KR19990035882A - 가용성 올리고사카라이드 결합 도메인을 기초로 한 분리 및 농축 시스템 - Google Patents

가용성 올리고사카라이드 결합 도메인을 기초로 한 분리 및 농축 시스템

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KR19990035882A
KR19990035882A KR1019980700543A KR19980700543A KR19990035882A KR 19990035882 A KR19990035882 A KR 19990035882A KR 1019980700543 A KR1019980700543 A KR 1019980700543A KR 19980700543 A KR19980700543 A KR 19980700543A KR 19990035882 A KR19990035882 A KR 19990035882A
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polymer
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cellulose
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KR1019980700543A
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찰스 에이 헤인즈
피터 톰
더글라스 지 킬번
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팜 윌리암 엔
유니버시티 오브 브리티시 콜롬비아
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Abstract

본 발명에 따라서 생물학적 조성물의 새로운 분리 및(또는) 정제 방법이 제공된다. 이 생물학적 조성물은 폴리사카라이드 결합 펩티드로 이루어지며 재조합 DNA 기술에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 이 방법에서, 생물학적 조성물을 함유하는 용액은 결합 펩티드가 결합하는 상 형성 올리고사카라이드와 혼합되어 상 분리가 유도된다. 그후에, 생물학적 조성물을 함유하는 상은 단리된다. 상 분리는 상 분리 유도제를 이용하거나, 또는 올리고사카라이드 중합체가 열분리 중합체일 때 온도를 중합체의 탁점 온도 이상으로 증가시킴으로써 유도된다.

Description

가용성 올리고사카라이드 결합 도메인을 기초로 한 분리 및 농축 시스템
서문
미생물계에서의 발현에 의한 단백질의 생성은 아주 가치있고 의학적으로 중요한 단백질의 중요한 공급원이 되었다. 재조합 단백질의 정제 및 회수는 발효 공정의 설계에 있어서 중요한 사항이다. 전통적인 단백질 정제 수단은 생성물을 단리하는데 사용될 수 있지만, 더욱 최근에는 수성 2상 추출 시스템이 인슐린과 같은 고투약량 치료약, 및 3-옥소스테로이드 이소머라아제, 알코올 데히드로게나아제 및 포스포프럭토키나아제와 같은 공업용 단백질을 포함한 단백질 생성물의 대규모 정제를 단순화하기 위한 수단으로서 상당한 산업적 관심을 받아왔다. 그 결과, 현재에는 각종 2상 시스템이 단백질 정제 및 세포 분리 분야 둘다에 대해 이용가능하다. 수성 2상 시스템에서의 추출은 고활성 수율(즉, 거대한 수성 환경은 정제 중의 단백질의 불활성화를 최소화함), 신속한 평형화 방법, 용이한 규모 비율 증가, 및 가장 중요하게는 연속 가공을 비롯한, 재조합 단백질 및 펩티드의 대규모 가공에 독특한 잇점을 제공한다.
수성 2상 분배 시스템의 기술적 타당성은 몇몇 시스템에서 100,000 L 규모로까지 입증되었다. 그것은 수용성이지만 비상용성인 2가지의 중합체 또는 수용성 중합체 및 강전해질을 물에 첨가함으로써 형성된다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 그의 낮은 가격 및 광범위한 분자량 분별에서의 이용성으로 인해 많은 공업용 2상 시스템에서 중합체 성분 중의 하나로서 제공된다. 분별된 덱스트란, a-1,3 분지화된 a-1,6-글루코사카라이드는 제2 중합체로서 제공되기도 한다. 그러나, 많은 다른 탄수화물 중합체를 포함한 많은 다른 수용성 중합체도 또한 사용된다. 수성 2상 시스템은 각 상이 분리 유도 성분 중의 하나에는 풍부하고 다른 성분에는 거의 결여된 상태로 주로 물을 함유한다. 발효 브로쓰로부터 얻은 단백질 및 다른 생고분자의 혼합물이 수성 2상 시스템에 첨가될 때, 각 유형의 단백질은 2상 형성 성분에 대한 그의 상대적 친화력 뿐만 아니라 그의 크기, 계면 화학 및 순 전하량에 독특하게 좌우되어 분배된다.
통상의 수성 2상 시스템에서의 상대적으로 낮은 분배 계수 및 선택성의 부족은 통상의 분배 시스템의 가변성과 친화 리간드의 독특한 결합 선택성을 혼합한 친화도 분배 시스템의 개발의 동기가 되었다. 대부분의 경우에, 생물 특이적 리간드는 상 형성 중합체, 일반적으로 PEG의 한 말단 또는 양 말단에 공유 결합된다. 그 후에, 상 형성 중의 중합체의 강력한 분배는 평형 상 중 하나로의 리간드의 축적을 야기시킨다. 리간드에 대한 표적 단백질의 강한 친화력과 결합된, 고불균형의 분배는 친화도 분리 및 농축의 기본 배경이다.
그러나, 통용되는 친화도 분배 시스템은 몇몇 공업 용도에 이용되긴 하지만, 그것은 중합체 사슬 당 단 하나 또는 두개의 리간드의 존재로 인한 낮은 리간드 밀도에 의해 그의 용량 및 분해능이 제한된다. 중합체 농도가 일반적으로 15 중량% 미만이기 때문에, 중합체 화학양론에 대해 1:1 또는 2:1 리간드를 갖는 친화도 분배 시스템은 일반적으로 5 내지 50의 표적 단백질 분리 팩터(불순물의 것에 상대적임)를 생기게 한다. 이러한 분리 팩터가 생성물 농축에 더욱 충분하긴 하지만, 그것은 일반적으로 비용 효과적인, 1 또는 2 단계 추출 과정에서 원하는 생성물 순도를 제공하지는 않는다. 전통적인 친화도 분배 시스템은 또한 중합체-리간드 콘쥬게이트를 형성하는데 필요한 화학 작용의 비용에 의해 제한된다. 예를 들면, PEG에 대한 리간드의 콘쥬게이션은 말단 히드록실 기를 브로마이드, 클로라이드, 또는 에폭시드와 같은, 더욱 반응성인 친전자체로 치환하는 것을 필요로 한다. 이어서, 두번째 친핵성 공격 반응은 중합체 및 리간드를 공유 결합시키는데 필요하다. 리간드 중합체 콘쥬게이트는 또한 정제될 각 단백질 또는 단백질류에 대해 특별하게 만들어져야 한다.
수성 2상 분리에 있어서의 최근의 발전은 수성 2상 시스템과 온도 유도된 상 분리를 결합시키는 것이다. 지금까지, 이러한 시스템은 상부 상 중합체로서 열분리 중합체를 사용하고 하부 상 중합체로서 덱스트란 또는 히드록시프로필 전분을 사용하였다. 정제 단계에 이은 온도 유도된 상 분리는 중합체를 생물학적 생성물로부터 분리하고 재순환할 수 있도록 한다. 이러한 형태에서, 이 과정은 열분리 중합체를 회수하는 잇점을 갖지만, 표적 단백질이 열분리 중합체에 대해 독특하고 강한 친화력을 갖지 않는다는 분명한 단점을 갖는다. 이러한 2상 시스템에 올리고사카라이드 결합 도메인 기술을 이용하면 중합체를 회수하고 재순환시키는 간단한 방법에 의해 이어지는, 도메인이 결합하는 중합체 함유 상으로의 고친화도 분리가 가능할 것이다. 그러므로, 목적하는 단백질을 정제하기 위한 신속하고 경제적이며 고용량의 방법을 개발하는 것, 특별하게는 일반적인 중합체-리간드 콘쥬게이트를 사용할 수 있는 방법을 개발하는 것이 중요한 일이다.
참조 문헌
상 형성 올리고사카라이드를 조사하기 위해서는 다음 문헌(Zaslavsky, Aqueous Two-Phase Partitioning, Marcel Dekker, Inc.: New York (1995); Albertson, P.A., Partitioning of Cell Particles and Macromolecules, 3rd ed., Wiley Interscience: New York (1986); Walter, H. Brooks, D.E., and Fisher, D., Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems, Academic Press: Orlando, FL (1985))을 참조하면 된다.
다음 참조 문헌은 열분리 중합체에 관한 것이다: Malcolm, and Rowlinson, (1957). Trans. Faraday Soc., 53, 921; Bailey and Callard, (1959). J. Appl. Polym, 1, 56; Horne, et al. J. Colloid Interface Sci., 35, 77; Saeki, et al. J. Chem Soc. Faraday Trans. 1, 79, 975; Fujishige, et al. (1989) J. Phys. Chem., 93, 3311; Galeav and Mattiasson, (1993). Enzyme Microb. Technol., 15, 354; and Chen and Hoffman, (1995). Nature, 373, 49.
엔도글루카나아제 C에 관한 참조 문헌은 다음과 같다: Moser et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 55: 2480-2487; Molecular Microbiology (1991) 5: 1221-1233; Coutinho, et al., Molecular Microbiology (1992) 6: 1243-1252; and Coutinho, et al., FEMS Microbiology Letters (1993) 113: 211-218. b-1,4-글리카나아제를 조사하기 위해서는 문헌(Gilkes, et al. (1991) Microbial Reviews 55: 303-315; and Miller, Jr., et al. (1995) Proc. 6th Int. Conf. on Biotechnology in the Pulp and Paper Industry, Vienna, Austria)을 참조하면 된다.
발명의 요약
중합체가 올리고사카라이드 중합체이고 분리 및(또는) 정제될 조성물이 올리고사카라이드 중합체에 결합하는 리간드로 이루어진 중합체-리간드 콘쥬게이트를 기초로 한, 수성 상 분리 및(또는) 정제 시스템, 및 그의 제조 및 용도가 제공된다. 리간드는 상 형성 올리고사카라이드 중합체에 결합할 수 있는 것으로 특징지워지는 아미노산 서열인 폴리사카라이드 결합 펩티드(PBP)이다. 이 조성물은 일반적으로 발효 브로쓰, 세포 용해질, 생물학적 유체, 또는 PBP에 융합된 당해 화학 성분 또는 고분자로 이루어진 화합물을 함유하는 다른 유체이다. 상 분리 시스템으로는 하나 이상의 상 형성 올리고사카라이드 중합체 및 상 유도 중합체, 다른 상 유도제 또는 상 분리를 유도하는 수단을 들 수가 있다. 이 방법은 올리고사카라이드 중합체 상으로 분배되는, 조성물과 상 분리 시스템을 접촉시키고, 이어서 상 분리를 유도하고 조성물을 단리하는 것을 포함한다. 이 조성물은 저이온 강도, 고 pH를 갖거나 또는 카오트로프제를 함유하는 제거 용액에 의해 올리고사카라이드 중합체로부터 제거될 수 있다. 또한, 특이적 또는 비특이적 프로테아제를 사용하여 화합물과 폴리사카라이드 결합 성분 사이에 프로테아제 인식 서열을 혼입시켜 올리고사카라이드 중합체에 결합된 채로 남아있는 폴리사카라이드 결합 성분으로부터 화합물을 효소적 제거할 수 있다. 프로테아제가 사용되는 경우, 그것은 제1 폴리사카라이드 결합 성분이 친화력을 갖지 않는 결정성 폴리사카라이드에 대해 친화력을 갖는 제2 폴리사카라이드 결합 성분에 결합되어 제공될 수 있다. 임의로, 프로테아제는 차후의 고상 폴리사카라이드로부터의 용출에 의해 재순환될 수 있다. 별법으로, 제2 폴리사카라이드 결합 성분에 결합된 프로테아제는 폴리사카라이드 결합 펩티드가 결합하지 않는 고상 폴리사카라이드 지지체에 결합되어 제공될 수 있다. 본 발명은 PBP에 결합될 수 있는 단백질 및 다른 화합물의 분리 및(또는) 정제에 이용될 수 있다.
본 발명은 리간드가 가용성 상 형성 올리고사카라이드에 결합한 중합체-리간드 쌍을 이용하는 친화도 상 분리에 의한 폴리펩티드 및 다른 화합물의 분리 및(또는) 농축 방법에 관한 것이다. 본 발명은 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) 셀룰라아제로부터의 셀룰로스 결합 도메인을 친화 리간드로서 함유하는 화합물에 대해 친화력을 갖는 가용성 올리고사카라이드로 이루어진 상 분리 시스템의 사용에 의해 예증된다.
도 1은 셀룰로모나스 피미 엔도글루카나아제 C(CenC)(Coutinho et al. Mol. Microbiol. (1991) 5: 1221-1233)의 셀룰로스 결합 도메인(N1 및 N2) 및 CceCelCCE(클로스트리듐 셀룰로리티컴(Clostridium cellulolyticum)으로부터의 셀룰라아제(Bagnarda-Tardif et al. Gene (1992) 119: 17-28), MxaEgl(믹소코커스 크산터스(Myxococcus xanthus)로부터의 β-1,3-글리카나아제)(Quillet et al. Gene (1995) 158: 23-29), SreCel1(스트렙토마이세스 레티쿨리(Streptomyces reticuli)로부터의 셀룰라아제)(Schlochttermeier et al. Mol. Microbiol. (1992) 6: 3611-3621), 및 TfuEl(터모모노스포라 푸스카(Thermomonospora fusca)로부터의 β-1,4-엔도글루카나아제)(Lao et al. J. Bacteriol. (1991) 173: 3397-3407)의 추정 셀룰로스 결합 도메인의 아미노산 서열 정렬을 기초로 한 셀룰로스 결합 도메인에 대한 일치 서열을 나타낸다. 아미노산 잔기는 단일 문자 코드로 표시된다. 대쉬(-)는 정렬을 개선시키기 위해 남겨진 간격을 나타낸다.
도 2는 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)에서의 PBDN1의 발현에 사용되는 pTugA 벡터의 도표를 나타낸다. pTugA의 사용은 고도의 유도 전사, 강화된 RNA 해독, 이식성, 고 복사수, 안정성 및 가변성의 결과를 낳는다. pTug 벡터는 복사수를 증가시키기 위해 pUC13으로부터 유도된 돌연변이체 pMB1 ori, LacIq에 의해 강력하게 억제되는 강한 고도의 유도(IPTG에 의함) tac 프로모터(Ptac)를 함유한다. 이. 콜리 숙주에 관계없이 적당한 리프레서 수준을 보장하는, lacIq 대립 유전자는 lacIq에 대한 Ptac의 일정한 비율을 유지하기 위해 pTug 벡터에 혼입된다. 유전자 10 해독 강화제(Olins et al. Gene (1988) 73: 227)도 또한 pTug 벡터에 혼입된다. 씨. 피미로부터의 엔도글루카나아제 A(CenA)의 리더 서열은 이. 콜리 상징액으로부터 재조합 폴리펩티드를 회수하기 위해 벡터에 혼입된다. 도 2A는 NcoI-HindIII 영역의 뉴클레오티드 및 코딩된 아미노산 서열 뿐만 아니라 유전자 10 해독 강화제("g10") 및 CenA 리더 서열("리더")를 포함한, NcoI 부위의 영역 업스트림의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 도 2B는 pTugA 벡터 지도를 나타낸다.
도 3은 pTugAS 벡터의 도표를 나타낸다. 도 3A는 SacI-HindIII 영역의 뉴클레오티드 및 코딩된 아미노산 서열 뿐만 아니라 SacI 부위의 영역 업스트림의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 도 3B는 pTugAS 벡터 지도를 나타낸다.
도 4는 pTugEO7K3의 작제를 나타낸다. 암피실린 내성에 대한 선택 마커 대신 카나마이신 내성에 대한 선택 마커를 갖는, pTugA의 유도체인 pTugK를 NcoI로 완전히 분해하였다. 엇물린 말단을 에스케리키아 콜리 DNA 폴리머라아제 I(Klenow 단편)로 수복하여 평활 말단의 제한 부위를 형성하였다. 그후에, 변형된 pTugK 벡터를 HindIII로 완전히 분해하고 4.2 kbp 단편을 단리하였다. pTZE07(Ong et al. Biotechnol. Bioeng. (1993) 42: 401-409)을 BamHI로 완전히 분해하고 엇물린 말단을 에스케리키아 콜리 DNA 폴리머라아제 I(Klenow 단편)로 수복하여 평활 말단의 제한 부위를 형성하였다. 그후에, 변형된 pTZE07을 HindIII로 완전히 분해하고 2.1 kbp 단편을 단리하였다. 4.2 및 2.1 kbp 단편을 연결하여 pTugE07K3을 제공하였다.
도 5는 pTugKN1의 작제를 나타낸다. pTugE07K3을 NheI 및 HindIII로 완전히 분해하여 CBDCex를 함유하는 1.8 kbp 단편을 제거하고 4.5 kbp 단편을 단리하였다. PCR을 이용하여 CBDN1을 코딩하는 유전자 단편의 5' 및 3' 말단에서 적절한 제한 부위를 도입하였다. 성숙한 CBDN1의 N-말단(ala-ser)과 일치하는 NheI 부위(밑줄)를 올리고뉴클레오티드 5'-TTACCTCATATGGCTAGCCCGATCGGGGA GGGAACG-3'을 이용하여 cbdN1의 5'에서 사일런트 돌연변이체로서 도입하였다. HindIII 부위를 올리고뉴클레오티드 5'-AGAATGAATTCAAGCTTAGAGCTC GACCTCGGAGTC-3'을 이용하여 cbdN1의 3' 말단에서 도입하였다. 해독 중지 코돈이 또한 이 프라이머에 포함되었다. 폴리머라아제 반응(PCR) 혼합물(50 ㎖ 총 용적)은 50 mM 트리스-HCl 완충액, pH 8.3 중에 10-100 ng 주형 DNA(pTZ-JC3)(Coutinho et al. Mol. Microbiol. (1992) 6: 1243-1252), 25-50 pmole (300 ng) 프라이머, 2 mM MgCl2, 6% 디메틸 술폭시드, 0.2 mM 2'-데옥시뉴클레오티드 5'-트리포스페이트 및 1 유닛 Taq DNA 폴리머라아제를 함유하였다. 28 연속 주기를 다음과 같이 수행하였다: 94 ℃에서 15초 동안 변성시키고, 57 ℃에서 1.4분 동안 어닐링시키고 72 ℃에서 1.5분 동안 프라이머 연장시켰다. 형성된 CBDN1PCR 단편을 NheI 및 HindIII로 완전히 분해하고 0.5 kbp 단편을 침전에 의해 정제하였다. 4.5 kbp 및 0.5 kbp 단편을 연결하여 pTugKN1을 제공하였다.
도 6은 pTugKN1 벡터를 나타낸다. pTugKN1 벡터는 암피실린 내성에 대한 선택 마커(β-락타마아제 코딩 서열)를 카나마이신 내성에 대한 선택 마커로 대체함으로써 pTugA 벡터로부터 유도된다. 씨. 피미의 엔도글루카나아제 A(CenA)의 리더 펩티드를 코딩하는 서열은 씨. 피미로부터의 엑소글루카나아제(Cex)의 리더 펩티드에 대한 코딩 서열로 대체되었다(Ong et al. Biotechnol. Bioeng. (1993) 42: 401-409 참조).
도 7은 PBDN1의 음이온 교환 크로마토그래피의 결과를 나타낸다. 부분 정제된 PBDN1(200 ㎖ 중의 150 ㎎)을 20 mM 인산 칼륨 완충액, pH 6.0에 평형화된 음이온 교환 칼럼(MonoQ) 상에 로딩시켰다(1 ㎖/분). 칼럼을 200 ㎖ 완충액, pH 6.0으로 세척한 후에, 결합 단백질을 염 구배(600 ㎖, 20 mM 인산 칼륨 완충액, pH 6.0 중의 0-1 M NaCl)를 이용하여 회수하였다(8 ㎖ 분별). PBDN1은 300 mM 염에서 칼럼으로부터 회수되었다(피이크 1). 불순 단백질은 더욱 단단하게 결합되었고 고농도의 염에서 제거되었다(피이크 2).
