CN1227357C - 用于扩增核酸序列的方法 - Google Patents
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Abstract
一种简便有效扩增核酸序列的方法,其特征在于在存在嵌合寡核苷酸引物的情况下完成DNA合成反应;一种提供大量DNA扩增片段的方法;一种通过联用上述方法和另一种核酸序列扩增方法而扩增核酸序列的有效方法;一种检测核酸序列的方法,它用于检测或定量微生物,例如病毒、细菌、真菌或酵母;以及一种检测上述方法原位获得的DNA扩增片段的方法。
Description
技术领域
本发明涉及合成DNA的方法,它可用于基因工程领域。它涉及扩增用作模板的核苷酸序列的方法以及检测所述方法扩增的核酸的方法。
背景技术
DNA合成用于基因工程领域研究的各种目的。除了诸如寡核苷酸的短链DNA的合成之外,大多数DNA合成通过其中使用DNA聚合酶的酶学方法完成的。一个酶学方法实例是聚合酶链反应(PCR)法,它详细描述于美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159。另一个实例是逆转录PCR(RT-PCR)法,它联合PCR法和逆转录酶反应,例如Trends in Biotechnology,10:146-152(1992)所述。上述方法的发展使得可扩增DNA或RNA的目的区。
例如采用3个步骤的反应进行上述DNA合成法。3个步骤如下:一个步骤是使双链DNA解离(变性)为单链DNA,一个步骤是使引物退火到所述单链DNA上,一个步骤是合成(延长)所述引物的互补链,以便扩增目的DNA区。或者,采用称为“穿梭PCR”(“PCR hosaizensen”(Recent advances in PCR methodology:Basic methodology andit’s application),Tanpakushitsu Kakusan Kouso,Bessatsu,(Protein,Nucleic Acid and Enzyme,增刊),41(5):425-428(1996))的反应进行,其中所述3个步骤中的2个步骤,即退火引物和延长步骤在相同温度下进行。
或者,可使用如1989年6月14日公布的EP 320,308所述的连接酶链式反应(LCR)法或如PCR Protocols,Academic Press Inc.,1990,第245-252页所述的基于转录的扩增***(TAS)法。上述4种方法需要在高温和低温下重复反应多次,以便再产生用于下一个扩增循环的单链靶分子。应该采用不连续相或循环进行所述反应***,因为如上所述该反应受限于温度。
因此,所述方法需要采用能够严格随时间调节宽范围温度的昂贵热循环仪。而且,所述反应需要时间将温度调节至2个或3个预定温度。耗费时间与循环次数成正比。
为了解决所述问题,已经开发了可恒温的情况下进行核酸扩增的方法。其实例包括JP-B 7-114718所述的链置换扩增(SDA)法、自我持续序列复制(3SR)方法、日本专利号2650159所述的基于核酸序列的扩增(NASBA)方法、转录介导的扩增(TMA)方法、日本专利号2710159所述的Qβ复制酶方法以及美国专利号5,824,517、WO 99/09211、WO 95/25180和WO 99/49081所述的各种改良SDA方法。美国专利号5,916,777介绍了恒温酶学合成寡核苷酸的方法。在这些恒温核酸扩增或合成寡核苷酸的方法的反应中,在恒温温育的反应混合物中平行进行引物延伸和/或在引物延伸后引物退火到单链延长的产物上(或原始靶序列)。
在所述恒温核酸扩增方法中,SDA方法是其中最终扩增DNA的***实例。SDA方法是利用DNA聚合酶和限制性内切核酸酶置换双链而扩增样品中的靶核酸序列(和其互补链)的方法。该方法需要用于扩增的四种引物,其中两种引物应该设计成含有所述限制性内切核酸酶识别位点。为了大量合成DNA,该方法需要用修饰的三磷酸脱氧核糖核苷酸作为底物。一个修饰的三磷酸脱氧核糖核苷酸实例为其中磷酸基的α位氧原子被硫原子(S)取代的(α-S)三磷酸脱氧核糖核苷酸。如果例如为了进行遗传实验,常规进行所述反应,则与使用修饰的三磷酸脱氧核糖核苷酸伴随的成本问题成为严重的问题。此外,例如当对所扩增的DNA片段进行限制性酶片段长度多态性(RFLP)分析时,在所述方法所扩增的DNA片段中加入修饰的核苷酸如(α-S)脱氧核糖核苷酸可能消除限制性酶对所扩增的DNA片段的可切割性。
美国专利号5,824,517所介绍的改良SDA方法为一种DNA扩增方法,该方法使用RNA和DNA组成的嵌合引物以及具有作为基本元件的其中DNA至少位于3’-末端的结构。WO 99/09211介绍的改良SDA方法需要使用产生5’-突出末端的限制酶。WO 95/25180所述的改良SDA方法需要使用至少2对引物。WO 99/49081介绍的改良SDA方法需要使用至少2对引物和至少一种修饰的三磷酸脱氧核糖核苷酸。另一方面,美国专利号5,916,777介绍的合成寡核苷酸的方法包括利用在3’-末端具有核糖核苷酸的引物合成DNA,使用所述引物完成反应,用内切核酸酶在引物-延伸链的引物和延伸链之间导入一个将其分开的缺口,消化模板并回收可再利用的引物。需要从所述反应***分离所述引物,然后使其再退火到模板上,以在所述方法中再利用所述引物。
如上所述,所述常规恒温核酸扩增方法仍然存在各种问题。因此,需要低成本扩增核苷酸序列的方法,用这样的方法可获得可进一步遗传工程操作的DNA片段。
发明目的
本发明的主要目的是提供扩增核苷酸序列的简便有效的方法,其特征为在寡核苷酸引物存在下进行DNA合成反应,而且本发明还提供大量生产扩增DNA片段的方法,以供应扩增DNA片段。
发明概述
因为进行了深入的研究,所以本发明人构建了用于基因扩增反应的优良***。开发一种在3’-末端或在3’-末端侧上具有核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物、内切核酸酶和DNA聚合酶存在下扩增目的DNA区的方法,从而完成所述优良***的构建。因此,完成了本发明。本发明的该方法称为恒温使用嵌合引物扩增核酸(ICAN)的方法,它为一种在恒温条件下使用嵌合寡核苷酸引物的扩增核苷酸序列的方法。
本发明的第一发明涉及用于扩增核苷酸序列的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)用至少一种与所述核酸的核苷酸序列基本互补的引物和DNA聚合酶处理模板核酸,以合成与模板互补的引物延伸链,其中所述引物为包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,以便用内切核酸酶进行切割;
(b)用所述内切核酸酶在包含所述核糖核苷酸的位点切割步骤(a)获得的双链核酸的引物延伸链;以及
(c)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(b)获得的引物延伸链达到链置换。
本发明的第二发明涉及用至少两种引物扩增核苷酸序列的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)用至少一种与所述核酸的核苷酸序列基本互补的引物和DNA聚合酶处理模板核酸,以合成与模板互补的引物延伸链,其中所述引物为包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,以便用内切核酸酶进行切割;
(b)用所述内切核酸酶在包含所述核糖核苷酸的位点切割步骤(a)获得的双链核酸的引物延伸链;
(c)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(b)获得的引物延伸链达到链置换,其中步骤(b)重复使用含有重新产生的引物延伸链的双链核酸;
(d)用至少一种不同于步骤(a)使用的引物和DNA聚合酶处理步骤(c)获得的释放置换链模板,以合成与置换链互补的引物延伸链,其中不同于步骤(a)使用的引物为嵌合寡核苷酸引物,该引物与置换链的核苷酸序列基本互补而且含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,以便用内切核酸酶进行切割;
(e)用内切核酸酶在含有核糖核苷酸的位点切割步骤(d)获得的双链核酸的引物延伸链;以及
(f)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(e)获得的引物延伸链达到链置换,其中步骤(e)重复使用含有重新产生的引物延伸链的双链核酸。
恒温下进行本发明的第一发明方法和第二发明方法。模板核苷酸序列可以是DNA序列。所述第一发明和第二发明的步骤(a)之前,可包括用反转录酶和模板RNA通过逆转录反应制备单链cDNA的步骤。所述单链cDNA可用作模板核苷酸序列。单链DNA和双链DNA均可以在本发明的第一发明和第二发明中用作模板DNA。如果双链DNA用作模板,则可以在使所述双链DNA变性为单链DNA的预处理步骤之后实施本发明的方法。
在上述的本发明中,用具有链置换活性的DNA聚合酶进行所述引物的延伸。选自大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的缺乏5’-3’外切核酸酶的BstDNA聚合酶和热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)的缺乏5’-3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶优选用于本发明。此外,内切核糖核酸酶可优选用作内切核酸酶。可使用的内切核糖核酸酶包括但不限于例如RNA酶H。
本发明的第三发明涉及扩增核苷酸序列的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)通过混合模板核酸、三磷酸脱氧核糖核苷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和切割引物产生的延伸链的内切核酸酶制备反应混合物,其中所述引物为与模板核酸的核苷酸序列基本互补而且包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,以便用内切核酸酶进行切割;以及
(b)温育反应混合物足够时间,以产生反应产物。
在本发明的第三发明中可使用的模板核苷酸序列的实例包括选自单链DNA、变性为单链DNA的双链DNA和RNA的逆转录反应获得的cDNA的核苷酸序列。在所述反应混合物中可能包含2种或2种以上的嵌合寡核苷酸引物。第一发明和第二发明使用的具有链置换活性的DNA聚合酶和内切核酸酶可优选用于本发明。
在本发明的第一发明至第三发明中使用的引物为嵌合寡核苷酸引物。例如可使用具有其中在所述引物的3’-末端或3’-末端侧上连接至少1个、优选2个或2个以上的连续核糖核苷酸残基的结构的嵌合寡核苷酸。
在本发明的第一至第三发明中使用的模板可以是预先用核酸扩增方法扩增的核酸。尽管可以没有限制地使用任何扩增核酸的方法,但是例如TAS方法、3SR方法、NASBA方法、TMA方法、Qβ复制酶方法、PCR方法、LCR方法和SDA方法可用作核酸扩增方法。本发明的方法可以与这些核酸扩增方法联合使用。
在核酸扩增反应中可使用随机引物或简并引物。例如可没有限制地优选使用至少在3’-末端或在3’-末端侧上具有随机序列或简并序列的引物。
本发明的第四发明涉及可用于第一发明至第三发明的嵌合寡核苷酸引物。该引物的特征为它包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸而且具有其中核糖核苷酸位于引物的3’-末端或在引物的3’-末端侧上的结构。例如可使用这样一种嵌合寡核苷酸引物:它包含至少一个、优选2个或2个以上连续核糖核苷酸残基而且能够从其3’末端延伸DNA链。设计这样的引物,以便诸如RNA酶H的核糖核酸酶作用于核糖核苷酸残基的3’-末端而切割所述引物。
本发明的第五发明涉及用于第一至第三发明的具有链置换活性的DNA聚合酶、内切核酸酶和包含它们的试剂盒。
