加され、それによりポリマーを再水和し
て相分離を誘導する。幾つかの応用では2以上の相を用いることができる。組成
物をオリゴ糖ポリマー相に分配するのに十分な時間の後、相が分離する。汚染タ
ンパク質の多糖類豊富相への分配(非親和性)は、システムのpH、ポリマー濃
度、及び分配電解質を調節することによって最小にする。操作の最適条件下では
、2つの水性相の多段階接触に次いで、標的組成物の完全又は部分的(しかし十
分な)精製が提供される。
対象となるポリペプチド又は化学的部位を含む組成物は、PBPを含む組成物
をポリマーから溶離することのできる除去溶液にポリマーを接触させることによ
りポリマーから取り外すことができ、または、PBPを含む組成物は、化合物と
PBPとの間にプロテアーゼ認識部位又は化学的切断部位を含むことにより酵素
的に除去することができる。後者の除去方法では、PBPはオリゴ糖ポリマーに
結合したままとなる。認識部位の例は、対応する酵素で特異的に切断されるコラ
ゲナーゼ、トロンビン、及び因子Xaを含む。例えば、低pH又はシアノゲンブ
ロミドに選択的な化学的切断部位も用いることができる。
切断を容易にするため、特異的切断酵素を切断酵素接合体として提供すること
ができ、この切断酵素はPBPに結合しており、PBPとは異なる基質結合性を
有し、可溶性オリゴ糖ポリマーに結合し、または同じ多糖類の全く異なる物理的
形状ではなく異なる多糖類に結合する。好ましくは、この第2のPBPは、第1
のPBPが結合しない不溶性多糖類に結合する。不溶性多糖類は、対象とする化
合物を含む混合物に添加して、切断酵素接合体を溶液から除去することができる
。溶液からの分離に続いて、切断酵素複合体は、不溶性多糖類から取り除いて再
利用することができる。あるいは、切断酵素複合体は、不溶性多糖類に既に結合
した形態、例えば、対象とする化合物を含む混合物を通過させるカラムの形態で
提供できる。
本発明は、今日使用されている水相分離システムに勝る幾つかの利点を有する
。オート麦又は大麦から得られるような、セルロース及び他のβ−グルカンなど
の炭化水素を含むオリゴ糖ポリマーは、豊富であり安価である。さらに、炭化水
素ポリマー及び他のオリゴ糖類に特異的に結合する種々のタンパク質が、本発明
のPBPの源として使用できる。一例として、本発明の相分離システムを用いた
融合タンパク質の分離及び/または精製手段として炭化水素に結合する炭化水素
ポリマー結合部分を含む融合タンパク質が調製できる。即ち、PBPの使用によ
り、相形成オリゴ糖ポリマーに結合できるPBPに結合することにより、任意の
ポリペプチドまたは化学的部位の分離及び/または精製のための一般的手段が提
供される。オリゴ糖ポリマーからのPBPの選択的結合は、単一のオリゴ糖ポリ
マー相分離システムを用いることにより、広範な化合物の精製及び/又は単離に
特に好ましいものにする。分離すべき各化合物について別々の相分離システムを
調製すること、即ち、各化合物に特異的なポリマー−リガンドを調製する必要が
ない。また、オリゴ糖は用いられている他の相分離用ポリマーに比較して多くの
結合部位を有するので、分配用リガンドに結合するポリマーの容量がかなり増大
する。
2相分離システムにおける1またはそれ以上の熱分離ポリマーの使用は、PB
Pが結合するポリマーを含む相の高親和性分離と、それに続くポリマーを回収及
びリサイクルするための簡単な方法というさらなる利点を与える。PBP化合物
は、ポリマーに特異的かつ強力に結合するが、高いpHにおいて、室温から生理
学的温度、一般的には40℃未満、通常は20℃の領域で水で溶離することによ
り容易に除去することができる。非タンパク質化合物では、PBPは、30℃、
pH7.0においてプロテアーゼK等の一般的プロテアーゼを用いたタンパク質
分解によって化合物から除去することができる。即ち、PBPは、化合物をオリ
ゴ糖ポリマーに結合させる手段を提供し、化合物は後に取り外される。相形成オ
リゴ糖に種々の親和性を持つ突然変異PBP又はPBDも、特別なシステム及び
/または応用に必要な親和性を変化させるために得られる。必要ならば、PBP
は、加水分解活性を持つタンパク質を含むポリサッカリダーゼ酵素全体までを含
んでもよく、PBPのみを含む配列が用いられる加水分解活性を実質的に含まな
くてもよい。後者は、基質の一体性を保持し、再利用できるべきである場合に望
ましい。上記のような多糖類の脱離溶液での処理は、多糖類の表面構造を変化さ
せない。マトリクスからPBP接合体を取り外す非特異的プロテアーゼの使用を
含む代替的方法は、接合体に直接作用し、多糖類表面は変えない。PBPと対象
化合物との間に、特異的試薬によって切断される結合基を導入することにより、
PBPはオリゴ糖ポリマーに結合させたまま、対象とする化合物のみを得ること
ができる。このシステムの他の鍵となる利点は、実験室的プロトコールから商業
的プロトコールに容量を線形的に比例させること、及び、システムが連続的プロ
セスとして進行できることを含む。
新規なポリペプチド組成物は、次式で表されるものを含む。
PBP−MR−X (1)
ここで:
PBDは、ポリサッカリダーゼの基質に高親和性を与え、任意にポリサッカリ
ダーゼ活性を実質的に欠いていてもよい多糖類または多糖類基質と結合する他の
タンパク質の基質結合領域からのアミノ酸の連続的配列として特徴づけられる。
PBPは、少なくとも多糖類に結合し相分離システムで用いるのに必要な最小数
のアミノ酸であり、相形成オリゴ糖に結合できることを更に特徴とする。
MRは、中間領域であり、結合であってもよく、2から30の炭素原子の短い
結合基または2から約20のアミノ酸を有してもよい。この領域は、融合タンパ
ク質の特異的切断を与えるアミノ酸配列、通常は、IgA1プロテアーゼまたは因子
Xa等の高い特異性のタンパク質分解酵素に認識されるものに相当する配列を含
んでもよい。
Xは、対象とする任意のペプチド又は化学的部位である。Xは、対象ポリペプ
チドの配列全部までを持つことを特徴都市、酵素、ホルモン、イムノグロブリン
、ペプチド、等であってもよい。
新規なポリペプチド組成物は、次式で表されるものを含む。
PBP−Z または (2)
PBP−MR−Z (3)
ここで:
PBP及びMRは上記の定義通りであり、Zは、PBPに結合された化学的部
位である。Zは、単に部位を表し、この部位の化学量は示していない。化学量は
変化しうる。
PBPは、本発明で用いられることが見出されたオリゴ糖に結合する酵素を含
む種々の源から得ることができる。2タイプのオリゴ糖が本発明で用いられるこ
とが見出され、(1)相分離システムにおけるオリゴ糖、及び(2)切断酵素の
除去に用いられるような固相システムで用いられるオリゴ糖である。相分離シス
テムのオリゴ糖は、一般的に、水溶液に可溶であり、PBP及び相分離できる対
象化合物を含む組成物に高い親和性及び結合する能力を持つという特徴を有し、
多糖類結合ペプチドを含む化合物を高度に豊富化、一般的に≧70%、好ましくは
≧80%とする。下記の表1は、他のポリマーまたは強電解質とともに水性2相シ
ステムを形成することが知られたオリゴ糖類の一部のリストである。
2相システムを形成すると思われる他の多糖類は、低分子量セロ多糖類(cello
saccharide);キトサン及び他のキチン誘導体;全ての水溶性グルカン(α、β
、及び/又は混合した結合かつ>3の重合度を持つもの)、修飾グルカン、及び
/または誘導グルカン;大麦またはオート麦β−グルカンなどの穀物β−グルカ
ン;及び、マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、キシログルカンを含
む。
2相システムを形成する多糖類ポリマーの他の群は、水中で熱分離する水溶性
両極性ポリマーを含む。ポリマーの2成分水溶液が、その曇点温度(CPT)を超え
て加熱されると、溶液層は2つの巨視的相に分離する。一方の相は、通常は下相
であるが、重いポリマー豊富なものであり、他方の相は典型的にはポリマーを殆
ど含まない。熱分離性を示すことが知られている多糖類ベースのポリマーは、メ
チルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、プロピルヒドロキシエチ
ルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロールを含む。しかし、実質
的に全ての水溶性β−1,4−結合セロ多糖類は、熱分離性を示すと思われる。
Jo
hansson,et al.,(1993).Macromolecules,26,4478; Harris,et al.,(1991
).Bioseparations,2,237; Alfred P.A.,et al.,(1992).Bioseparations,2
,363; 及びAlfred P.A.,et al.,(1994).J.Chromatog.,659,289。熱分離す
る他の水溶性ポリマーは、プロピレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリ
プロピレングリコール、及びエチレンオキシドとプロピレノキシドの直鎖状ラン
ダムコポリマー(商品名UCON及びPluronic)を含む。
固相回収システムでは、種々の多糖類基質が興味深い。これらは、セルロース
、例えば酢酸セルロース等のβ−1,4−グルコシド結合によって結合したD−
グルコピラノース単位からなる多糖類化合物;繰り返し骨格単位がβ−1,4−
D−キシロピラノースであるキシラン;β−1,4−結合したN−アセチル、2
ーアミノ−2−デオキシ−β−D−グルコピラノース単位からなる点でセルロー
スに類似したキチンを含む。上に挙げた様な多糖類に結合できる酵素は、本発明
において、それらの基質に結合できるアミノ酸配列の源として興味深い。
下記の表6は、可溶性グルカン(α、β及び/または混合結合)に親和性を有
する全ての結合ドメインを含む1またはそれ以上の可溶性/不溶性多糖類に結合
する結合ドメインを列挙する。C.fimiのエンドグルカナーゼCenAからのN1セル
ロース結合ドメインは、可溶性セロ多糖類に結合することが知られている唯一の
タンパク質であり、任意の可溶性多糖類に結合することが知られているタンパク
質の小さな組(small set)の一つである。また、表2から5に挙げたのは、推定