도 8은 배양 상징액으로부터 정제하는 도중의 PBDN1의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. pTugKN1을 갖는 JM101로부터의 배양 상징액(유도됨)(레인 2), 전체 배양 현탁액(세포 및 브로쓰)(레인 3), 배양 상징액에서의 단백질의 결합 후의 아비셀 분획물(레인 4), 상징액의 아비셀로의 결합 후의 분별을 통한 유동물(레인 5), 아비셀로부터 H2O로 용출된 분획물(레인 6) 및 MonoQ 정제 후의 PBDN1(레인 7 및 8)을 12.5% 아크릴아미드를 함유하는 겔 상에서 분석하였다. 분자량 표준(레인 1)은 나타낸 바와 같다.
도 9는 PBPs(PBDN1및 PBDN1N2)의 분석을 위한 친화도 전기이동 겔을 나타낸다. 정제된 소 혈청 알부민(BSA)(레인 1), PBDN1(레인 2) 및 PBDN1N2(레인 3)의 가용성 올리고사카라이드로의 결합은 13% 아크릴아미드를 함유하는 천연 겔에서 분석하였다. 올리고사카라이드의 부재(-) 하에 겔에서의 이동과 관계있는 폴리사카라이드((0.1% w/v) 히드록시에틸 셀룰로스(HEC) 또는 보리 글루칸)의 존재(+) 하에 겔에서의 지체는 결합의 지표이다. 크실란은 비결합 폴리사카라이드로서 이용된다. 각 단백질 5 ㎎을 각 겔 상에 로딩시켰다. 도 9A는 보리 β-글루칸의 존재(+) 및 부재(-) 하의 결합을 비교하고, 도 9B는 히드록시에틸 셀룰로스의 존재(+) 및 부재(-) 하의 결합을 비교하며, 도 9C는 자작나무 크실란의 존재(+) 및 부재(-) 하의 결합을 비교한다.
도 10은 pTZ-JC13의 작제에 사용된 벡터를 나타낸다(도 10C). 도 10A는 PBDN1을 코딩하는 단편을 얻는데 사용된, 전체 CenC를 코딩하는 유전자 단편을 함유하는 PTZ-JC2를 나타낸다. 도 10B는 CenA를 코딩하는 단편을 얻는데 사용된, 벡터 pUC18-1.6 cenA PT를 나타낸다.
도 11은 SDS-PAGE 분석을 이용한 CenA 및 PBDN1-CenA 융합 단백질로부터의 단백질 가수분해 생성물의 분석 결과를 나타낸다. 각 폴리펩티드 8 ㎎을 30 ℃에서 3시간 동안 씨. 피미 프로테아제 0 유닛(레인 5 및 9), 0.1 유닛(레인 4 및 8), 0.5 유닛(레인 3 및 7) 또는 1.0 유닛(레인 2 및 6)과 함께 50 ㎖ 인산염 완충액, pH 7.0(50 mM)에서 인큐베이션시켰다. 반응 생성물을 12.5% 아크릴아미드를 함유하는 겔 상에서 분석하였다. 분자량 마커(레인 1)는 나타낸 바와 같다. P30은 셀룰로스 결합 도메인의 단백질 가수분해 제거 후의 CenA의 촉매 작용 도메인에 해당한다(Gilkes et al. J. Biol. Chem. (1988) 263: 10401-10407 참조).
도 12는 SDS-PAGE를 이용한 비흡수된 폴리펩티드의 분석에 의해 이어지는, 셀룰로스에 대한 시차 흡수에 의한 CenA 및 PBDN1-CenA의 분리 결과를 나타낸다. 도 12A에서, 두 폴리펩티드 25 ㎎(레인 2 및 3), 100 ㎎(레인 4 및 5), 또는 250 ㎎(레인 6 및 7)을 함유하는 완충액 등분량을 세균 미결정질 셀룰로스와 함께(BMCC(+)) 또는 세균 미결정질 셀룰로스 없이(BMCC(-)) 인큐베이션시켰다. 도 12B에서, BMCC 인큐베이션 혼합물로부터의 비흡수된 분획물 함유 상징액을 인산 팽윤된 셀룰로스와 함께(PASC(+)) 더 인큐베이션시켰다. (PASC(-))를 추가하지 않은 대조 샘플에 의한 결과도 나타내었다.
도 13A 및 13B는 융합 단백질의 고정화 및 용도에 대한 개략도이다. 도 13A는 융합 단백질의 피이드-배치식 생성, 정제 및 고정화를 나타낸다. 도 13B는 재사용가능한 발효기-고정화 칼럼 장치에 의한 셀룰로스 재료의 글루코스로의 가수분해를 위한 융합 단백질의 용도를 나타낸다.
도 14는 셀룰로스 기질로부터 제거가능한 표지를 효소적 분리하기 위한 2가지의 제거가능한 표지 조성물 및 수단을 나타낸다: 화살표는 화학 성분을 나타내고, 오픈 박스는 특이적 프로테아제에 대한 프로테아제 절단 부위를 나타내고, 교차된 평행선 무늬를 넣은 박스는 셀룰로스 결합 도메인을 나타낸다.
도 15는 pH 7 및 35 ℃에서 50 mM 인산염 완충액에서의 히드록시에틸 셀룰로스의 CBDN1로의 결합에 대한 등온 적정 마이크로 열계량 데이터를 나타낸다.
도 16은 pH 7 및 35 ℃에서 50 mM PBS에서의 히드록시에틸 셀룰로스 및 플루로닉(Pluronic) P105의 혼합물에 대한 예비 상 평형 데이터를 나타낸다.
도 17은 새로운 CBDN1-융합 기술을 기초로 한 친화도 분배 시스템의 개략도를 나타낸다. 과량의 염을 제거하기 위한 투과 단계 후에, 표적 단백질은 필요시에 팩터 Xa및 팩터 Xa-CBD 융합 단백질의 적당한 발현 시스템을 위한 표적 단백질(Assouline et al., (1993) Protein Eng., 7: 787)과 관계 있는 -1 위치에서 삽입된 팩터 Xa에 대한 IQGR-특이적 인식 부위에서의 분해에 의해 융합 작제물로부터 회수될 수 있다. 친화도 분배 단계 직후의 팩터 Xa분해에 의한 표적 단백질의 직접적인 회수 방법을 이용하여 공정을 단순화시킬 수 있다.
도 18은 물 및 100 mM 시트르산염 완충액에서의 UCON 50-HB-5100에 대한 실험적 탁점 도표를 나타낸다. 10。(w/w) UCON 용액에 대해서, 상 분리는 2상 혼합물 중에서 323 K에서 또한 완충액 함유 시스템에서 312 K에서 일어난다.
상 형성 올리고사카라이드 중합체에 결합하는 조성물의 정제 및(또는) 분리를 위해 사용될 수 있는 수성 상 분리 시스템이 제공된다. 일반적으로, 조성물로는 폴리펩티드 또는 당해 화학 성분에 콘쥬게이션된, 폴리사카리다아제의 폴리사카라이드 결합 도메인(PBD)과 같은, 올리고사카라이드 중합체에 대해 고친화력을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 폴리사카라이드 결합 펩티드(PBP)를 들 수가 있다. 그러나, 폴리사카라이드 결합 펩티드는 올리고사카라이드 중합체에 결합하는 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. PBP가 폴리사카리다아제의 PBD, 폴리사카라이드 결합 단백질 또는 폴리사카라이드에 결합할 수 있는 것으로 계획 처리된 단백질의 결합 도메인으로부터 유도될 수 있는 경우에 PBPs의 제조 방법도 또한 제공된다. PBP는 자연 발생되거나 또는 합성일 수 있다. PBP가 PBD이거나 또는 PBD로부터 유도되는 경우, 아미노산 서열은 일반적으로 폴리사카리다아제의 가수분해 효소 활성은 거의 결핍되어 있지만, 기질 결합 활성은 유지한다.
상 분리 시스템은 일반적으로 성분의 혼합 시에 상 분리 시스템의 성분의 비상용성에 의해 형성되는 2상으로 이루어진다. 시스템의 한 성분은 상 형성 올리고사카라이드이고 두 번째 성분은 올리고사카라이드 중합체와 비상용성인, 제2 중합체와 같은 상 유도제, 또는 상 분리를 유도하기 위해 충분히 고 농도에서 존재하는, 강 전해질, 특히 황산염 또는 시트르산염과 같은 염이다. 상 형성 올리고사카라이드가 열 분리 중합체인 경우, 상 분리는 정제될 화합물을 함유하는 조성물 및 상 형성 중합체를 상 분리가 일어날 때 까지 가열시킴으로써 유도될 수 있다.
상 분배 시스템을 이용하는 단계는 폴리사카라이드 결합 펩티드로 이루어진 조성물과 상 분리 시스템을 접촉시키는 것을 포함한다. 상 분배 시스템은 미리 혼합될 수 있거나, 또는 조성물은 성분 중 어느 것의 건조 형태(예를 들면, 동결 건조)에 첨가될 수 있다. 일례로서, 올리고사카라이드 중합체가 조성물에 첨가됨으로써, 중합체의 재수화 및 상 분리가 유도된다. 어떤 경우에, 2가지를 초과하는 상이 이용될 수 있다. 조성물을 올리고사카라이드 중합체 상으로 분배시키기에 충분한 시간이 지난 후에, 상은 분리된다. 불순 단백질의 폴리사카라이드 풍부 상으로의 분배(비친화)는 시스템 pH, 중합체 농도, 및 분배 전해질의 첨가를 조절함으로써 최소화된다. 최적의 작동 조건하에서, 2가지의 수성상의 다단계 접촉은 표적 조성물의 완전한 또는 부분적인(하지만 충분한) 정제를 제공한다.
폴리펩티드 또는 당해 화학 성분으로 이루어진 조성물은 PBP로 이루어진 조성물을 중합체로부터 용출시킬 수 있는 제거 용액과 중합체를 접촉시킴으로써 중합체로부터 제거될 수 있거나 또는 PBP로 이루어진 조성물은 화합물과 PBP 사이에 프로테아제 인식 부위 또는 화학 분해 부위를 포함시킴으로써 효소적으로 제거될 수 있다. 후자의 제거 방법에서, PBP는 올리고사카라이드 중합체에 결합된 채로 남아있다. 인식 부위의 예로는 콜라게나아제, 트롬빈, 및 각각의 효소에 의해 특이적으로 분해되는 팩터 Xa를 들 수가 있다. 예를 들면, 낮은 pH 또는 시아노겐 브로마이드에 민감한 화학적 분해 부위도 또한 사용될 수 있다.
용이한 제거를 위해, 특이적 분해 효소는 분해 효소 착체로서 제공될 수 있으며, 그 분해 효소는 가용성 올리고사카라이드 중합체에 결합하거나 또는 단지 다른 물리적 형태의 동일한 폴리사카라이드가 아닌 다른 폴리사카라이드에 결합하는 PBP의 것과 다른 기질 결합 특성을 갖는 PBP에 결합된다. 바람직하게는, 제2 PBP는 제1 PBP가 결합하지 않는 불용성 폴리사카라이드에 결합한다. 불용성 폴리사카라이드는 용액으로부터 분해 효소 착체를 제거하기 위해 당해 화합물을 함유하는 혼합물에 첨가될 수 있다. 용액으로부터의 분리에 이어서, 분해 효소 착체는 불용성 폴리사카라이드로부터 제거되고 재사용될 수 있다. 별법으로, 분해 효소 착체는 당해 화합물을 함유하는 혼합물이 통과되는 칼럼의 형태에서 불용성 폴리사카라이드에 이미 결합된 채로 제공될 수 있다.
본 발명은 통용되는 수성 상 분리 시스템에 대한 몇가지 잇점을 제공한다. 셀룰로스 및 다른 β-글루칸, 예를 들면 귀리 및 보리로부터 얻은 것과 같은 탄수화물 중합체를 포함한 올리고사카라이드 중합체는 풍부하고 값이 싸다. 또한, 각종 단백질은 탄수화물 중합체 및 다른 올리고사카라이드에 특이적으로 결합하며 본 발명에 대한 PBP의 공급원으로서 사용될 수 있다. 일례로서, 본 발명의 상 분리 시스템을 이용하여 융합 단백질을 분리 및(또는) 정제하기 위한 수단으로서 탄수화물에 결합하는 단백질의 탄수화물 중합체 결합 부분을 포함하는 융합 단백질이 제조될 수 있다. 따라서, PBP의 사용은 그것을 상 형성 올리고사카라이드 중합체에 결합할 수 있는 PBP에 부착시킴으로써 임의의 폴리펩티드 또는 화학 성분의 친화도 분리 및(또는) 정제를 위한 일반적인 수단을 제공한다. 올리고사카라이드 중합체로부터의 PBP의 선택적인 결합은 그것을 단일 올리고사카라이드 중합체 상 분리 시스템을 이용한 각종 화합물의 정제 및(또는) 단리에 특히 적합하게 한다. 분리될 각 화합물에 대한 상 분리 시스템을 제조하는 것, 즉 각 화합물에 대해 특정 중합체-리간드를 제조하는 것이 불필요하다. 또한, 올리고사카라이드는 사용된 다른 상 분리기 중합체에 비해 많은 결합 부위를 가지므로, 분배 리간드를 결합시키는 중합체의 능력을 상당히 증가시킨다.
2상 시스템에서의 1가지 이상의 열분리 중합체의 사용은 중합체를 회수하고 재순환시키기 위한 간단한 방법에 의해 이어지는 PBP가 결합하는 중합체를 함유하는 상으로의 고친화도 분리의 추가의 잇점을 제공한다. PBP 화합물은 중합체에 특이적으로 강력하게 결합하지만 일반적으로 40 ℃ 미만, 일반적으로 20 ℃ 범위의 실온 내지 생리학적 온도에서 고 pH에서 물에 의한 용출에 의해 쉽게 제거될 수 있다. 비단백질 화합물의 경우, PBP는 30 ℃ 및 pH 7.0에서 프로테아제 K와 같은 일반적인 프로테아제를 이용하여 단백질 가수분해에 의해 화합물로부터 제거될 수 있다. 따라서, PBP는 올리고사카라이드 중합체에 화합물을 부착시키는 수단을 제공하며, 그 화합물은 후에 제거될 수 있다. 상 형성 올리고사카라이드에 대한 친화도를 변화시킨 돌연변이체 PBPs 또는 PBDs를 얻어 특별한 시스템 및(또는) 용도에 요구되는 바와 같이 친화도를 변화시킬 수 있다. 원하는 바와 같이, PBP는 가수분해 활성을 갖는 단백질을 포함한, 전체 폴리사카리다아제 효소까지를 포함할 수 있거나 또는 PBP 만을 포함하는 서열이 이용되어 가수분해 활성이 거의 없을 수 있다. 기질의 완전 상태가 유지되어 재사용될 수 있는 후자의 것이 바람직하다. 폴리사카라이드를 상기한 바와 같은 탈착 용액으로 처리하는 것은 폴리사카라이드의 표면 구조를 변화시키지 않는다. 매트릭스로부터 PBP 콘쥬게이트를 분리시키기 위한 비특이적 프로테아제의 사용을 포함한 다른 절차는 콘쥬게이트에 직접 작용하며 폴리사카라이드 표면을 변형시키지 않는다. PBP와 특정 시약에 의해 청징화될 수 있는 당해 화합물 사이에 결합 기를 도입함으로써 대상 화합물 만이 올리고사카라이드 중합체에 결합한 PBP를 남겨둔채 얻어질 수 있다. 이 시스템의 다른 잇점은 이것이 실험용 프로토콜에서 상업적 프로토콜까지 부피로 1차적으로 달 수 있다는 것이고 이 시스템이 연속 과정으로서 전개될 수 있다는 것이다.
새로운 폴리펩티드 조성물은 다음 화학식 1을 갖는 것을 포함할 수가 있다.
PBP-MR-X
상기 식에서,
PBD는 폴리사카리다아제 또는 폴리사카라이드 기질에 결합하여 폴리사카리다아제의 기질에 고친화도 결합을 제공하고, 임의로 폴리사카리다아제 활성이 거의 결여된 다른 단백질의 기질 결합 영역으로부터의 아미노산의 연속 서열로서 특징지워진다. PBP는 적어도 폴리사카라이드를 결합시키고 상 분리 시스템에서 사용하는데 필요한 서열의 최소 아미노산 수 정도로 커야 하며 상 형성 올리고사카라이드에 결합할 수 있는 것으로서 특징지워지며,
MR은 중간 부분이고, 단일 결합; 2 내지 30개의 탄소 원자의 짧은 결합 기일 수 있거나, 또는 약 2 내지 약 20개의 아미노산을 갖는다. 이 영역은 융합 단백질의 특이적 분해를 제공하는 아미노산 서열, 일반적으로 IgA1 프로테아제 또는 팩터 Xa와 같은 고특이성의 단백질 가수분해 효소에 의해 인식되는 것에 해당하는 서열을 포함할 수 있고,
X는 당해 펩티드 또는 화학 성분일 수 있다. X는 당해 폴리펩티드의 전체 서열까지를 갖는 것으로 특징지워지며, 효소, 호르몬, 이뮤노글로불린, 펩티드 등일 수 있다.
새로운 폴리펩티드 조성물은 다음 화학식 2 또는 화학식 3을 갖는 것을 포함한다.
PBP-Z
PBP-MR-Z
상기 식에서,
PBP 및 MR은 상기 정의한 바와 같고, Z는 PBP에 부착된 화학 성분이다. Z는 성분의 화학양론이 아니라 그 성분 만을 나타낸다. 화학양론은 가변적일 수 있다.
PBP는 본 발명에서 이용될 수 있는 올리고사카라이드에 결합하는 효소를 포함한 각종 공급원으로부터 얻을 수 있다. 2가지 유형의 올리고사카라이드가 본 발명에서 이용될 수 있다. (1) 상 분리 시스템에서의 올리고사카라이드, 및 (2) 분해 효소의 제거에 사용되는 것과 같은, 고상 시스템에서 사용되는 올리고사카라이드. 상 분리 시스템에서 올리고사카라이드는 일반적으로 폴리사카라이드 결합 펩티드로 이루어진 화합물이 상 중의 하나에 아주 풍부하도록, 일반적으로 ≥약 70%, 바람직하게는 ≥약 80%가 되도록 PBP 및 상 분리할 수 있는 당해 화합물로 이루어진 조성물에 대해 고친화력 및 결합능을 갖는, 수용액에 가용성인 특징을 갖는다. 하기 표 1은 다른 중합체 또는 강전해질과 수성 2상 시스템을 형성하는 것으로 알려진 올리고사카라이드의 일부 리스트이다.
상 형성 올리고사카라이드
비하전된폴리사카라이드1화합물 하전된폴리사카라이드 저분자량
덱스트란 Na 카르복시메틸덱스트란 셀룰로스로부터 유래된 덱스트린(셀로트리오스, 셀로테트라오스 등)
히드록시프로필 덱스트란 Na 카르복시메틸셀룰로스 크실로스, 크실로비오스,크실로트리오스 등
카르복시메틸 덱스트란 Na 덱스트란설페이트 유도체 말토덱스트린 및
말토덱스트린아라비노갈락탄 DEAE 덱스트란폴리갈락투로닌산 (펙틴)
히드록시프로필 전분아밀로펙틴메틸 셀룰로스히드록시에틸 셀룰로스에틸히드록시에틸 셀룰로스카르복시메틸 셀룰로스히드록시프로필 셀룰로스피콜카르복시메틸 전분히드록시에틸 전분풀루란
1중합체는 조원료이거나 또는 정제된 것일 수 있다.
2상 시스템을 형성하기 쉬운 다른 폴리사카라이드로는 저분자량 셀로사카라이드의 혼합물; 키토산 및 다른 키틴 유도체; 모든 수용성 글루칸(a, β, 및(또는) 〉3의 중합도를 갖는 혼합된 결합), 변형된 글루칸, 및(또는) 유도체화된 글루칸; 보리 또는 귀리 β-글루칸과 같은 곡류 β-글루칸; 및 만난, 글루코만난, 갈락토만난, 크실로글루칸을 들 수가 있다.