本发明的第六发明涉及检测靶核酸的方法,其特征在于所述方法包括用用于扩增本发明的第一至第三发明的核苷酸序列的方法扩增靶核酸,然后检测所述核酸。检测方法包括其中处于猝灭状态距离的2个或2个以上荧光染料标记的核糖核苷酸(RNA)探针检测靶核酸的方法。
本发明的第七发明涉及用于检测本发明第六发明的靶核酸的方法的具有链置换活性的DNA聚合酶、内切核酸酶和包含它们的试剂盒。
本发明的第八发明涉及制备包含固定核酸的材料的方法,其中所述核酸布局在预定区域,其特征在于所述方法包括将用本发明的第一至第三发明的扩增核苷酸序列的方法扩增的核酸排列固定在支持物上的预定区域。特别优选这样一种方法:在该方法中扩增与其互补链基本游离的单链核酸,并将其排列固定在预定区域中。
本发明的第九发明涉及具有固定核酸的材料,其中所述核酸布局在用本发明的第八发明的方法制备的预定区域中。特别优选具有固定核酸的材料,其中与其互补链基本游离的单链核酸排列固定在预定区域。
本发明的第十发明涉及检测样品中的靶核酸的方法,其特征在于所述方法使用具有固定核酸的材料,其中所述核酸布局在本发明的第九发明的预定区域中,以检测与所述材料预定区域中的排列固定的核酸杂交的核酸。
本发明的第十一发明涉及大量生产核酸的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)用至少一种与所述核酸的核苷酸序列基本互补的引物和DNA聚合酶处理模板核酸,以合成与模板互补的引物延伸链,其中所述引物为包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于所述引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,以便用内切核酸酶进行切割;
(b)用内切核酸酶于包含核糖核苷酸的位点切割步骤(a)获得的双链核酸的引物延伸链;以及
(c)用具有链置换活性的DNA聚合酶从双链核酸引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(b)获得的引物延伸链以达到链置换。
本发明的第十二发明涉及用至少两种引物大量产生核酸的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)用至少一种与所述核酸的核苷酸序列基本互补的引物和DNA聚合酶处理模板核酸,以合成与模板互补的引物延伸链,其中所述引物为包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,以便用内切核酸酶进行切割;
(b)用所述内切核酸酶在包含所述核糖核苷酸的位点切割步骤(a)获得的双链核酸的引物延伸链;
(c)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(b)获得的引物延伸链达到链置换,其中步骤(b)重复使用含有重新产生的引物延伸链的双链核酸;
(d)用至少一种不同于步骤(a)使用的引物和DNA聚合酶处理步骤(c)获得的释放置换链模板,以合成与置换链互补的引物延伸链,其中不同于步骤(a)使用的所述引物为嵌合寡核苷酸引物,该引物与置换链的核苷酸序列基本互补而且含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,以便用内切核酸酶进行切割;
(e)用内切核酸酶在含有核糖核苷酸的位点切割步骤(d)获得的双链核酸的引物延伸链;以及
(f)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(e)获得的引物延伸链达到链置换,其中步骤(e)重复使用含有重新产生的引物延伸链的双链核酸。
本发明的第十三发明涉及大量生产核酸的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)通过混合模板核酸、三磷酸脱氧核糖核苷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和切割引物产生的延伸链的内切核酸酶制备反应混合物,其中所述引物为与模板核酸的核苷酸序列基本互补而且包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,以便用内切核酸酶进行切割;以及
(b)温育反应混合物足够时间,以产生反应产物。
本发明的第十四发明涉及扩增核苷酸序列的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)通过核酸扩增反应扩增包含需要扩增的序列的核酸,以制备模板核酸;
(b)用至少一种与所述核酸的核苷酸序列基本互补的引物和DNA聚合酶处理步骤(a)获得的模板核酸,以合成与模板互补的引物延伸链,其中所述引物为包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,以便用内切核酸酶进行切割;
(c)用所述内切核酸酶在包含所述核糖核苷酸的位点切割步骤(b)获得的双链核酸的引物延伸链;以及
(d)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(c)获得的引物延伸链达到链置换。
本发明的第十五发明涉及用至少两种引物扩增核苷酸序列的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)通过核酸扩增反应扩增包含需要扩增的序列的核酸,以制备模板核酸;
(b)用至少一种与所述核酸的核苷酸序列基本互补的引物和DNA聚合酶处理步骤(a)获得的模板核酸,以合成与模板互补的引物延伸链,其中所述引物为包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,以便用内切核酸酶进行切割;
(c)用所述内切核酸酶在包含所述核糖核苷酸的位点切割步骤(b)获得的双链核酸的引物延伸链;
(d)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(c)获得的引物延伸链达到链置换;其中步骤(c)重复使用含有重新产生的引物延伸链的双链核酸;
(e)用至少一种不同于步骤(b)使用的引物和DNA聚合酶处理步骤(d)获得的释放置换链模板,以合成与置换链互补的引物延伸链,其中不同于步骤(b)使用的所述引物为嵌合寡核苷酸引物,该引物与置换链的核苷酸序列基本互补而且含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,以便用内切核酸酶进行切割;
(f)用内切核酸酶在含有核糖核苷酸的位点切割步骤(e)获得的双链核酸的引物延伸链;以及
(g)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(f)获得的引物延伸链达到链置换,其中步骤(f)重复使用含有重新产生的引物延伸链的双链核酸。
本发明的第十六发明涉及扩增核苷酸序列的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)通过核酸扩增反应扩增包含需要扩增的序列的核酸,以制备模板核酸;
(b)通过混合步骤(a)获得的模板核酸、三磷酸脱氧核糖核苷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和切割引物产生的延伸链的内切核酸酶制备反应混合物,其中所述引物为与模板核酸的核苷酸序列基本互补而且包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,以便用内切核酸酶进行切割;以及
(c)温育反应混合物足够时间,以产生反应产物。
在本发明的第十四至第十六发明中,通过核酸扩增反应预先扩增包含需要扩增的序列的核酸。然后扩增产物用作本发明的第一至第三发明方法中的模板核酸。尽管可以没有限制地使用任何扩增核酸的方法,但是例如TAS方法、3SR方法、NASBA方法、TMA方法、Qβ复制酶方法、PCR方法、LCR方法和SDA方法可在第十四至第十六发明中用作核酸扩增方法。
在核酸扩增反应中可使用随机引物或简并引物。例如可没有限制地优选使用至少在3’-末端或在3’-末端侧上具有随机序列或简并序列的引物。
本发明的第十七发明涉及扩增核苷酸序列的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)用至少一种与所述核酸的核苷酸序列基本互补的引物和DNA聚合酶处理模板核酸,以合成与模板互补的引物延伸链,其中所述引物为包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上;
(b)用内切核酸酶在包含所述核糖核苷酸的位点切割步骤(a)获得的双链核酸的引物延伸链;以及
(c)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(b)获得的引物延伸链达到链置换。
本发明的第十八发明涉及用至少两种引物扩增核苷酸序列的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)用至少一种与所述核酸的核苷酸序列基本互补的引物和DNA聚合酶处理模板核酸,以合成与模板互补的引物延伸链,其中所述引物为包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上;
(b)用内切核酸酶在包含所述核糖核苷酸的位点切割步骤(a)获得的双链核酸的引物延伸链;
(c)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(b)获得的引物延伸链达到链置换,其中步骤(b)重复使用含有重新产生的引物延伸链的双链核酸;
(d)用至少一种不同于步骤(a)使用的引物和DNA聚合酶处理步骤(c)获得的释放置换链模板,以合成与置换链互补的引物延伸链,其中不同于步骤(a)使用的引物为嵌合寡核苷酸引物,该引物与置换链的核苷酸序列基本互补而且含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上;
(e)用内切核酸酶在含有核糖核苷酸的位点切割步骤(d)获得的双链核酸的引物延伸链;以及
(f)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(e)获得的引物延伸链达到链置换,其中步骤(e)重复使用含有重新产生的引物延伸链的双链核酸。
本发明的第十九发明涉及扩增核苷酸序列的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)通过混合模板核酸、三磷酸脱氧核糖核苷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和切割引物产生的延伸链的内切核酸酶制备反应混合物,其中所述引物为与模板核酸的核苷酸序列基本互补而且包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上;以及
(b)温育反应混合物足够时间,以产生反应产物。
本发明的第二十发明涉及扩增核苷酸序列的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)用至少一种与所述核酸的核苷酸序列基本互补的引物和DNA聚合酶处理模板核酸,以合成与模板互补的引物延伸链,其中所述引物为包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于所述引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,其中内切核酸酶在包含核糖核苷酸的位点进行切割;
(b)用所述内切核酸酶于包含核糖核苷酸的位点切割步骤(a)获得的双链核酸的引物延伸链;以及
(c)用具有链置换活性的DNA聚合酶从双链核酸引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(b)获得的引物延伸链以达到链置换。