β−1,3−グルカン結合ドメイン(表2);連鎖球菌(streptcoccal)グルカン
結合配列(repeat)(Cplスーパーファミリー)を含むタンパク質(表3);キチン結合ドメ
インを持つ酵素(表4);及びデンプン結合ドメイン(表5)を含有するタンパ
ク質の例である。
興味深い結合特性及び特異性を持つ新たなPBPは、種々の異なる実験方法お
よび方法論を用いて多様な手法で同定及びスクリーニングすることができる。こ
れらは、NMRスペクトル(Zhu,et a;.,Biochemistry(1995)34:,Gehring,et
a al.,Biochemistry(1991)30: 5524-5531)、UV差分スペクトル(Belshaw,e
t al.,Eur.J.Biochem.(1993)211: 717-724)、蛍光(滴定)スペクトル(Mi
ller,et al.,J.Biol.Chem.(1983)258: 13665-13672)、UVまたは蛍光ス
トップド・フロー分析(De Boeck,et al.,Eur.J.Biochem.(1985)149: 141-
415)等のスペクトル(滴定)方法、親和性電気泳動(Mimura,et al.,J.chro
matography(1992)597: 345-350)または固定化モノまたはオリゴ糖類上の親和性
クロマトグラフィ等の親和性方法、濁度または比濁分析(Knibbs,et al.,J.B
iol.Chem.(1993)14940-14947)を含む析出又は凝集分析、競合阻害アッセイ(
定量的IC50の決定を含むものまたは含まないもの)、及び、示差または等温滴定
熱分析(Sigurskjoid,et al.,J.Biol.Chem.(1992)267: 8371-8376; Sigurs
kjoid,et al.,Eur.J.Biol.(1994)225: 133-141)、熱的CDまたは蛍光ス
ペクトルを用いたオリゴ糖の存在下または不存在下での(溶融)相対的タンパク
質安定性アッセイ等の種々の物理的又は物理化学的方法を含む。定性的及び(結
合または解離定数、IC50値、熱力学的パラメータ等の定量的)分析ともに、これ
らの方法で実施することができる。可溶性オリゴ糖ポリマーに高い親和性及び低
い親和性を有する両方のPBPの同定が興味の対象であり、例えば、PBP含有
化合物を豊富に含むオリゴ糖ポリマー相の分配及び/または単離に続くオリゴ糖
ポリマーの除去の容易性を向上させるといった特別な応用によっては、高い親和
性よりも低い親和性の方が有用である。
PBPは、残りの酵素からPBPをはさみ切ることによる酵素の単離及び精製
に従って得られる。相分離システムでの使用のために、PBPは可溶性相形成オ
リゴ糖への結合についてスクリーニングされる。NMR単独、NMA/熱分析、
親和性電気泳動単独、親和性電気泳動/競合アッセイ、及び結合等温線を含む多
くの方法の任意のものがスクリーニングのために使用できる。等温滴定マイクロ
熱分析(ITC)を用いた結合平衡測定が好ましい。結合平衡測定における等温滴定
マイクロ熱分析(ITC)の利点は、結合等温線が反応熱の実験によって決定される
ので、結合定数に加えてエンタルピー(及びエントロピー)が直接見積もれると
いう事実から導かれる。即ち、1回のマイクロ熱滴定により、結合等温線に従っ
て結合エネルギーの完全な特徴付けが得られる(Haynes,et al.,J.Colloid I
nterface Csi.,(1994)169: 313; Colloids & Surfaces,(1994)2: 517)。
一般的に、相分離のために、可溶性オリゴ糖に対するPBPの結合についての
Kaは、少なくとも弱い抗体−抗原相互作用の範囲、例えば、3103M、好まし
くは104M、最も好ましくは106Mである。PBPのオリゴ糖に対する結合
が発熱または吸熱であるとき、低温において、結合は各々増加または減少し、分
配過程の温度調節手段を提供する。
オリゴ糖ポリマー−PBP対の決定に加えて、相分離手段である、オリゴ糖ポ
リマーとともに用いられる相分離システムの第2の成分の評価をする必要もある
。相分離手段は、他のポリマー、または、十分な量の相誘導剤、一般的には塩、
通常は硫酸塩又はクエン酸塩等の強電解質、または、物理変化、例えばセロ糖類
ポリマーが熱分離性を持つ場合の温度などである。古典的なデキストラン/PE
Gシステムに匹敵する特性を持つがコストの低い分離システムを形成できるポリ
マー対の例は、デキストラン/PEGと同様に炭化水素とポリ(オキシ-エーテ
ル)との非相容性に基づくものを含めて多数ある(Skuse,et al.,Enzyme Micr
ob.Technol.(1992)14: 785参照)。これらの例は、ヒドロキシプロピルデンプ
ン(Tjerneld,et al.,Enzyme Microb.Technol.(1986)8: 417)、マルトデキ
ストリン(Szlag,et al.,ACS Symposium Series(1990)419: 38-52)、ヒドロ
キシプロピルセルロース(Skuse,et al.,Enzyme Nicrob.Technol.(1992)14:
785)、及びカルボキシメチルセルロース()を含み、それらは全てPEGと分離
システムを形成するのに良好に用いられている。
システム、及び/または、安定した2相分離システムが形成される全ポリマー
濃度、または、ポリマー及び他の相誘導剤濃度を決定するためのHaynes等の方法
(Fluid Phase Equilibria(1989)53: 463)を用いた誘導手段を改善するため、
選択された第1及び第2の成分の組み合わせの相平衡データが得られる。一般に
、PBP接合体は約10mMから約1Mのイオン強度緩衝媒質中、中性pHで、相形成
オリゴ糖に結合する。結合は、相分離システムの成分によって、4℃から少なく
とも70℃の温度で行われる。結合は、実質的に即座に起こり、温度は臨界的で
はない。一度PBP接合体が相形成オリゴ糖に結合すると、それはその相内に分
配される。
相分離システムの成分及び特別な応用のための最適な多党類結合ドメインが同
定されると、PBPは、ホスト細胞に、適切な多糖類結合部位をコードするDN
Aを含むDNA構造体を形質転換することによって調製される。「多糖類結合部
位」なる語は、少なくともポリサッカリダーゼまたは多糖類結合タンパク質の多
糖類結合領域の機能性部分を含むアミノ酸配列を意味する。「機能性部分」は、
対象とするオリゴ糖ポリマーのに結合するアミノ酸配列を意味する。好ましくは
、対象とするタンパク質をコードするDNAがPBP DNA配列に結合(ligate
)する。式(1)の組成物をコードする融合遺伝子、またはPBPDNA配列の
みが、真核細胞または原核細胞のホスト細胞において発現される。PBPのみが
調製された場合、必要ならば、発現され単離された多糖類結合ペプチドは、対象
とする化合物、即ち、タンパク質又は化学的部位と接合できる。
セルラーゼ遺伝子などのポリサッカリダーゼ遺伝子及び多糖類結合タンパク質
のための遺伝子の単離に用いられた技術は、合成、ゲノムDNAからの単離、c
DNAからの調製、または擦れ等の組み合わせを含めてこの分野で知られている
(USPN 5,137,819、5,202,247及び5,340,731参照)。可溶性オリゴ糖に結合する
幾つかのポリペプチド結合ドメインのための配列は知られている(図1参照)。
種々のポリサッカリダーゼ及び多糖類結合タンパク質をコードするDNAは知ら
れている。遺伝子を操作する多くの技術が良く知られており、制限、消化、切除
、結合、in vitro突然変異、プライマー修正、リンカー及びアダプターの採用な
ど
を含む(Sambrook,et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold S
pring Harbor LAboratory,Cold Spring Harbor,Nwe York,1989)。
一般的に、所望のDNAを得るための方法は、所望の特性を有するポリサッカ
リダーゼまたは多糖類結合タンパク質を発現する生物からの遺伝子ライブラリの
作製を含む。ドナー微生物のゲノムは、単離され、BamHI等の適当な制限酵素で
切断される。得られた断片は、対応する制限酵素で予め切断されたベクター分枝
に結合される。適当なベクターの例は、pBR322であり、それは制限エンドヌクレ
アーゼBamHIで切断できる。
ポリサッカリダーゼのアミノ酸配列も、cDNAまたはポリサッカリダーゼ遺
伝子またはポリペプチド結合タンパク質遺伝子に対するドナー細胞として対象細
胞からのmRNAまたはDNAから調製された遺伝子ライブラリをスクリーニン
グするためのプローブの設計に使用できる。ポリサッカリダーゼcDNA又は結
合タンパク質cDNA又はそれらの断片を用いることにより、他の微生物に見ら
れる構造的に関連した遺伝子が容易にクローニングできる。特に考慮されるのは
、ポリサッカリダーゼの触媒及び結合ドメインが分離している生物から得られる
遺伝子のヌクレオチド配列に基づくオリゴ糖ブローブを用いた、ポリサッカリダ
ーゼ活性を発現する生物からの遺伝子の単離であるが、他の多糖類結合タンパク
質も使用できる(例えば、Shoseyev,et al.,Proc.Nat'l.Acad.Sci..(USA)
(1992)89: 3483-3487参照)。
ポリサッカリダーゼまたは多糖類結合タンパク質の結合ドメインについての共
通配列を用いて開発したプローブは特に興味深い。今日までに特性化されている
C.fimiからのβ-1,4-グリカナーゼは、エンドヌクレアーゼA、B、C及びD
(各々、CenA、CenB、CenC及びCenD)、エキソセロビオヒドロラーゼA及びB(
各々、CbhA及びCbhB)、及びキシラナーゼA及びD(各々、Cex及びXylD)であ
る(Wong,et al.,(1986)Gene,44: 315; Meinke,et al.,(1991)J.Bacterio
l.,173: 308; Coutinho,et al.,(1991)Mol.Microbiol.5: 1221; Meinke,e
t al.,(1993)bactriol.,175: 1910; Meinke,et al.,(1994)Mol.Microbiol.