2상 시스템을 형성하는 또다른 폴리사카라이드 중합체 군으로는 물에서 열분리되는 수용성 양극성 중합체를 들 수가 있다. 중합체의 이성분 수용액이 그의 탁점 온도(CPT) 이상으로 가열될 때, 용액 상은 2개의 거시적 상으로 분리된다. 상 중의 하나, 일반적으로 하부 상은 중합체가 많이 풍부한 반면, 다른 상은 통상적으로 중합체를 거의 또는 전혀 함유하지 않는다. 열분리 특성을 나타내는 것으로 알려진 폴리사카라이드 기재 중합체로는 메틸 셀룰로스, 에틸 히드록시에틸 셀룰로스, 프로필 히드록시에틸 셀룰로스, 및 히드록시프로필 메틸 셀룰로스를 들 수가 있다. 그러나, 임의의 수용성 β-1,4-결합된 셀로사카라이드는 반드시 열분리 특성을 나타내야 한다(Johansson, et al. (1993). Macromolecules, 26, 4478; Harris, et al. (1991). Bioseparations 2, 237; Alfred P. A. et al. (1992). Bioseparations, 2, 363; and Alfred P.A. et al. (1994). J. Chromatog., 659, 289). 열분리되는 다른 수용성 중합체로는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리프로필렌 글리콜 및 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드(상품명 UCON 및 Pluronic)의 선형 랜덤 공중합체를 들 수가 있다.
고상 회수 시스템에 있어서는 각종 폴리사카라이드 기질이 해당한다. 이것으로는 셀룰로스, β-1,4-글리코시드 결합에 의해 연결된 D-글루코피라노스 단위로 구성된 폴리사카라이드 및 그의 에스테르, 예를 들면 셀룰로스 아세테이트; 반복 골격 단위가 β-1,4-D-크실로피라노스인 크실란; β-1,4-결합된 N-아세틸, 2-아미노-2-데옥시-β-D-글루코피라노스 단위로 구성된다는 점에서 셀룰로스와 비슷한 키틴을 들 수가 있다. 상기한 바와 같은 폴리사카라이드에 결합할 수 있는 효소는 그러한 기질에 결합할 수 있는 아미노산 서열의 공급원으로서 본 발명에 있어서 중요하다.
하기 표 6에는 가용성 글루칸(a, β, 및(또는) 혼합된 결합)에 대해 친화력을 갖는 모든 결합 도메인을 포함한 1가지 이상의 가용성/불용성 폴리사카라이드에 결합하는 결합 도메인을 나타내었다. 씨. 피미의 엔도글루카나아제 CenC로부터의 N1 셀룰로스 결합 도메인은 가용성 셀로사카라이드를 결합시키는 것으로 알려진 단백질 및 임의의 가용성 폴리사카라이드를 결합시키는 것으로 알려진 작은 셋트의 단백질 중의 하나이다. 또한, 표 2 내지 5에는 추정 β-1,3-글루칸-결합 도메인(표 2); 연쇄 구균의 글루칸 결합 반복 단위를 함유하는 단백질(Cp1 슈퍼패밀리)(표 3); 키틴 결합 도메인을 갖는 효소(표 4), 및 전분 결합 도메인(표 5)을 함유하는 단백질의 예를 나타내었다.
추정 β-1,3 글루칸 결합 도메인을 함유하는 단백질의 개요
공급원(균주)1 단백질 수탁 번호 참조 문헌2
타입 I
비. 써큘란스(B. circulans) (WL-12) GLCA1 P23903/M34503/JQ0420 1
비. 써큘란스(LAM 1165) 2 Bg1H JN0772/D17519/S67033
타입 II
악티노마두라(Actinomadura) 종(FC7) XynII U08894 3
아르트로박터(Arthrobacter) 종(YCWD3) GLCI D23668 9
오. 잔티네올리티카(O. xanthineolytica) GLC P22222/M60826/A39094 4
알. 파에시타비더스(YLM-50) 5a,b RPI Q05308/A45053/D10753
알. 콤무니스 리신 A12892 6
에스. 리비단스(S. lividans)(1326) XlnA P26514/M64551/JS07986 7
티. 트리덴타터스(T. tridentatus) 팩터Ga D16622 8
1B.: 바실러스(Bacillus), O.: 에르스코비아(Oerskovia), 알. 파에시타비더스: 라로박터 파에시타비더스(Rarobacter faecitabidus), 알. 콤무니스: 리시너스 콤무니스(Ricinus communis), S.: 스트렙토마이세스(Streptomyces), T.: 태키플레어스(Tachypleus)(참게)
2참조 문헌1) Yahata et al. (1990) Gene 86, 113-117; 2) Yamamoto et al. (1993) Biosci. Biotechnol. Biochem. 57, 1518-1525; 3) Harpin et al. (1994) EMBL Data Library; 4) Shen et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 1058-1063; 5a) Shimoi et al. (1992) J.Biol. Chem. 267, 25189-25195; 5b) Shimoi et al. (1992) J. Biochem 110, 608-613; 6) Horn et al. (1989) Patent A12892; 7) Shareck et al. (1991) Gene 107, 75-82; 8) Saeki et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 1370-1374; 9) Watanabe et al. (1993) EMBL Data Library
연쇄 구균의 글루칸 결합 반복 단위(Cpl 슈퍼패밀리)를 함유하는 단백질의 개요
공급원 단백질 수탁 번호 참조 문헌1
에스. 다우네이(소브리너스)(S. downei)(sobrinus))(0MZ176) GTF-I D13858 1
에스. 다우네이(소브리너스)(MFe28) GTF-I P11001/M17391 2
에스. 다우네이(소브리너스)(MFe28) GTF-S P29336/M30943/A41483 3
에스. 다우네이(소브리너스)(6715) GTF-I P27470/D90216/A38175 4
에스. 다우네이(소브리너스) DEI L34406 5
에스. 뮤턴츠(인그브리트)(S. mutants(Ingbritt)) GBP M30945/A37184 6
에스. 뮤턴츠(GS-5) GTF-B A33128 7
에스. 뮤턴츠(GS-5) GTF-B P08987/M17361/B33135 8
에스. 뮤턴츠 GTF-B3'-ORF P05427/C33135 8
에스. 뮤턴츠(GS-5) GTF-C P13470/M17361/M22054 9
에스. 뮤턴츠(GS-5) GTF-C 이용가능하지 않음 10
에스. 뮤턴츠(GS-5) GTF-D M29296/A45866 11
에스. 살리바리어스(S. salivarius) GTF-J A44811/S22726/S28809Z11873/M64111 12
에스. 살리바리어스 GTF-K S22737/S22727/Z11872 13
에스. 살리바리어스(ATCC25975) GTF-L L35495 14
에스. 살리바리어스(ATCC25975) GTF-M L35928 14
에스. 뉴모니아에(S. pneumoniae) R6 LytA P06653/A25634/M13812 15
에스. 뉴모니아에 PspA A41971/M74122 16
파아지 HB-3 HBL P32762/M34652 17
파아지 Cp-1 CPL-1 P15057/J03586/A31086 18
파아지 Cp-9 CPL-9 P19386/M34780/JQ0438 19
파아지 EJ-1 EJL A42936 20
씨. 디피실(C. difficile) (VPI 10463) ToxA P16154/A37052/M30307X51797/S08638 21
씨. 디피실(BARTS W1) ToxA A60991/X17194 22
씨. 디피실(VPI 10463) ToxB P18177/X53138/X60984S10317 23,24
씨. 디피실(1470) ToxB S44271/Z23277 25,26
씨. 노비(C. novyi) a-톡신 S44272/Z23280 27
씨. 노비 a-톡신 Z48636 28
씨. 아세토부틸리컴(C. acetobutylicum)(NCIB8052) 29 CspA S49255/Z37723
씨. 아세토부틸리컴(NCIB8052) 30 CspB Z50008
씨. 아세토부틸리컴(NCIB8052) 30 CspC Z50033
씨. 아세토부틸리컴(NCIB8052) 30 CspD Z50009
1참조 문헌1) Sato et al. (1993) DNA sequence 4, 19-27; 2) Ferreti et al. (1987) J. Bacteriol. 169, 4271-4278; 3) Gilmore et al. (1990) J. Infect. Immun. 58, 2452-2458; 4) Abo et al. (1991) J. Bacteriol. 173, 989-996; 5) Sun et al. (1994) J. Bacteriol. 176, 7213-7222; 6) Banas et al. (1990) J. Infect. Immun. 58, 667-673; 7) Shiroza et al. (1990) Protein Sequence Database; 8) Shiroza et al. (1987) J. Bacteriol. 169, 4263-4270; 9) Ueda et al. (1988) Gene 69, 101-109; 10) Russel (1990) Arch. Oral. Biol. 35, 53-58; 11) Honda et al. (1990) J. Gen. Microbiol. 136, 2099-2105; 12) Giffard et al. (1991) J. Gen. Microbiol. 137, 2577-2593; 13) Jacques (1992) EMBL Data Library; 14) Simpson et al. (1995) J. Infect. Immun. 63, 609-621; 15) Gargia et al. (1986) Gene 43, 265-272; 16) Yother et al. (1992) J. Bacteriol. 174, 601-609; 17) Romero et al. (1990) J. Bacteriol. 172, 5064-5070; 18) Garcia et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 914-918; 19) Garcia et al. (1990) Gene 86, 81-88; 20) Diaz et al. (1992) J. Bacteriol. 174, 5516-5525; 21) Dove et al. (1990) J. Infect. Immun. 58, 480-488; 22) Wren et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 70, 1-6; 23) Barroso et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18, 4004-4004; 24) von Eichel-Streiber et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 233, 260-268; 25) Sartinger et al. (1993) EMBL Data Library; 26) von Eichel-Streiber et al. (1995) Mol. Microbiol. In Press; 27) Hofmann et al. (1993) EMBL Data Library; 28) Hofmann et al. (1995) Mol. Gen. Genet. In Press; 29) Sanchez et al. (1994) EMBL Data Library; 30) Sanchez et al. (1995) EMBL Data Library.
키틴 결합 도메인을 갖는 효소의 개략
공급원(균주) 효소 수탁 번호 참고 문헌2
세균 효소
타입 I
아에로모나스(Aeromonas) 종(No10S-24) Chi D31818 1
바실러스 써큘란스(WL-12) ChiA1 P20533/M57601/A38368 2
바실러스 써큘란스(WL-12) ChiD P27050/D10594 3
잔티노박테리엄 리비덤(Janthinobacterium lividum) Chi69 U07025 4
스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 프로테아제C A53669 5
타입 II
아에로모나스 카비아(Aeromonas cavia)(K1) Chi U09139 6
아에로모나스 종(0-7) Chi85 A40633/P32823/D13762 7
오토그라파 캘리포니아(Autographa california)(C6) NPH-128a P41684/L22858 8
세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) ChiA A25090/X03657/L01455/P07254 9
타입 III
리조퍼스 올리고스포러스(Rhizopus oligosporus)(IFO8631) Chi1 P29026/A47022/D10157/S27418 10
리조퍼스 올리고스포러스(IFO8631) Chi2 P29027/B47022/D10158/S27419 10
사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) Chi S50371/U17243 11
사카로마이세스 세레비지에(DBY939) Chi1 P29028/M74069 12
사카로마이세스 세레비지에(DBY918) Chi2 P29029/M7407/B41035 12
식물 효소
헤베인 슈퍼페밀리
알리움 사티범(Allium sativum) Chi M94105 13
아마란터스 카우다터스(Amaranthus caudatus) AMP-1b P27275/A40240 14,15
아마란터스 카우다터스 AMP-2b S37381/A40240 14,15
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(CV. colombia) ChiB P19171/M38240/B45511 16
아라비돕시스 탈리아나 PHPc U01880 17
공급원(균주) 효소 수탁 번호 참고 문헌2
브라시카 나퍼스(Brassica napus) Chi U21848 18
브라시카 나퍼스 Chi2 Q09023/M95835 19
헤베아 브라질리언시스(Hevea brasiliensis) Hev1d P02877/M36986/A03770/A38288 20,21
호르데움 불가레(Hordeum vulgare) Chi33 L34211 22
리코페르시콘 에스컬렌텀(Lycopersicon esculentum) Chi9 Q05538/Z15140/S37344 23
니코티아나 타바컴(Nicotiana tabacum) CBP20e S72424 24
니코티아나 타바컴 Chi A21091 25
니코티아나 타바컴(cv. Havana) Chi A29074/M15173/S20981/S19855 26
니코티아나 타바컴(FB7-1) Chi JQ0993/S0828 27
니코티아나 타바컴(cv. Samsun) Chi A16119 28
니코티아나 타바컴(cv. Havana) Chi P08252/X16939/S08627 27
니코티아나 타바컴(cv. BY4) Chi P24091/X51599/X64519/S13322 26,27,29
니코티아나 타바컴(cv. Havana) Chi P29059/X64518/S20982 26
오리자 사티범 (Oryza sativum) (IR36) ChiA L37289 30
오리자 사티범 ChiB JC2253/S42829/Z29962 31
오리자 사티범 Chi S39979/S40414/X56787 32
오리자 사티범(cv. Japonicum) Chi X56063 33
오리자 사티범(cv. Japonicum) Chi1 P24626/X54367/S14948 34
오리자 사티범 Chi2 P25765/S15997 35
오리자 사티범(cv. Japonicum) Chi3 D16223 32
오리자 사티범 ChiA JC2252/S42828 30
오리자 사티범 Chi1 D16221 32
오리자 사티범(IR58) Chi U02286 36
오리자 사티범 Chi X87109 37
피섬 사티범(Pisum sativum) (cv. Birte) Chi P36907/X63899 38
피섬 사티범(cv. Alcan) Chi2 L37876 39
공급원(균주) 효소 수탁 번호 참고 문헌2
포풀러스 트리코카르파(Populus trichocarpa) Chi S18750/S18751/X59995/P29032 40
포풀러스 트리코카르파(H11-11) Chi U01660 41
파세올러스 불가리스(Phaseolus vulgaris)(cv. Saxa) Chi A24215/S43926/Jq0965/P36361 42
파세올러스 불가리스(cv. Saxa) Chi P06215/M13968/M19052/A25898 43,44,45
삼부커스 니그라(Sambucus nigra) PR-3f Z46948 46
세칼 세레알(Secale cereale) Chi JC2071 47
솔라넘 투베로섬(Solanum tuberosum) ChiB1 U02605 48
솔라넘 투베로섬 ChiB2 U02606 48
솔라넘 투베로섬 ChiB3 U02607/S43317 48
솔라넘 투베로섬 ChiB4 U02608 48
솔라넘 투베로섬(cv. Maris Piper) WIN-1g P09761/X13497/S04926 49
솔라넘 투베로섬(cv. Maris Piper) WIN-2g P09762/X13497/S04927 49
트리티컴 아에스티붐(Triticum aestivum) Chi S38670/X76041 50
트리티컴 아에스티붐 WGA-1h P10968/M25536/S09623/S07289 51,52
트리티컴 아에스티붐 WGA-2h P02876/M25537/S09624 51,53
트리티컴 아에스티붐 WGA-3h P10969/J02961/S10045/A28401 54
울머스 아메리카나(Ulmus americana)(NPS3-487) Chi L22032 55
우르티카 디오이카(Urtica dioica) AGLi M87302 56
비그나 운구이쿨라타(Vignaunguiculata)(cv. Red caloona) Chi1 X88800 57
1NHP: 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스 엔도키티나아제 유사 서열
Chi: 키티나아제
b항미생물 펩티드,c프레-헤베인 유사 단백질,d헤베인,e키틴 결합 단백질,f파토게네시스 관련 단백질,g상처 유도 단백질,h맥아 아글루티닌,i아글루티닌(렉틴)
2키틴-결합 도메인 참조 문헌1) Udea et al. (1994) J. Ferment. Bioeng. 78, 205-211; 2) Watanabe et al. (1990) J. Biol. Chem. 265, 15659-16565; 3) Watanabe et al. (1992) J. Bacteriol. 174, 408-414; 4) Gleave et al. (1994) EMBL Data Library; 5) Sidhu et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 20167-20171; 6) Jones et al. (1986) EMBO J. 5, 467-473; 7) Sitrit et al. (1994) EMBL Data Library; 8) Genbank entry only; 9) Tsujibo et al. (1993) J. Bacteriol 175, 176-181; 10) Yanai et al. (1992) J. Bacteriol. 174, 7398-6706; 11) Pauley (1994) EMBL Data Library; 12) Kuranda et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 19758-19767; 13) van Damme et al. (1992) EMBL Data Library; 14) Broekaert et al. (1992) Biochemistry 31, 4308-4314; 15) de Bolle et al (1993) Plant Mol. Physiol. 22, 1187-1190; 16) Samac et al. (1990) Plant Physiol. 93, 907-914; 17) Potter et al. (1993) Mol. Plant Microbe Interact 6, 680-685; 18) Buchanan-Wollaston (1995) EMBL Data Library; 19) Hamel et al. (1993) Plant Physiol. 101, 1403-1403; 20) Broekaert et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci USA 87, 7633-7637; 21) Lee et al. (1991) J. Biol. Chem. 266, 15944-15948; 22) Leah et al. (1994) Plant Physiol. 6, 579-589; 23) Danhash et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22, 1017-1029; 24) Ponstein et al. (1994) Plant Physiol. 104, 109-118; 25) Meins et al. (1991) Patent EP0418695-A1; 26) van Buuren et al. (1992) Mol. Gen. Genet 232, 460-469; 27) Shinshi et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14, 357-368; 28) Cornellisen et al. (1991) Patent EP0440304-A2; 29) Fukuda et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16, 1-10; 30) Yun et al. (1994) EMBL Data Library; 31) Kim et al. (1994) Biosci. Biotechnol. Biochem. 58, 1164-1166; 32) Nishizawa et al. (1993) Mol. Gen Genet. 241, 1-10; 33) Nishizawa et al. (1991) Plant Sci 76, 211-218; 34) Huang et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16, 479-480; 35) Zhu et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 226, 289-296; 36) Muthukrishhnan et al. (1993) EMBL Data Library; 37) Xu (1995) EMBL Data Library; 38) Vad et al. (1993) Plant Sci 92, 69-79; 39) Chang et al. (1994) EMBL Data Library; 40) Davis et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17, 631-639; 41) Clarke et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25, 799-815; 42) Broglie et al. (1989) Plant Cell 1, 599-607; 43) Broglie et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6820-6824; 44) Lucas et al. (1985) FEBS Lett. 193, 208-210; 45) Hedrick et al. (1988) Plant Physiol. 86, 182-186; 46) Roberts et al. (1994) EMBL Data Library; 47) Vamagami et al. (1994) Biosci. Biotechnol. Biochem. 58, 322-329; 48) Beerhues et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24, 353-367; 49) Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215, 200-208; 50) Liao et al. (1993) EMBL Data Library; 51) Smith et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13, 601-603; 52) Wright et al. (1989) J. Mol. Evol. 28, 327-336; 53) Wright et al. (1984) Biochemistry 23, 280-287; 54) Raikhel et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6745-6749; 55) Hajela et al. (1993) EMBL Data Library; 56) Lerner et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 11085-11091; 57) Vo et al. (1995) EMBL Data Library.