本发明的第二十一发明涉及用至少两种引物扩增核苷酸序列的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)用至少一种与所述核酸的核苷酸序列基本互补的引物和DNA聚合酶处理模板核酸,以合成与模板互补的引物延伸链,其中所述引物为包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于所述引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,其中内切核酸酶在包含核糖核苷酸的位点进行切割;
(b)用所述内切核酸酶于包含核糖核苷酸的位点切割步骤(a)获得的双链核酸的引物延伸链;
(c)用具有链置换活性的DNA聚合酶从双链核酸引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(b)获得的引物延伸链以达到链置换,其中步骤(b)重复使用含有重新产生的引物延伸链的双链核酸;
(d)用至少一种不同于步骤(a)使用的引物和DNA聚合酶处理步骤(c)获得的释放置换链模板,以合成与置换链互补的引物延伸链,其中不同于步骤(a)使用的引物为嵌合寡核苷酸引物,该引物与置换链的核苷酸序列基本互补而且含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,其中内切核酸酶在包含核糖核苷酸的位点进行切割;
(e)用所述内切核酸酶在含有核糖核苷酸的位点切割步骤(d)获得的双链核酸的引物延伸链;以及
(f)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(e)获得的引物延伸链达到链置换,其中步骤(e)重复使用含有重新产生的引物延伸链的双链核酸。
本发明的第二十二发明涉及扩增核苷酸序列的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)通过混合模板核酸、三磷酸脱氧核糖核苷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和切割引物产生的延伸链的内切核酸酶制备反应混合物,其中所述引物为与模板核酸的核苷酸序列基本互补而且包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,其中所述内切核酸酶在包含所述核糖核苷酸的位点进行切割;以及
(b)温育反应混合物足够时间,以产生反应产物。
本发明的第二十三发明涉及测定核酸的核苷酸序列的方法,其特征在于所述方法包括按照本发明的第一至第三发明以及第十四至第二十二发明中任一发明的方法扩增核苷酸序列。
附图简述
图1为说明其中使用单链的本发明方法的一个实例的流程图。在该图中,用实心园标示的释放DNA链用作(6)中的模板DNA。
图2显示利用不同反应时间经本发明的方法扩增的DNA片段的琼脂糖凝胶电泳结果。
发明详述
本文使用的脱氧核糖核苷酸(也称为dN)是指其糖部分由D-2-脱氧核糖构成的核苷酸。脱氧核糖核苷酸包括例如碱基部分为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或胸腺嘧啶的脱氧核糖核苷酸。
本文使用的核糖核苷酸(也称为N)是指其糖部分由D-核糖构成的核苷酸。核糖核苷酸包括碱基部分为腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶的核糖核苷酸。所述核糖核苷酸还包括修饰的核糖核苷酸,例如其中α-位置的磷酸基的氧原子被硫原子取代的修饰核糖核苷酸(也称为(α-S)核糖核苷酸或(α-S)N)或其它衍生物。
本发明使用的嵌合寡核苷酸引物是指包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的引物。所述引物可包含未修饰的脱氧核糖核苷酸和/或修饰脱氧核糖核苷酸。或者它可包含未修饰核糖核苷酸和/或修饰核糖核苷酸。
用于本发明的嵌合寡核苷酸引物包括任何在所述引物3’-末端或在所述引物的3’-末端侧上具有核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物、可用于在本发明方法中延伸核酸链、可用内切核酸酶切割以及可用于实现链置换反应。
本文使用的3’-末端侧是指诸如引物的核酸的中心至3’-末端的部分。同样,5’-末端侧是指核酸的中心至5’-末端的部分。
本文使用的内切核酸酶可以是作用于由退火到模板核酸上的嵌合寡核苷酸引物延伸DNA获得的双链DNA而且在包含核糖核苷酸的引物部分特异性对其进行切割的任何内切核酸酶。
本文使用的DNA聚合酶是指利用模板DNA链重新合成DNA链的酶。所述DNA聚合酶包括但不限于pol I-型DNA聚合酶(例如大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow片段和Taq DNA聚合酶)、α-型DNA聚合酶(例如激烈热球菌的DNA聚合酶(Stratagene)、VENT DNA聚合酶(New England Biolabs)、KOD DNA聚合酶(Toyobo)和DEEP VENTDNA聚合酶(New England Biolabs))以及非α-、非-pol I-型DNA聚合酶(例如WO 97/24444介绍的DNA聚合酶)。具有链置换活性的DNA聚合酶包括芽孢杆菌属的嗜热菌如热坚芽孢杆菌(此后称为B.ca)和嗜热脂肪芽孢杆菌(此后称为B.st)的DNA聚合酶以及这些DNA聚合酶缺乏其5’-3’外切核酸酶活性的变异体。而且,链置换型DNA聚合酶包括具有链置换活性而不具有5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶,例如Klenow片段。此外,所述DNA聚合酶可以是多种DNA聚合酶的混合物,例如具有链置换活性的DNA聚合酶和不具有链置换活性的DNA聚合酶的没有限制的混合物。
本文使用的“链置换活性”是指能够实现链置换的活性,也就是能够根据模板的核苷酸序列进行DNA复制,同时置换所述DNA链,以释放退火到模板链的互补链。此外,因为链置换从模板核苷酸序列释放的DNA链在本文中称为“释放链”。
下面更详细地介绍本发明:
(1)用于本发明的嵌合寡核苷酸引物
在本发明的方法中使用的引物为包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物。这样的引物包括包含未修饰核糖核苷酸和/或修饰核糖核苷酸的寡核苷酸引物。
在本发明的方法中使用的嵌合寡核苷酸引物可以是任何这样的引物:具有与模板核酸的一部分核苷酸序列基本互补的核苷酸序列、可用于从其3’-末端延伸DNA链以及在其3’-末端或3’-末端侧具有在DNA合成反应中内切核酸酶进行切割的位点。例如可以使用在3’-末端或3’-末端侧具有核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物。通常设计所述引物,使得它与需要扩增区段上游的一部分(即在模板核酸中相当于需要扩增的区段的核苷酸序列3’的部分)互补。本文使用的“基本互补核苷酸序列”是指在所用的反应条件下可退火到模板DNA的核苷酸序列。本领域技术人员根据已知方法例如参照Labo Manual PCR(TakaraShuzo,第13-16页,1996)可设计这种嵌合寡核苷酸引物或寡核苷酸引物。可使用设计引物的市售软件,例如OLIGOTM引物分析软件(Takara Shuzo)。
在本发明的方法中使用的嵌合寡核苷酸引物可以包含一种或多种修饰核糖核苷酸。本文使用的核糖核苷酸可以是未修饰的核糖核苷酸或修饰核糖核苷酸,它们可位于嵌合寡核苷酸引物的3’-末端或3’-末端侧上而且被内切核酸酶识别或被内切核酸酶切割。所述核糖核苷酸包括如上所述的未修饰核糖核苷酸和修饰核糖核苷酸。未修饰核糖核苷酸或修饰核糖核苷酸或其组合可用于本发明的嵌合寡核苷酸引物,条件是它不消除引物的功能。修饰核糖核苷酸的实例包括但不限于其中与磷酸基结合的氧原子被硫原子取代的(α-S)核糖核苷酸以及核糖2-位的羟基被甲氧基取代的核糖核苷酸。通过采用例如用硫化反应试剂(Glen Research)或2-OMe-RNA-CE亚磷酰胺试剂(Glen Research)经美国专利号5,003,097介绍的方法制备的(α-S)三磷酸核糖核苷酸可产生这种包含修饰核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物。
可设计能够在本发明的扩增方法中使用的嵌合寡核苷酸引物包含修饰核糖核苷酸,它赋予对内切核酸酶切割的抗性。这种引物是有用的,因为人们可控制在扩增反应步骤中用内切核酸酶进行切割的位点。
根据扩增后的DNA片段的需要形式(单链或双链)在本发明的方法中可使用一种或两种嵌合寡核苷酸引物。具体来说,当需要单链DNA时,使用一种嵌合寡核苷酸引物,而当需要双链DNA时使用两种引物。
在本发明的方法中使用的嵌合寡核苷酸引物的长度没有特别限制,但是优选约12-约100个核苷酸、更优选约15-约40个核苷酸。最好是所述嵌合寡核苷酸的核苷酸序列与模板核酸基本互补,以便它在所用的反应条件下退火到模板核酸上。所述引物在3’-末端或3’-末端侧上包含在如下所述的步骤中使用的内切核酸酶识别的序列。
例如尽管目的不是限制本发明,但是具有以下通式表示的结构的寡核苷酸在本发明的DNA合成方法中可用作引物:
通式:5’-dNa-Nb-dNc3’
(a:11或11以上的整数;b:0或1或1以上的整数;c:0或1或1以上的整数,前提是b和c不能同时为0;dN:脱氧核糖核苷酸;N:未修饰核糖核苷酸和/或修饰核糖核苷酸)。
例如其中a=11或11以上的整数;以及b=1和c=0,b=2和c=0,b=3-5和c=0,或者b=2和c=0-5的所述通式表示的嵌合寡核苷酸引物可优选用于本发明。在本发明的方法中使用的嵌合寡核苷酸引物的3’-末端或3’-末端侧的核糖核苷酸长度优选为1-基体至15-基体、更优选1-基体至10-基体、最优选1-基体至5-基体。通式中的c数目没有特别限制,但是可选择能用于本发明方法的任何数。通常优选5或5以下的整数。在反应中c为3、2和1分别较c为4、3、2可获得更好的结果。尤其在c=0时能够实现最有效的反应。
用于本发明的嵌合寡核苷酸引物具有其中内切核酸酶在包含核糖核苷酸的位点切割用DNA聚合酶从引物延伸的DNA链(引物延伸链)的结构。换句话说,核糖核苷酸位于所述嵌合寡核苷酸引物的3’-末端或3’末端侧上,以便用内切核酸酶进行切割。例如当RNA酶H作用于从退火到模板核酸、所述通式表示的嵌合寡核苷酸引物延伸DNA产生的双链DNA时,在所述核糖核苷酸部分切割所述嵌合寡核苷酸引物。然后产生其中在所述寡核苷酸引物和延伸合成的DNA链之间导入一个缺口的双链DNA。然后从缺口部位进行DNA聚合酶的链置换反应。然而,在本发明的方法中可使用任何这样的嵌合寡核苷酸引物:可用于从引物的3’-末端延伸核酸链、可用内切核酸酶切割以及可用DNA聚合酶实现链置换反应。
例如可用Applied Biosystems Inc.(ABI)的394型DNA合成仪按照亚磷酰胺方法合成具有任何核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。或者可用任何方法合成所述嵌合寡核苷酸引物,包括磷酸三酯法、H-磷酸酯法和硫代磷酸酯法。
(2)用于本发明的内切核酸酶
下面这样的任何内切核酸酶可用于本发明:作用于由退火到模板核酸的上述(1)描述的嵌合寡核苷酸引物延伸DNA产生的双链DNA,而且切割延伸链以实现链置换反应。也就是说,所述内切核酸酶为在所述双链DNA的嵌合寡核苷酸引物部分产生一个缺口的酶。可用于本发明的内切核酸酶的实例包括但不限于核糖核酸酶。其中可优选使用作用于DNA和RNA组成的双链核酸的RNA部分的内切核糖核酸酶H(RNA酶H)。具有上述活性的任何核糖核酸酶,包括嗜温内切核酸酶和耐热内切核酸酶可优选用于本发明。例如大肠杆菌的RNA酶H可用于如下所述的实施例中的本发明方法约50℃-约70℃的反应。也可以优选使用市售的耐热核糖核酸酶HybridaseTM热稳定RNA酶H(Epicenter Technologies)。此外,所述核糖核酸酶可以是天然核糖核酸酶或变异体。本文标示的RNA酶H酶单位为根据参考实施例所述的检测酶单位的方法表示的值。