,12: 413; Shen,et al.,Biochem.J.in press; O'Neill,et al.,(1986)Ge
ne,44: 325; 及びMillward-Sadler,et al.,(1994)Mol.Microbiol.,
11: 375参照)。全ては種々の複雑度を有するモジュラータンパク質(図1)で
あるが、2つの特徴が共通している:独立して機能することのできる触媒ドメイ
ン(CD)及びセルロース結合ドメイン(CBD)である(MillWard-Sadler,et al.,(1
994)MOl.Microbiol.,11: 375; Gilkes,et al.,(1988)J.Biol.Chem.,263:
10401; Meinke,et al.,(1991)J.Bacteriol.,173: 7126; 及びCoutinho,et
al.,(1992)Mol.Microbiol.,6: 1242参照)。4つの酵素、CenB、CenD、CbhA
及びCbhB、フィブロネクチン・タイプIII(Fn3)配列(repeat)が、CDのN末
端をC末端CBDから分離している。酵素のCDはグリコシドヒドロラーゼの6
つのファミリーから来る(Henrisaat(1991)Biochem.J.,280: 309; 及びHenris
aat,et al.,(1993)Biochem.J.,293: 781参照);全ての酵素は、ファミリー
IIまたはCBDからのN−又はC−末端を有する(Tomme,et al.,Adv.Micr
ob.Physiol.,in press参照);CenCは、そのN−末端にファミリーIVからの
タンデムCBDを有する;CenB及びXylDは、各々、ファミリーIII及びIIか
らの第2の内部CBDを有する。Cex及びXylDは明らかにキシラナーゼであるが
、XylDではなくCeXはセルロースに低活性しか持たない。にもかかわらず、幾つ
かの他の細菌キシラナーゼと同様に(Gilbert,et al.,(1993)J.Gen.Microbi
ol.,139: 187参照)、それらはCBDを有する。類似のシステムは、関連する
細菌から得られる(Wilson(1992)Crit.Rev.Biotechnol.,12: 45; 及びHazlew
ood,et al.,(1992)J.Appl.Bacteriol.,72: 244参照)。C.fimiは、おそら
く他のβ-1,4-グリカナーゼを生成する。無関係な細菌である、例えば、Clos
tridium thermocellumは、20又はそれ以上のβ-1,4-グリカナーゼを生成す
る(Beguin,et al.,(1992)FEMS Microbiol.Lett.,100: 523)。
結合ドメインの共通配列の例は、図1に示したセルロース結合ドメインの共通
配列であり、エンドグルカナーゼCN1結合ドメインによって例示される。プロ
ーブは、全配列よりかなり短くできるが、少なくとも10、好ましくは少なくと
も14のヌクレオチド長でなければならない。より長いオリゴ糖類も有用であり
遺伝子の全長まで、好ましくは500未満、より好ましくは250末満のヌクレ
オチド長である。RNA又はDNAプローブが使用できる。一般に、結合ドメイ
ンは、結合領域と少なくとも40%の相同性を示し()、可溶性β-1,4-グルカン
と3103MのKaで結合するようにヌクレオチドでコードされる。アミノ酸比
較の分析は、PC/Gene(IntelliGenetics,Inc.)のプログラムを用いて実施でき
る。多重配列アライメント及び系統樹の作成にPCLUSTALも使用できる。
使用において、プローブは検出可能な方法(例えば、32P、3H、ビオチンま
たはアビディン(avidin))でラベルされ、遺伝子が探索される生物からの一本鎖
DNA又はRNAとともにインキュベートされる。ハイブリダイゼーションは、
一本鎖または二本鎖(ハイブリダイズした)DNA(又はDNA/RNA)が(
典型的にはニトロセルロース紙を用いて)分離された後にラベルによって検出さ
れる。オリゴヌクレオチドで好適に用いられるハイブリダイゼーション技術は、
当業者には周知である。プローブは、通常は特定を容易にするために検出可能な
ラベルと共に用いられるが、非ラベルのオリゴヌクレオチドも、ラベル化プロー
ブの前駆体としても、二本鎖DNA(またはDNA/RNA)の直接検出のため
に供される方法で用いるのにも有用である。従って、「オリゴヌクレオチドプロ
ーブ」なる語は、ラベル化及び非ラベル化形態の両方を意味する。
ポリサッカリダーゼまたは多糖類結合タンパク質のPBPを単離するために、
幾つかの遺伝子的方法が用いられる。一つの方法は、遺伝子の一部を除去し、次
いでフレーム内に残った遺伝子−ベクター断片を融合して切り詰めたタンパク質
をコードする変異遺伝子を得るために制限酵素を用いる。他の方法は、DNAの
5’及び3’末端から外的に、又は、遺伝子内の制限されたキャップから内的に
ヌクレオチドを全体的に削除するために、Bal31等のエキソヌクレアーゼの使用
を含む。遺伝子欠失方法は、短縮されたタンパク質分子をコードする変異遺伝子
をもたらし、それは基質又は多糖類結合能力を評価される。結合活性の評価に適
した基質は、上記の表2に挙げたものを含む。
多糖類結合領域をコードするヌクレオチド配列が同定されると、cDNAまた
は染色体DNAの何れかとして種々の方法で操作されて、発現生成物が上記式(
1)で表されるような構造を有する組成物が調製される。ヌクレオチド配列は、
対象とするポリペプチドをコードするDNA配列と融合させてもよい。成分ポリ
ペプチドの三次元構造が保持されるのが特に望ましい。断片の源及び所望のポリ
ペプチドの長さによって、制限は、キメラポリペプチドを構成するのに用いられ
る合成遺伝子に設計してもよい。可能ならば、制限部位は、ポリペプチドのアミ
ノ酸配列を不変のまま保持する。しかし、新たな制限部位が、タンパク質の活性
は変化させずにアミノ酸配列を変化させる場合もある。
発現カセットの構成の間、DNAの種々の断片が通常は適当なクローニングベ
クターでクローニングされ、DNAの増幅、DNAの修飾、又は配列、リンカー
等の結合又は除去による操作を可能にする。通常は、ベクターは細菌中で少なく
とも比較的高いコピー数で複製が可能である。グラム陰性菌、特に大腸菌(E.col
i)でクローニングするための多くのベクターが既に入手可能であり、pBR322、pT
Z、pUC等のようなベクターを含む。クローニングベクターは、ホスト細菌中で効
率的な複製システム機能を持つことを特徴とする。
クローニングベクターは、少なくとも1つの独特な制限部位、通常は複数の独
特な制限部位を持ち、多数の制限部位を有していてもよい。さらに、クローニン
グベクターは、形質転換体(transformant)の選択のための1またはそれ以上のマ
ーカーを有するであろう。これらのマーカーは、通常は、抗生物質、重金属、毒
ァ等の細胞毒剤に対する抵抗性、栄養要求性ホストの相補性、またはファージに
対する免疫性を提供する。ベクター及びカセットの適当な制限により、好ましく
は末端の修飾により、張出しにおけるチューイング・バック(chewing back)また
は充填により、平滑末端を提供するために、リンカーの添加により、テイリング
(tailing)により、ベクターの発現カセット又はその成分への結合及び接合のた
めに相補的末端が提供されうる。
カセットの作製におけるDNAの各操作の後、プラスミドはクローニングされ
て単離され、必要ならば、特別なカセット成分が分析されて正しい配列が得られ
ているかが確認される。操作の性質によって、所望の配列がプラスミドから摘出
されて他のベクターに導入されるか、または、必要ならば、プラスミドは制限さ
れ発現カセット成分が操作される。
幾つかの例では、ベクターが異なる複製システムを要求する異なるホストで複
製できるシャトルベクターが用いられる。これは、2つのホストで機能的なさら
なるマーカーを必要としてもしなくてもよい。そのようなマーカーが必要な場合
、これらはベクター中に導入可能で、プラスミド含有カセットでは、必要ならば
、
2つの複製システム及びマーカーが一方のホストから他方に輸送されてもよい。
選択のために、任意の有用なマーカーが使用できる。望ましくは、ネオマイシン
またはテトラサイクリン耐性が興味深い。しかし、選択用マーカーは極めて便利
であるが、形質転換された細胞のスクリーニングのための他の方法が当業者には
知られており、例えば、形質転換された細胞は、それらが作製する特異的な生成
物によってスクリーニングされ;所望の生成物は免疫学的又は酵素的方法によっ
て決定してもよい。
次いで、融合タンパク質をコードするDNAは、発現を供する種々の方法によ
って操作できる。細菌についての、例示的な転写調節領域またはプロモータは、
ラムダ左及び右プロモータ、trp及びlacプロモータ、Tacプロモータ等を含む。
転写調節領域は、例えば、成長媒質中の滋養剤または発現生成物の存在又は不存
在、温度などで、融合遺伝子の発現時間を変化させることのできる調節配列をさ
らに含んでもよい。例えば、融合遺伝子の発現は、バクテリオファージラムダP
Lプロモータ、バクテリオファージラムダOLオペレータ及び温度感受性リブレ
ッサを用いて温度によって調節される。プロモータの調節は、リブレッサとオペ
レータの相互作用を通して達成される。好ましいプロモータは、強いグルコース
-抑制非感受性Tacプロモータである。高レベル発現ベクターの例は、Graham等,
(1995)Gene 158: 51-54に記載されている。
発現カセットは、適当な細胞性ホストにおけるエピソーム維持のための複製シ
ステム内に含まれていてもよく、複製システム無しで提供されてもよく、ホスト
ゲノムと一体化できる。DNAは、形質転換、カルシウムリン酸析出されたDN
Aの使用、細胞をウイルスに接触させることによるトランスフェクト、DNAの
微小注入等の周知の方法でホストに導入できる。
融合タンパク質DNAが適当なホストに導入されると、ホストは成長して融合
タンパク質を発現できる。微生物ホストを用いてもよく、例えば、大腸菌等の細
菌、Saccaromyces,特にS.Cerevisiae,Streptomyces,Bacillus Pichiapastor
is,又はBHK及びCHO等の哺乳類細胞といった真核細胞を含む。組み換え生成物は
、野生タイプ又は他のグリコシレーションを有するグリコシル化でも非グリコシ
ル化でもよい。グリコシル化の量は、部分的に、特別なペプチド、及び、それ
が生成される生物に依る。即ち、大腸菌細胞における生成物の発現は、非グリコ
シル化生成物を生じ、昆虫細胞での生成物の発現は一般的に、哺乳類細胞におけ
る生成物の発現よりグリコシル化が少ない。酵母での発現は、高度なグリコシル
化をもたらす。
生成物がホスト細胞中に保持された誘導タンパク質の単離のために、細胞が収
穫され、溶解され、生成物が分離され、相分離システムを用いて単離及び/また
は精製される。幾つかの例では、構造遺伝子のリーディングフレームより上流及
びその中に、融合タンパク質の分泌を促すシグナル配列(分泌リーダ)を供する
のが望ましい。例示的な分泌リーダは、ペにシリナーゼ、イムノグロブリン、T
−細胞レセプター、外膜タンパク質などの分泌リーダを含む。正しいリーディン
グフレームにおける融合により、融合タンパク質が媒質中に分泌される。しかし
、大腸菌などの細菌発現系では、かなりの分画が細胞外媒質に漏出する(Ong,e
t al.,Biotech.Bioeng.(1993)42: 401)。生成物が分泌される場合、滋養媒
質及び相分離システムを用いて単離された生成物を回収することができる。活性
タンパク質を精製するために、タンパク質を再び折り重ねることを可能にできる
。
相分離システムは、生物学的流体、発酵液、細胞溶解液、または精製及び相分
離を誘導すべき生物学的化合物の他の源と組み合わせることができる。PBPを
含む成分のオリゴ糖相への分配に従って水性混合物を分離及び/または精製する
ために、相は分離され、PBPを含む組成物は種々の方法のうち任意の方法でポ
リマー相から分離される。これらは、分離したオリゴ糖相の、異なる相誘導ポリ
マーまたはPBPを含む組成物を抽出する塩との接触;例えば、酸または塩基、
尿素、エタノール、DMSOなどの分離剤をオリゴ糖相に添加することによる化学的
及び物理的条件の変化;結合反応が発熱または吸熱であるときは、結合親和性が
低下するのに十分な量の温度変化;並びに、PDP-オリゴ糖ポリマーからの対
象化合物を持つことを含む。
切断が用いられる場合、対象とするタンパク質又は化学的部位は、多糖類結合
領域と対象タンパク質又は化学的部位との間に存在する配列に特異的はプロテア
ーゼを用いることにより多糖類結合領域から容易に切断され、PBPはオリゴ糖