전분 결합 도메인을 함유하는 효소의 개략
공급원(균주) 효소 수탁 번호 참고 문헌5
에이. 아워로리(A. awarori)(var. kawachi) AMYG P23176/D00427/JT0479 1,2
에이. 니거(A. Niger)(T21) AMYG S73370 3
에이. 니거-에이. 아워모리 AMYG1/G2 P04064/A90986/A29166/X00712/X00548K02465 4,5,67,8,9
에이. 오리자에(A. oryzae) AMYG(GLAA) P36914/JQ1346/D01035/S75274/D01108 10,11
에이. 시로우사미(A. Shirousamii) AMYG(GLA) P22832/JQ0607/D10460 12
바실러스 종(B1018) AMYa P17692/M33302/D90112/S09196 13
바실러스 종(TS-23) a-AMY U22045 14
바실러스 종(1-1) CGT P31746/S26399 15
바실러스 종(6.63) CGT P31747/X66106/S21532 16
바실러스 종(17-1) CGT P30921/M28053/A37208 17
바실러스 종(38-2) CGT P09121/M19880/D00129/S24193 18,19
바실러스 종(1011) CGT P05618/A26678/M17366 20
바실러스 종(DSM5850) CGT A18991 21
바실러스 종(KC201) CGT D13068 15,22
비. 세레우스(B. Cereus)(SPOII) b-AMY A48961/P36924/S54911 23
비. 써큘란스(8) CGT P30920/X68326/S23674 24
비. 써큘란스(251) CGT X78145 25
비. 리케니포르미스(B. Licheniformis) CGTA P14014/X15752/S15920 26
비. 마세란스(IFO 3490) CGTM(CDG1) P04830/X5904/S31281 27
비. 마세란스(IAM 1243) CGT M12777 28
비. 마세란스 CGTM(CDG2) P31835/S26589 29
비. 오벤시스(B. Ohbensis) CGT P27036/D90243 30
비. 스테아로터모필러스(B. stearothermophilus) AMYMb P19531/M36539/S28784 31
비. 스테아로터모필러스(NO2) CGT P31797/X59042/S26588/X59043/X59404/S31284 32
씨. 롤프시(C. rolfsii(AHU9627)) AMYG2 D49448 33
디. 디스코이데움(D. discoideum) ORF S15693/X51947 34
에이치. 그리세아(H.grisea)(var. thermoidea) GLA1 M89475 35
에이치. 레지나에(H.resinae)(ATCC20495) GAMP Q03045/X68143/X67708/S31422/S33908 36-38
공급원(균주) 효소 수탁 번호 참고 문헌5
케이. 뉴모니아에(K. pneumoniae)(M5A1) CGT P08704/M15264/A29023 39
엔. 크라사(N. crassa)(74-OR23-1A) GLA-1 P14804/X67291/S13711/S13710/S36364 40,41
피. 사카로필라(P.saccharophila)(IAM1504) MTAc P22963/X16732/S05667 42
슈도모나스(Pseudomonas) 종(KO-8940) AMF-1d D10769/JS0631/D01143 43
피. 스투제리(P. stutzeri)(MO-19) AMYPc P13507/M24516/A32803 44
에스. 그리세우스(S. griseus)(IMRU3570) AMY P30270/X57568/S14063 45
에스. 리모수스(S.limosus)(S. albidoflavus) AML P09794/M18244/B28391 46
에스. 비올라세우스(S. violaceus)(S. venezuela)(ATCC15068) AML P22998/M25263/JS0101 47
Th. 쿠르바타(curvata)(CCM3352) TAMc P29750/X59159/JH0638 48
Th. 터모술푸로게네스(thermosulfurogenes)(DSM3896/EM1)f AMYA P26827/X54654/X54982/S17298/S37706 49
Th. 터모술푸로게네스(ATCC33743) AMYB P19584/M22471/A31389 50
a조전분 분해 아밀라제,b말토게닉 a-아밀라제,c말토테트라오스-형성 아밀라제(1,4-a-말토테트라히드롤라제),d말토펜타오스-형성 아밀라제,e열안정성 a-아밀라제,f원래는 클로스트리듐 터모술푸로게네스.AMYG, GAM 및 GLA: 글루코아밀라제, AMY 또는 AML: 알파-아밀라제, CGT: β-시클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라제 또는 시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라제, ORF: 오픈 리딩 프레임A.: 아스퍼길러스(Aspergillus), B.: 바실러스(Bacillus), C.: 코르티슘(Corticium), D.: 딕티오스텔륨(Dictiostelium), 에이치. 그리세아: 휴미콜라 그리세아(Humicola grisea), 에이치. 레지네아: 호르모코니스 레지나에(Hormoconis resinae)(Amorphotheca resinae), 케이.: 클레브시엘라(Klebsiella), 엔.: 뉴로스포라(Neurospora), 에스.: 스트렙토마이세스(Streptomyces), Th. 쿠르바타: 터모모노스포라 쿠르바타(Thermomonospora curvata), Th. 터모안에어로박터(Thermoanaerobacter).
5전분 결합 도메인 참조 문헌1) Hayashida et al. (1989) Agric. Biol. Chem. 53, 135-141; 2) Hayashida et al. (1989) Agric. Biol. Chem. 53, 923-929; 3) Zhong et al. (1994) Wei Sheng Wu Hseuh Pao 34, 184-190; 4) Boel et al. (1984) EMBO J. 3, 1097-1102; 5) Boel et al. (1984) EMBO J. 3, 1581-1583; 6) Svensson et al. (1986) Eur. J. Biochem. 154, 497-502; 7) Svensson et al. (1983) Carlsberg Res. Commun., 48, 529-544; 8) Nunberg et al. (1984) Mol. Cell. Biol. 4, 2306-2315; 9) Flwer et al. (1990) Curr. Genet. 18, 537-545; 10) Hata et al. (1991) Agric. Biol. Chem. 55, 941-949; 11) Hata et al. (1991) Gene 108, 145-150; 12) Shibuya et al. (1990) Agric. Biol. Chem. 54, 1905-1914; 13) Itkor et al. (1990) Biochem. Biophys. res. Commun. 166, 630-636; 14) Lin et al. (1995) EMBL Data Library; 15) Schimd et al. (1988) Proceedings of the fourth International symposium on cyclodextrins Huber, O. and Szejtli, J. Eds. pp71-76, Kluwer, Academic Publishers; 16) Akhmetzjanov (1992) EMBL Data Library; 17) Kaneko et al. (1989) J. Gen. Microbiol. 135, 3447-3457; 18) Kaneko et al. (1988) J. Gen. Microbiol. 134, 97-105; 19) Hamamoto et al. (1987) Agric. Biol. Chem. 51, 2019-2022; 20) Kimura et al. (1987) J. Bacteriol. 169, 4399-4402; 21) Patent WO9114770-A1; 22) Kitamoto et al. (1992) J. Ferment. Bioeng. 74, 345-351; 23) Nanmori et al. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59, 623-627; 24) Nitschke et al. (1990) Appl. Microbial. Biotechnol. 33, 542-546; 25) Lawson et al. (1994) J. Mol. Biol. 236, 590-560; 26) Hill et al. (1990) Nucleids Acids Res 18, 199-199; 27) Fujiwara et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58, 4016-4025; 28) Takano et al. (1986) J. Bacteriol. 166, 1118-1122; 29) Sugimoto et al. Patent No. UK 2169902; 30) Sin et al. (1991) Appl. Microbiol. Biotechnol. 35, 600-605; 31) Didericksen et al. (1988) FEMS Microbiol. Lett. 56, 53-60; 32) Fujiwara et al. (1992) Appl. Environ. Microbiol. 58, 4016-4025; 33) Nagasaka et al. (1995) EMBL Data Library; 34) Maniak et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18. 3211-3217; 35) Berka et al. (1992) EMBL Data Library; 36) Joutsjoki et al. (1992) FEMS Microbiol. Lett. 78, 237-244; 37) Vainio et al. (1993) Curr. Genet. 24, 38-44; 38) Fagerstrom et al. (1990) J. Gen Microbiol. 136, 913-920; 39) Binder et al. (1986) Gene 47, 269-277; 40) Stone et al. (1989) Curr. Genet. 24, 205-211; 41) Koh-Laur et al. (1989) Enzym. Microb. Technol. 11, 692-695; 42) Zhoe et al. (1989) FEBS Lett. 255, 37-41; 43) Shida et al. (1991) Biosci. Biotechnol. Biochem. 56, 76-8; 44) Fujita et al. (1989) J. Bacteriol. 171, 1333-1339; 45) Vigal et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225, 278-288; 46) Long et al. (1987) J. Bacteriol. 169, 5745-5754; 47) Virolle et al. (1988) Gene 74, 321-334; 48) Petricek et al. (1992) Gene 112, 77-83; 49) Bahl et al. (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57, 1554-1559; 50) Kitamoto et al. (1988) J. Bacteriol. 170, 5848-5854.
중요한 결합 특징 및 특이성을 갖는 새로운 PBPs를 각종 다른 실험 기술 및 방법을 이용하여 다양한 방식으로 동정하고 스크리닝할 수 있다. 이 기술로는 분광검사(적정)법, 예를 들면 NMR 분광검사법(Zhu et al. Biochemistry (1995) 34; Gehring et al. Biochemistry (1991) 30: 5524-5531), UV 차동 분광검사법(Belshaw et al. Eur. J. Biochem. (1993) 211: 717-724), 형광 (적정) 분광검사법(Miller et al. J. Biol. Chem. (1983) 258: 13665-13672), UV 또는 형광 저지 유동 분석(De Boeck et al. Eur. J. Biochem. (1985) 149: 141-415), 친화도 방법, 예를 들면 친화도 전기이동법(Mimura et al. J. chromatography (1992) 597: 345-350) 또는 고정된 모노 또는 올리고사카라이드 상의 친화도 크로마토그래피, 혼탁 또는 비탁 분석을 비롯한 침전 또는 응집 분석(Knibbs et al. J. Biol. Chem. (1993) 14940-14947), 경쟁 저해 분석(정량적 IC50 측정을 포함하거나 또는 포함하지 않음) 및 시차 주사 또는 등온 적정 열계량법을 포함한 각종 물리적 또는 물리화학적 방법(Sigurskjold et al. J. Biol. Chem. (1992) 267: 8371-8376; Sigurskjold et al. Eur. J. Biol. (1994) 225: 133-141) 또는 열 CD 또는 형광 분광검사법을 이용한 올리고사카라이드의 부재 또는 존재하의 비교 단백질 안정성 분석(용융)을 들 수가 있다. 정성 및 정량 (회합 또는 해리 상수, IC50 값, 열역학적 파라메터 등) 분석은 둘다 이 방법으로 수행될 수 있다. 가용성 올리고사카라이드 중합체에 대해 더 높고 더 낮은 결합 친화력을 갖는 PBPs의 동정은 특별한 용도에 따라 대상이 될 수 있으며, 더 높지 않고 더 낮은 결합 친화력은 예를 들면 PBP를 함유하는 화합물에 풍부한 올리고사카라이드 중합체 상의 분배 및(또는) 단리에 이은 올리고사카라이드 중합체의 제거의 편의성을 개선시키는데 유용할 수 있다.
폴리사카라이드 결합 도메인의 공급원
결합 도메인 결합 도메인이 발견되는 단백질
셀룰로스 결합 도메인1 β-글루카나아제(아비셀라아제, CMC아제, 셀로덱스트리나아제)엑소글루칸스 또는 셀로비오히드롤라제셀룰로스 결합 단백질크실라나아제혼합된 크실라나아제/글루카나아제에스테라아제키티나아제β-1,3-글루카나아제β-1,3-(β-1,4)-글루카나아제(β-)만나아제β-글루코시다아제/갈락토시다아제셀룰로스 신타아제(미확인)
전분/말토덱스트린결합 도메인 a-아밀라아제2,3β-아밀라아제4,5플룰라나아제글루코아밀라아제6,7시클로덱스트린 글루코트랜스퍼라아제8-10(시클로말토덱스트린 글루카노트랜스퍼라아제)말토덱스트린 결합 단백질11
덱스트란 결합 도메인 (연쇄구균) 글리코실 트랜스퍼라아제12덱스트란 수크라아제(미확인)클로스트리디알 톡신13,14글루코아밀라아제6덱스트란 결합 단백질
β-글루칸 결합 도메인 β-1,3-글루카나아제15,16β-1,3-(β-1,4)-글루카나아제(미확인)β-1,3-글루칸 결합 단백질17
키틴 결합 도메인 키티나아제키토비아제키틴 결합 단백질(셀룰로스 결합 도메인도 참조)헤이베인
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PBP는 효소의 단리 및 정제에 이어서 효소의 나머지 부분으로부터 PBP를 떼어냄으로써 얻어질 수 있다. 상 분리 시스템에서 사용하기 위해 PBP의 가용성 상 형성 올리고사카라이드로의 결합을 위해 스크리닝하였다. NMR, NMA/열계량법, 친화도 전기이동, 친화도 전기이동/경쟁 분석, 및 결합 등온선을 비롯한 임의의 많은 방법들이 스크리닝에 사용될 수 있다. 등온 적정 마이크로 열계량법(ITC)을 이용한 결합 평형 연구가 바람직하다. 결합 평형 연구에서의 등온 적정 마이크로 열계량법(ITC)의 잇점은 결합 등온선이 반응열에 의한 실험에 의해 한정되며, 그와 같이 엔탈피(및 엔트로피(결합 상수 이외의 변화))의 직접 평가를 가능하게 한다는 사실에서 유래된다. 따라서, 단일 마이크로 열계량 적정은 결합 등온선과 함께 결합 에너지론의 완전한 특징화를 제공한다(Haynes et al., J. Colloid Interface Sci., (1994) 169:313; Colloids & Surfaces, (1994) 2: 517).
일반적으로, 상 분리에 사용하기 위해, PBP의 가용성 올리고사카라이드로의 결합에 대한 Ka는 적어도 약한 항체-항원 상호작용 범위, 즉 103M, 바람직하게는 104M, 가장 바람직하게는 106M에 있다. 올리고사카라이드로의 PBP의 결합이 발열성 또는 흡열성인 경우, 결합은 분배 단계의 온도 변조 수단을 조건으로 각각 저온에서 증가 또는 감소할 것이다.
올리고사카라이드 중합체-PBP 쌍 형성을 확인하는 것 이외에, 상 분리 수단인, 올리고사카라이드 중합체와 함께 사용될 상 분리 시스템의 제2 성분을 평가할 필요가 있다. 상 분리 수단은 또다른 중합체, 또는 충분량의 상 유도제, 일반적으로 강전해질, 예를 들면 일반적으로 황산염 또는 시트르산염과 같은 염 또는 물리적 변화, 예를 들면 셀로사카라이드 중합체가 열분리 특성을 갖는다면 온도 변화일 수 있다. 탄수화물과 폴리(옥시-에테르) 사이의 비상용성을 기준으로 한 덱스트란/PEG 시스템과 같은 것을 비롯한, 전통적인 덱스트란/PEG 시스템 보다 더 저렴하지만 필적할 만한 특성을 갖는 분배 시스템을 형성할 수 있는 중합체 쌍의 예는 많이 있다(Skuse et al., Enzyme Microb. Technol. (1992) 14: 785). 그의 예로는 PEG와 분배 시스템을 형성하는데 사용되어온 히드록시프로필 전분(Tjerneld et al., Enzyme Microb. Technol. (1986) 8: 417), 말토덱스트린(Szlag et al., ACS Symposium Series (1990) 419: 38-52), 히드록시프로필 셀룰로스(Skuse et al., Enzyme Microb. Technol. (1992) 14: 785), 및 카르복시메틸 셀룰로스(Albertsson, Partition of Cell Particles and Macromolecules, Wiley Interscience (1971))를 들 수가 있다.
시스템을 개발하기 위하여, 상 평형 데이터를 얻어 안정한 2상 분배 시스템이 형성되는 농도 이상의, 총 중합체 농도, 또는 중합체 및 다른 상 유도제 농도를 결정하기 위하여 헤이네스 등의 절차(Fluid Phase Equilibria (1989) 53: 463)를 이용하여 선택된 제1 및 제2 성분, 및(또는) 유도 수단을 조합하는데 이용하였다. 일반적으로, PBP-콘쥬게이트는 약 10 mM 내지 약 1 M의 중간 이온 농도 완충액에서 중성 pH에서 상 형성 올리고사카라이드에 결합된다. 결합은 상 분리 시스템의 성분에 따라서 4 ℃ 내지 70 ℃ 이상의 온도에서 행해진다. 결합은 실제로 순간적이며 온도는 결정적이지 않다. 일단 PBP-콘쥬게이트가 상 형성 올리고사카라이드에 결합되면, 그것은 그 상으로 분배된다.
일단 특별한 용도를 위한 상 분리 시스템의 성분 및 가장 적절한 폴리사카라이드 결합 성분이 확인되면, PBP는 적절한 폴리사카라이드 결합 성분을 코딩하는 DNA로 이루어진 DNA 작제물을 숙주 세포로 형질변환시킴으로써 제조될 수 있다. "폴리사카라이드 결합 펩티드"란 문구는 폴리사카리다아제 또는 폴리사카라이드 결합 단백질의 폴리사카라이드 결합 영역의 적어도 관능적인 부분을 포함하는 아미노산 서열을 의미한다. "관능적인 부분"은 당해 올리고사카라이드 중합체에 결합하는 아미노산 서열을 의미한다. 바람직하게는, 당해 단백질을 코딩하는 DNA는 PBP DNA 서열에 연결된다. 화학식 1에 따른 조성물을 코딩하는 융합된 유전자, 또는 PBP DNA 서열은 숙주 세포, 진핵 또는 원핵 생물 세포에서 발현된다. PBP 만이 제조되는 경우, 필요시에 발현 및 단리된 폴리사카라이드 결합 펩티드는 당해 화합물, 즉 단백질 또는 화학 성분에 콘쥬게이션될 수 있다.
폴리사카리다아제 유전자, 예를 들면 셀룰라아제 유전자 및 폴리사카라이드 결합 단백질에 대한 유전자를 단리하는데 사용되는 기술은 당업계에 알려져 있으며, 그의 예로는 합성, 게놈 DNA로부터의 단리, cDNA로부터의 제조, 또는 그의 혼합법을 들 수가 있다(USPN 5,137,819, 5,202,247 및 5,340,731). 가용성 올리고사카라이드에 결합하는, 몇몇 폴리펩티드 결합 도메인에 대한 서열은 알려져 있다(도 1 참조). 각종 폴리사카리다아제 및 폴리사카라이드 결합 단백질을 코딩하는 DNAs도 또한 알려져 있다. 각종 유전자 조작 기술은 잘 알려져 있으며, 그의 예로는 제한, 분해, 절제, 연결, 시험관내 돌연변이 유발, 프라이머 수선, 링커 및 어댑터 이용 등을 들 수가 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
일반적으로, 목적하는 DNA를 얻는 방법은 소정의 특성을 갖는 폴리사카리다아제 또는 폴리사카라이드 결합 단백질을 발현하는 생물체로부터 게놈 라이브러리를 제조하는 것을 포함한다. 공여 미생물의 게놈은 단리되고 BamHI과 같은 적절한 제한 효소에 의해 분해된다. 얻어진 단편은 상용성 제한 효소에 이미 분해된 벡터 분자에 연결된다. 적절한 벡터의 예는 제한 엔도뉴클레아제 BamHI에 의해 분해될 수 있는 플라스미드 pBR322이다.
또한, 폴리사카리다아제의 아미노산 서열을 이용하여 폴리사카리다아제 유전자 또는 폴리펩티드 결합 단백질 유전자를 위한 공여 세포로서 당해 세포에서 얻은 mRNA 또는 DNA로부터 제조된 게놈 라이브러리 또는 cDNA를 스크리닝하기 위한 프로브를 만들 수 있다. 혼성화 프로브로서 폴리사카리다아제 cDNA 또는 결합 단백질 cDNA 또는 그의 단편을 이용함으로써 다른 미생물에서 발견되는 구조적으로 관련있는 유전자가 쉽게 클로닝될 수 있다. 다른 폴리사카라이드 결합 단백질이 사용될 수도 있긴 하지만, 폴리사카리다아제의 촉매 및 결합 도메인이 불연속적인 생물체로부터 얻을 수 있는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 기초로 한 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여 폴리사카리다아제 활성을 발현하는 생물체로부터의 유전자의 단리에 대해서 특히 잘 고려되어야 한다(Shoseyev, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) (1992) 89: 3483-3487).