在本发明方法中使用的内切核酸酶如RNA酶H的切割反应效率可能取决于引物3’-末端附近的核苷酸序列,而且影响所需要的DNA的扩增效率。所以,必然要设计所用RNA酶H的最佳引物。
本文使用的术语“导入一个缺口”或“缺口”是指在双链核酸的双链之一内部切割开。例如RNA酶H作用于DNA和包含核糖核苷酸的DNA组成的杂交双链核酸,选择性在核糖核苷酸部位切割所述双链中的包含核糖核苷酸的链,因此在杂交双链核酸中导入一个缺口。
(3)用于本发明的DNA聚合酶
对DNA具有链置换活性的DNA聚合酶可用于本发明。具体来说,可优选使用基本缺乏5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。
本文使用的“链置换活性”是指能够实现链置换的活性,也就是能够根据模板的核苷酸序列进行DNA复制,同时置换所述DNA链,以释放退火到模板链的互补链。此外,因为链置换从模板核苷酸序列释放的DNA链在本文中称为“释放链”。
具有链置换活性的任何DNA聚合酶均可用于本发明。其实例包括得自芽孢杆菌属的嗜热菌如热坚芽孢杆菌(此后称为B.ca)和嗜热脂肪芽孢杆菌(此后称为B.st)的缺乏其5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶变异体以及大肠杆菌的DNA聚合酶I的大片段(Klenow片段)。嗜温DNA聚合酶和耐热DNA聚合酶均可优选用于本发明。
B.ca为最适生长温度约70℃的嗜热菌。已知该菌的Bca DNA聚合酶具有DNA依赖性DNA聚合酶活性、RNA依赖性DNA聚合酶活性(反转录活性)、5’-3’外切核酸酶活性和3’-5’外切核酸酶活性。
所述酶可以为从其天然来源纯化的酶或利用遗传工程技术产生的重组蛋白。利用遗传工程技术或其它方法使所述酶进行诸如取代、缺失、添加或***的修饰。修饰酶的实例包括Bca BEST DNA聚合酶(Takara Shuzo),它为缺乏其5’-3’外切核酸酶活性的Bca DNA聚合酶。
(4)用于本发明的反应缓冲液组成
包含缓冲组分、镁盐和各种dNTP的反应缓冲液用于本发明。可优选使用的缓冲组分的实例包括但不限于Tricine、tris-盐酸盐和磷酸盐(磷酸钠和磷酸钾)。其中包含Tricine或磷酸盐缓冲组分的缓冲液可优选用于本发明。缓冲组分的终浓度范围为5-100mM、优选20-50mM。pH范围为6.0-9.5、优选7.0-9.2。例如优选使用pH7.5-9.2、包含22-46mM Tricine的缓冲液或pH7.0-8.0、包含25-50mM磷酸钾的缓冲液。可优选使用的镁盐实例包括但不限于氯化镁、醋酸镁或硫酸镁。镁盐的终浓度范围为1-20mM、优选2-10mM。混合物中作为DNA延伸反应的底物的各种dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)的终浓度范围为0.1-3.0mM、优选0.2-1.2mM。用于50μl反应体积的引物量范围为1-1000pM、优选10-100pM。此外,所述反应混合物可含有添加剂,以便例如稳定扩增反应。可加入终浓度为0.1%或更低的BSA、终浓度为10%或更低的二甲基亚砜、终浓度为4mM或更低的二盐酸腐胺或浓度为0.01%或更低的丙邻二胺。或者可含有NMP(1-甲基-2-吡咯烷二酮)、甘油、聚(乙二醇)、二甲基亚砜和/或甲酰胺。预期加入这样的有机溶剂可减少寡核苷酸引物的非特异性退火。
在50μl反应体积中作为内切核酸酶实例的大肠杆菌RNA酶H含量范围优选为3-200U、更优选15-60U。在50μl反应体积中作为DNA聚合酶实例的Bca BEST DNA聚合酶含量范围优选为0.5-100U、更优选1-22U。其中所述内切核酸酶的优选单位数推测随其类型而不同。在这种情况下,调节缓冲液的组分以及需要加入的酶量,使得扩增产物量最大。在任何情况下,必需根据所用的酶类型优化反应缓冲液的组分等。
(5)本发明用于扩增核苷酸序列的方法
利用上述(1)所述的至少一种寡核苷酸引物和上述(2)所述的内切核酸酶和上述(3)所述的DNA聚合酶可进行本发明的方法。用于PCR法的各种dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP的混合物)可与三磷酸核苷一样用作所述方法延伸反应中的底物。所述各种dNTP可包含dNTP类似物,例如7-去氮杂-dGTP,前提是它为所用DNA聚合酶的底物。所述方法中使用嵌合寡核苷酸引物。例如采用DNA合成仪按照常规合成方法可制备所述引物。组合的嵌合寡核苷酸引物和常规寡核苷酸引物可用于本发明方法中。
可制备或者从可能含有核酸的任何样品中分离获得在本发明方法中用作模板的核酸(DNA或RNA)。可能含有核酸的样品实例包括但不限于生物样品,例如全血,血清,血沉棕黄层,尿液,大便,脑脊液,***,唾液,组织(例如癌组织或***)和细胞培养物(例如哺乳动物细胞培养物或细菌细胞培养物),含有核酸的样品如类病毒、病毒、细菌、真菌、酵母、植物和动物,怀疑污染或感染微生物(例如病毒或细菌)的样品(例如食品或生物制剂)以及可能含有生物的样品如土壤和废水。所述样品可以是含有按照已知方法如上所述处理所述样品获得的核酸的制剂。可用于本发明的制剂实例包括细胞破坏制品或分级分离所述制品、所述样品中的核酸或特定核酸分子如富集mRNA的样品获得的样品。可优选使用采用已知方法扩增所述样品中包含的核酸获得的核酸,例如DNA或RNA。
没有限制地采用例如去垢剂裂解、超声处理、用玻璃珠振荡或搅拌或弗氏细胞压碎器从上述材料可制备包含核酸的制剂。在某些情况下最好进一步处理所述制剂,以纯化所述核酸(例如在存在内源性核酸酶的情况下)。在这类情况下,利用已知方法如酚提取、层析、离子交换、凝胶电泳或密度梯度离心纯化所述核酸。
当期望扩增具有得自RNA的序列的核酸时,用利用所述RNA作模板的反转录反应合成的cDNA作为模板可实施本发明的方法。人们可制备用于反转录反应的引物的任何RNA均可用于本发明的所述方法,包括RNA分子如样品总RNA、mRNA、tRNA和rRNA以及特定的RNA类型。
在所用反应条件下退火到模板RNA的任何引物均可用于所述反转录反应。所述引物可以是具有与特定模板RNA互补的核苷酸序列的引物(特异性引物)、寡聚dT(脱氧胸腺嘧啶)引物和具有随机序列的引物(随机引物)。为了特异性退火,用于反转录的引物的长度优选为6个或6个以上核苷酸、更优选9个或9个以上核苷酸。考虑到寡核苷酸的合成,所述引物长度优选为100个或100个以下核苷酸、更优选30个或30个以下核苷酸。
此外,嵌合寡核苷酸引物可用作反转录引物。嵌合寡核苷酸引物也可以用作利用反转录获得的cDNA作为模板的本发明的扩增核苷酸序列的方法中的链置换反应的引物。这种引物可以是具有上述(1)所述特性而且可用于RNA的反转录反应的任何引物。
具有利用RNA模板合成cDNA的活性的任何酶均可用于反转录反应。其实例包括各种来源制得的反转录酶,例如禽单核细胞增多症病毒来源的反转录酶(AMV RTase)、莫洛尼鼠类白血病病毒反转录酶(MMLV RTase)和2型劳斯相关病毒反转录酶(RAV-2RTase)。此外,可使用还具有反转录活性的DNA聚合酶。在高温下具有反转录活性的酶如栖热菌属细菌的DNA聚合酶(例如Tth DNA聚合酶)和亚孢杆菌属的嗜热菌的DNA聚合酶优选用于本发明。尽管目的不是限制本发明,但是优选例如亚孢杆菌属的嗜热菌的DNA聚合酶如B.st的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)和B.ca的DNA聚合酶(Bca DNA聚合酶)。例如Bca DNA聚合酶对反转录反应不需要镁离子。而且它可合成cDNA,同时在高温条件下抑制模板RNA的二级结构形成。天然DNA聚合酶和具有反转录酶活性的所述酶的变异体均可使用,前提是它们具有所述活性。
用本发明方法扩增核酸时,预先扩增模板核酸可以更有效地扩增目的核酸。例如当扩增微量基因组DNA中存在的核苷酸序列时,首先用合适的核酸扩增方法扩增包含目的核苷酸序列的DNA片段。然后由此获得的扩增DNA片段用作模板,以进行本发明的扩增方法。可用本发明的方法进行第一个扩增步骤。或者可用已知的核酸扩增方法如PCR方法进行第一个步骤。而且可在用于所述扩增步骤的引物的5’-末端侧加入特定核苷酸序列。当用这种引物扩增的片段用作模板时,可用具有加入上述引物的特定核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物进行本发明的扩增方法。换句话说,不管需要扩增的区段的核苷酸序列如何,可用共同的嵌合寡核苷酸引物通过本发明的方法进行所述核酸扩增步骤,其中PCR扩增的DNA片段用作模板。可以联合本发明的方法和利用具有如上所述加在5’-末端侧的特定核苷酸序列的引物的PCR达到此目的。
通常人们应该制备一对目的核苷酸序列特异性引物,以便在第一个核酸扩增步骤中特异性扩增所述序列。然而,不使用目的核苷酸序列特异性引物,而用非特异性扩增核酸片段的随机引物或者一对选自一组现成简并引物的引物可扩增模板核酸。能够减少扩增多个模板核酸需要的引物对数目。利用例如采用具有标记序列的随机引物的PCR方法(Nucleic Acids Research,24(19):3778-3783(1996))或利用具有标记序列的简并引物的简并寡核苷酸引导的PCR方法(DOP-PCR;Genomics,13:718-725(1992))可达到减少引物对的目的。各所述引物在3’-末端具有随机序列或简并序列。如果用具有标记序列的引物扩增的核酸作模板进行本发明的扩增方法,则可以用一种嵌合寡核苷酸引物进行本发明的方法。这种嵌合寡核苷酸引物具有与所述标记序列相同的核苷酸序列。通过采用这样一种引物,用具有相同标记序列的引物扩增的所有核酸均可用作模板。因此通过联合本发明的方法和利用随机引物或简并引物的核酸扩增方法可以非常低的成本大量供应各种核苷酸序列。
利用模板DNA链重新合成DNA链的任何DNA聚合酶均可用于所述核酸扩增方法。这样的DNA聚合酶包括pol I-型DNA聚合酶(例如大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow片段和Taq DNA聚合酶)、α-型DNA聚合酶(例如激烈热球菌的DNA聚合酶、VENT DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶和DEEP VENT DNA聚合酶)以及非α-、非-pol I-型DNA聚合酶(例如WO 97/24444介绍的DNA聚合酶)。此外,可优选使用至少两种DNA聚合酶的混合物如TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo)或KOD dash DNA聚合酶(Toyobo)。而且可优选使用以下DNA聚合酶:例如B.ca的DNA聚合酶、B.st的DNA聚合酶、这些DNA聚合酶缺乏其5’-3’外切核酸酶活性的变异体、9°N DNA聚合酶、Pfu(exo-)DNA聚合酶(Stratagene)、Tth DNA聚合酶(Toyobo)和Tfl DNA聚合酶(Promega)。
如果在本发明的扩增方法中使用线性DNA片段(例如PCR扩增的片段)作为模板,则导入称为间隔部分的序列可提高扩增效率。间隔部分位于模板线性DNA片段的3’-末端和用于本发明方法的引物的5’-末端的退火部位之间。例如最好设计用于本发明扩增方法的引物,使得间隔部分的长度没有限制地为1-约70个碱基、更优选约5-约60个碱基。间隔部分的优选碱基数可以随用于本发明扩增方法的引物序列而变化。参照本发明实施例公开的内容可确定最佳间隔部分。例如预先用PCR扩增一个片段,使得间隔部分加入到本发明扩增引物退火区段的3’,这样的扩增片段可用作本发明扩增方法的模板。在一个实施方案中,预先用一种引物扩增模板核酸。这样的引物在5’-3’方向具有间隔部分的一个区段、本发明扩增引物的一个区段和扩增核酸的另一个引物的一个区段。如此扩增的片段然后用作本发明扩增方法中的模板。用于扩增核酸的另一个引物的区段可以是用于核酸扩增方法如PCR方法的引物的任何区段。或者用于扩增核酸的另一个引物的区段可以是本发明的另一个扩增引物的一个区段。