ポリマーに結合したまま残される。好ましくは、このプロテアーゼは、その残部
が対象とするポリペプチドのPBPからの切断を誘発するような形態で提供され
る。一例として、プロテアーゼが、対象ポリペプチドに結合した第1の多糖類結
合部位とは異なった基質特異性を持ち及び/または異なる結合特性を持つ第2の
多糖類結合部位に結合している切断酵素複合体としての切断プロテアーゼが調製
できる(Assuline,et al.,(1993)Protein Engineering,6: 787-792; Assouli
ne,et al.)。即ち、対象とする組み換えタンパク質からの結合ドメインの切断
は溶液内で行うことができ、次いで、切断酵素複合体は、第1の多糖類結合部位
が結合しない多糖類基質に結合させることによって除去できる。あるいは、切断
酵素複合体は、第1の多糖類結合部位が結合しない多糖類マトリクス上に固定化
することができる(Assouline,et al.,(1993)同上; Assouline,et al.,(_
)同上)。対象とする組み換えタンパク質又は化学的部位は、ポリマーに結合し
たままの汚染PBPを含むことなく、オリゴ糖ポリマーから分離される。また、
PBP複合体のPBP部分を完全に減成するために非特異的プロテアーゼを用い
ることもでき、即ち、例えば、約50mg/mlのプロテアーゼKで、37℃において
20分間処理することにより、オリゴ糖ポリマーから分離することができる。Di
r等,(1991)Bio/Technology,9: 1096-1099。
幾つかの例では、融合タンパク質自身が対象であってもよく、従って、融合タ
ンパク質の成分を分離するのではなく、オリゴ当ポリマーから取り外されるのが
融合タンパク質であってもよい。融合タンパク質をオリゴ糖ポリマーから脱離さ
せるために、低イオン強度の緩衝液又は水、あるいはアルカリpHの緩衝液また
はカオトロピック塩が必要とされる。脱離のための温度は臨界的ではないが、一
般的には10℃−40℃の範囲であり、通常は室温、即ち約20℃である。結合
した融合タンパク質は、水で繰り返し洗浄するか、連続水流で希釈する。一般的
に、pH9.5の炭酸塩バッファまたは6MのグアニジンHClが、この脱離過程に使
用される。希水酸化ナトリウム(約0.1M)が、好ましい処理である場合もある。
接着性を変えて水で脱離可能、又は必要なら不可能にするために、PBPの性質
を変化させてもよい。マトリクスへの脱離媒質の適用は、オリゴ糖ポリマーから
の融合タンパク質の放出を起こす。基質からの放出に続くPBP接合体の単離の
ために、種々の技術が使用できる。例えば、上記のように、多糖類表面を、PB
P
接合体を含まない脱離溶液で洗浄することができる。PBP接合体は、例えば、
pHのイオン強度を変化させて、PBP接合体をイオン交換媒体または第2の多
糖類マトリクスに再吸着させることにより脱離溶液から分離できる。
親和性相分離システムは、多くの用途がある。これらは、混合物中の成分の濃
縮、混合物中の成分の精製を含み、精製は2倍、一般的には20倍以上であり、
80から90%の精製も含む。精製倍数(fold purification)は、汚染物の除去
に対する特異的活性k等の増加で測定される。幾つかの応用では、この方法は、
細胞分離及び/または特別な細胞タイプの豊富化についても使用できる。例えば
、幹細胞の個体数は、細胞を細胞表面の炭化水素残基に結合するPBPのみ、ま
たは、特異的な結合対、例えばレセプターリガンド、例えばペプチドホルモン又
は他のホルモンであって、第2の成員、即ちレセプターが細胞表面に存在する結
合対の第1の成員が融合するPBPに接触させることによって豊富化できる。使
用できる他のリガンドは、抗−CD34等の抗体、及びIL−2等のサイトカイ
ンを含む。親和性相分配に続いて、細胞は、例えばトリプシンを用いて、分離さ
れたオリゴ糖ポリマー相から放出される。親和性相分離システムの剪断力は、他
の細胞分離方法よりかなり小さく、分離された細胞の損傷を少なくできる。
この技術の他の用途は、抽出の生体変換、即ち、特に生成物がフィードバック
して酵素反応の阻害剤となる酵素的過程における反応生成物の分配方法を含む。
そのようなシステムでは、酵素は酵素活性が保持されるようにPBPに結合して
いる。酵素の基質は、自然にオリゴ糖ポリマー相に分配されるものまたはPBP
に結合するものであり、生成物は、生成物が基質より疎水性であるときのように
、オリゴ糖ポリマー相に保持されず第2の成分に分配されるものである。このシ
ステムの第2の成分は、次いで除去され生成物が回収される。抽出生体変換シス
テムで用いられる酵素反応の例は、トリグリコシレーション、例えばβ-1,4-
結合したオリゴ糖甘味料のためのもの;混合エステル交換、例えば低級脂肪酸の
高級脂肪酸への変換のためのもの、及び、グリセロール生成、ペプチド合成のた
めのものを含む。PBPを保持する主体組成物は、PBPの基質への吸着が強力
かつ特異的であるので、多糖類支持体上の対象化合物の固定化手段として用いら
れる。
固定化されたシステムは、例えば、診断アッセイ用固体状試薬、酵素、抗体断
片、ペプチドホルモンなどを含む試薬の調製;クリアランス比率の減少に結びつ
いた薬物であって、セルロースが例えばカルボキシメチルセルロース等の可溶物
、又は、微結晶セルロース(アビセル)等の固体支持体のいずれかであり、薬物
がインターロイキン2等のポリペプチドであるもの;例えば、カルボキシメチル
セルロースに結合し、同じセルロース支持体に結合する、例えば輸送すべき薬物
の免疫特異性を向上させるアジュバントとともに用いられる薬物輸送(ドラッグ・デリバリー
);染料結合、例えば、塗料または染料の多糖類、例えばセルロース表面への
結合;例えば、紙及び布(コットン)への印刷;例えば、木片の処理のためのリ
グナーゼ等の酵素の標的化、例えば木材パルプの漂白のための、ポルフィリンの
標的化に対して、加水分解または相乗効果を与えること;例えばBt毒素や他の抗
微生物剤等の殺虫剤の植物表面への結合などの農業用途;例えば、有機体の根表
面への結合などの窒素固定;持続的肥沃剤放出;及び持続的殺菌剤放出における
用途が見出された。これらは、海水環境などの高い塩濃度の条件下でも、海水に
露出された表面の抗腐食のために使用でき、新鮮な水への移行が融合タンパク質
を除去する。
この方法で精製できる生物学的物質の例は、インターロイキン2、因子X、リ
グニナーゼ、及びTPA、あるいは、PBPと融合できる任意の他のペプチド及
びタンパク質を含む。他の例は、(真核細胞又は原核細胞または組織培地からの
)培養液、生物学的流体、組織抽出物、細菌、真菌、植物、動物、魚、及び家禽
を含む細胞溶解液からの抽出物、特に精製されたタンパク質等を含む。一般的に
、混合物は、この親和性分離システムを適用する前に、細胞破片を取り除くため
に浄化される。
以下の実施例は例示のために提供され、何ら限定するものではない。
実施例
略語
pNPC = p-ニトロフェニル-β-D-グルコシド;
HPA = ハイド・パウダー・アクスレ(hide powder axure)
gCenA及びgCex = C.fimiからのCenA及びCexのグリコシル化形態
;
ngCenA及びngCex = 組み換え大腸菌からのCenA及びCexの非グ
リコシル化形態;
RPC = 逆相クロマトグラフィ;
SDS-PAGE = ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動;
a-Pro/Thr = 合成Cex Pro/Thrボックスに対して検出されたラビッ
ト抗血清;
PMSF = フェニル−メチルスルホニルフルオリド。
生物学的培地寄託
以下の寄託を、American Type Culture Collection(ATCC),12301 Park Lawn D
rive,Rockville,Maryland 20852に行なった。大腸菌C600におけるプラスミドp
cEC-2上でクローニングした遺伝子CenAの誘導体を、1986年4月23日に寄託し、AA
TCC寄託番号67101が与えられた。プラスミドpEC-1上でクローニングした遺
伝子Cexの誘導体を、1986年5月27日に寄託し、AATCC寄託番号67120が与え
られた。大腸菌JM83、pUC12-1.1cexを、1986年4月23日に寄託し、AATCC寄託番号
67102が与えられた。pTugA(寄託番号L24193)、pTugAS(寄託番号
L24367)、C.fimi CenA(寄託番号M15823)、C.fimi CenC(寄託番
号X57858)の全ヌクレオチド配列は、GenBankに寄託された。
材料
KlucelまたはHPCは、Aqualonから供給される。HPCは、セルロース分子から誘
導され、セルロース-2-ヒドロキシプロピルエーテルとして知られている。
NatrosolまたはHFCは、Aqualonから供給される。HECは、ヒドロキシエチル側
鎖を有する変性セルロースポリマーであり、セルロース-2-ヒドロキシエチルエ
ーテルとして知られている。HECは、白色の非イオン性パウダーである。HECは、
次の商品名で市販されている:Alcoramnosan/Liporamnosan(Vevy);Tylose H シリーズ
(Hoechst Celanese/Colorants & Surf.)。
Bermocoll EまたはEHECは、Berol Nobel ABから供給される。EHECは、エチル
セルロースのエチレングリコールエーテルである。EHECは、Aqualonから、Aqual
on EHECなる商品名で市販されてもいる。
ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)は、Sigmaから供給される。HPMC
は、メチルセルロースのプロピレングリコールE−足るであり、メチルヒドロキ
シプロピルセルロースとしても知られている。HPMCは、次の商品名で市販されて
もいる:Banecel/Culminal HPMC(Aqualon); Viscontran MHPC(Henkel)。
デキストランは、Pharmacia Biotechから供給される。
Pluronicは、BASFから供給される。Pluronicは、エチレンオキシドとプロピレ
ンオキシドのブロックコポリマーである。Pluronicの固体形態(F-シリーズ)及びペ
ースト形態(P-シリーズ)の両方が用いられる。
実施例1
CBDN1の単離
プラスミドの保持及び組み換えタンパク質の生成のためのホスト細胞として、
大腸菌JM101(SupE,thi-1,Δ(tac-proAB),[F'traD36,proAB,tacIqZΔM15](
Yanish-Perron,et al.,Gene(1985)33: 103-119)を用いた。培地を、液体トリ
プトン−酵母抽出物−リン酸塩媒質(TYP)中またはルリア液(Luria broth)(カナ
マイシン(100mg/ml)を添加したLB寒天)上で、30℃で成長させた。
pTguKN1(図5参照)を宿した大腸菌JM101株の終夜培地を、1ml当たり100mgの
カナマイシンを添加したTYPで500倍に希釈し、2.0-3.0の最適密度になるまで
30℃で成長させた。PBDN1生成は、イソプロピル-1-チオ-β-D-ガラクトピラ
ノシド(IPTG)を、最終濃度が0.1mMとなるまで添加することによって誘発し、細
菌は30℃で18時間さらにインキュベートした。培地上清を、13000xgで10
分間遠心分離(4℃)して浄化し、細胞を除去した。PBDN1の精製に、以下のよ
うにセルロース上の親和性クロマトグラフィを用いた。浄化した培地上清を、微
結晶セルロース(Avicel)(50mgL-1)で、随時攪拌してPBDN1を結合させながらイン
キュベート(4℃)した。セルロース懸濁液を、ブフナー漏斗上でガラスフィルタ(W
hatman GF/A)を通して濾過し、pH7.0の50mMリン酸カリウム中の1MのNACl溶
液
で簡単に洗浄した。結合したPBDN1は、水で脱離し、限外濾過で濃縮した。部分
的に精製されたPBDN1は、次いで、pH6.0の20mMリン酸カリウムバッファで平衡さ
れたアニオン交換かラム(MonoQ)に入れ、1ml/分の速度で作動させた。タンパク
質はカラムに緊密に結合し、塩勾配(0-1N NaCl,pH6.0)で除去した(図7参照
)。PBDN1は、300mMの塩で回収された(図7、ピーク1)。汚染タンパク質は、よ
り緊密に結合し、より高い塩濃度で除去された(図7、ピーク2)。
実施例2
親和性電気泳動による、CBDN1及びCBDN1N2に結合した
HEC、大麦β-グルカン及びキシランの分析
HEC及び大麦β-グルカン等のDP315を持つ可溶性多糖類へのCBDN1及びCBDN1N2
の結合を特定及び評価するために、親和性電気泳動(Miura,et al.,(1992)J.