폴리사카리다아제 또는 폴리사카라이드 결합 단백질의 결합 도메인에 대한 일치 서열을 이용하여 개발된 프로브가 특히 주목된다. 지금까지 특징화된 씨. 피미로부터의 β-1,4-글리카나아제는 엔도글루카나아제 A, B, C 및 D(각각 Cen A, CenB, CenC 및 CenD), 엑소셀로비오히드롤라아제 A 및 B(각각 CbhA 및 CbhB), 및 크실라나아제 A 및 D(각각 Cex 및 XylD)이다(Wong et al. (1986) Gene, 44: 315; Meinke et al. (1991) J. Bacteriol., 173; 308; Coutinho et al., (1991) Mol. Microbiol. 5: 1221; Meinke et al., (1993) Bacteriol., 175: 1910; Meinke et al., (1994) Mol. Microbiol., 12: 413; Shen et al., Biochem. J., in press; O'Neill et al., (1986) Gene, 44: 325; and Millward-Sadler et al., (1994) Mol. Microbiol., 11: 375). 모든 것은 복잡도를 변화시켰지만 두가지 공통적인 특징을 갖는 모듈 단백질이다(도 1): 무관하게 기능할 수 있는 촉매 도메인(CD) 및 셀룰로스 결합 도메인(CBD)(Millward-Sadler et al., (1994) Mol. Microbiol., 11: 375; Gilkes et al., (1988) J. Biol. Chem., 263: 10401; Meinke et al., (1991) J. Bacteriol., 173: 7126; and Coutinho et al., (1992) Mol. Microbiol., 6: 1242). 4가지 효소, CenB, CenD, CbhA 및 CbhB에서, 피브로넥틴 타입 III(Fn3) 반복 단위는 C 말단 CBD로부터 N 말단 CD를 분리한다. 효소의 CDs는 6가지의 글리코시드 히드롤라아제 족으로부터 생기며(Henrissat (1991) Biochem. J., 280: 309; and Henrissat et al., (1993) Biochem. J., 293; 781); 모든 효소는 II족으로부터의 N- 또는 C-말단 CBD 또는 CBDs 족을 가지며(Tomme et al., Adv. Microb. Physiol., in press); CenC는 그의 N-말단에서 IV족으로부터의 텐덤 CBDs를 가지며; CenB 및 XylD 각각은 III 및 II족으로부터의 제2, 내부 CBD를 갖는다. Cex 및 XylD는 분명히 분명하게 크실라나아제이지만, XylD가 아닌 Cex는 셀룰로스에 대한 낮은 활성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 몇몇 다른 세균 크실라나아제와 같이(Gilbert et al., (1993) J. Gen. Microbiol., 139: 187), 그들은 CBDs를 갖는다. 유사한 시스템은 관련 박테리아에 의해 생성된다(Wilson (1992) Crit. Rev. Biotechnol., 12: 45; and Hazlewood et al., (1992) J. Appl. Bacteriol., 72: 244). 씨. 피미는 대개는 다른 β-1,4-글리카나아제를 형성한다. 비관련 세균, 클로스트리듐 터모셀럼(Clostridium thermocellum)은 예를 들면 20개 이상의 β-1,4-글리카나아제를 형성한다(Beguin et al., (1992) FEMS Microbiol. Lett., 100: 523).
결합 도메인의 일치 서열의 예는 엔도글루카나아제 CN1 결합 도메인에 의해 예시되는, 도 1에 나타낸 셀룰로스 결합 도메인에 대한 일치 서열이다. 프로브는 전체 서열 보다 상당히 짧지만, 길이가 10 뉴클레오티드 이상, 바람직하게는 14 뉴클레오티드 이상이어야 한다. 더 긴 올리고뉴클레오티드도 또한 유용하며, 유전자의 완전 길이 까지, 길이가 바람직하게는 500 뉴클레오티드 이하, 더욱 바람직하게는 250 뉴클레오티드 이하가 유용하다. RNA 또는 DNA 프로브가 사용될 수 있다. 일반적으로, 결합은 뉴클레오티드에 의해 코딩된 채로 남아 있어, 그러한 동정은 결합 영역과 약 40% 이상의 상동성(보존 치환을 위한 적절한 여유로서 더 우수한 배치를 위한 갭 등을 포함함)을 나타낼 것이며 103M의 Ka를 갖고 가용성 β-1,4-글루칸에 결합할 것이다. 아미노산 서열의 비교 분석은 PC/Gene(IntelliGenetics, Inc.)의 프로그램을 이용하여 수행될 수 있다. PCLUSTAL은 다중 서열 배치 및 계보의 형성을 위해 이용될 수 있다.
사용할 때에, 프로브는 통상적으로 (32P,3H, 바이오틴 또는 아비딘)에 의해 검출가능한 방법으로 표지화되며, 조사될 유전자가 있는 생물체로부터의 단일 가닥 DNA 또는 RNA와 함께 인큐베이션된다. 혼성화는 단일 가닥 및 이중 가닥(혼성화) DNA (또는 DNA/RNA)를 (통상적으로 니트로셀룰로스 종이를 이용함) 분리한 후에 표지에 의해 검출된다. 올리고사카라이드와 사용하기에 적합한 혼성화 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 프로브가 일반적으로 용이한 동정을 가능하게 하는 검출가능한 표지와 함께 사용되긴 하지만, 비표지화된 올리고뉴클레오티드는 표지된 프로브의 전구체로서 또한 이중 가닥 DNA (또는 DNA/RNA)의 직접적인 검출을 제공하는 방법에서 사용하기에 유용하다. 따라서, "올리고뉴클레오티드 프로브"란 용어는 표지 및 비표지된 형태 둘다와 관계가 있다.
폴리사카리다아제 또는 폴리사카라이드 결합 단백질의 PBP를 단리하기 위하여, 몇가지 유전자 기술이 이용될 수 있다. 한가지 방법은 유전자의 일부를 제거하고 절단된 단백질을 코딩하는 돌연변이된 유전자를 얻기 위해 프레임내에 남아있는 유전자-벡터 단편을 융합시키기 위해 제한 효소를 이용한다. 또다른 방법은 DNA의 5' 및 3' 말단으로부터 외부에서 또는 유전자 내의 제한된 갭으로부터 내부에서 뉴클레오티드를 조직적으로 삭제하는 Bal31과 같은 엑소뉴클레아제를 사용하는 것을 포함한다. 이 유전자 삭제 방법의 결과 짧아진 단백질 분자를 코딩하는 돌연변이된 유전자가 형성되며, 그것은 그후에 기질 또는 폴리사카라이드 결합능에 대해 평가될 수 있다. 결합 활성을 평가하기 위한 적절한 기질은 상기 표 2에 나타내었다.
일단 폴리사카라이드 결합 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 cDNA 또는 염색체 DNA로서 확인되면, 그것은 발현 생성물이 상기 화학식 1에 의해 표시되는 구조를 갖는 조성물의 다양한 제조 방법으로 조작될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 당해 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열에 융합될 수 있다. 3차원적 구조의 성분 폴리펩티드가 유지되는 것이 아주 바람직하다. 목적하는 폴리펩티드 단편의 공급원 및 길이에 따라서, 키메릭 폴리펩티드를 작제하는데 이용되는 합성 유전자에 제한이 이루어질 수 있다. 가능하다면, 제한 부위(들)은 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변형되지 않은 채로 남겨둔다. 그러나, 어떤 경우에 새로운 제한 부위(들)의 포함은 단백질의 활성을 변화시키지 않고 변형된 아미노산 서열을 형성할 수 있다.
발현 카세트의 작제 중에, 각종 DNA 단편은 일반적으로 DNA의 증폭, DNA의 변형 또는 서열, 링커 등의 연결 또는 제거에 의한 조작을 가능하게 하는, 적절한 클로닝 벡터에서 클로닝된다. 일반적으로, 벡터는 세균에서 적어도 상대적으로 많은 복사 수로 복제할 수 있다. pBR322, pTZ, pUC 등과 같은 벡터를 포함한 많은 벡터들은 그람 음성 박테리아, 특히 이. 콜리에서 클로닝하기 위해 쉽게 이용할 수 있다. 클로닝 벡터는 숙주 박테리아에서 기능적인 효율적인 복제 시스템을 갖는 것으로 특징지워진다.
클로닝 벡터는 적어도 하나의 독특한 제한 부위, 일반적으로 복수의 독특한 제한 부위를 가지며, 또한 다중 제한 부위를 포함할 수 있다. 또한, 클로닝 벡터는 형질변환체의 선택을 제공하는 1가지 이상의 마커를 가질 것이다. 이 마커는 일반적으로 항생물질, 중금속, 독소 등과 같은 세포독성 제제에 대한 내성, 영양요구성 숙주의 상보성, 또는 파아지에 대한 면역성을 제공할 것이다. 벡터 및 카세트의 적절한 제한, 적절하게는 말단의 변형에 의해, 평활 말단을 제공하기 위한 오버행의 파괴 또는 충전에 의해, 링커의 첨가에 의해, 테일링에 의해, 상보성 말단이 발현 카세트 및 그의 성분에 벡터를 결합 및 연결하기 위해 제공될 수 있다.
카세트의 개발시의 DNA의 각각의 조작 후에, 플라스미드는 클로닝되고 단리되며, 필요시에 특별한 카세트 성분은 적당한 서열이 얻어지는 것을 보장하기 위해 그의 서열에 관해 분석된다. 조작 특성에 따라서, 원하는 서열이 플라스미드로부터 잘려지고 다른 벡터에 도입될 수 있거나 또는 플라스미드가 제한될 수 있으며, 적절하게는 발현 카세트 성분이 조작된다.
어떤 경우에는, 다른 복제 시스템을 요구하는 다른 숙주에서 복제될 수 있는 셔틀 벡터가 이용된다. 이것은 2가지 숙주에서 기능적인 추가의 마커를 요구하거나 또는 요구하지 않을 수 있다. 그러한 마커가 필요한 경우, 그것은 벡터에 포함될 수 있으며, 카세트, 2가지 복제 시스템 및 마커(들)을 함유하는 플라스미드는 필요시에 한 숙주로부터 다른 숙주로 전달될 수 있다. 선택을 위하여, 임의의 유용한 마커가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 네오마이신 또는 테트라사이클린에 대한 내성에 해당한다. 그러나, 선택 마커가 편리를 위하여 아주 바람직하긴 하지만, 형질변환된 세포를 스크리닝하는 다른 절차가 당업계의 숙련인에게 알려져 있으며, 예를 들면 형질변환된 세포는 그들이 만드는 특정 생성물에 의해 스크리닝될 수 있고, 원하는 생성물의 합성은 면역학적 또는 효소적 방법에 의해 확인될 수 있다.
융합 단백질을 코딩하는 DNA는 각종 발현 방법으로 조작될 수 있다. 예시적인 전사 조절 영역 또는 프로모터로는 박테리아의 경우 lac 프로모터, 람다 좌 및 우 프로모터, trp 및 lac 프로모터, Tac 프로모터 등을 포함할 수 있다. 전사 조절 영역은 추가로 융합된 유전자의 발현 시간이 변조되도록 하는 조절 서열, 예를 들면 성장 배지에서의 영양분 또는 발현 생성물의 존재 또는 부재, 온도 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합된 유전자의 발현은 박테리오파지 람다 PB 프로모터, 박테리오파지 람다 OL 오퍼레이터 및 감온성 리프레서로 이루어진 조절 서열을 이용하여 온도에 의해 조절될 수 있다. 프로모터의 조절은 리프레서와 오퍼레이터 사이의 상호 작용을 통해 이루어진다. 바람직한 프로모터는 강한 글루코스 억제 불감성 Tac 프로모터이다. 고도의 발현 벡터의 예는 문헌(Graham et al., (1995) Gene 158: 51-54)에 기재되어 있다.
발현 카세트는 적절한 세포 숙주에서의 에피솜 보존을 위한 복제 시스템내에 포함될 수 있거나 또는 숙주 게놈에 동화될 수 있는 복제 시스템 없이 제공될 수 있다. DNA는 인산 칼슘-침전된 DNA를 이용한 형질변환, 세포와 바이러스와의 접촉에 의한 트랜스펙션, DNA의 세포로의 미세 주입 등과 같은 공지된 기술에 따라 숙주로 도입될 수 있다.
일단 융합 단백질 DNA가 적절한 숙주에 도입되면, 숙주는 성장되어 융합 단백질을 발현할 수 있다. 미생물 숙주가 이용될 수 있으며, 그 예로는 이. 콜리와 같은 세균, 및 사카로마이세스, 특히 에스. 세레비지에, 스트렙토마이세스, 바실러스 피치아 파스토리스와 같은 진핵 생물, 또는 BHK 또는 CHO와 같은 포유 동물 세포를 들 수가 있다. 재조합 생성물은 글리코실화되거나 또는 비글리코실화될 수 있으며, 그것은 야생형 또는 다른 글리코실화일 수 있다. 글리코실화의 양은 특별한 펩티드의 서열 뿐만 아니라 그것이 생성되는 생물체에 부분적으로 좌우된다. 따라서, 이. 콜리 세포에서의 생성물의 발현 결과 비글리코실화 생성물이 형성되며, 곤충 세포에서 생성물을 발현시키면 일반적으로 포유동물 세포에서의 생성물의 발현 보다 덜 글리코실화된다. 효모에서의 발현은 과다 글리코실화의 결과가 생길 수 있다.
융합 단백질의 단리를 위해서, 생성물이 숙주 세포에 보유되는 경우, 세포를 수거하고, 분해하고 생성물을 상 분리 시스템을 이용하여 분리하고, 단리하고 (또는) 정제한다. 어떤 경우에, 융합 단백질의 분비를 제공하는, 구조 유전자를 갖는 리딩 프레임으로부터 업스트림에 또한 리딩 프레임 내에 시그날 서열(분비 리더)를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 예시적인 분비 리더로는 페니실리나아제, 이뮤노글로불린, T-세포 수용체, 외막 단백질 등의 분비 리더를 들 수가 있다. 적당한 리딩 프레임내에서의 융합에 의하여, 융합 단백질은 매질로 분비될 수 있다. 그러나, 이. 콜리와 같은 세균 발현 시스템에서, 상당한 분획물이 세포외 매질로 흘러들어 간다(Ong et al., Biotech. Bioeng. (1993) 42:401). 생성물이 분비되는 경우, 영양 배지는 모아지고 생성물은 상 분리 시스템을 이용하여 단리된다. 활성 단백질을 생성하기 위하여, 단백질이 재폴딩되도록 할 필요가 있다.
상 분리 시스템은 생물학적 유체, 발효 브로쓰, 세포 용해질 또는 정제되고 상 분리 유도될 생물학적 화합물의 다른 공급원과 혼합된다. 수성 혼합물의 성분을 분리 및(또는) 정제하기 위하여, PBP로 이루어진 조성물의 올리고사카라이드로의 분배에 이어서, 상은 분리되고 PBP로 이루어진 조성물은 여러 방법으로 중합체 상으로부터 해리된다. 이 방법은 분리된 올리고사카라이드 상을 PBP로 이루어진 조성물을 추출하는 다른 상 유도 중합체 또는 염과 접촉시키고; 분리된 올리고사카라이드 상에 산 또는 염기, 우레아, 에탄올, DMSO 등과 같은 해리제를 첨가함으로써 화학적 및(또는) 물리적 조건을 변화시키거나, 또는 결합 반응이 흡열 또는 발열 반응인 것으로 확인되는 경우 온도를 충분히 변화시켜 결합 친화도가 감소되도록 하고; PDP-올리고사카라이드 중합체로부터 당해 화합물을 갖는 것으로 이루어진다.
분해가 이용되는 경우, 당해 단백질 또는 화학 성분은 폴리사카라이드 결합 영역과 올리고사카라이드 중합체에 결합된 PBP를 남겨둔 당해 단백질 또는 화학 성분 사이에 존재하는 서열에 특이적인 프로테아제를 사용하여 폴리사카라이드 결합 영역으로부터 쉽게 분해될 수 있다. 바람직하게는, 프로테아제는 PBP로부터의 당해 폴리펩티드의 분해에 이어서 그의 제거를 용이하게 할 형태로 제공된다. 일례로서, 분해 프로테아제는 분해 효소 착체로서 제공될 수 있으며, 여기서 프로테아제는 당해 폴리펩티드에 결합되고 (또는) 다른 결합 특성을 갖는 제1 폴리사카라이드 결합 성분의 것과 다른 기질 특이성을 갖는 제2 폴리사카라이드 결합 성분에 결합된다(Assouline et al. (1993) Protein Engineering 6: 787-792; Assouline et al.). 따라서, 당해 재조합 단백질로부터의 결합 도메인의 분해는 용액 중에서 행해질 수 있으며, 분해 효소 착체는 제1 폴리사카라이드 결합 성분이 결합하지 않는 폴리사카라이드 기질에 결합함으로써 제거된다. 별법으로, 분해 효소 착체는 제1 폴리사카라이드 결합 성분이 결합하지 않는 폴리사카라이드 매트릭스 상에 고정될 수 있다(Assouline et al. (1993) 상기 참조; Assouline et al. ( ) 상기 참조). 당해 재조합 단백질 또는 화학 성분은 중합체에 결합된 채로 남아 있는 불순 PBPs가 없는 올리고사카라이드 중합체로부터 방출된다. 또한, 비특이적 프로테아제를 이용하여 PBP 착체의 PBP 부분을 완전히 분해할 수 있으므로, 예를 들면, 약 37 ℃에서 약 20분 동안 약 50 mg/ml의 농도로 프로테아제 K로 처리하여 그것을 올리고사카라이드 중합체로부터 방출되도록 한다(Dir et al. (1991) Bio/Technology, 9: 1096-1099).
어떤 경우에는, 융합 단백질 자체가 해당하는 것일 수 있으며, 그러므로 그것은 융합 단백질의 성분을 분리하기 보다는 올리고사카라이드 중합체로부터 제거되는 융합 단백질이다. 융합 단백질을 올리고사카라이드 중합체로부터 분리하기 위하여, 저이온 강도 완충액 또는 물이 필요하거나 또는 알칼리 pH의 완충액 또는 카오트로프 염이 필요하다. 실온, 즉 약 20 ℃가 일반적으로 바람직하긴 하지만, 탈착하기 위한 온도는 중요하지 않으며 일반적으로 10 ℃ 내지 40 ℃이다. 결합된 융합 단백질은 물에서 반복적으로 세척되거나 또는 물의 연속적인 흐름에 의해 희석된다. 일반적으로, pH 9.5 탄산염 완충액 또는 6M 구아니딘 HCl은 이러한 탈착 단계에 사용될 수 있다. 묽은 수산화 나트륨(약 0.1M)이 어떤 경우에는 바람직한 처리 수단일 수 있다. PBP의 특성은 그의 부착성을 변화시키기 위해 변형될 수 있으므로 그것은 물에 의해 탈착될 수 있거나 또는 필요시에 그렇지 않을 수 있다. 탈착 매질의 매트릭스로의 이용은 올리고사카라이드 중합체로부터의 융합체의 방출을 야기시킨다. 기질로부터의 방출에 이은 PBP-콘쥬게이트의 단리를 위해 각종 기술이 이용될 수 있다. 예를 들면, 폴리사카라이드 표면은 상기한 바와 같은 탈착 용액으로 PBP-콘쥬게이트 없이 세척될 수 있다. PBP-콘쥬게이트는 pH의 이온 강도를 변화시키고 PBP-콘쥬게이트를 이온 교환 매질 또는 제2 폴리사카라이드 매트릭스 상에 재흡착시킴으로써 탈착 용액으로부터 분리될 수 있다.