双链DNA如分离的基因组DNA或PCR片段和单链DNA如总RNA或mRNA经反转录反应制得的cDNA均可在本发明中用作模板DNA。优选使用双链DNA变性成为的单链DNA。
如果线性双链DNA如PCR扩增产物用作模板,则可去除本发明扩增方法中的变性步骤。使本发明引物的退火部位位于所述DNA末端内侧约50个碱基处可去除变性步骤。如果需要扩增具有RNA序列的核酸,则可在本发明的DNA合成方法中用一种DNA聚合酶进行利用RNA作为模板的反转录反应以及利用所述反转录反应产生的cDNA作为模板的DNA扩增反应。所述DNA聚合酶具有反转录酶活性和链置换活性。
所述模板的合适长度为因为存在完整靶序列或至少所述片段中靶序列的足够部分而为引物序列提供充分结合的长度。
如果DNA模板为双链DNA,则在本发明方法中使所述DNA变性为单链DNA,以使引物能够结合到模板DNA链上。对于变性而言优选使双链DNA保持在变性温度(例如约95℃)下。其它方法包括其中利用pH升高的方法。在这种情况下,应该降低pH,以便使寡核苷酸引物可结合到扩增反应的靶上。在双链DNA变性为单链DNA后或者如果RNA用作模板时,利用反转录反应制备cDNA(单链DNA)后,在恒温条件下连续扩增核苷酸序列。
“连续”是指反应温度或反应混合物组成没有变化地进行反应。本文使用的“恒温”是指温度基本恒定的条件,在此温度下各步骤的酶和核酸链具有功能。
在不受理论限制下,考虑在本发明的扩增核苷酸序列的方法中连续、重复平行进行(例如在恒温条件下)以下步骤:
[1]使模板DNA退火到至少一种寡核苷酸引物上的步骤;
[2]实现从所述引物的3’-末端延伸与所述模板DNA互补的DNA的反应的步骤;
[3]用内切核酸酶切割步骤[2]延伸的DNA链的步骤;
[4]实现从步骤[3]切割的所述位点的3’-末端延伸DNA的反应,同时释放步骤[2]延伸DNA链而不会使其从模板DNA降解的步骤;以及
[5]用步骤[4]获得的双链聚核苷酸重复步骤[3]和步骤[4]的步骤。
可应用嗜温DNA聚合酶例如Klenow片段在通常温度(例如37℃)下进行上述反应。采用耐热酶(内切核酸酶和DNA聚合酶)也可以在高温(例如50℃或更高,或60℃或更高)下进行。在这种情况下,非特异性引物退火受到抑制,使得DNA扩增的特异性增加。而且解决了模板DNA形成二级结构的问题,使得DNA聚合酶的延伸能力提高。在一个实施方案中,可在所述方法中连续进行反转录反应和核苷酸序列扩增。在这种情况下,联合应用反转录酶和上述反应或者利用具有反转录活性的DNA聚合酶可扩增具有RNA产生的序列的DNA。
本发明的第一方面为一种采用单链DNA作为模板和至少一种嵌合寡核苷酸引物扩增核苷酸序列的方法。
它为一种扩增核苷酸序列的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)用至少一种与所述核酸的核苷酸序列的一部分基本互补的引物和DNA聚合酶处理模板核酸,以合成与模板互补的引物延伸链,其中所述引物为包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,以便用内切核酸酶进行切割;
(b)用所述内切核酸酶在包含所述核糖核苷酸的位点切割步骤(a)获得的双链核酸的引物延伸链;以及
(c)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(b)获得的引物延伸链达到链置换。
本发明的第二方面为一种用单链DNA作为模板和至少两种本发明的嵌合寡核苷酸引物扩增核苷酸序列的方法。
它为一种应用至少两种引物扩增核苷酸序列的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)用至少一种与所述核酸的核苷酸序列的一部分基本互补的引物和DNA聚合酶处理模板核酸,以合成与模板互补的引物延伸链,其中所述引物为包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,以便用内切核酸酶进行切割;
(b)用所述内切核酸酶在包含所述核糖核苷酸的位点切割步骤(a)获得的双链核酸的引物延伸链;
(c)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(b)获得的引物延伸链达到链置换,其中步骤(b)重复使用含有重新产生的引物延伸链的双链核酸;
(d)用至少一种不同于步骤(a)使用的引物和DNA聚合酶处理步骤(c)获得的释放置换链模板,以合成与置换链互补的引物延伸链,其中不同于步骤(a)使用的引物为嵌合寡核苷酸引物,该引物与置换链的核苷酸序列的一部分基本互补而且含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸,所述核糖核苷酸位于引物的3’-末端或引物的3’-末端侧上,以便用内切核酸酶进行切割;
(e)用内切核酸酶在含有核糖核苷酸的位点切割步骤(d)获得的双链核酸的引物延伸链;以及
(f)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(e)获得的引物延伸链达到链置换,其中步骤(e)重复使用含有重新产生的引物延伸链的双链核酸。
本发明第三或第四方面为一种其中利用在双链DNA变性为单链DNA的预处理步骤后获得的单链DNA作为模板,扩增按照本发明第一或第二方面的核苷酸序列的方法。
本发明的第五或第六方面为一种其中利用RNA作为模板经反转录反应制备单链cDNA步骤后获得的cDNA作为模板,扩增按照所述第一或第二方面的核苷酸序列的方法。
本文使用的“重新产生的引物延伸链”是指从因为链置换重新用于复制的寡核苷酸引物延伸的、与模板核苷酸序列互补的DNA链。
本文使用的“重复使用”是指在链置换步骤中再次利用由模板核苷酸序列和重新产生的引物延伸链组成的双链DNA。
在本发明各上述方面中,与模板单链DNA互补的嵌合寡核苷酸引物首先退火到所述DNA上。然后利用DNA聚合酶的作用从所述引物的3’-末端沿所述模板DNA的其余序列延伸与所述模板DNA互补的DNA(引物延伸链),以合成双链DNA。一种内切核酸酶作用于所述双链DNA,在所述嵌合寡核苷酸引物的核糖核苷酸部分的3’-末端侧的一个位点对其进行切割。所述内切核酸酶不会切割所述DNA其它部位。因此,内切核酸酶起在所述双链DNA导入一个缺口的缺口酶的作用。尽管本发明不受理论的束缚,但是所述内切核酸酶可能改变所述嵌合寡核苷酸引物和模板DNA组成的双链DNA的结构。具有链置换活性的DNA聚合酶从所述双链DNA导入缺口的3’-末端再延伸DNA链,产生新的引物延伸链,同时释放所述缺口3’-末端下游的DNA。因此,新的引物延伸链置换先前合成的引物延伸链。
可用两种引物进行本发明扩增核苷酸序列的方法,所述引物即与模板核酸互补的嵌合寡核苷酸引物和另一种与置换链互补的嵌合寡核苷酸引物。在这种情况下,一种引物结合到模板DNA链引起链置换反应,而另一种引物结合到因为所述链置换反应释放的置换链,而开始另一个链置换反应。显然如果利用这一方面,则一种引物的反应产物可用作另一引物的模板。因此,由于模板量增加,所以扩增产物量以非线性方式增加。
当用双链DNA作为模板进行本发明的扩增核苷酸序列的方法时,在所述双链DNA变性之前或之后,在反应混合物中加入1种嵌合寡核苷酸引物、4种三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)、1种DNA聚合酶和一种内切核酸酶。如果利用热处理变性所述双链DNA而不使用耐热酶,则优选在变性后加入所述酶。
如上述(2)所述,选择用于所述方法的内切核酸酶,使得它于引物的核糖核苷酸部分切割链。最好是于所述核糖核苷酸的3’位点切割所述链。人们应该选择DNA聚合酶,使得它以合适的速率解离缺口DNA链。
用于本发明的DNA聚合酶从缺口位点向下游合成延伸链,同时置换先前的延伸DNA链。重要的是,所述DNA聚合酶没有5’-3’外切核酸酶活性,否则它可降解所述置换链。例如Klenow片段(大肠杆菌DNA聚合酶I的外切核酸酶缺陷型变异体)、从Bst DNA聚合酶获得的类似片段(New England Biolabs)和B.ca的Bca BEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)可用作这样的DNA聚合酶。也可以使用Gene,97:13-19(1991)中所述的Sequenase 1.0和Sequenase 2.0(United StatesBiochemical)以及T5DNA聚合酶和29 DNA聚合酶。如果加入合适的抑制剂能够抑制所述活性,则通常具有外切核酸酶活性的聚合酶可以用于本发明的DNA合成方法。
可以在不同温度下进行本发明扩增核苷酸序列的方法或者可以恒温进行。温度变化是指相应步骤的反应温度是变化的,但是所述变化不会干扰各步骤的反应。具体来说,温度变化是指温度变化到适宜于例如各引物的退火、互补链的合成反应、使互补链产生缺口和链置换反应。
另一方面,恒温是指各步骤的反应温度不变而且各步骤在基本恒定的温度下进行。必需选择温度以优化两种情况的反应条件。
本发明扩增核苷酸序列的方法的特征之一是所述方法在核酸合成期间不需要上下调节温度。因此,本发明提供恒温合成核苷酸序列的方法。许多常规核酸扩增方法需要上下调节温度,以使靶链与合成链解离。为此,这些方法需要特殊的反应设备例如热循环仪。然而,仅使用可保持恒温的设备就可进行本发明的方法。
如上所述,可在单一温度下进行本发明的方法。优选在以下条件下进行:选择反应温度和严格条件水平使引物非特异性退火降低,以及使所述引物特异性退火到模板核苷酸序列。尽管目的不是限制本发明,但是如上所述本发明的方法可利用耐热酶而在高温下进行。此外,最好在充分保持所用酶活性的合适温度下进行本发明的方法,以便保持高水平的反应效率。尽管反应温度随所用酶而不同,但是优选为约20℃-约80℃、更优选约30℃-约75℃、最优选约50℃-约70℃。尤其是当在高温条件下进行所述反应时,最好使用比正常温度下反应的引物长度更长的引物。例如参考其Tm值可确定适合所述反应温度的引物序列和长度。另一方面,可使用用于设计引物的市售软件,例如OLIGOTM引物分析软件(Takara Shuzo)。例如当反应温度使用55℃-60℃或65℃时,用于本发明方法的引物可以是例如没有限制地为12-100个核苷酸长度、优选14-50个核苷酸长度、更优选15-40个核苷酸长度。升高反应温度产生的作用之一是解决了模板DNA形成二级结构的问题。升高反应温度使得能够扩增需要的核酸,即使使用GC含量高的核酸作为模板也如此。而且同样有效扩增长链长度的一个区。于约100bp-约20kbp、尤其是约200bp-约4.3kbp、更特别为约250bp-约1500bp范围观测到这样的作用。
在本发明方法中使用具有反转录酶活性的DNA聚合酶(例如BcaBEST DNA聚合酶)使得由RNA扩增核苷酸序列可常规进行,其中包括用RNA制备cDNA的步骤(反转录反应)。或者,独立进行由RNA制备cDNA的步骤获得的产物即cDNA可在本发明方法中用作模板DNA。
在各种情况下,重复本发明方法的反应,直至用合适的方法例如失活酶或降低反应温度中止为止,或者直至反应消耗完其中一种试剂为止。
图1图示一个实施方案,其中使用单链DNA作为模板和两种引物。连续平行进行的相应步骤如下所述:
(1)使模板单链DNA退火到嵌合寡核苷酸引物的步骤;
(2)实现从所述引物的3’-末端延伸DNA的反应以形成引物延伸链的步骤;
(3)用内切核酸酶在引物包含核糖核苷酸的位点切割的步骤;
(4)用DNA聚合酶从步骤(3)的切割位点实现链置换的步骤;
(5)重复使用由步骤(4)获得的模板和步骤(3)重新产生的引物延伸链组成的双链DNA的步骤,同时在步骤(6)反应和以下步骤中使用释放的置换链;