Chromatography 597: 345-350)を用いた。元の連続円板電気泳動方法を不連続
方法に換えた。BioRad電気泳動システムの同じプレートに、一方は多糖類(0.1%
w/v)、他方はリガンドを含まない2つの無垢のゲルを順次調製した。これによ
り、可溶性多糖類の有または無における分析が、同条件で行われること、及び、
観察される効果(結合グルカンの存在における阻害)が異常な電気泳動的移動の
結果ではないことが確保される。各ゲルの負の対照としてBSAを用いた。タンパ
ク質(各5mg)を、ゲル上に載せた。電気泳動は、pH8.2-8.8で2から3時間、4
℃において、天然条件下で行った。CBDN1及びCBDN1N2は、HEC及び大麦β-グルカ
ンと強く相互作用し、その結果、オリゴ糖類を含むゲル(+)におけるそれらの
移動は、β-グルカンの存在しないゲルでの移動に比較して、顕著に阻害された
(図9A及び9B参照)。CBDN1及びCBDN1N2は、キシランへの親和性は示さず、
この繰り管の存在するゲルにおいて、存在しないゲルでの移動に比較して阻害さ
れた移動は観察されなかった(図9C参照)。N1及びN1N2は、各々、CBDN 1
及びCBDN1N2を表す。
実施例3
CBDN1及びCBDN1N2−融合タンパク質に関する
オリゴ糖結合定数の等温滴定マイクロ熱分析測定
親和性分離システムに好適なリガンドの組を特定することを目的として、広範
な水溶性オリゴ糖に対するCBDN1の結合熱力学を測定するのに、マイクロ熱分析(
microcalorimetry)を用いた。データを下記の表7に示す。図15は、35℃で
pH7における、50mMのPBS中のヒドロキシエチルセルロース(HEC)に結合するCB
DN1ついて、Calorimetry Sciences Corp.のmodel 4200 ITCを用いて測定した可
逆的結合等温線データを示す。CBDN1は、HECに強く結合し、弱い抗原−抗体相互
作用の範囲の平衡結合定数を持つ。CPDN1に結合する大麦β-グルカンは、これら
の条件で更に強い(Ka=85,500M-1)。両方のオリゴ糖について、CPDN1結合は、
親和性分離システムに現在使用されている殆ど全てのPEGベースの親和性リガ
ンド(例えば、Chibacron blue-PEG,Procion red-PEG,dinitrophenyl-PEG,二
酢酸-PEGよりさらに緊密である。これらの相対的に高い結合親和性は、単一のオ
リゴ糖鎖が多数のCPDN1融合タンパク質に結合する能力と組み合わされて、この
親和性分離システムにおいて容量(capacity)及び選択性の両方が高くなることを
示唆している。N1結合の熱力学の要旨を下記の表8に示す。CPDN1のHEC及びβ
-グルカンへの結合は共に強い発熱であり、結合が低温で増加すること、及び、
温度低下が分配過程に温度上昇が溶離過程に使用できることを示している。
実施例4
HEC及びPluronic P105の混合物の相平衡分析
35℃でpH7における50mMのPBS中のHEC及びPluronic P105(ポリ(エチレ
ングリコール)-ポリ(プロピレングリコール)コポリマー)の混合物について
、Heynes等(Fluid Phase Equibria,(1989)53: 463)の方法を用いて相平衡デ
ータを得た。図16に示すように、約3%(wt/wt)のPluronic P105及び2%のHECを
超える任意の全ポリマー濃度において、安定な2相分離システムが形成され、か
なり大きな範囲の2相組成物及び親和性分配に有用な平衡連結線長を与える。
実施例5
オリゴ糖ポリマーからのCBDN1の好適な溶離条件の
等温滴定マイクロ熱分析測定
温度、塩濃度、及び、エチレングリコールまたは尿素などの共溶媒のタイプ及
び濃度の関数として平衡解離定数を測定することによる、PBPN1−炭化水素複合
体の水素結合構造を分解させるために設計される好適な溶離条件を決定するため
に、ITCも用いられた。
実施例6
CenC CBD遺伝子断片とC.fimiエンドヌクレアーゼA(CenA)遺伝子断片
との融合体を含む発現ベクターの構築及び融合タンパク質の特性化
ベクターの構築
プラスミドpTZ-JC2(図10A参照)は、Smal及びHindIIIで完全に消化された
。3.9kbpの断片が回収された。プラスミドpUC18-1.6 CenA_PT(図10B参照)
は、HpaI及びHindIIIで完全に消化されて1.1kbpの断片が回収された。これらの3
.9kbp及び1.1kbpの断片は、次いで、結合されて、pTZ-JC13(図10C)を与え
た。このベクターを、大腸菌JM101の形質転換に用いる。
融合タンパク質の酵素的特性化
pTZ-JC13のコードされた発現生成物(融合タンパク質)は、元のCenA及びその
単離した触媒ドメインp30との比較における、アビセル、細菌性微結晶セルロー
ス(BMCC)及びリン酸膨潤セルロース(PASC)に対する触媒活性について特性化され
た。特異的活性は、固定量の基質から固定したアッセイ条件下で精製される可溶
性還元糖の量で決定した。還元糖は、熱分析アッセイで測定し、グルコース標準
を用いて決定した。ポリペプチドの濃度は、Coonasiie Brilliant Blue G-250(
Gilkes,et al.,(1988)J.Biol.Chem.,263: 10401-10407)の結合によって決
定した。
融合タンパク質のタンパク質分解に対する感受性の評価
融合タンパク質の使用における主な考慮点は、タンパク質分解に対する耐性を
含む種々の条件下でのポリペプチドの安定性である。融合タンパク質の、リンカ
ー配列無しにおけるタンパク質分解に対する感受性は、C.fimiプロテアーゼで評
価された。C.fimiプロテアーゼによる融合タンパク質の切断は、SDS-PAGEによっ
てモニターされた(図12参照)。融合タンパク質の安定性は、CenAの安定性と
比較された。プロテアーゼ濃度とタンパク質分解条件は、結果を最適化するため
に変化させた。
融合タンパク質の結合特性の評価:示差吸着分析
異なるセルロース異形に対するPBD-融合タンパク質の親和性を決定するために
、種々のセルロースマトリクスに対する結合が、結合分画のSDS-PAGE分析によっ
て単純に評価される。この分析は、PBDN1は非結晶セルロース(PASC)に結合する
が、結晶セルロース(BMCC)には結合しないことを示した。これらの異なる結合特
性は、一方の成分の他方の存在下での選択的除去の可能性を与える。第1段階で
BMCCを添加してCenAを除去する。第1段階の後に溶液中に残ったPBD-融合タンパ
ク質は、次いでPASCへの吸着によって除去される(図12)。セルロース濃度に
対する種々のタンパク質成分の濃度は、アッセイの間に広く変化させ、セルロー
スの不飽和、飽和及び過飽和の影響を評価した。
この選択的除去または異なる成分の結合は、融合タンパク質の加工及び精製に
おける使用について重要な意味を持つ。そのようなプロセスは、融合タンパク質
からのPBDのタンパク質分解的除去を含む一方、CBD-プロテアーゼを用いて多糖
類に結合して対照化合物を遊離させる。プロテアーゼは、次いで、そのセルロー
ス(例えば、BMCC)への結合によって除去され、純粋な化合物が放出される。
実施例7
オリゴ糖ポリマーベースの親和性相分離
を用いたベロ細胞の分離を媒介する
二官能性融合タンパク質の生成及び精製
細胞株、細胞列、及び成長条件
化学物質は、HPLCの分析等級であった。組み換えDNA実験は、アンシピリン
(Behringer Mannheim GmbH,Mannheim,独国)を100mg/mlで添加したLB媒質中
における大腸菌JM101中で、37℃で行った。高レベル発現実験及び大規模タン
パク質製造は、アンシピリン(100mg/ml)を添加したTYP媒質(1リットル当たり、16
gトリプシン、16g酵母抽出物、5g NaCl、2.5gK2HPO4)中、37℃で成長させた
大腸菌R1360で行った。細菌媒質成分は、Difco Laboratories(Detroit,MI)から
のものである。振動フラスコ培地の振動速度は、250rpmに設定した。培地は、0.