친화도 상 분리 시스템은 많은 용도를 갖는다. 이 방법은 혼합물 중의 성분을 농축시키고, 혼합물 중의 성분을 정제하는 것을 포함하며, 정제는 2배, 일반적으로 20배 이상일 수 있고 80 내지 90%까지 정제할 수 있다. 폴딩 정제는 불순물의 제거, 비활성 K의 증가에 관련하여 측정될 수 있다. 몇몇 용도를 위하여, 이 방법은 또한 세포 분리 및(또는) 특별한 세포 타입의 풍부화에 이용될 수도 있다. 예를 들면, 간 세포 군은 세포를 그 세포의 표면 상의 탄수화물 잔기에 결합하는 PBP와, 또는 수용체 리간드와 같은, 특정 결합 쌍의 제1 부분, 예를 들면 펩티드 호르몬 또는 특이적 결합 쌍의 제2 부분, 즉 수용체가 세포 표면 상에 존재하는 다른 호르몬이 융합되는 PBP와 접촉시킴으로써 풍부할 수 있다. 사용될 수 있는 다른 리간드로는 항체, 예를 들면 항-CD34 및 IL-2와 같은 시토킨을 들 수가 있다. 친화도 상 분배에 이어서, 세포는 예를 들면 트립신을 이용하여 분리된 올리고사카라이드 중합체 상으로부터 방출될 수 있다. 친화도 상 분배 시스템에서의전단력은 분리된 세포에 손상을 덜 주는 다른 세포 분리 방법에서 상당히 더 작다.
이 기술의 다른 용도로는 추출물 생전환, 즉 특히 생성물이 효소 반응의 피드백 제어제인 효소적 과정에서 반응 생성물을 분배하는 방법을 들 수가 있다. 그러한 시스템에서, 효소는 PBP에 결합되어 효소는 효소 활성을 유지한다. 효소에 대한 기질은 올리고사카라이드 중합체 상으로 자연적으로 분배하거나 또는 PBP에 결합하는 것이며, 그 생성물은 올리고사카라이드 중합체 상에 남아있지는 않지만, 생성물이 기질 보다 더 소수성일 때 제2 성분으로 분배하는 것이다. 그후에, 시스템의 제2 성분은 제거되고 생성물은 회수된다. 추출물 생전환 시스템과 사용될 수 있는 효소 반응의 예로는 예를 들면 β-1,4-결합된 올리고사카라이드 감미제의 제조를 위한 트랜스글리코실화; 예를 들면 저급 지방산의 고급 지방산으로의 전환 및 글리세롤 생성, 및 펩티드 합성을 위한 혼합된 에스테르교환 반응을 들 수가 있다. PBP를 보유하는 조성물은 당해 화합물을 폴리사카라이드 지지체 상에 고정시키는 수단으로서 사용될 수 있는데, 그 이유는 PBP의 그의 기질로의 흡착이 강하고 특이적이기 때문이다.
고정화된 시스템의 용도로는 예를 들면 진단 분석을 위한 효소, 항체 단편, 펩티드 호르몬 등을 비롯한 고상 시약의 제조; 셀룰로스가 가용성, 예를 들면 카르복시메틸 셀룰로스이거나 또는 약물이 인터루킨 2와 같은 폴리펩티드인 경우의 미세 결정성 셀룰로스(아비셀)와 같은 고상 지지체일 수 있는 경우의 클리어런스 율을 감소시키기 위한 약물 결합; 예를 들면 카르복시메틸 셀룰로스에 결합되고 전달될 약물의 면역 특이성의 향상을 위한 동일한 셀룰로스 지지체로의 보조제의 결합과 함께 이용될 수 있는 약물 전달; 폴리사카라이드, 예를 들면 셀룰로스 표면으로의 페인트 또는 염료의 커플링; 종이 및 천(면) 상의 인쇄; 및 가수분해 또는 상승작용을 제공하기 위해 목재 칩의 처리를 위한 리그니나아제와 같은 효소의 표적화, 예를 들면 목재 펄프의 표백을 위한 포르피린의 표적화; 식물 표면으로의 살충제, 예를 들면 Bt 독소 또는 다른 항미생물제의 결합과 같은 농업 용도; 예를 들면 생물체의 뿌리 표면으로의 결합을 위한 질소 고정; 비료의 지연 방출; 및 살균제의 지연 방출을 들 수가 있다. 그것은 신선한 물로 전달되어 융합 단백질을 제거하는 해수에 노출된 표면의 항 오염을 위한 해양 환경에서와 같은 고염 조건하에 이용될 수도 있다.
이런 식으로 정제될 수 있는 생물학적 제제의 예로는 인터루킨 2, 팩터 X, 리그니나아제, 및 TPA, 또는 PBP에 융합될 수 있는 임의의 다른 폴리펩티드 또는 단백질을 들 수가 있다. 다른 예로는 배양 브로쓰(원핵 또는 진핵 세포 또는 조직 배양물로부터 얻음), 생물학적 유체, 조직 추출물, 세균, 진균, 식물, 동물, 어류 및 가금류를 포함한 세포 용해질로부터의 추출물, 특히 정제된 단백질 등을 들 수가 있다. 일반적으로, 혼합물은 세포 파쇄물을 제거하기 위해 친화도 분배 시스템에 이용되기 전에 청징화된다.
다음 실시예는 제한하려는 것이 아니라 예시의 목적으로 제공된 것이다.
약자
pNPC =p-니트로페닐-β-D-셀로비오시드;
HPA = 하이드 파우더 어쥬어(Hide Powder Azure);
gCenA 및 gCex = 씨. 피미로부터의 CenA 및 Cex의 글리코실화된 형태;
ngCenA 및 ngCex = 재조합 이. 콜리로부터의 CenA 및 Cex의 비글리코실화된 형태;
RPC = 역상 크로마토그래피;
SDS-PAGE = 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기이동;
a-Pro/Thr = 합성 Cex Pro/Thr 박스에 대한 토끼 항혈청;
PMSF = 페닐-메틸술포닐 플루오라이드
생물학적 배양물 기탁
다음 기탁은 미국 20852 메릴랜드주 록크빌 파크 로운 드라이드 12301에 소재하는 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 이루어졌다. 에스케리키아 콜리 C600에서의 플라스미드 pcEC-2 상의 클로닝된 유전자 CenA의 유도체는 1986년 4월 23일에 ATCC 수탁 번호 제67101호로 기탁되었다. 플라스미드 pEC-1 상의 클로닝된 유전자 Cex의 유도체는 1986년 5월 27일에 ATCC 수탁 번호 제67120호로 기탁되었다. 이. 콜리 JM83, pUC12-1.1cex는 1986년 4월 23일에 ATCC 수탁 번호 제67102호로 기탁되었다. pTugA(수탁 번호 L24193), pTugAS(수탁 번호 L24367), 씨. 피미 CenA(수탁 번호 M15823) 및 씨. 피미 CenC(수탁 번호 X57858)의 완전 뉴클레오티드 서열은 GenBank에 기탁되었다.
재료
클루셀(Klucel) 또는 HPC는 아쿠알론사(Aqualon)에 의해 공급되었다. HPC는 셀룰로스 분자로부터 유도되며 셀룰로스 2-히드록시프로필 에테르로서도 알려져 있다.
나트로솔(Natrosol) 또는 HEC는 아쿠알론사(Aqualon)에 의해 공급되었다. HEC는 히드록시에틸 측쇄를 함유하는 변형된 셀룰로스 중합체이며 셀룰로스 2-히드록시에틸 에테르로서도 알려져 있다. HEC는 백색의 비이온성 분말이다. HEC는 또한 다음 상품명으로 판매된다: 알코람노산/리포람노산(Alcoramnosan/ Liporamnosan)(Vevy); 틸로스 H계(Hoechst Celanese/Colorants & Surf사 제품).
베르모콜(Bermocoll) E 또는 EHEC는 베롤 노벨(Berol Nobel) AB사에 의해 공급된다. EHEC는 에틸 셀룰로스의 에틸렌 글리콜 에테르이다. EHEC는 아쿠알론 사에 의해 아쿠알론(Aqualon) EHEC라는 상품명으로 판매된다.
히드록시프로필메틸 셀룰로스(HPMC)는 시그마사(Sigma)에 의해 공급된다. HPMC는 메틸 셀룰로스의 프로필렌 글리콜 에테르이며 메틸히드록시프로필 셀룰로스로서도 알려져 있다. HPMC는 또한 다음 상품명으로 판매된다: 베네셀/쿨미날(Benecel/Culminal) HPMC(아쿠알론); 비스콘트란(Viscontran) MHPC(헨켈).
덱스트란은 파마시아 바이오테크사(Pharmacia Biotech)에 의해 공급된다.
플루로닉스(Pluronics)는 바스프사(BASF)에 의해 공급된다. 플루로닉은 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드의 블록 공중합체이다. 플루로닉스의 고상물 형태(F계) 및 페이스트 형태(P계)가 둘다 사용될 수 있다.
실시예 1
CBDN1의 단리
에스케리키아 콜리 JM101(SupE, thi-1, Δ(tac-proAB)), (F'traD36, proAB, tacIqZΔM15)(Yanish-Perron et al., Gene (1985) 33: 103-119)을 플라스미드의 유지 및 재조합 단백질의 생성을 위한 숙주 균주로서 사용하였다. 배양물을 액상 트립톤-효모 추출물-인산염 배지(TYP)에서 또는 루리아(Luria) 브로쓰(LB 아가, 카나마이신(100 mg/ml)으로 보충됨) 상에서 30 ℃에서 성장시켰다.
pTugKN1을 갖는 이. 콜리 균주 JM101(도 5 참조)의 철야 배양물을 100 mg 카나마이신/ml로 보충된 TYP에서 500배 희석하고, 30 ℃에서 2.0 내지 3.0의 광학 밀도로 성장시켰다. 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(IPTG)를 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 첨가하여 PBDN1생성을 유도하고 세균을 30 ℃에서 18시간 동안 더 인큐베이션시켰다. 배양 상징액을 13000 x g에서 10분 동안 원심분리(4 ℃)시켜 청징화하고 세포를 폐기하였다. 셀룰로스 상에서의 친화도 크로마토그래피를 이용하여 다음과 같이 PBDN1을 정제하였다. 청징화된 배양 상징액을 때때로 교반시키며 미세결정질 셀룰로스(아비셀)(50 mg.L-1)와 함께 인큐베이션(4℃)시켜 PBDN1을 결합하도록 하였다. 셀룰로스 현탁액을 유리 필터(Whatman GF/A)를 통하여 흡인 여과기 상에 여과시키고 50 mM 인산 칼륨, pH 7.0 중의 1 M NaCl로 간단히 세척하였다. 결합된 PBDN1을 물로 탈착시키고 한외 여과에 의해 농축시켰다. 부분적으로 정제된 PBDN1을 1 ml/분의 유속으로 작동되는, 20 mM 인산 칼륨 완충액, pH 6.0 중에 평형화된 음이온 교환 칼럼(MonoQ) 상에 로딩시켰다. 단백질을 칼럼에 밀착 결합시키고 염 구배(0-1 N NaCl, pH 6.0)로 제거하였다(도 7 참조). PBDN1을 300 mM 염에서 회수하였다(피이크 1, 도 7). 더욱 밀착 결합된 불순 단백질을 고농도 염에서 제거하였다(피이크 2, 도 7).
실시예 2
CBDN1및 CBDN1N2에 대한 HEC, 보리 β-글루칸 및 크실란 결합의 친화도 전기이동에 의한 분석
친화도 전기이동(Mimura et al. (1992) J. Chromatography 597: 345-350)을 이용하여 HEC 및 보리 β-글루칸과 같은 DP315로 가용성 폴리사카라이드에 대한 CBDN1및 CBDN1N2의 결합을 확인 및 평가하였다. 원래의 연속 디스크 전기 이동법을 불연속 방법으로 대체하였다. 2가지 천연 겔, 폴리사카라이드를 함유하는 것(0.1% w/v) 및 리간드를 함유하지 않는 것을 BioRad 전기 이동 시스템의 동일한 플레이트에서 서로 별도로 제조하였다. 이것은 가용성 폴리사카라이드의 존재 또는 부재하의 분석이 반드시 동일한 조건하에서 수행되며 관찰된 효과(결합 글루칸의 존재하의 지연)가 변칙적인 전기이동의 결과가 아니라는 것을 확실히 하는 것이다. BSA를 각 겔에서 음성 대조군으로서 사용하였다. 단백질(각각 5 mg)을 겔 상에 로딩시켰다. 전기이동을 pH 8.2-8.8에서 2 내지 3시간 동안 천연 조건하에 4 ℃에서 수행하였다. CBDN1및 CBDN1N2는 HEC 및 보리 β-글루칸과 강하게 상호작용하며, 그 결과 이들 올리고사카라이드를 함유(+)하는 겔에서의 그들의 이동은 β-글루칸의 부재(-)하의 겔에서의 이동에 비해 많이 지연되었다(도 9A 및 9B). CBDN1및 CBDN1N2는 크실란에 대한 친화력을 나타내지 않으며 글리칸의 존재하의 겔에서의 이동은 글리칸의 부재시의 이동에 비해 지연되지 않았다(도 9C 참조). N1 및 N1N2는 각각 CBDN1및 CBDN1N2를 의미한다.
실시예 3
CBDN1및 CBDN1-융합 단백질에 대한 올리고사카라이드 결합 상수의 등온 적정 마이크로 열계량 측정
마이크로 열계량법을 이용하여 친화도 분배 시스템에 대한 적당한 리간드 셋트를 확인할 목적으로 광범위한 수용성 올리고사카라이드에 대한 CBDN1의 결합 열역학을 측정하였다. 이러한 데이터를 하기 표 7에 나타내었다. 도 15는 35 ℃ 및 pH 7에서 50 mM PBS 중에서 히드록시에틸 셀룰로스(HEC)로의 CPDN1의 결합에 대해 칼로리메트리 사이언스 코포레이션(Calorimetry Sciences Corp.) 모델 4200 ITC로 측정된 가역성 결합 등온선 데이터를 나타낸다. CPDN1은 약한 항체-항원 상호작용 범위의 평형화 결합 상수로 HEC에 강하게 결합한다. CPDN1에 대한 보리 β-글루칸 결합은 이러하 조건에서 보다 더 강하다(Ka= 85,500 M-1). 두 올리고사카라이드에 대해서, CPDN1결합은 친화도 분배 시스템에서 통용되는 거의 모든 PEG 기재 친화 리간드(예를 들면, 시바크론 블루(Cibacron blue)-PEG, 프로시온 레드(Procion red)-PEG, 디니트로페닐-PEG, 디아세트산-PEG) 만큼 밀접하거나 또는 그보다 더 밀접하다. 단일 올리고사카라이드 사슬에 있어서 다중 CPDN1융합 단백질에 결합할 가능성과 결합된, 이러한 비교적 높은 결합 친화력은 용량 및 선택성이 둘다 이러한 친화도 분배 시스템에서 높을 것이라는 것을 암시한다. N1 결합 열역학의 개요는 하기 표 8에 제공되었다. HEC 및 보리 β-글루칸에 대한 CPDN1의 결합은 강한 발열성이며, 그것은 결합이 저온에서 증가할 것이며 온도 감소가 분배 단계에서 이용되며 온도 상승이 용출 단계에서 이용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 4
HEC와 플루로닉(Pluronic) P105의 혼합물의 상 평형화 분석
35 ℃ 및 pH 7에서 50 mM PBS 중의 HEC 및 플루로닉 P105(폴리(에틸렌 글리콜)-폴리(프로필렌 글리콜) 공중합체)의 혼합물에 대해 문헌(Fluid Phase Equilibria, (1989) 53: 463)의 절차를 이용하여 상 평형 데이터를 얻었다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 약 3%(wt/wt) 이상의 플루로닉 P105 및 2% HEC의 총 중합체 농도에서 안정한 2상 분배 시스템이 형성되므로, 적절하게 큰 범위의 2상 조성물 및 친화도 분배에 유용한 평형 타이 라인 선 길이를 제공하게 된다.
셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi)의 엔도글루카나아제 C로부터의 CBDN1의 결합 특이성
리간드 CBDN1 α에 대한 결합 검측 방법
가용성 리간드
글루코스 - NMR
셀로비오스 - NMR
셀로트리오스 +/- NMR/열계량법
셀로테트라오스 ++ NMR/열계량법
셀로펜타오스 +++ NMR/열계량법
셀로헥사오스 +++ NMR/열계량법
메틸셀룰로스(MC) ++ 친화도 전기이동
카르복시메틸셀룰로스(CMC) + 친화도 전기이동/경쟁 분석
에틸히드록시에틸셀룰로스(EHEC) ++ 친화도 전기이동
히드록시에틸셀룰로스(HEC) +++ 친화도 전기이동/경쟁 분석
히드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC) +++ 친화도 전기이동
보리 β-글루칸 +++ 열계량법/친화도 전기이동/경쟁 분석
귀리 β-글루칸 +++ 열계량법/친화도 전기이동
키토산 +/- 친화도 전기이동
글루코만난 + 친화도 전기이동
만난 - 친화도 전기이동
크실란 - 친화도 전기이동/경쟁 분석
아라비노갈락탄 - 친화도 전기이동
전분(아밀로펙틴) - 친화도 전기이동
덱스트란 T70 - 친화도 전기이동
라미나린 - 친화도 전기이동
불용성 리간드
인산 팽윤된 셀룰로스(PASC) +++ 결합 등온선
아비셀 + 결합 등온선
세균 미세결정질 셀룰로스(BMCC) - 결합 등온선
투니신 셀룰로스 +/- 결합 등온선
키틴 +/- 결합 등온선
아밀로스 - 결합 등온선
세파덱스 +/- 결합 등온선
파키만 - 결합 등온선
35 ℃에서의 N1 결합 열역학의 요약
NMR 등온 적정 마이크로 열계량법
리간드 Ka(M-1) Ka(M-1) DH0(Kcal/mol) -TDS0(kcal/mol)
셀로트리오스 180±50 n.m -- --
셀로테트로스 4200±700 4100±500 -6.4±0.2 1.4±0.1
셀로펜토스 34000±7500 17900±3100 -6.8±0.2 0.86±0.1
셀로헥소스 51000±18000 25200±3900 -6.9±0.2 0.79±0.1
보리
β-글루칸 n.m. 85500±4400 -7.3±0.1 0.48±0.1
HEC n.m. 67000±3900 -7.2±0.1 0.50±0.1
실시예 5
올리고사카라이드 중합체로부터의 CBDN1에 대한 적합한 용출 조건의 등온 적정 마이크로 열계량 측정
ITC를 이용하여 온도, 염 농도 및 유형, 및 PBPN1-탄수화물 착체의 알맞은 수소 결합 구조를 파괴하는 것으로 만들어진, 에틸렌 글리콜 또는 우레아와 같은 보조 용매의 함수로서 평형 해리 상수를 측정하여 적합한 용출 조건을 확인하였다.
실시예 6
cenC CBD 유전자 단편 및 씨. 피미. 엔도글루카나아제 A(cenA) 유전자 단편의 융합을 포함한 발현 벡터의 작제 및 그 융합 단백질의 특징화
벡터의 작제
플라스미드 pTZ-JC2(도 10A 참조)를 SmaI 및 HindIII로 분해를 완결하였다. 3.9 kbp 단편을 회수하였다. 플라스미드 pUC18-1.6 cenA PT(도 10B 참조)를 HpaI 및 HindIII로 분해시키고 1.1 kbp 단편을 회수하였다. 3.9 및 1.1 kbp 단편을 결합시켜 pTZ-JC13(도 10C 참조)을 제공하였다. 이 벡터를 이용하여 이. 콜리 JM101을 형질변환시켰다.
융합 단백질의 효소적 특징화
pTZ-JC13에 의해 코딩된 발현 생성물(융합 단백질)을 아비셀, 세균 미세결정성 셀룰로스(BMCC) 및 인산 팽윤된 셀룰로스(PASC)에 대한 그의 촉매 활성을 원래의 CenA 및 그의 단리된 촉매 도메인 p30과 비교하여 특징화하였다. 일정한 분석 조건하에서 일정량의 기질로부터 생성된 가용성 환원당의 양으로부터 비활성을 측정하였다. 환원당을 비색계 분석에 의해 측정하고 글루코스 표준을 이용하여 확인하였다. 폴리펩티드의 농도를 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250(Coomassie Brilliant Blue)의 결합에 의해 측정하였다(Gilkes et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 10401-10407 참조).