(6)使不同于步骤(1)的寡核苷酸引物退火到作为模板的步骤(5)的释放置换链的步骤;
(7)由所述引物的3’-末端实现DNA延伸反应以形成引物延伸链的步骤;
(8)用内切核酸酶于引物包含核糖核苷酸的位点进行切割的步骤;
(9)用DNA聚合酶从步骤(8)的切割位点实现链置换的步骤;以及
(10)重复使用步骤(9)获得的模板和步骤(8)重新产生的引物延伸链的步骤。
当双链DNA用作模板时,所述双链DNA变性后获得的各单链DNA用作步骤(1)的模板。所以,扩增产物量比用单链DNA作为模板获得扩增产物量更多。另外,与当单链DNA用作模板时所需要的检测扩增产物的时间相比,检测扩增产物的时间更短。
用于扩增核苷酸序列的本发明方法可用于各种应用核苷酸序列扩增的实验方法,包括检测、标记和对核酸进行测序。
此外,用于扩增核苷酸序列的本发明方法可用于原位核酸扩增法、在固相支持物上扩增核酸的方法如DNA芯片或者其中多个区同时扩增的多核酸扩增法。
用于扩增核苷酸序列的本发明方法的特征之一为它能够制备单链DNA。为此,一种或两种嵌合寡核苷酸引物可用于所述方法。例如如果使用两种寡核苷酸引物,则可应用用于所谓的不对称PCR法的引物比进行本发明的方法,其中用相对于另一种寡核苷酸引物量的过量的一种寡核苷酸引物进行扩增反应。因此,相对于另一条链产物量,一条链的置换产物量过量。
根据用于扩增核苷酸序列的本发明方法,能够制备基本上不含其互补链的单链DNA。例如能够在很短的时间内容易地产生用于制备含有固定核酸的材料如DNA芯片的单链DNA、用于检测靶核酸的单链DNA探针或用于长链PCR法的大引物。通过应用本发明的方法可选择性只扩增有义序列或反义序列。因此,本发明可有效用作制备具有有义序列或反义序列的核酸的方法。
此外,用于扩增核苷酸序列的本发明方法不需要使用可随时间调节温度的反应设备。因此,能够以高体积反应混合物进行扩增反应。所以,能够大量工业化生产核酸(例如医药用途核酸)。
用于扩增核苷酸序列的本发明方法中的引物的使用效率约为100%,它可能比常规方法如PCR法高5-10倍以上。
(6)用于扩增核苷酸序列的本发明方法的试剂盒
本发明提供用于如上所述第一至第六方面的扩增核苷酸序列的方法的试剂盒。在一个实施方案中,所述试剂盒为包装形式,其中包含关于在链置换反应中使用DNA聚合酶和内切核酸酶的说明书。同样,包含具有链置换活性的DNA聚合酶、内切核酸酶和用于链置换反应的缓冲剂的试剂盒优选用于本发明的方法。另一方面,可以根据说明书选择使用市售具有链置换活性的DNA聚合酶和/或内切核酸酶。另外,所述试剂盒可以包括当RNA用作模板时使用的用于反转录反应的试剂。如以上(3)所述,可从各种DNA聚合酶中选择用于本发明的DNA聚合酶。如以上(2)所述,可从各种内切核酸酶中选择内切核酸酶。具有以上(4)所述的反应缓冲液组分的缓冲液优选用作链置换反应的缓冲液。
“说明书”为印刷材料,介绍使用所述试剂盒的方法,例如制备用于链置换反应的试剂的方法、推荐的反应条件等。说明书包括小册子或散页形式的使用手册、粘贴于试剂盒上的标签和装有试剂盒的包装表面的说明。说明书还包括电子媒介如国际互联网公开或提供的信息。
(7)用于检测本发明核苷酸序列的方法以及用于所述方法的试剂盒
利用用于扩增核苷酸序列的本发明方法能够检测样品中的靶核酸。检测方法包括:
(a)用如上所述的扩增核苷酸序列的本发明方法扩增靶核酸;以及
(b)检测以上步骤扩增的靶核酸。
所述方法可以用来检测或定量样品中的特定基因。换句话说,能够检测或定量所有怀疑含有核酸如DNA或RNA的样品中的特定基因。能够检测或定量特定基因的样品实例包括但不限于生物样品,例如全血、血清、血沉棕黄层、尿、粪便、脑脊液、***、唾液、组织(例如癌组织或***)和细胞培养物(例如哺乳动物细胞培养物或细菌细胞培养物)、含有核酸的样品如类病毒、病毒、细菌、真菌、酵母、植物和动物,怀疑污染或感染微生物如病毒或细菌的样品(例如食品或生物制剂),以及可能含有生物的样品如土壤和废水。例如根据是否存在类病毒、病毒、真菌、细菌或其它目标微生物衍生的特定基因或其含量,能够检测或定量样品中的类病毒、病毒、真菌、细菌或其它微生物。而且,本发明的方法可以用来区别生物的基因型或检测基因的表达水平。在所述检测方法中可优选使用RNA和DNA二者作为模板核酸。
用于检测核酸的已知方法可用于步骤(b)。这类方法的实例包括利用电泳检测具有特定大小的反应产物以及利用探针的杂交检测。荧光物质如溴化乙锭用于电泳检测。利用探针的杂交可与电泳检测联合起来。可用放射性同位素或非放射性物质如生物素或荧光物质标记探针。另外,在步骤(a)使用标记核苷酸可能有助于检测扩增产物。荧光极化法、荧光能量跃迁等也可以用于所述检测。可以自动化检测靶核酸或通过构建合适的检测***定量靶核酸。
用2种或2种以上荧光物质以产生猝灭状态的距离标记的核糖核苷酸(RNA)探针可用于本发明的检测方法。探针不发射荧光。当探针退火到由与探针互补的靶核酸扩增的DNA时,RNA酶H消化探针。则增加所述探针上的荧光物质之间的距离,使得发射荧光。因此,发射荧光表示存在靶核酸。如果RNA酶H用于扩增核苷酸序列的本发明方法,则可在反应混合物中只加入探针就能够检测靶核酸。例如组合荧光物质6-羧基荧光素(6-FAM)和N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)可优选用于标记探针。
在恒温条件下扩增核苷酸序列的本发明方法不需要使用设备如热循环仪。用于本发明扩增方法的引物数也可以为1个或2个,比常规方法使用的引物数少。因为用于PCR等的试剂如dNTP能够用于本发明方法,所以与常规方法相比,可降低使用费。因此,本发明方法可优选用于其中常规进行检测的领域,包括遗传实验。与PCR法相比,本发明方法以较短的时间提供更大量的扩增产物。所以,本发明方法可用作检测基因的简便、快速和敏感的方法。
本发明进一步提供用于检测靶核酸的方法的试剂盒。如上所述,用于扩增核苷酸序列的本发明方法的试剂盒能够用作这种试剂盒。试剂盒可以进一步包含用于扩增靶核酸的嵌合寡核苷酸引物以及用于检测扩增的靶核酸的试剂如探针。
(8)在预定区域含有固定核酸阵列的本发明材料及其生产方法
DNA芯片(也称为DNA微阵列或DNA阵列)是具有固定核酸的材料,其中基因或DNA的各种片段排列固定在固体支持物如载玻片上预定区域或预定位置。DNA芯片用于检测核酸样品中是否存在具有与DNA芯片预定区域的阵列固定DNA互补的序列的核酸。如下进行检测:使DNA芯片与用样品制备的核酸试样、优选为标记核酸试样接触进行杂交。因为DNA芯片能够以一个步骤检测或定量样品中的核酸数量,所以它是非常有用的方法,它大大促进了基因表达的分析、或者突变或多态性的分析。其中在预定区域排列固定双链核酸的DNA芯片在使其经过合适变性后用于杂交。其中在预定区域排列固定与需要检测的靶核酸互补的单链DNA的DNA芯片特别优选用于检测靶核酸。
如上所述,本发明的方法可以单链形式扩增需要的DNA。尽管可以使用纯化扩增产物的任何方法,但是优选利用异丙醇沉淀的纯化。由此获得的DNA,最好为基本上不含其互补链的单链DNA,可优选用作固定在DNA芯片上的DNA片段。因此,本发明的方法优选用作制备需要排列固定在预定区域的DNA的方法,以生产DNA芯片。任何不溶性支持物均可用作在其预定区域上排列固定由此获得的DNA的支持物,但是优选使用玻璃或塑料制成的平板形支持物以及硝酸纤维素或尼龙制成的膜形支持物。固定核酸的已知方法可用于所述固定。DNA可以直接固定在支持物上。或者,DNA可以通过一个合适的接头或连接多个DNA分子后固定在支持物上。
能够检测或定量与具有固定核酸的材料(例如DNA芯片)上的核酸杂交的靶核酸,在所述材料上本发明方法扩增的DNA排列固定在预定区域上。可如下完成这种检测或定量:使所述材料与用怀疑含有靶核酸的样品制备的核酸试样接触,以进行杂交。其中,本发明的方法扩增的单链DNA排列固定在预定区域中的DNA芯片,与常规材料相比,使得可以以更方便操作、更高敏感性而且更高重复性检测靶核酸。
(9)用于大量生产核酸的本发明方法
如上所述,本发明的一个方面提供用于扩增核苷酸序列的方法,该方法可以在恒温下进行。可如下用所述方法生产需要的核酸:混合需要扩增的核酸的模板核酸和反应需要的各种成分,以及使所述混合物在恒温条件下反应。因为PCR方法需要随时间改变反应混合物的温度,因此其反应体积限制为其中能够控制温度的体积(通常为200μl或200μl以下)。因此,难以按比例增大体积。相反,本发明的方法不存在这样的限制。通过增加反应混合物体积能够产生大量核酸。在本发明的方法中,由一个模板分子合成无数互补链分子。而且利用这些互补链分子作为模板能够合成核酸。因而,通过适当选择模板和引物能够有效地大量生产需要的核酸。此外,与PCR方法不同的是,本发明的方法不需要特殊的设备或复杂的温度变化,这样的事实使得它在设备成本和能量成本方面具有优势。所以,本发明方法是大量生产核酸的优良工业方法。
此外,本发明方法可用作大量供应DNA片段的方法,例如需要固定在DNA芯片上的大量DNA片段的供应。具体来说,在一个实施方案中,能够以简便的反应步骤大量获得DNA片段。在另一个实施方案中,可使用有限量的引物获得各种DNA片段。预先用已知核酸扩增方法(例如PCR方法)扩增用作本发明方法中的模板的核酸的步骤可加入后一实施方案中。例如根据利用具有标记序列的随机引物扩增核酸的方法(Nucleic Acids Research,24(19):3778-3783(1996))或使用简并引物的简并寡核苷酸引导的PCR(DOP-PCR;Genomics,13:718-725(1992)),能够使用有限数量的引物扩增各种用作模板的核酸。对于上述步骤产生的用作模板的所有核酸而言,使用一种或几种引物就可进行本发明的扩增方法。可以如下达到此目的:设计用于本发明扩增方法的引物,以使它相当于加在随机引物或简并引物的标记序列。因此,与常规方法相比,联合制备用作模板的核酸的合适步骤和本发明方法可大量以及低成本供应各种DNA片段。
包含核酸的药用组合物可以含有在细胞中表达有用多肽的双链DNA或抑制目的基因表达的单链反义DNA。应用合适的方法例如基因转移的载体(例如脂质体)将所述核酸传送到生物体内。用于产生核酸的本发明方法优选用于产生大量医药用途的单链核酸或双链核酸。另外,利用本发明方法能够很容易地产生含有例如抑制体内核酸降解的dNTP类似物的核酸。
因为本发明扩增的DNA片段由常见核苷酸组成,所以利用所述DNA中的限制酶位点可将所扩增的DNA亚克隆入合适载体。此外,例如可用不存在RFLP问题的限制酶处理DNA。因此,所述DNA可广泛用于遗传实验领域。因为本发明扩增的DNA片段由正常核苷酸组成,所以RNA聚合酶的启动子序列可加入所扩增的片段中。所扩增的片段可用作合成RNA的模板,所述RNA例如可用作探针。当然,应用荧光标记的dNTP代替正常dNTP进行扩增核苷酸序列的本发明方法,能够产生荧光标记的DNA探针。
因为本发明方法最终扩增的片段在两端没有与用于扩增的引物互补的核苷酸序列,所以能够降低因为扩增产物的遗留所致的污染。因此,本发明方法可用于其中常规扩增相同区段的遗传实验等。
用于扩增核苷酸序列的本发明方法的特征列举如下:
1.它可由少量模板扩增大量核酸。当使用两种引物时,扩增产物以二次方增加。
2.它可恒温进行。在这种情况下,它不需要使用诸如热循环仪的设备。因此,反应体积能够容易地放大。
3.通常采用一种或两种嵌合寡核苷酸引物和两种酶(DNA聚合酶和内切核酸酶)进行扩增反应。
4.因为由一个引物分子合成无数DNA链,所以引物量不会限制扩增产物量。而且,引物利用效率为约100%,它比PCR方法的引物利用效率高得多。
5.根据目的可选择性扩增单链或双链DNA。
6.因为它不需要诸如(α-S)dNTP的dNTP类似物用于扩增反应,所以试剂成本低廉。而且可获得不含dNTP类似物的天然形式核酸。
7.它可通过联合本发明方法和另一种核酸扩增方法而低成本、大量供应扩增的DNA片段。
如上所述,本发明方法适合工业规模生产核酸。
实施例
以下实施例更详细地阐明本发明,而不能解释为限制本发明范围。
参考实施例
按照以下方法检测在本发明方法中使用的RNA酶H的单位值。
(1)制备所用的试剂溶液