15mMのイソプロピル-D-チオガラクトシド(IPTG,Sigma Chemical Co.,St.Lou
is,MO)で誘発した。接着実験に用いたベロ(アフリカミドリザル、kidney-ATC
C CCL81)細胞は、Tフラスコ中の、10%のNCS(Gibco BRL)を添加したDMEMまた
はDMEM/F12媒質(Gibco BRL,Gaitherburg,MD)中で、37℃かつ5%のCO2で
保持した。
組み換えDNA技術
全ての組み換えDNA操作は既に述べたように行った(Sanbrook(1989)同上
)。二本鎖DNAは、アルカリ溶解法で調製した。DNA制限及び修飾酵素は、
操作者の推薦に従って用いた。DNA断片は、寒天ゲル電気泳動によって分離し
た。大きなDNA断片は、GeneCleanTM(Bio101,La Jolla,CA)を用いて単離し
た。小さなDNA断片(100bp未満)は、液体窒素法で単離した。凍結した反応
性大腸菌が、全ての形質転換に用いられた。オリゴデオキシヌクレオチドは、AB
I 380A DNA合成機(Applied Biosystems,Foster City,CA)で合成し、C18
カートリッジクロマトグラフィで精製した。オリゴデオキシヌクレオチドのアニ
ーリングは、配列バッファ(40mM Tris-HClまたはpH 7.5,20mM MgCl2,50mM Na
Cl)中、74℃で10分間実施し、次いで4℃で除冷した。DNAは、修飾T7
DNAポリメラーゼジ(Sanger,et al.,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA(1977)74:
5463-5467)を用いたデオキシ鎖停止法によって配列した。
ポリペプチド分析
ポリペプチドは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(S
DS-PAGE)によって分解した。ゲルをCoomassie Brilliant Blue R250(BioRad,R
ichmond,CA)で染色した;ImageQuantTMソフトウェアを備えた走査光度計(Com
puting Densitometer,Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)を用いてバンドを
定量化した。純粋なCBPN1/RGD標準を、純粋なCBD/RGD(Scopes.Anal.Biochem
.(1974)59: 277-282)に対して決定された励起係数を用いて280nmにおいて決定
した。ウェスタンブロットは、初期抗体としてラビット抗-CenA血清を、第2の
抗体としてセイヨウワサビペルオキシダーゼ(Gibco BRL)に接合したヤギ抗-ラ
ビット血清用いて実施した。
オリゴ糖結合アッセイ
これは、実施例2と同様に実施した。
CBPN1/RGDの大規模製造及び精製
CBDN1は、Wierzba,et al.,Biotechnol.and Bioeng.(1995)47: 147-154に
記載されているようにして生成したが、CBDN1に対するコード配列は、R1360/pTZ
18U-CBD/RGD構造体におけるアルロマナーゼfimiエンドヌクレアーゼA(CenA)の
セルロース結合ドメイン(CBD)をコードする配列に置き換えた。この構造を含む
大腸菌をアンピシリン(100mg/ml)及びIPTG(0.15mM)を添加したTYP媒質中、1
2-L発酵器中で、37℃で成長させた。細胞は、31,000gの遠心分離(Shaples-St
okes Division,Pennwalt Corp.,Warminster,PA)により培養媒質から分離し
た。培養媒質及び細胞分画中のCBDN1/RGDは、実施例4に示したようなHECとPluc
tonic piosの混合物を用いた親和性相分離を用いて別々に精製した。培養媒質は
、GF/Cガラスフィルタ(Whatman International,Maidstone,UK)を通して濾過
し、細胞残物を除去した。培養媒質を相分離システムに添加した。他の水性2相
分離システム(例えば、Joshi,et al.,Bioseparations,(1990)11: 311)の方
法論に従うと、分離がCBDN1融合のHECへの結合によって極めて促進されるという
重大な相違がある。図17は、システムの模式図であり、培養上清又は細胞抽出
液からのCBDN1-融合タンパク質の親和性抽出が、市販のGraesserタイプ接触器(
殆どの大規模分離システムで採用されている)または混合器−沈殿器バター(mix
er-settler batter)(Haynes,PhD Thesis,University of California at Bar
keley(1991))の何れかで起こる。CBDN1-融合タンパク質を含む炭化水素豊富な
抽出相
は、生成物のバック抽出のために第2の混合器−沈殿器バターに輸送される一方
、ポリ(オキシ-エーテル)豊富な相は非相溶性塩で剥奪され、次いで親和性接
触器にリサイクルされる(Haynes,et al.,AIChE J.,(1991)37: 1401)。結合
した標的タンパク質を含む炭化水素豊富な抽出相に、通常は硫酸塩又はクエン酸
塩である塩を十分に添加することにより、相分離が生ずる(Walter,et al.,Pa
rtitioning in Aqueous Two-Phase Systems,Academic Press(1985))。リガン
ド-タンパク質複合体の解離、即ち、生成物回収の簡単な手段を導く相分離には
、2M以上の塩濃度が必要である。CBDN1及びHECの間の強い発熱結合は、解離が、
温度の温和な上昇または水素結合分解性共溶媒の添加の何れかを通しても達成し
うることを示している。過剰な塩は、透析濾過(diafiltration)または他の脱飽
和(desatting)方法によって除去できる。懸濁液は、4℃で終夜、温和に攪拌し
た。溶離液は、1-dDカットオフ膜(Amicon Division,W.R.Grace & Co.,Bever
ly,HA)を用いた限外濾過により濃縮して(50nM GdmC1未満まで)dH2Oと交換し
た。CBDN1/RGD溶液(5から12mg/ml)は、濾過滅菌(0.2mm)して−20℃で保存
した。
大腸菌細胞は、50mMリン酸カリウムバッファ(pH7.0)で洗浄し、3mMのEDTAを
添加した150mLの同バッファ中に再懸濁し、50mLのFrech pressure cell(SLM Ins
truments,Urbana,IL)中で破壊した。細胞抽出液にフェニルメチルスルホニル
フルオリド(1mM)及びペプスタインA(1mM)を添加してタンパク質分解を最小限に
した。細胞残物は、4℃において、17,400gで30分間遠心分離することによっ
て除去した。上清を、相分離システムに添加し、発酵液について上述したように
、CBDN1/RGDを精製した。
細胞分離アッセイ
細胞は、トリプシン及びEDTAでディッシュから剥離し、0.01%のダイズトリプ
シン阻害剤(sigma)を含むDMEM媒質で1度洗浄し、阻害剤無しのDMEM媒質で2回
洗浄した。全部で4×106の洗浄した細胞は、血清を含まない培養媒質中のCBDN1
である。37℃で1時間インキュベートした後、結合したCBDN1/RGDを持つ細
胞を、親和性相分離システムに添加した。HEC相の分離の後、HECから細胞を放出
させるためにトリプシンを添加し、遠心分離により細胞を回収した。細胞の生存
は、ト
リパンブルー(trypan blle)排除を用いて検査した。
実施例8
アビセルに固定化したβ-グルコシダーゼ融合タンパク質
を用いたセロビオースからのグルコースの生成
この方法は、エンドグルカナーゼ−エキソグルカナーゼの共インキュベートと
、それに続く、得られたセロビオース混合物のβ-グルコシダーゼが固定化され
たアビセルカラムへのチャンネリングを用いる(図13B参照)。この方法は以
下の通りである。発酵容器では、エンドグルカナーゼとエキソグルカナーゼの両
方が、減成すべきセルロース材料を含む媒質に添加される。酵素は、固定した時
間だけ反応させ、媒質に可溶なセロビオースを生成する。費やされた全媒質と酵
素は、まずアビセルカラムを通し、エンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼ
の両方を固定化及び濃縮する。セロビオースを含む溶離液は、固定化したβ-グ
ルコシダーゼPBDCexを具備する第2のアビセルカラムに通し、セロビオースをグ
ルコース単位に加水分解する。エンドグルカナーゼ及びエキソグルカナーゼは、
第1のカラムから溶離によって再生される。両方のカラムは、精製及び酵素的変
換のために数回再利用できる。
実施例9
CBDN1-アルカリホスファターゼ融合タンパク質発現カセットの調製
TNphoAは、大腸菌アルカリホスファターゼ遺伝子であるphoAから、そのシグナ
ル配列('phoA)を差し引いたものを含むトランスポゾンTn5の誘導体である。正し
いリーディングフレームにおける発現された遺伝子への転位挿入は、PhoA融合タ
ンパク質を生成する。標的遺伝子がタンパク質輸送シグナルを含む場合、これら
は、融合タンパク質の直接分泌が可能である。この分泌は、酵素が細胞外に分泌
されたときにのみ存在するアルカリホスファターゼ活性によって検出できる。Tn
phoAは、多重クローニング部位を持つプラスミドにおけるC.fimi CBDN1コード配
列とのphoA遺伝子融合体の生成に用いられる。対象とするタンパク質をコードす
る遺伝子は、多重クローニング部位(mcs)にクローニングされ、融合タンパク質
と
して発現される。遺伝子生成物は、HEC-Pluronic IOS CBDN1での親和性相分離に
よって生成される。
遺伝子融合体の調製及び分析
CBDN1との遺伝子融合を生成するために、TnphoAでの転移的突然変異が用いら
れた。CBDN1を含むプラスミドはpTugKN1である(図5及び6参照)。
転移現象は、トランスポゾンITnohoA-1(Gutierrez,et al.,J.Mol.Biol.(
1987)195: 289-297)を含む欠陥ラムダ相を持つ大腸菌CC118(pTugKN1)の感染によ
って媒介される。大腸菌CC118はphoA遺伝子に欠失を含む。CBDN1を持つフレーム
のCBDN1コード領域への転移的挿入は、細胞外媒質を標的とするCBDN1-phoA融合
タンパク質を生成する。カナマイシン(トランスポゾン−誘導)及びアンシピリ
ン耐性について選ばれたコロニーは、色原体基質5-ブロモ-4-クロロ-3-イン
ドリルホスファート(XP)上で、アルカリホスファターゼについてスクリーニング
された。PhoA+コロニーからのプラスミドDNAが形質転換され、上記のように
選択されスクリーニングされた。PhoA+コロニーは、Congo red(Greenwood,et
al.,FEBS Letters(1984)2: 259-263)で染色されたカルボキシメチルセルロ
ース(CMC)プレート上でエンドグルカナーゼ活性をスクリーニングされた。所望
のペプチドは、PhoA+、EngA-、及びアンシピリン及びカナマイシン耐性である。
プラスミドDNAは、PhoA+、EngA-コロニーから単離され、CBDN1に正しい方
向でTnphoA挿入を有するコロニーに対する制限消化及び寒天ゲル電気泳動で分析
された。これらのクローンの幾つかは、フレーム外挿入を持ち、融合体のタンパ
ク質生成物を見るときに明らかになる。CBDN1-PhoA融合タンパク質は、HEC等の
可溶性オリゴ糖への結合について分析された。TnphoAの正確な挿入位置は、鎖停
止法を用いたDNA配列形成によって決定した。
融合タンパク質の精製