단백질 가수분해에 대한 융합 단백질의 민감성의 평가
융합 단백질이 용도에 있어서의 주요 사항은 단백질 가수분해에 대한 내성을 포함한 여러 조건하에서의 폴리펩티드의 안정성이다. 링커 서열의 부재하의 단백질 가수분해에 대한 융합 단백질의 민감성은 씨. 피미 프로테아제로 평가하였다. 씨. 피미 프로테아제에 의한 융합 단백질의 분해는 SDS-PAGE로 검지하였다(도 12 참조). 융합 단백질의 안정성을 CenA의 안정성과 비교하였다. 프로테아제 농도 및 단백질 가수분해 조건을 변화시켜 그 결과를 최적화하였다.
융합 단백질의 결합 특성의 평가; 시차 흡수 분석
다른 셀룰로스 이형태에 대한 PBD-융합 단백질의 친화도를 한정하기 위하여, 각종 셀룰로스 매트릭스에 대한 결합을 결합 분획물의 SDS-PAGE 분석에 의해 간단히 평가하였다. 이러한 분석은 PBDN1이 비결정성 셀룰로스(PASC)에 결합하지만 결정성 셀룰로스(BMCC)에는 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 한편 CBDCenA는 셀룰로스 재료 둘다에 대해 친화력을 갖는다. 이러한 다른 결합 특성은 다른 것의 존재하에 한가지 성분을 선택적으로 제거할 가능성을 제공한다. 첫 번째 단계에서는, BMCC가 첨가되어 CenA를 제거한다. 첫 번째 단계 후에 용액에 남겨진 PBD 융합 단백질은 PASC로의 흡착에 의해 제거되었다(도 12 참조). 셀룰로스 농도와 관계 있는 각종 단백질 성분의 농도는 셀룰로스를 비포화, 포화 및 과포화시키는 효과를 평가하기 위한 분석 중에 광범위하게 변화되었다.
다른 성분의 이러한 선택적인 제거 또는 결합은 융합 단백질의 처리 및 정제에 사용하는데 중요한 관계가 있다. 그러한 과정은 융합 단백질로부터의 PBD의 단백질 가수분해 제거를 포함할 수 있으며 당해 화합물을 유리시키기 위해 CBD-프로테아제를 사용한 폴리사카라이로의 결합을 포함할 수 있다. 프로테아제는 순수한 화합물을 남겨두면서 셀룰로스(예를 들면, BMCC)로의 그의 결합에 의해 제거된다.
실시예 7
올리고사카라이드-중합체 기재 친화도 상 분배를 이용한 베로 세포의 분리를 매개하는 이작용기성 융합 단백질의 생성 및 특성
세균 균주, 세포주, 및 성장 조건
화학물질은 HPLC 등급으로 분석하였다. 재조합 DNA 실험은 100 mg/ml의 암피실린(Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany)으로 보충된 LB 배지에서 37 ℃에서 성장된 이. 콜리 JM 101에서 수행되었다. 고도의 발현 연구 및 대규모 단백질 생성은 암피실린(100 mg/ml)으로 보충된 TYP 배지(리터 당 16 g 트립톤, 16 g 효모 추출물, 5 g NaCl, 2.5 g K2HPO4)에서 37 ℃에서 성장된 이. 콜리 R1360에서 수행되었다. 세균 배지 성분은 디프코 라보라토리사(Difco Laboratories(Detroit, MI))의 것이었다. 진탕기 플라스크 배양물에 대한 진탕기 속도는 250 rpm으로 정해졌다. 배양물은 0.15 mM에서 이소프로필-D-티오갈락토시드(IPTG, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)로 유도되었다. 부착 연구에서 사용된 베로(아프리카 그린 원숭이, 신장-ATCC CCL 81) 세포를 37 ℃에서 10% NCS(Gibco BRL), 및 5% CO2로 보충된 DMEM 또는 DMEM/F12 배지(Gibco BRL, Gaithersburg, MD) 중에서 T 플라스크에 유지하였다.
재조합 DNA 기술
모든 재조합 DNA 작업을 상기한 바와 같이 수행하였다(Sambrook (1989) 상기 참조). 이중 가닥 DNA를 알칼리 분해 방법에 의해 제조하였다. 제조업자의 지시에 따라 DNA 제한 및 변형 효소를 이용하였다. DNA 단편을 아가로스 겔 전기이동에 의해 분리하였다. 큰 DNA 단편을 GeneCleanTM(Bio101, La Jolla, CA)를 이용하여 단리하였다. 작은 DNA 단편(100 bp 미만)을 액체 질소 방법에 의해 단리하였다. 냉동된 반응력이 있는 이. 콜리 세포를 모든 형질변환에 사용하였다. 올리고데옥시뉴클레오티드를 ABI 380A DNA 합성기(Applied Biosystems, Foster City, CA)로 합성하고 C18 카트리지 크로마토그래피로 정제하였다. 올리고데옥시뉴클레오티드의 어닐링을 서열화 완충액(40 mM Tris-HCl 또는 pH 7.5, 20 mM MgCl2, 50 mM NaCl)에서 74 ℃로 10분 동안 수행하고, 이어서 4 ℃에서 서서히 냉각시켰다. DNA를 변형된 T7DNA 폴리머라제를 이용하여 디데옥시 사슬 종결 방법에 의해 서열화하였다(Sanger et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1977) 74: 5463-5467).
폴리펩티드 분석
폴리펩티드를 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기이동(SDS-PAGE)에 의해 분해하였다. 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 R250(BioRad, Richmond, CA)으로 염색하고; ImageQuant(등록상표) 소프트웨어가 장착된 주사 농도계(Computing Densitometer, Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)를 사용하여 밴드를 정량화하였다. 순수한 CBPN1/RGD 표준을 각 셋트의 겔과 함께 포함시켰다. CBPN1/RGD의 순수한 제조물의 농도를 순수한 CBD/RGD에 대해 결정된 흡광 계수를 이용하여 280 nm에서의 흡광도에 의해 결정하였다(Scopes, Anal. Biochem. (1974) 59: 277-282). 1차 항체로서 토끼 항-CenA 혈청을 이용하고 2차 항체로서 양고추냉이 페록시다아제(Gibco BRL)에 콘쥬게이션된 염소 항-토끼 혈청을 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
올리고사카라이드 결합 분석
이것을 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다.
CBDN1/RGD의 대규모 생성 및 정제
CBDN1에 대한 코딩 서열을 R1360/pTZ18U-CBD/RGD 작제물에서의 알루로마나아제 피미 엔도글루카나아제 A(Cen A)의 셀루테스 결합 도메인(CBD)에 대한 코딩 서열로 대체한 것을 제외하고는, CBDN1을 문헌(Wierzba et al., Biotechnol. and Bioeng. (1995) 47: 147-154)에 기재된 바와 같이 생성시켰다. 작제물을 함유한 이. 콜리를 암피실린(100 mg/ml), 및 IPTG(0.15 mM)로 보충된 TYP 배지 중의 12-L 발효기(Chemap AG, Volketswil, Switzerland)에서 37 ℃에서 성장시켰다. 세포를 31,000 g에서 원심분리(Sharples-Stokes Division, Pennwalt Corp., Warminster, PA)시켜 배지로부터 분리하였다. 배지 및 세포 분획물 중의 CBDN1/RGD를 실시예 4에 기재된 바와 같이 HEC 및 플루로닉 피오스의 혼합물을 이용하는 친화도 상 분배를 이용하여 개별적으로 정제하였다. 배지를 GF/C 유리 섬유 필터(Whatman International, Maidstone, UK)를 통해 여과시켜 세포 파쇄물을 제거하였다. 이 배지를 상 분리 시스템에 첨가하였다. 분리가 HEC에 대한 CBDN1융합물의 결합에 의해 크게 증가된다는 중요한 차이점을 갖는 다른 수성 2상 분배 시스템에 대한 방법론(예를 들면, Joshi et al., Bioseparations, (1990) 11:311)에 따랐다. 도 17은 시스템의 개략도이며, 그 시스템에서 배양 상징액 또는 세포 추출물로부터의 CBDN1-융합 단백질의 친화도 추출은 상업용 그래서(Graesser) 타입 접촉기(대부분의 대규모 분배 시스템에 이용됨) 또는 혼합기-침강기 배터(Haynes, PhD Thesis, University of California at Berkeley (1991))에서 일어난다. CBDN1융합 단백질을 함유하는 탄수화물 풍부 추출물 상은 생성물의 역추출을 위한 제2 혼합기-침강기 배터로 펌핑되며, 폴리(옥시-에테르) 풍부 상은 비상용성 세일로 스트리핑되며 그후에 친화성 접촉기로 재순환된다(Haynes et al., AIChE J., (1991) 37: 1401). 충분한 염, 일반적으로 황산염 또는 시트르산염을 결합된 표적 단백질을 함유하는 탄수화물 풍부 추출물 상에 첨가하면 상 분리가 일어난다(Walter et al., Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems, Academic Press (1985)). 상 분리에 필요한 2M 및 고 염 농도는 리간드-단백질 착체의 해리를 유도하기도 하며, 따라서 생성물 회수의 간단한 수단이 된다. CBDN1및 HEC 사이의 강한 발열성 결합은 해리가 온도의 적당한 증가 또는 수소 결합 파괴 보조용매의 첨가를 통해 이루어질 수 있다는 것을 나타낸다. 과량의 염은 투과 또는 다른 탈염 방법에 의해 제거하였다. 현탁액은 4 ℃에서 철야로 부드럽게 교반하였다. 용출액을 농축시키고 1-dD 분리 막(Amicon Division, W.R. Grace & Co., Beverly, MA)를 이용하여 한외 여과법에 의해 dH2O(50 nM GdmC1 미만으로)로 교환시켰다. CBDN1/RGD 용액(5 내지 12 mg/mL)을 멸균 여과(0.2 mm)시키고 -20 ℃에서 저장하였다.
이. 콜리 세포를 50 mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 세척하고, 3 mM EDTA로 보충된 동일한 완충액 150 mL에 재현탁시키고 50 mL 프렌치 압력 세포(SLM Instruments, Urbana, IL)에서 파괴시켰다. 단백질 가수분해를 최소화하기 위하여 페닐메틸술포닐플루오라이드(1 mM) 및 펩스타인 A(1 mM)를 세포 추출물에 첨가하였다. 세포 파쇄물을 4 ℃에서 30분 동안 17,400 g에서 원심분리시켜 제거하였다. 스트렙토마이신 설페이트(Sigma)를 상징액(1.5% w/v)에 첨가하였다. 4 ℃에서 철야로 인큐베이션시킨 후에, 침전물을 4 ℃에서 30분 동안 17,400 g에서 원심분리시켜 모았다. 상징액을 친화도 분배 시스템에 첨가하고 CBDN1/RGD를 배양 브로쓰에 대해 상기한 바와 같이 정제하였다.
세포 분리 분석
세포를 트립신 및 EDTA로 배양 디쉬로부터 분리하고, 0.01% 콩 트립신 억제제(Sigma)를 함유하는 DMEM 배지로 1회 세척하고, 억제제 없이 DMEM 배지로 2회 세척하였다. 총 4 x 106의 세척된 세포는 무혈청 배지 중의 CBDN1이었다. 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후에, CBDN1/RGD 결합된 세포를 친화도 상 분배 시스템에 첨가하였다. HEC 상의 분리 후에, 트립신을 첨가하여 HEC로부터 세포를 방출시키고 세포를 원심분리시켜 모았다. 세포의 생존율을 트립판 블루 배제에 의해 평가하였다.
실시예 8
아비셀 상에 고정된 β-글루코시다아제 융합 단백질을 이용한 셀로비오스로부터의 글루코스의 생성
이 절차는 엔도글루카나아제-엑소글루카나아제 동시 인큐베이션과 후속적으로 생성된 셀로비오스 혼합물을 β-글루코시다아제가 고정되어 있는 아비셀 칼럼으로 채널링시키는 것을 이용한다(도 13B 참조). 이 방법은 다음과 같다. 발효 용기에서, 적당한 비율의 엔도글루카나아제 및 엑소글루카나아제를 분해될 셀룰로스 재료를 함유하는 배지에 첨가하였다. 효소를 일정 기간 동안 반응시켜 배지에 가용성인 셀로비오스를 생성시켰다. 효소와 함께 전체 소비된 배지를 먼저 엔도글루카나아제 및 엑소글루카나아제를 고정화시키고 농축시키는 아비셀 칼럼을에 통과시켰다. 셀로비오스를 함유하는 용출액을 셀로비오스를 글루코스 단위로 가수분해시키는 고정화된 β-글루코시다아제 PBDCex융합 단백질을 갖는 제2 아비실 칼럼에 채널링시켰다. 엔도글루카나아제 및 엑소글루카나아제를 용출시켜 제1 칼럼으로부터 재생성시켰다. 두 칼럼을 정제 및 효소적 전환을 위해 수회 재사용할 수 있다.
실시예 9
CBDN1-알칼리 포스파타아제 융합 단백질 발현 카세트의 제조
TNphoA는 이. 콜리 알칼리 포스파타아제 유전자, phoA, 마이너스 그의 서열('phoA)을 함유하는 트랜스포손 Tn5의 유도체이다. 적당한 리딩 프레임 내의 발현된 유전자로의 전위 삽입은 PhoA 융합 단백질을 형성한다. 표적 유전자가 단백질 방출 시그날을 함유한다면, 이것은 융합 단백질의 분비를 지시할 수 있다. 이 분비는 효소가 외질로 분비될 때에만 존재하는 알칼리 포스파타아제 활성에 의해 검출될 수 있다. TnphoA를 이용하여 다중 클로닝 부위를 갖는 플라스미드 중에 씨. 피미 CBDN1코딩 서열을 갖는 phoA 유전자 융합물을 형성하였다. 당해 단백질을 코딩하는 유전자는 다중 클로닝 부위(mcs)에 클로닝되고 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 유전자 생성물은 HEC-플루로닉 IOS CBDN1에서의 친화도 상 분배에 의해 정제된다.
유전자 융합의 제조 및 분석
TnphoA에 의한 전위 돌연변이 형성을 이용하여 CBDN1과의 유전자 융합을 형성하였다. CBDN1을 함유하는 플라스미드는 pTugKN1이다(도 5 및 6 참조).
전위는 트랜스포손, 1TnphoA-1을 함유하는 불완전한 람다 파아지에 의한 이. 콜리 CC118(pTugKN1)의 감염에 의해 매개된다(Gutierrez et al., J. Mol. Biol. (1987) 195: 289-297). 이. 콜리 CC118은 phoA 유전자의 결실을 포함한다. CBDN1에 의한 프레임내 CBDN1코딩 서열로의 전위 삽입은 세포외 배지에 대해 표적화된 CBDN1-PhoA 융합 단백질을 형성한다. 카나마이신(트랜스포손-유도됨) 및 암피실린 내성에 대해 선택된 콜로니를 색원체 기질 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(XP)에 대한 알칼리 포스파타아제 활성을 위해 스크리닝하였다. PhoA+ 콜로니로부터의 플라스미드 DNA를 상기한 바와 같이 재형질변환시키고, 선택하고 스크리닝하였다. PhoA+ 콜로니를 Congo 레드로 염색된 카르복시메틸 셀룰로스(CMC) 플레이트에 대한 엔도글루카나아제 활성을 위해 스크리닝하였다(Greenwood et al., FEBS Letters (1984) 2: 259-263). 바람직한 표현형은 PhoA+, EngA-, 및 암피실린 및 카나마이신에 대한 내성이다.
플라스미드 DNA를 PhoA+, EngA- 콜로니로부터 단리하고, 적당히 배향된 CBDN1중의 TnphoA 삽입물을 갖는 콜로니에 대해 제한 분해 및 아가로스 겔 전기이동에 의해 분석하였다. 이들 클론 중 일부는 프레임 외 삽입물을 가질 수 있고, 융합물의 단백질 생성물에서 볼 때 분명하게 될 가능성이 있다. CBDN1-PhoA 융합 단백질을 HEC와 같은 가용성 올리고사카라이드에 대한 결합에 대해 분석하였다. TnphoA의 정확한 삽입 위치는 사슬 종결 방법을 이용하여 DNA 서열화에 의해 결정하였다.
융합 단백질의 정제
융합 단백질을 함유하는 청징화된 이. 콜리 추출물을 HEC 중합체에 대한 융합 단백질의 결합을 촉진시키는 완충액 중에서의 HEC-플루로닉 105 친화도 상 분배 시스템에 적용하였다. 플루로닉 105 상으로부터 HEC 상을 분리한 후에, 온도를 증가시키고 융합 단백질을 수집하여 융합 단백질을 해리시켰다. 수집된 분획물을 알칼리 포스파타아제 활성에 대해 분석하고 효소 피이크를 이온 교환 또는 겔 여과 크로마토그래피에 의해 더 정제하였다. 알칼리 포스파타아제 활성의 회수를 최적화하기 위해 정제 조건을 변화시켰다.
파라메터(± 누적 표준 오차)를 이중의 상반 형태로 플롯팅된 흡수 데이터로부터 계산하였다. Ka및 a의 값을 실시예 3, C에 상술한 바와 같이 [No] = 101 mmol 격자 잔기.g 셀룰로스-1을 이용하여 계산하였다. 아비셀, BMCC 및 재생성된 셀룰로스(RC)를 포함한 셀룰로스에 대한 PBPCex, 및 키틴의 흡수 및 상대 친화도를 미국 특허 출원 제5,340,731호의 도 15 및 16에 나타내었다. 미국 특허 출원 제5,340,731호의 도 17은 적어도 폴리사카리다아제의 PBP가 염료 또는 안료와 같은, 단백질 또는 화학 성분과 같은 당해 리간드에 결합되어 있는 혼성체 단백질로 이루어진 본 발명의 조성물로의 CEBCex의 결합에 대한 청정제 첨가의 영향을 나타낸다. 2가지의 다른 제거가능한 표지 재조성물의 셀룰로스로부터의 효소적 분리의 예를 표 14(상기)에 나타내었다.
실시예 10
단일 열분리 중합체 시스템
CBDN1또는 다른 가용성 폴리사카라이드 결합 도메인이 친화력을 갖는 단일 열분리 폴리사카라이드를 이용하는 친화도 농축 및 분리 시스템을 제조하였다. 이러한 폴리사카라이드군의 성분으로는 메틸 셀룰로스, 에틸 히드록시에틸 셀룰로스, 프로필 히드록시에틸 셀룰로스, 및 히드록시프로필 메틸 셀룰로스를 들 수가 있다. 이러한 시스템을 배양 중에 배양 상징액으로 분비된 가용성 올리고사카라이드 결합 도메인을 함유하는 융합/혼성 단백질을 결합 및 분리시키거나, 또는 세포 용해, 삼투 쇽 등에 이어 가용성 올리고사카라이드 결합 도메인을 함유하는 세포내 융합/혼성 단백질을 결합 및 분리하는데 이용할 수 있다. 두 시스템에서, 그 과정은 다음과 같다: 열분리 폴리사카라이드를 유동 점 온도 미만의 온도에서 노출된 융합 단백질을 함유하는 용해질 또는 배양 상징액에 첨가한다. 열분리 폴리사카라이드 및 배양 상징액 또는 용해질을 혼합하고 온도를 폴리사카라이드에 대한 유동 점 온도 이상의 온도에 도달할 때 까지 서서히 상승시켰다. 잔류 용액 중의 중합체 풍부 상의 형성시에, 중합체 풍부 상을 회수하고 융합 단백질을 폴리사카라이드로부터 용출시킬 수 있다. 그후에, 모든 잔류 용질과 함께 잔류 용액을 폐기할 수 있다.
이 과정을 4단계로 나눈다: 올리고사카라이드 결합 단백질을 함유하는 수용액 또는 올리고사카라이드 결합 단백질을 함유하는 임의의 융합 단백질로의 열분리 중합체의 첨가 및 중합체의 상기 단백질로의 접촉 및 결합; 혼합 조건하에서 온도의 CPT 이상의 온도로의 느린 상승; 물 풍부 및 중합체 풍부 상(중력 침강에 의해 이루어질 수 있거나 또는 원심분리에 의해 증가될 수 있음)의 분리를 용이하게 하기 위한 CPT 이상의 온도에서의 혼합의 배제; 및 중합체 풍부 상(표적 단백질을 함유함)의 회수 및 표적 올리고사카라이드 결합 단백질 또는 올리고사카라이드 결합 단백질을 함유하는 융합 단백질의 용출.