用于测定活性的反应混合物:无菌水中含有所述终浓度的以下物质:40mM tris-盐酸盐(pH7.7,37℃)、4mM氯化镁、1mM DTT、0.003%BSA、4%甘油和24μM poly(dT)。
聚[8-3H]腺苷酸溶液:370kBq聚[8-3H]腺苷酸溶液溶解于200μl无菌水中。
聚腺苷酸溶液:用无菌超纯水使聚腺苷酸稀释为3mM浓度。
酶稀释溶液:无菌水中含有以下所述终浓度的物质:25mM tris-盐酸盐(pH7.5,37℃)、5mM 2-巯基乙醇、0.5mM EDTA(pH7.5,37℃)、30mM氯化钠和50%甘油。
制备热变性的小牛胸腺DNA:使200mg小牛胸腺DNA悬浮膨胀于100ml TE缓冲液中。根据于UV 260nm检测的吸光度,用无菌超滤水将所述溶液稀释为1mg/ml浓度。使稀释溶液于100℃加热10分钟,然后在冰浴中快速冷却。
(2)用于检测活性的方法
在985μl反应混合物中加入7μl聚[8-3H]腺苷酸溶液,以检测上述(1)制备溶液的活性。于37℃温育混合物10分钟。在混合物中加入8μl聚腺苷酸使其终浓度为24μM。混合物再于37℃温育5分钟。由此制得1000μl聚[8-3H]rA-聚-dT反应混合物。然后使200μl反应混合物于30℃温育5分钟。其中加入1μl合适连续稀释度的酶溶液。不同时间从反应混合物中取出50μl各样品用于随后的检测。加入酶至取样的时间(分钟)定义为Y。加入1μl酶稀释溶液代替酶溶液而制备50μl用作测定总CPM或空白对照的反应混合物。在所述样品中加入100μl100mM焦磷酸钠、50μl热变性的小牛胸腺DNA溶液和300μl 10%三氯乙酸(300μl超纯水用于检测总CPM)。使混合物于0℃温育5分钟,然后以10000rpm离心10分钟。离心后,取250μl产生的上清液置于小瓶中。其中加入10ml Aquasol-2(NEN Life Science Products)。以液闪计数器检测CPM。
(3)计算单位
按照以下公式计算每种酶的单位值:
单位/ml={(测得的CPM-空白CPM)×1.2*×20×1000×稀释度)}200(μl)/(总CPM×Y(分钟)×50(μl)×9**)
1.2*:每50μl的总CPM中含有的聚[8-3H]rA-聚-dT量(nM)。
9**:校正系数。
实施例1
(1)合成模板DNA和引物
利用DNA合成仪(Applied Biosystems)合成在本实施例中使用的用作模板的具有99个碱基的单链DNA和引物。99个碱基的单链DNA的核苷酸序列示于序列表的SEQ ID NO:1。上游引物和下游引物的基本核苷酸序列分别示于序列表的SEQ ID NO:2和3。以下详细介绍本实施例所用引物的结构:
引物对1:具有序列表的SEQ ID NO:2或3所示核苷酸序列而且全部由脱氧核糖核苷酸组成的引物组合;
引物对2:其中在引物对1的每个引物中,3’-末端的第一个和第二个脱氧核糖核苷酸被核糖核苷酸取代而且3’-末端的第二个核糖核苷酸的5’-末端侧的磷酸键被一个硫代磷酸键取代的引物组合;
引物对3:其中在引物对1的每个引物中,3’-末端的脱氧核糖核苷酸被核糖核苷酸取代而且该核糖核苷酸的5’-末端侧的磷酸键被硫代磷酸键取代的引物组合;
引物对4:其中在引物对1的每个引物中,3’-末端的第一个和第二个脱氧核糖核苷酸被核糖核苷酸取代的引物组合;以及
引物对5:其中在引物对1的各引物中,3’-末端的第三个和第四个脱氧核糖核苷酸被核糖核苷酸取代而且3’-末端的第四个核糖核苷酸5’-末端侧的磷酸键被硫代磷酸键取代的引物组合。
(2)扩增反应
使用Bca BEST DNA聚合酶(Takara Shuzo)和克隆的核糖核酸酶H(Takara Shuzo)检测以下介绍的1-7模型反应***,其中Bca BEST DNA聚合酶为得自热坚芽孢杆菌的缺乏5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶,而所述核糖核酸酶H为大肠杆菌核糖核酸酶H。
如下制备反应混合物:
35mM tris-盐酸盐缓冲剂(pH7.5)、0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、2.7%甘油、5%二甲亚砜、1.4mM各种dNTP、10mM氯化镁、20pM一种上述(1)所述引物对中的一个或两个引物、0.6ng用作模板的合成单链DNA、5U Bca BEST DNA聚合酶和60U克隆的核糖核酸酶H,最终反应体积为50μl。使反应混合物混合均一,于55℃温育60分钟,然后于90℃加热2分钟灭活所述酶。取8μl反应混合物在3%NuSieve 3∶1琼脂糖(Takara Shuzo)凝胶上进行电泳。以下介绍在相应模型中使用的引物:
模型1-5:使用引物对1-5中的一对;
模型6:只使用引物对2的下游引物;以及
模型7:使用引物对4而不加入核糖核酸酶H。
结果当使用模型2-5的反应混合物时,观测到具有40个碱基对(bp)至约90bp的目的大小范围的扩增片段,说明DNA是利用这些反应***扩增的。在只使用两种引物中一种引物的模型6中观测到具有约70个碱基(b)的预期大小的扩增片段(单链DNA片段)。在模型1或7的反应中没有观测到DNA扩增。
(3)证实扩增产物
用Microcon-100(Takara Shuzo)过滤上述(2)所述的模型4反应获得的反应混合物,回收捕获在滤膜上的扩增DNA片段。利用双脱氧法测得DNA片段的核苷酸序列。结果证实上述反应扩增的片段为具有与模板DNA相同的核苷酸序列的DNA。
(4)检测反应时间
制备上述(2)所述的模型2的反应混合物,以研究当反应不同时间时扩增产物量的变化。使反应混合物于55℃温育0、15、30、60、90或120分钟。然后于90℃处理混合物2分钟,灭活所述酶。取8μl反应混合物在3%NuSieve 3∶1琼脂糖凝胶上进行电泳分析。电泳结果见图2。图中数字1-6分别代表点样反应0、15、30、60、90或120分钟的反应混合物泳道。M代表点样用作分子量标记的100bpDNA梯型标记(Takara Shuzo)的泳道。
如图2所示,0分钟反应时间没有观测到扩增产物。证实随着反应时间从15分钟至30或60分钟的时间延长,扩增产物量增加。然而,电泳观测到反应时间为60分钟或更长时间的扩增产物量几乎没有变化,说明所用反应***的扩增在约60分钟时达到平台。
实施例2
(1)制备RNA
应用TRIzol试剂(Life Technololes),以培养的人细胞HT29(ATCC HTB-38)(Dainippon Pharmaceutical)制备在本实施例中用作模板的RNA。获得的总RNA的浓度调节为1μg/μl。OD260/OD280值为1.8,它表示RNA的分光光度纯度。
(2)扩增反应
使用具有反转录活性和DNA聚合酶活性的Bca BEST DNA聚合酶以及核糖核酸酶H内切核酸酶确定是否由RNA扩增cDNA。
加入1μg上述总RNA制备具有实施例2所述组成的反应混合物。利用实施例1的引物对2作为引物扩增编码人转铁蛋白受体的目标区(基因登录号X01060)。
使反应混合物于55℃温育60分钟,然后于90℃加热2分钟灭活所述酶。当8μl反应混合物在3%NuSieve 3∶1琼脂糖凝胶上电泳时,观测到具有56bp预期大小的扩增片段。此外,用具有目标核苷酸序列的探针进行RNA杂交。使用在5’-末端以生物素标记的具有序列表的SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的DNA探针进行DNA杂交。结果所述探针与上述扩增的片段杂交,证实本发明方法正确扩增目标区。
实施例3
(1)合成引物
应用双链DNA作为模板研究本发明的扩增方法。用DNA合成仪(Applied Biosystems)合成所用的引物。引物的基本核苷酸序列示于序列表的SEQ ID NO:5-13。以下详细介绍在本实施例使用的引物的结构。应用pUC19 DNA(Takara Shuzo)作为引物对A-F的模板。可从数据库获得pUC19的核苷酸序列(基因登录号L09137)。所扩增的双链DNA片段用作引物对G的模板。按照所附的标准方法应用具有序列表的SEQ ID NO:14或15所示的序列的引物和TaKaRa RNA PCR试剂盒(AMV)Ver.2.1(Takara Shuzo)由实施例2获得的人总RNA制备片段。
引物对A(扩增片段长度:约450bp):具有其中3’-末端的第一个和第二个碱基被核糖核苷酸取代的序列表的SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列的引物组合;
引物对B(扩增片段长度:约250bp):具有其中3’-末端的第一个和第二个碱基被核糖核苷酸取代的序列表的SEQ ID NO:5或7所示的核苷酸序列的引物组合;
引物对C(扩增片段长度:约520bp):具有其中3’-末端的第一个和第二个碱基被核糖核苷酸取代的序列表的SEQ ID NO:5或8所示的核苷酸序列的引物组合;
引物对D(扩增片段长度:约890bp):具有其中3’-末端的第一个和第二个碱基被核糖核苷酸取代的序列表的SEQ ID NO:5或9所示的核苷酸序列的引物组合;
引物对E(扩增片段长度:约130bp):具有其中3’-末端的第一至第三个碱基被核糖核苷酸取代的序列表的SEQ ID NO:10或6所示的核苷酸序列的引物组合;
引物对F(扩增片段长度:约220bp):具有其中3’-末端的第一至第三个碱基被核糖核苷酸取代的序列表的SEQ ID NO:11或6所示的核苷酸序列的引物组合;以及
引物对G(扩增片段长度:约320bp):具有其中3’-末端的第一至第三个碱基被核糖核苷酸取代的序列表的SEQ ID NO:12或13所示的核苷酸序列的引物组合。
(2)扩增反应
如下制备反应混合物:
35mM磷酸钾缓冲剂(pH7.5)、0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、5%二甲亚砜、1.4mM各种dNTP、10mM氯化镁、60pM一种上述(1)所述引物对中的每个引物、100ng用作模板的pUC19 DNA、5.5U Bca BEST DNA聚合酶和60U核糖核酸酶H,最终反应体积为50μl。
反应条件如下。使没有DNA聚合酶或核糖核酸酶H的反应混合物于98℃加热变性1分钟,然后冷却至55℃。然后其中加入DNA聚合酶和核糖核酸酶H,混合物于55℃温育60分钟。完成反应后,使混合物于90℃加热2分钟灭活所述酶。然后取8μl反应混合物在3%NuSieve 3∶1琼脂糖凝胶上进行电泳。
结果证实应用任何一个引物对均获得目的扩增片段。因此证实双链DNA能够用作模板进行本发明扩增方法中的扩增反应。
(3)用限制酶消化扩增产物
检测限制酶对用本发明的扩增方法获得的扩增片段的消化。pUC19质粒DNA用作模板DNA。使用序列表的SEQ ID NO:5和6分别所示的pUC19上游(2)NN引物和pUC19下游NN引物。在所述各种引物中,3’-末端的第一个和第二个碱基被核糖核苷酸取代。反应混合物的组成如下。
反应混合物A:35mM磷酸钾缓冲剂(pH7.5)、10mM氯化镁、1.4mM各种dNTP、0.01%BSA、5%DMSO、2.7%甘油、100pM各pUC19上游(2)NN引物和pUC19下游NN引物、500ng pUC19DNA,加入无菌蒸馏水至反应体积为48μl。
反应混合物于98℃加热变性1分钟,然后冷却至55℃。然后向其中加入60U大肠杆菌核糖核酸酶H和5.5U Bca BEST使反应体积为50μl。使反应混合物于55℃温育1小时。完成反应后,使混合物于90℃加热2分钟灭活所述酶。然后使反应混合物在3%琼脂糖凝胶上进行电泳,纯化获得的扩增产物。将所回收的扩增产物重新悬浮在100μl无菌蒸馏水中。
使用如此获得的DNA溶液进行限制酶消化。所用限制酶为AccII(Takara Shuzo)和BcnI(Takara Shuzo)。反应混合物的组成如下。
3μl DNA溶液、1μl各酶所附带的10×AccII缓冲液或10×BcnI缓冲液、1μl限制酶AccII或BcnII,加入无菌蒸馏水至反应体积为10μl。反应混合物于37℃反应30分钟。向其中加入1.5μl 10×加样缓冲液。取6μl混合物在3%NuSieve琼脂糖凝胶上进行电泳。