融合タンパク質を含む透明な大腸菌細胞抽出液を、融合タンパク質のHECポリ
マーへの結合を促進する、バッファ中のHEC-pluranic 105親和性相分離システム
に適用した。HEC相をPluranic 105相から分離した後、温度を上げることにより
融合
タンパク質を解離させ、融合タンパク質を回収した。回収した分画を、アルカリ
ホスファターゼ活性についてアッセイし、酵素ピークをイオン交換又はゲル濾過
クロマトグラフィでさらに精製した。精製条件を変化させ、アルカリホスファタ
ーゼ活性の回収を最適化した。
パラメータ(±標準誤差を加えた)は、両逆数形態でプロットした吸着データ
から計算した。Ka及びaについての値は、実施例3Cに詳述したように、[No
]=101mmol格子残基・gセルロース-1を用いて計算した。アビセル、BMCC及び
再生セルロース(RC)を含むセルロースに対するPBPCex及びキチンの吸着及び相対
的親和性は、USSN5,340,731の図15及び16に示した。USSN5,340,731の図17
は、多糖類の少なくともPBPが、例えば染料又は色素等のタンパク質又は歯学的
部位のような対象リガンドに結合したハイブリッドタンパク質を含む本発明の組
成物に対するCEBCexの結合に対する洗剤添加の影響を示している。セルロースか
らの2つの異なる脱離可能なラベル改組(recomposition)の酵素的脱結合の例を
図14に示した(上記)。
実施例10
単一熱分離ポリマーシステム
一つの部類の親和性濃縮及び分離システムは、CBDN1又は他の可溶性多糖類結
合ドメインが親和性を有する単一の熱分離性多糖類を用いる。この属(ファミリー)の
多糖類は、メチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、プロピルヒ
ドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む。
これらのシステムは、培養中に培養上清に外生成される可溶性オリゴ糖結合ドメ
インを含む融合/ハイブリッドタンパク質の結合及び分離、または、細胞溶解、
浸透圧ショック等に従う可溶性オリゴ糖結合ドメインを含む細胞内融合/ハイブ
リッドタンパク質の結合及び分離のいずれにも用いられる。いずれにシステムで
も、プロセスは以下の通りである:熱分離性多糖類を、露出された融合タンパク
質を含む培養上清または溶解液に、流動点(current point)温度より低温で添加
する。この熱分離性多糖類と培養上清又は溶解液を混合し、多糖類の流動点温度
より上に達するまで温度を徐々に上昇させる。残りの溶液中にポリマー豊富な相
が形成
されたとき、ポリマー豊富相を回収し、融合タンパク質を多糖類から溶離するこ
とができる。このとき、残りの溶質を全て含有する残りの溶液は廃棄できる。
このプロセスは、4つの過程に分けられる:熱分離性多糖類の、オリゴ糖結合
タンパク質又はオリゴ糖結合ドメインを含む任意の融合タンパク質を含有する水
溶液への添加及びポリマの前記タンパク質への接触並びに結合;混合条件下での
CPTを超える温度への序序の昇温;水豊富及びポリマー豊富相の分離を誘発す
るためのCPTを超える温度における混合の排除(これは、重力静置または遠心
分離による促進によっても達成できる);及び(標的タンパク質を含む)ポリマ
ー豊富相の回収並びに標的とするオリゴ糖結合タンパク質又はオリゴ糖結合ドメ
インを含む融合タンパク質の溶離。
実施例11
1又はそれ以上の熱分離性ポリマーを含む親和性水性2相システム
CBDN1に親和性を有する1又はそれ以上の熱分離性ポリマーを含む水性2相シ
ステムを作製する(以下の表参照)。これらのシステムは、ドメインが結合する
ポリマーを含む相の高い親和性分離を可能にし、次いでポリマーは簡単な方法に
よって回収及びリサイクルできる。
CBDN1及び他のオリゴ糖結合タンパク質に結合できる4つの異なるセルロース
ベースのポリマーを、2つの非セルロースポリマーと組み合わせて用い、多数の
新規な水性2相システムを形成した。形成された水性2相システムの特性は、以
下に議論する。
Pluronic−Klucelシステム
8つの異なるPluronicを、3つの等級のKluelとともに用いた。用いたPluroni
cは、F68、F77、F108、P84、P103、P104、P105及びP123である。Klucelの等級は
、Klucel H、l及びMであった。
Pluronic F68-Klucel H:各ポリマーを少なくとも13%(全重量%)含む溶液から
2相システムを形成した。
Pluronic F68−Klucel L:各ポリマーを少なくとも13%(全重量%)含む溶液か
ら
2相システムを形成した。
Pluronic F68−Klucel M:12%(w/w)を超えるポリマー濃度で相分離が観察された
。
Pluronic F77−Klucel H:各ポリマー9%の範囲の溶液で相分離が観察された。上
相は透明で下相は濁っていた。
Pluronic F77−Klucel L:各ポリマー10%(w/w)の範囲の濃度の溶液で相分離が観
察された。
Pluronic F77−Klucel M:各ポリマーを少なくとも10%(全重量%)含む溶液か
ら2相システムを形成した。
Pluronic F108−Klucel H:各ポリマーを少なくとも10%(全重量%)含む溶液か
ら2相システムを形成した。
Pluronic F108−Klucel L:各ポリマーを少なくとも10%(全重量%)含む溶液か
ら2相システムを形成した。
Pluronic F108−Klucel M:各ポリマーを少なくとも9%(全重量%)含む溶液か
ら2相システムを形成した。
Pluronic P103−Klucel H:約6.5%のPluronic及び7.1%のKlucelの濃度について
分離が観察された。
Pluronic P104−Klucel H:4.1%のPluronic及び3.8%のKlucelの濃度について分
離が観察された。
Pluronic P105−Klucel H:4.5%のPluronic及び2.8%のKlucelの濃度について相
分離が観察された。低濃度での2相システムは粘稠ではなかった。
Pluronic P105−Klucel L:5.0%のPluronic及び3.5%のKlucelの濃度で分離が起
こった。この範囲の溶液での2相システムは粘稠ではなかった。40℃より上で
は相熱分離は低かった。
Pluronic P105−Klucel M:低くても、3.9%のPluronic及び2.5%のKlucelの濃度
で相分離が観察された。下相は、38℃で粘稠となって濁った、
Pluronic P123−Klucel H:5.6%のPluronic及び4.0%のKlucelの濃度で2相シス
テムが形成された。
デキストラン(Dextran)−Natrosolシステム
3つの等級のDextranを、3つの等級のNatrosolとともに用い、新規な水性2
相システムを形成した。Dextranの等級は、T40、T70及びT50の等級を含み、Natr
osolの等級は、250 HR、250 LR及び250 MRを含む。
Dextran T40−Natrosol 250 LR:各ポリマー10%の範囲の濃度の溶液から水性2
相システムを形成した。
Dextran T70−Natrosol 250 LR:約5.2%のDextran及び5.0%のNatrosolの溶液か
ら水性2相システムを形成した。
Dextran T500−Natrosol 250 LR:両方のポリマー5.3%の溶液から水性2相シス
テムを形成した。
Plironic−デキストラン(Dextran)システム
4つの等級のDextranを、4つの等級のPluronicとともに用い、本発明に有用
な新規な水性2相システムを形成した。用いたDextranの等級は、T40、T500及び
T2000である。用いたPluronicは、F68、F77、F108及びP105を含む。低ポリマー
濃度及び低粘度の点から、試験した殆どの組み合わせについて、優れた相分離特
性が観察された。
Pluronic F68−Dextran T40:各ポリマー約9.0%の濃度で相分離が観察された。
Pluronic F68−Dextran T70:各々7.0%及び5.9%のPluronic及びDextranの濃度に
ついて相分離が観察された。
Pluronic F68−Dextran T500:各ポリマー約6.8%の濃度で水性2相システムが形
成された。
Pluronic F68−Dextran T2000:各ポリマー約9.0%の濃度で水性2相システムが
形成された。
Pluronic F77−Dextran T40:10.0%のPluronic及び9.2%のDextranの濃度におい
て水性2相システムが形成された。
Pluronic F77−Dextran T70:各ポリマー約8.2%の濃度の溶液で相分離が起こっ
た。
Pluronic F77−Dextran T500:両方のポリマーについて7.0%の濃度で水性2相シ
ステムが形成された。
Pluronic F77−Dextran T2000:両方のポリマーについて10.7%の濃度で相分離が
観察された。
Pluronic F108−Dextran T40:各ポリマー約7.0%の濃度で水性2相システムが形
成された。
Pluronic F108-Dextran T70:7.0%の範囲の濃度で水性2相システムが形成され
た。
Pluronic F108−Dextran T500:3.9%のPluronic及び3.4%のDextranの濃度におい
て相分離が起こった。
Pluronic F108−Dextran T2000:3.4%のPluronic及び3.9%のDextranの範囲の濃
度において水性2相システムが形成された。
Pluronic F105−Dextran T40:各ポリマー8.0%の範囲の濃度で水性2相システム
が形成された。
Pluronic F105−Dextran T70:6.3%の濃度のPluronic及びDextranにおいて水性
2相システムが形成された。
Pluronic F105−Dextran T500:各ポリマー6.0%よりやや低い濃度で分離が起こ
った。
Pluronic F105−Dextran T2000:各ポリマー6.0%の範囲の濃度で相分離が起こっ
た。
Klucel−デキストラン(Dextran)システム
3つの等級のKucelを、4つの等級のDextranと組み合わせて用い、新規な水性
2相システムを形成した。Klucelの等級は、Klucel H、 L及びMであった。Dextr
anの等級は、T40、T70、T500及びT2000であった。
Klucel H−Dextran T40:各々6.8%及び8.3%の濃度のKlucel及びDextranにおいて
、水性2相システムが形成された。
Klucel H−Dextran T70:各ポリマー6.8%の濃度で、水性2相システムが形成さ
れた。
Klucel H−Dextran T500:3.0%より僅かに大きな濃度で、相分離が起こった。
Klucel H−Dextran T2000:3.2%の範囲の濃度で、相分離が観察された。
Klucel L−Dextran T40:4.0%より大きな濃度の溶液で、相分離が観察された。
Klucel L−Dextran T70:各ポリマー3.6%の濃度で、水性2相システムが形成さ
れた。
Klucel L−Dextran T500:3.9%の濃度で分離が観察された。
Klucel L−Dextran T2000:3.5%のKlucel及び3.1%のDextranの濃度で、相分離が
観察された。
Klucel M−Dextran T40:3.1%より僅かに大きな濃度で水性2相システムが形成
された。