실시예 11
1가지 이상의 열분리 중합체를 함유한 친화도 수성 2상 시스템
CBDN1에 대해 친화력을 갖는 1가지 이상의 열분리 중합체를 함유하는 수성 2상 시스템을 만들었다(하기 표 참조). 이러한 시스템은 중합체를 회수 및 재순환시키는 간단한 방법에 의해 이어지는 도메인이 결합하는 중합체를 함유하는 상으로의 고친화도 분리를 가능하게 한다.
CBDN1및 다른 올리고사카라이드 결합 단백질을 결합시킬 수 있는 4가지의 다른 셀룰로스 기재 중합체를 2가지의 다른 비셀룰로스 중합체와 함께 이용하여 많은 새로운 수성 2상 시스템을 형성하였다. 형성된 수성 2상 시스템의 특성을 다음과 같이 논의하였다.
플루로닉(Pluronic) - 클루셀(Klucel) 시스템
8가지 다른 등급의 플루로닉을 3가지 등급의 클루셀과 함께 사용하였다. 사용된 플루로닉으로는 F68, F77, F108, P84, P103, P104, P105 및 P123을 들 수가 있다. 사용된 클루셀의 등급은 클루셀 H, L 및 M이었다.
플루로닉 F68 - 클루셀 H: 2상 시스템은 각 중합체 10%(총 중량%) 이상을 함유하는 용액으로부터 형성되었다.
플루로닉 F68 - 클루셀 L: 2상 시스템은 각 중합체 13%(총 중량%) 이상을 함유하는 용액으로부터 형성되었다.
플루로닉 F68 - 클루셀 M: 상 분리는 12%(w/w)를 초과하는 중합체 농도에 대해 관찰되었다.
플루로닉 F77 - 클루셀 H: 상 분리는 각 중합체 농도가 9% 범위인 용액에 대해서 관찰되었다. 상부 상은 맑은 반면 하부 상은 탁했다.
플루로닉 F77 - 클루셀 L: 상 분리는 각 중합체 농도가 10%(w/w) 범위인 용액에 대해서 관찰되었다.
플루로닉 F77 - 클루셀 M: 2상 시스템은 각 중합체 10%(총 중량%) 이상을 함유하는 용액으로부터 형성되었다.
플루로닉 F77 - 클루셀 H: 2상 시스템은 각 중합체 10%(총 중량%) 이상을 함유하는 용액으로부터 형성되었다.
플루로닉 F108 - 클루셀 L: 2상 시스템은 각 중합체 10%(총 중량%) 이상을 함유하는 용액으로부터 형성되었다.
플루로닉 F108 - 클루셀 M: 2상 시스템은 각 중합체 9%(총 중량%) 이상을 함유하는 용액으로부터 형성되었다.
플루로닉 P103 - 클루셀 H: 분리는 플루로닉 약 6.5% 및 클루셀 7.1%의 용액에 대해 관찰되었다.
플루로닉 P104 - 클루셀 H: 분리는 플루로닉 4.1% 및 클루셀 3.8% 농도의 용액에 대해 관찰되었다.
플루로닉 P105 - 클루셀 H: 상 분리는 플루로닉 4.5% 및 클루셀 2.8% 농도의 용액에 대해 관찰되었다. 저 농도에서의 2상 시스템은 점성이 아니었다.
플루로닉 P105 - 클루셀 L: 분리는 플루로닉 5.0% 및 클루셀 3.5% 농도 범위에서 일어났다. 이 범위의 2상 용액은 점성이 아니었다. 하부 상은 40 ℃ 이상의 온도에서 열 분리되었다.
플루로닉 P105 - 클루셀 M: 상 분리는 플루로닉 3.9% 및 클루셀 2.5%의 낮은 농도에 대해 관찰되었다. 하부 상은 38 ℃ 이상의 온도에서 점성이 되고 탁하게 되었다.
플루로닉 P123 - 클루셀 H: 2상 시스템은 플루로닉 5.6% 및 클루셀 4.0% 농도에서 형성되었다.
덱스트란 - 나트로솔 시스템
3가지 등급의 덱스트란을 3가지 등급의 나트로솔과 함께 사용하여 새로운 셋트의 수성 2상 시스템을 형성하였다. 덱스트란의 등급은 T40, T70 및 T500 등급이었고 나트로솔 등급은 250 HR, 250 LR 및 250 MR이었다.
덱스트란 T40 - 나트로솔 250 LR: 수성 2상 시스템은 각 중합체 10% 범위 농도의 용액으로부터 형성되었다.
덱스트란 T70 - 나트로솔 250 LR: 수성 2상 시스템은 덱스트란 약 5.2% 및 나트로솔 5.0%의 용액으로부터 형성되었다.
덱스트란 T500 - 나트로솔 250 LR: 수성 2상 시스템은 두 중합체 5.3%의 용액으로부터 형성되었다.
플루로닉 - 덱스트란 시스템
4가지 등급의 덱스트란을 4가지 등급의 플루로닉과 함께 사용하여 본 발명에 유용한 새로운 셋트의 수성 2상 시스템을 형성하였다. 사용된 덱스트란 등급은 T40, T500 및 T2000이었다. 사용된 플루로닉은 F68, F77, F108 및 P105였다. 우수한 상 분리 특성은 낮은 중합체 농도 및 낮은 점도 면에서 시험된 중합체 배합물 대부분에 대해 관찰되었다.
플루로닉 F68 - 덱스트란 T40: 상 분리는 각 중합체 약 9.0% 농도에 대해 관찰되었다. 2상 시스템은 이 농도에서 둘다 맑고 아주 점성질이지는 않다.
플루로닉 F68 - 덱스트란 T70: 상 분리는 플루로닉 7.0% 및 덱스트란 5.9%의 농도에 대해 관찰되었다.
플루로닉 F68 - 덱스트란 T500: 수성 2상 시스템은 각 중합체 약 6.3% 농도에서 형성되었다.
플루로닉 F68 - 덱스트란 T2000: 수성 2상 시스템은 각 중합체 약 9.0% 농도에서 형성되었다.
플루로닉 F77 - 덱스트란 T40: 수성 2상 시스템은 플루로닉 10.0% 및 덱스트란 9.2%의 농도에서 형성되었다.
플루로닉 F77 - 덱스트란 T70: 상 분리는 각 중합체 약 8.2% 농도의 용액에 대해 일어났다.
플루로닉 F77 - 덱스트란 T500: 수성 2상 시스템은 두 중합체 7.0% 농도에서 형성되었다.
플루로닉 F77 - 덱스트란 T2000: 상 분리는 두 중합체 10.7% 농도에서 관찰되었다.
플루로닉 F108 - 덱스트란 T40: 수성 2상 시스템은 각 중합체 약 7.0% 농도에서 형성되었다.
플루로닉 F108 - 덱스트란 T70: 수성 2상 시스템은 7.0% 범위의 농도에서 형성되었다.
플루로닉 F108 - 덱스트란 T500: 상 분리는 플루로닉 3.9% 및 덱스트란 3.4%의 농도에서 일어났다.
플루로닉 F108 - 덱스트란 T2000: 수성 2상 시스템은 플루로닉 3.4% 및 덱스트란 3.9% 범위의 농도에서 형성되었다.
플루로닉 F105 - 덱스트란 T40: 수성 2상 시스템은 각 중합체 8.0% 범위의 농도에서 형성되었다.
플루로닉 F105 - 덱스트란 T70: 수성 2상 시스템은 플루로닉 및 덱스트란 6.3% 농도에서 형성되었다.
플루로닉 F105 - 덱스트란 T500: 분리는 각 중합체 6.0% 약간 아래의 농도에서 일어났다.
플루로닉 F105 - 덱스트란 T2000: 상 분리는 각 중합체 6.0% 범위의 농도에서 일어났다.
클루셀 - 덱스트란 시스템
3가지 등급의 클루셀을 4가지 등급의 덱스트란과 함께 사용하여 새로운 셋트의 수성 2상 시스템을 형성하였다. 사용된 클루셀 등급은 클루셀 H, L 및 M이었다. 사용된 덱스트란 등급은 덱스트란 T40, T70, T500 및 T2000이었다.
클루셀 H - 덱스트란 T40: 수성 2상 시스템은 클루셀 6.9% 및 덱스트란 8.3%의 농도에서 형성되었다.
클루셀 H - 덱스트란 T70: 수성 2상 시스템은 각 중합체 6.8%의 농도에서 형성되었다.
클루셀 H - 덱스트란 T500: 상 분리는 3.0%를 약간 넘는 농도에서 일어났다.
클루셀 H - 덱스트란 T2000: 상 분리는 3.2% 범위의 농도에 대해서 관찰되었다.
클루셀 L - 덱스트란 T40: 상 분리는 4.0%를 넘는 농도의 용액에 대해 관찰되었다.
클루셀 L - 덱스트란 T70: 수성 2상 시스템은 각 중합체 3.6% 농도에서 형성되었다.
클루셀 L - 덱스트란 T500: 분리는 3.9%의 농도에서 관찰되었다.
클루셀 L - 덱스트란 T2000: 상 분리는 클루셀 3.5% 및 덱스트란 3.1%의 농도에 대해 관찰되었다.
클루셀 M - 덱스트란 T40: 수성 2상 시스템은 3.1%를 약간 넘는 농도에서 형성되었다.
클루셀 M - 덱스트란 T70: 상 분리는 3.5% 범위의 농도에 대해서 관찰되었다.
클루셀 M - 덱스트란 T500: 상 분리는 3.5%의 중합체 농도에 대해서 관찰되었다.
클루셀 M - 덱스트란 T2000: 수성 2상 시스템은 4.0% 미만의 농도에서 형성되었다.
HPMC - 덱스트란 시스템
시그마 HPMC를 5가지의 다른 등급의 덱스트란과 함께 사용하여 새로운 셋트의 수성 2상 시스템을 형성하였다. 사용된 덱스트란 등급은 덱스트란 T40, T70, T500, T2000 및 소듐 덱스트란 설페이트였다.
HPMC - 덱스트란 T40: 상 분리는 각 중합체 3.0% 미만의 농도에 대해 관찰되었다.
HPMC - 덱스트란 T70: 분리는 HPMC 3.8% 및 덱스트란 4.6%의 중합체 농도에 대해 관찰되었다.
HPMC - 덱스트란 T500: 상 분리는 3.4% 미만의 농도의 용액에 대해 일어났다.
HPMC - 덱스트란 T2000: 분리는 4.0% 정도의 농도에 대해서 일어났다.
HPMC - 소듐 덱스트란 설페이트: 분리는 HPMC 2.9% 및 소듐 덱스트란 설페이트 4.1%의 농도에서 일어났다.
HPMC - 플루로닉 시스템
시그마 HPMC를 5가지의 등급의 플루로닉과 함께 사용하여 새로운 셋트의 수성 2상 시스템을 형성하였다. 플루로닉은 P-시리즈였고 그 예로는 플루로닉 P84, P103, P104, P105 및 P123을 들 수가 있다.
HPMC - 플루로닉 P84: 상 분리는 HPMC 6.3% 및 플루로닉 7.8%의 농도에 대해 관찰되었다. 이 농도에서, 상부 상은 맑았으며 아주 약간은 이 용액이 상 경계에 가까울 수 있다는 것을 나타낸다.
HPMC - 플루로닉 P103: 수성 2상 시스템은 4.0% 미만의 농도에서 형성되었다.
HPMC - 플루로닉 P104: 분리는 3.6% 범위 농도의 용액에 대해 일어났다.
HPMC - 플루로닉 P105: 상 분리는 5.5% 범위의 중합체 농도에 대해 관찰되었다.
HPMC - 플루로닉 P123: 상 분리는 HPMC 5.5% 및 플루로닉 6.4%의 농도에서 일어났다.
실시예 12
셀룰로스 기재 중합체와 CBD 사이의 상호작용의 친화도 전기이동 분석
셀룰로모나스 피미 CenC의 셀룰로스 기재 도메인(CBDN1)의 N-말단과 분자 사이의 상호작용을 확인하기 위하여 4가지의 셀룰로스 기재 중합체에 대해 친화도 전기이동 분석을 실시하였다. CBDN1및 CBDN1N2를 4가지의 셀룰로스 기재 중합체 모두에 대해 개별적으로 시험하였다. 셀룰로스 분자에 결합하지 않는 소 혈청 알부민(BSA)을 대조용으로서 사용하였다. 그 결과를 아래에 요약하였다.
클루셀(HPC)
클루셀 H 및 클루셀 L과 CBDN1및 CBDN1N2사이의 강한 결합 상호작용을 pH 7에서 관찰한 결과 겔 상에서의 이동 총 손실이 일어났다(도 9 참조).
나트로솔(HEC)
나트로솔과 CBDN1및 CBDN1N2의 강한 결합이 관찰되었다(도 9 참조).
베르모콜 E(EHEC)
결합 상호작용을 2가지 등급의 베르모콜 E와 CBDN1및 CBDN1N2에 대해 연구하였다. 전기이동 분석에 의해 측정된 바와 같이 두 중합체는 모두 CBDN1또는 CBDN1N2중 어느 하나에 강하게 결합하였다.
히드록시프로필메틸 셀룰로스(HPMC)
HPMC는 전기이동 분석에 의해 측정된 바와 같이 CBDN1또는 CBDN1N2중 어느 하나에 강하게 결합하였다.
통용되는 친화도 분배 시스템은 중합체 사슬 당 단 하나 또는 두개의 리간드의 존재로 인한 낮은 리간드 밀도에 의해 그의 용량 및 분해능이 제한된다. 중합체 농도가 일반적으로 15 중량% 미만이기 때문에, 중합체 화학양론에 대해 1:1 또는 2:1 리간드를 갖는 친화도 분배 시스템은 일반적으로 5 내지 50의 표적 단백질 분리 팩터(불순물의 것에 상대적임)를 생기게 한다. 이러한 분리 팩터가 생성물 농축에 더욱 충분하긴 하지만, 그것은 일반적으로 비용 효과적인, 1 또는 2 단계 추출 과정에서 소정의 생성물 순도를 제공하지는 않는다. 전통적인 친화도 분배 시스템은 또한 중합체-리간드 콘쥬게이트를 형성하는데 필요한 화학 작용의 비용에 의해 제한된다. 이러한 비용 및 용량 제한은 상 형성 중합체 중 하나의 단량체 단위가 친화 리간드로서 제공된다면 해결될 수 있다. 각종 수용성 셀룰로스 기질에 대한 CBDN1의 정교하게 선택된 결합은 연속 정제 또는 재조합 단백질에 대해 새로운, 비용 효과적인, 융통성이 많은 친화도 분배 시스템을 제공한다. 표적 단백질 또는 펩티드에 대한 CBDN1의 유전자 결합은 센티몰량의 전해질의 존재하에 수용성 탄수화물에 강하게 결합하며 융합 파트너의 생물학적 활성을 유지하는 융합물이 형성되도록 한다.
본 명세서에 언급된 모든 문헌 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술의 숙련인의 수준의 지표가 된다. 각각의 문헌 및 특허 출원이 참고로 인용되도록 특별하게 개별적으로 표시된 바와 같이 모든 문헌 및 특허 출원은 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 인용되었다.
본 발명은 지금 충분히 설명되었지만, 첨부된 청구 범위의 취지 또는 영역에서 벗어나지 않게 많은 변화 및 변형이 이루어질 수 있다는 사실은 당업계의 숙련인에게 명백할 것이다.

Claims (20)

  1. 폴리사카라이드 결합 펩티드를 포함하는 화합물의 혼합물을 함유하는 용액 및 상기 화합물이 결합하는 상 형성 올리고사카라이드 중합체의 상 분리를 유도하여 상기 화합물이 상기 올리고사카라이드 중합체를 함유하는 상으로 분배되고,
    상기 올리고사카라이드 중합체 상을 수집하고,
    상기 화합물을 상기 올리고사카라이드 중합체로부터 해리시켜 상기 혼합물에 비해 정제된 상기 화합물을 함유하는 용액을 얻는 것으로 이루어지는, 폴리사카라이드 결합 펩티드를 포함하는 화합물을 혼합물의 다른 성분으로부터 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상 분리가 상 분리 유도제에 의해 유도되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 올리고사카라이드 중합체가 열분리 중합체이고 상 분리가 상기 용액을 상 분리가 일어나는 온도로 가열시킴으로써 유도되는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 올리고사카라이드 중합체가 β-1,4-글루칸인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 β-1,4-글루칸이 셀룰로스인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 셀룰로스가 히드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸히드록시에틸 셀룰로스 및 히드록시프로필 셀룰로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 폴리사카라이드 결합 펩티드가 폴리사카리다아제 또는 폴리사카라이드 결합 단백질의 폴리사카라이드 결합 도메인으로부터 유래되는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 폴리사카리다아제가 셀룰라아제인 방법.
  9. 수용액에 가용성이며, 폴리사카라이드 결합 펩티드를 포함하는 폴리펩티드가 결합하는 상 형성 올리고사카라이드 중합체를 제1 성분으로서 갖고, 상 분리 유도제를 제2 성분으로서 갖는 상 분리 시스템을, 상기 폴리펩티드가 상기 올리고사카라이드 중합체를 함유하는 상으로 분배되도록 하는 조건하에서 상기 폴리펩티드의 혼합물과 접촉시키고,
    상기 올리고사카라이드 중합체 상을 수집하고,
    상기 폴리펩티드를 상기 올리고사카라이드 중합체로부터 해리시켜 상기 혼합물에 비해 정제된 상기 폴리펩티드를 함유하는 용액을 얻는 것으로 이루어지는, 폴리펩티드를 혼합물의 다른 성분으로부터 정제하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 상기 폴리사카라이드 결합 펩티드 및 고분자를 포함하는 융합 폴리펩티드인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 융합 폴리펩티드가 상기 폴리사카라이드 결합 펩티드 및 상기 고분자 사이에 프로테아제 인식 서열을 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 프로테아제 인식 서열이 상기 폴리사카라이드 결합 펩티드와 이종성인 방법.
  13. 폴리사카라이드 결합 펩티드가 103M 내지 107M의 Ka로 결합하는 상 형성 올리고사카라이드 중합체를 제1 성분으로서 갖고, 상 분리 유도제를 제2 성분으로서 가지며, 상기 제1 및 제2 성분이 각각 상 분리를 유도하기에 충분한 양으로 존재하는 2상 분배 시스템.
  14. 제13항에 있어서, 상기 폴리사카라이드 결합 펩티드가 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) 엔도글루칸스 씨로부터 유래된 2상 분배 시스템.
  15. 제14항에 있어서, 상기 폴리사카라이드 결합 펩티드가 CBDN1인 2상 분배 시스템.
  16. 제13항에 있어서, 상기 제1 성분이 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 에틸히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스 및 메틸 셀룰로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 2상 분배 시스템.
  17. 제13항에 있어서, 상기 제2 성분이 폴리에틸렌 글리콜 중합체, 덱스트란, 및 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드의 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  18. 가용성 올리고사카라이드에는 결합하지만 결정성 셀룰로스에는 결합하지 않는 셀룰로스 결합 도메인.
  19. 제18항에 있어서, 상기 결합 도메인이 CBDN1인 셀룰로스 결합 도메인.
  20. 수용액에 가용성이며 폴리사카라이드 결합 펩티드를 포함하는 화합물이 결합하는 열분리 β-1,4-결합 셀로사카라이드 중합체를 갖는 혼합물을, 상 분리가 일어나며 상기 화합물이 분배된 셀로사카라이드 중합체 상이 얻어지는 온도로 가열하고,
    상기 혼합물의 다른 성분으로부터 분리된 상기 화합물을 함유하는 상기 셀로사카라이드 중합체 상을 수집하는 것으로 이루어지는, 폴리사카라이드 결합 펩티드를 포함하는 화합물을 혼합물로부터 분리하는 방법.
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