Klucel M-Dextran T70:3.5%の範囲の濃度で、相分離が観察された。
Klucel M−Dextran T500:3.5%のポリマー濃度で、相分離が観察された。
Klucel M−Dextran T2000:4.0%より低い濃度で水性2相システムが形成された
。
HPMC−デキストラン(Dextran)システム
SigmaのHPMCを、5つの異なる等級のDextranとともに用い、新規な水性2相シ
ステムを形成した。用いたDextranの等級は、T40、T70、T500、T2000及びデキス
トラン硫酸ナトリウム(Sodium Dextran Sulpate)である。
HPMC−Dextran T40:各ポリマー3.0%より低い濃度で相分離が観察された。
HPMC−Dextran T70:3.8%のHPMC及び4.6%のDextranのポリマー濃度で分離が観察
された。
HPMC−Dextran T500:3.4%より低い濃度で相分離が起こった。
HPMC−Dextran T2000:4.0%に近い濃度で分離が起こった。
HPMC−Sodium Dextran Sulfate:2.9%のHPMC及び4.1%のデキストラン硫酸ナトリ
ウムのポリマー濃度から分離が起こった。
HPMC−Pluronicシステム
SigmaのHPMCを、5つ等級のPluronicとともに用い、新規な水性2相システム
を
形成した。Pluronicは、P-シリーズから用い、P84、P103、P104、P105及びP123を含
む。
HPMC−Pluronlc P84:6.3%のHPMC及び7.8%のPluronicの濃度で相分離が観察され
た。この濃度で、上相は透明であり、この溶液が相境界に近いことは殆ど示さな
い。
HPMC−Pluronic P103:4.0%より低い濃度で水性2相システムが形成された。
HPMC−Pluronic P104:3.6%の範囲の濃度の溶液で分離が起こった。
HPMC−Pluronic P105:5.5%の範囲のポリマー濃度で相分離が観察された。
HPMC−Pluronic P123:5.5%のHPMC及び6.4%のPluronicの濃度で相分離が起こっ
た。
実施例12
セルロースベースのポリマーとCBDとの相互作用の親和性電気泳動分析
4つのセルロースベースのポリマーに対して、この分子と、Cellulomonas fim
i CenCのセルロース結合ドメイン(CBDN1)のN末端との間の相互作用を決定する
ために親和性電気泳動分析を用いた。CBDN1及びCBDN2は、4つのセルロースベー
スポリマー全てに対して別々に試験された。対照として、セルロース分子に結合
しないウシ血清アルブミン(BSA)を用いた。結果を以下にまとめる。
Klucel(HPC)
pH7において、Klucel H及びKlucel Lと、CBDN1及びCBDN1N2の間の強い結合
性相互作用が観察され、その結果、ゲル上の泳動で全てが失われた(図9参照)
。
Natrosol(HEC)
NatrosolとCBDN1及びCBDN1N2との強い結合が観察された(図9参照)。
Bermocoll E(EHEC)
2つの等級のBermocoll EのCBDN1及びCBDN1N2とについて、結合性相互作用を
研究した。電気泳動アッセイによる測定によれば、両方のポリマーは、CBDN1及
びC
BDN1N2のいずれかに強く結合した。
ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)
HPMCは、電気泳動アッセイによる測定によれば、CBDN1及びCBDN1N2のいずれか
に強く結合した。
現在の親和性分離システムは、ポリマー鎖当たりに1または2のリガンドが存
在することからもたらされる低いリガンド密度によるそれらの容量及び溶解力に
よって制限されている。ポリマー濃度は通常15重量%未満であり、1:1また
は2:1というリガンド対ポリマーの化学量を持つ親和性分離システムは、通常
5から50の(汚染物に対する)標的タンパク質分離因子(separation factor)
を有する。これらの分配因子は、生成物の濃縮には十分以上であるが、常に所望
の純度を、1又は2段階の抽出プロセスでコスト効率よく提供するとは限らない
。また、古典的な親和性分離システムは、ポリマーリガンド接合体を調製するの
に必要な化学物質の高価さによっても制限される。これらのコスト及び容量的制
限は、相形成ポリマーの一つのモノマー単位が親和性リガンドとして供される場
合に除去できる。CBDN1の種々の水溶性セルロース基質への精妙な選択的結合は
、組み換えタンパク質の連続的精製のための新たな、コスト効率の良い、高い応
用性を持つ親和性分離システムを与える。CBDN1の標的タンパク買又はペプチド
への発生学的結合は、センチモル量の電解質の存在下で可溶性炭化水素に結合し
、融合相手の生物学的活性を保持する融合をもたらす。
本明細書で挙げた全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する技術分野の当
業者のレベルを示す。全ての刊行物及び特許出願は、ここに、個々の刊行物及び
特許出願各々が、特別にかつ個々に、参考文献として取り入れるべきことが示さ
れているのと同じように、その同一内容の参考文献として取り入れられる。
以上、本発明を詳細に説明したが、当業者が、添付する請求の範囲の精神又は
範囲から離れることなく、本発明に多くの変化又は修飾を施すことができること
は言うまでもない。
【手続補正書】特許法第184条の8第1項
【提出日】1997年8月21日
【補正内容】
請求の範囲
1.混合物中の他の成分から多糖類結合ペプチドを含有する化合物を精製する方
法であって、
前記混合物及び前記化合物に結合する相形成オリゴ糖ポリマーを含む溶液の相
分離を導いて、前記化合物が前記オリゴ糖ポリマーを含む相に分配されるように
し、
前記オリゴ糖ポリマー相を回収し、
前記化合物を前記オリゴ糖から解離させることによって、前記混合物に比較し
て精製された前記化合物の溶液を得ることを含んでなる方法。
2.相分離が、相分離誘発剤を用いて導かれる請求項1記載の方法。
3.前記オリゴ糖ポリマーが熱分離性ポリマーであり、相分離が、前記溶液を相
分離が生ずる温度まで加熱することによって導かれる請求項1記載の方法。
4.前記オリゴ糖ポリマーが、β−1,4−グリカンである請求項1記載の方法
。
5.前記β−1,4−グリカンが、セルロースである請求項4記載の方法。
6.前記セルロースが、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロ
ース、エチルヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルセルロース
からなる群から選択される請求項5記載の方法。
7.前記多糖類結合ペプチドが、ポリサッカリダーゼまたは多糖類結合タンパク
質の多糖類結合ドメインから導かれる請求項1記載の方法。
8.前記ポリサッカリダーゼがセルロースである請求項7記載の方法。
9.混合物の他の成分からポリペプチドを精製する方法であって、
第1の成分としての水性溶液に可溶であり前記ポリペプチドが結合する相形成
オリゴ糖ポリマーと、第2の成分としての相分離誘発剤とを有する相分離システ
ムと前記混合物とを所定条件下で接触させることにより、前記ポリペプチドを前
記オリゴ糖ポリマーを含有する相に分配し、ただし、前記ポリペプチドは多糖類
結合ペプチドを含み、
前記オリゴ糖ポリマー相を回収し、
前記化合物を前記オリゴ糖から解離させることによって、前記混合物に比較し
て精製された前記化合物の溶液を得ることを含んでなる方法。
10.前記ポリペプチドが、多糖類結合ペプチドと高分子とを含んでなる融合ポ
リペプチドである請求項9記載の方法。
11.前記融合ポリペプチドが、前記多糖類結合ペプチドと前記高分子との間に
プロテアーゼ認識配列を有する請求項10記載の方法。
12.前記プロテアーゼ認識配列が、前記多糖類結合ペプチドとは異種構造であ
る請求項11記載の方法。
13.第1の成分としての多糖類結合ペプチドが103Mから107MのKaで結
合する相形成オリゴ糖ポリマーと、第2の成分としての相分離誘発剤とを含有し
てなり、前記第1及び第2の成分が、各々相分離を導くのに十分な量存在し、前
記第1の成分が、ヒドロキシエチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロ
ース、及びメチルセルロースからなる群から選択される2相分離システム。
14.前記多糖類結合ペプチドが、C.finiエンドグルカナーゼCから導かれる
請求項13記載の2相分離システム。
15.前記多糖類結合ペプチドがCBDN1である請求項14記載の2相分離シス
テム。
16.多糖類結合ペプチドと2相分離システムとを含み、前記2相分離システム
が、第1の成分としての多糖類結合ペプチドが103Mから107MのKaで結合
する相形成オリゴ糖ポリマーと、第2の成分としての相分離誘発剤とを含有して
なり、前記第1及び第2の成分が、各々相分離を導くのに十分な量存在する組成
物。
17.前記第2の成分が、ポリエチレングリコールポリマー、デキストラン、及
び、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのコポリマーからなる群から選択
される請求項13記載の2相分離システム。
18.多糖類結合ペプチドを含む化合物を、混合物の他の成分から精製するため
の組成物の使用方法であって、前記組成物が、可溶性オリゴ糖類に結合するが結
晶性セルロースには結合しないセルロース結合ドメインを含む方法。
19.前記結合ドメインがCBDN1である請求項18記載の方法。
20.混合物から多糖類結合ペプチドを含有する化合物を分離する方法であって
、
前記混合物を、水性媒体に可溶であり前記化合物に結合する熱分離性のβ−1
,4−を結合したオリゴ糖ポリマーとともに、相分離が起こる温度まで加熱して
、前記化合物が分配されたオリゴ糖ポリマー相を得、
前記混合物の他の成分から精製された前記化合物を含む前記オリゴ糖ポリマー
相を回収することを含んでなる方法。
21.第3の成分として、前記オリゴ糖ポリマーに結合する多糖類結合ペプチド
を含む組成物を含有する請求項13記載の2相分離システム。
22.不溶性多糖類に結合する多糖類結合ペプチドを含んでなる切断酵素複合体
。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S
Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ
,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU,
CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,GE,H
U,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ
,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,
MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,R
O,RU,SD,SE,SG,SI,SK,TJ,TM
,TR,TT,UA,UG,UZ,VN
(72)発明者 トウメ,ピーター
カナダ国 ブリティッシュコロンビア V
6L 1X2 ヴァンクーヴァー ダブリ
ュ トゥウェンティエイス アヴェニュ
2930
(72)発明者 キルバーン,ダグラス ジー
カナダ国 ブリティッシュコロンビア V
6S 1T4 ヴァンクーヴァー ダブリ
ュ トゥウェンティナインス アヴェニュ
3728