结果用两种限制酶AccII和BcnI均获得限制酶消化的目的DNA片段。
(4)检测突变
研究利用本发明扩增方法检测突变。pUC19用作模板。pUC19上游(2)NN引物和pUC19下游NN引物的基本核苷酸序列分别示于序列表的SEQ ID NO:5和6。这两种引物均为其中3’-末端的第一个和第二个碱基被核糖核酸取代的嵌合寡核苷酸引物。此外,制备这样的4种引物:pUC19上游(2)NN引物3’-末端的碱基被U(它与模板中的相应碱基互补)或A、C或G(它为错配碱基)取代,分别称为pUC19上游(2)NN-U、pUC19上游(2)NN-A、pUC19上游(2)NN-C或pUC19上游(2)NN-G。这些引物的组合如下:
引物对1:pUC19上游(2)NN-U和pUC19下游NN;
引物对2:pUC19上游(2)NN-A和pUC19下游NN;
引物对3:pUC19上游(2)NN-C和pUC下游NN;以及
引物对4:pUC19上游(2)NN-G和pUC19下游NN。
如下制备反应混合物。
30mM磷酸钾缓冲剂(pH7.3)、0.01%牛血清白蛋白(BSA)、5%DMSO、1mM各种dNTP、8mM醋酸镁、60pM各引物、50ng模板DNA,加入无菌蒸馏水至反应体积为48μl。
反应混合物于98℃加热变性1分钟,然后冷却至55℃。然后向其中加入5.5U Bca BEST DNA聚合酶和60U大肠杆菌核糖核酸酶H,使反应混合物于55℃温育60分钟。然后使混合物于90℃加热2分钟灭活所述酶。取8μl反应混合物在4%NuSieve 3∶1琼脂糖(TakaraShuzo)凝胶上进行电泳。结果证实只有当使用包含在pUC19上游(2)NN的3’-末端具有互补碱基的引物的引物组合,才检测到约450bp的目的扩增片段。相反,在包含在pUC19上游(2)NN的3’-末端具有错配碱基的引物的组合中没有观测到扩增片段。
实施例4
(1)用微量试管的反应
研究本发明扩增方法的反应体积。选择编码人转铁蛋白受体的区段作为扩增区段。使用具有序列表的SEQ ID NO:12或13所示序列的引物。在所述引物中,3’-末端的第一个和第二个碱基被核糖核苷酸取代。RT-PCR扩增的约750bp的片段用作模板DNA。反应体积调节为50、100、300或500μl。反应混合物组成如下。
反应混合物A:10μl的5×特殊缓冲液(135mM磷酸钾缓冲剂(pH7.5)、0.5mg/ml BSA、2.5%DMSO)、4μl的100mM醋酸镁、5μl的10mM各种dNTP、10μl的10μM ATP、1μl的Bca BEST DNA聚合酶(22U/μl)、1μl核糖核酸酶H(60U/μl),加入无菌蒸馏水至39μl。
反应混合物B:各3μl的20μM人转铁蛋白受体S引物(SEQ IDNO:12)和20μM人转铁蛋白受体引物(SEQ ID NO:13)、约100ng的DNA模板,加入无菌蒸馏水至11μl。如果反应体积为50μl或更高,按比例增加上述组分。
对于扩增反应,使反应混合物B于98℃处理2分钟,然后于55℃温育3分钟。将反应混合物B加入在1500-μl微量试管中于55℃预温育的反应混合物A中。混合后,使反应混合物于55℃温育1小时。完成反应后,将混合物转移到冰浴中。取8μl反应混合物在3%琼脂糖凝胶上进行电泳。
结果采用各所述体积有效扩增约300bp的目的片段。另外,证实采用PCR扩增的片段用作模板DNA能够没有任何问题地获得扩增的目的片段。
(2)用陪替氏培养皿的反应
研究使用陪替氏培养皿防止因为反应体积增加所致的反应混合物温度的不均一。选择编码人转铁蛋白受体的区段作为扩增区段。使用具有序列表的SEQ ID NO:12或13所示序列的引物。在所述引物中,3’-末端的第一个和第二个碱基被核糖核苷酸取代。RT-PCR扩增的约750bp的片段用作模板DNA。反应体积调节为10ml。反应混合物组成如下。
反应混合物A:2000μl的5×特殊缓冲液(135mM磷酸钾缓冲剂(pH7.5)、0.5mg/ml BSA、2.5%DMSO)、800μl的100mM醋酸镁、1000μl的10mM各种dNTP,加入无菌蒸馏水至9.1ml。
反应混合物B:各200μl的60μM人转铁蛋白受体S引物(SEQ IDNO:12)和60μM人转铁蛋白受体引物(SEQ ID NO:13)、约10μg的用作模板的DNA,加入无菌蒸馏水至500μl。
反应混合物C: 200μl Bca BEST DNA聚合酶(22U/μl)和200μl核糖核酸酶H(60U/μl)。
对于扩增反应,使反应混合物B于98℃处理1分钟,然后于55℃温育3分钟。将反应混合物B加入在60-mm(直径)塑料陪替氏培养皿中于55℃预温育的反应混合物A中。反应混合物C再加入其中。混合后,使反应混合物于55℃温育1小时。完成反应后,将混合物转移到冰浴中。取8μl反应混合物在3%琼脂糖凝胶上进行电泳。
结果即使采用10ml反应体积也有效扩增约300bp的目的片段。另外,证实采用PCR扩增的片段用作模板DNA能够没有任何问题地获得扩增的目的片段。因此证实与常规PCR方法相比,本发明的方法可更优选用于制备需要大量DNA片段的DNA芯片。
实施例5
(1)所用缓冲液类型和核糖核酸酶H量之间的关系
研究所用缓冲液类型和核糖核酸酶H量之间的关系。其中249bp或911bp的片段克隆入pUC19载体(称为pUC19-249和pUC19-911)的质粒DNA用作模板。嵌合寡核苷酸引物用作引物,在所述引物中具有序列表的SEQ ID NO:16或17所述序列的MF2N3(24)引物或MR1N3(24)引物的3’-末端第一个至第三个碱基被核糖核苷酸取代。使用这些引物组合分别获得pUC19-249和pUC19-911的约450bp和约1100bp的扩增片段。
选择tris-盐酸盐缓冲液、磷酸钾缓冲液和Tricine缓冲液用作待研究的缓冲***。其中不加入所研究的核糖核酸酶H量,其终浓度范围为0.3-1.2U/μl。如实施例1(2)所述制备tris-盐酸盐缓冲***,不同的是使用10ng pUC19-249或200ng pUC19-911、60pM各所述引物和11U/50μl反应体积的Bca BEST DNA聚合酶。制备含有相似组成的磷酸钾缓冲液***。制备含有以下所示终浓度的各成分的Tricine缓冲液***:34mM Tricine缓冲剂(pH8.7)、10mM氯化钠、10mM硫酸铵、0.01%BSA、1%DMSO、4mM醋酸镁和0.5mM各dNTP。在所述缓冲***中加入10ng/50μl反应体积的pUC19-249质粒或200ng/50μl反应体积的pUC19-911质粒、60pM/50μl反应体积的各引物、预定浓度的RNA酶H和11U/50μl反应体积的Bca BEST DNA聚合酶。
对于扩增反应,用作模板的pUC19-249或pUC19-911和相应引物的混合物于98℃加热变性1分钟,然后冷却至55℃。向其中加入其余反应成分的混合物。使混合物于55℃反应60分钟。反应完成后,使混合物冷却至4℃,向其中加入1/10体积的0.5M EDTA中止反应。取3μl反应混合物在3%NuSieve 3∶1琼脂糖(Takara Shuzo)凝胶上进行电泳。
结果当pUC19-249用作模板时,对所用缓冲***观测到扩增效率增加顺序如下:tris-盐酸盐<磷酸钾<Tricine。当pUC19-911用作模板时,对所用缓冲***观测到的扩增效率增加顺序如下:tris-盐酸盐<Tricine<磷酸钾。结果不加入核糖核酸酶H观测不到目的扩增片段,但是使用终浓度为0.3-1.2U/μl的核糖核酸酶H产生目的扩增片段。
(2)研究引物量
研究所用引物量对本发明扩增方法的影响。使用具有其中在上述(1)所述的组分中pUC19-249用作模板的组成的反应混合物***。60U/50μl反应体积的核糖核酸酶H用于磷酸钾缓冲***,而30U/50μl反应体积的核糖核酸酶H用于tris-盐酸盐缓冲***或Tricine缓冲***。所研究的引物浓度范围为10-100pM/50μl。反应条件以及扩增结果的证实如上述(1)所述。
结果用含有引物浓度范围为10-100pM/50μl的各反应缓冲***观测到扩增的目的片段。
(3)反应缓冲液的pH的影响
研究反应混合物的pH对本发明扩增方法的影响。反应混合物的组成如上述(2)所述。所研究的磷酸钾缓冲***的pH为7.0-8.0,Tricine缓冲***的pH为7.5-9.2,而tris-盐酸盐缓冲***的pH为7.5-9.0。反应条件以及扩增结果的证实如上述(1)所述。
结果在用于相应缓冲***的pH范围观测到扩增的目的片段。
(4)添加剂的影响
应用上述(3)所述的磷酸缓冲***(pH7.5)的反应混合物组成研究加入二甲亚砜(DMSO)的影响。另外,还研究加入聚胺的作用。所研究的加入DMSO的量从0至10%。另一方面,四盐酸精胺(Sigma)、三盐酸亚精胺(Sigma)、乙酰腐胺(Nacalai Tesque)、二盐酸腐胺(NacalaiTesque)、亚丙基二胺(Nacalai Tesque)、丙邻二胺(Nacalai Tesque)和二盐酸二氨基甲烷(Nacalai Tesque)用作聚胺。加入的丙邻二胺和亚丙基二胺量范围为0-2%。其它聚胺的用量范围为0-5mM。反应条件和扩增结果的证实如上述(1)所述。
结果应用以下所示范围浓度的添加剂有效扩增目的DNA片段:0-5%DMSO;0-200μM四盐酸精胺或亚精胺;40μM-40mM乙酰腐胺或二盐酸腐胺;0.002%-0.02%亚丙基二胺;0.0001%-0.01%丙邻二胺以及0.1μM-10μM二盐酸二氨基甲烷。
(5)研究镁盐类型
研究镁盐类型对本发明扩增方法的影响。pUC19 DNA用作模板。分别具有序列表的SEQ ID NO:11和6所示序列的pUC19上游NN 249引物和pUC19下游NN引物用作引物。应用一对这样的引物获得约225bp的扩增片段。氯化镁、醋酸镁和硫酸镁用作镁盐。反应混合物的组成如下。
35mM磷酸钾缓冲剂(pH7.3)、8mM(终浓度)氯化镁、醋酸镁或硫酸镁、1.0mM(终浓度)各dNTP、50ng pUC19 DNA、60pM各引物、60U核糖核酸酶H、5.5U的Bca BEST DNA聚合酶,加入无菌蒸馏水至反应体积为50μl。反应条件和扩增结果的证实如上述(3)所述。
结果用各所述镁盐观测到目的扩增片段。
(6)研究镁和dNTP的浓度
研究镁和dNTP浓度对本发明扩增方法的影响。反应混合物的组成如上述(5)所述,不同的是使用25ng的pUC19 DNA以及不同浓度的镁和各种dNTP。反应条件和扩增结果的证实如上述(1)所述。
在各dNTP终浓度固定为1mM的反应***中,当使用的镁终浓度范围为6mM-10mM时,获得目的扩增片段。在镁终浓度固定为8mM的反应***中,当使用的各dNTP终浓度范围为0.6mM-1.2mM时,获得目的扩增片段。此外,在各dNTP终浓度范围固定为0.5mM的反应***中,当使用的镁终浓度范围为2mM-6mM时,获得目的扩增片段。在镁终浓度固定为4mM的反应***中,当使用的各dNTP终浓度范围为0.2mM-0.8mM时,获得目的扩增片段。
(7)研究磷酸钾缓冲剂或Tricine缓冲剂浓度变化和反应性
研究磷酸钾缓冲剂或Tricine缓冲剂浓度对本发明扩增方法的影响。在pUC19-249用作模板的情况下,反应混合物的组成同上述(1)所述,不同的是使用终浓度为20-50mM的磷酸钾缓冲剂或终浓度为22-46mM的Tricine缓冲剂。反应条件和扩增结果的证实如上述(1)所述。
结果当使用终浓度范围为20-50mM的磷酸钾缓冲剂或终浓度范围为22-46mM的Tricine缓冲剂时,获得目的扩增片段。
(8)研究Bca BEST DNA聚合酶的浓度
研究Bca BEST DNA聚合酶浓度对本发明扩增方法的影响。在pUC19-249用作模板的情况下,反应混合物的组成同上述(1)所述,不同的是使用磷酸钾缓冲***或Tricine缓冲***和浓度范围为1-22U/50μl反应体积的Bca BEST DNA聚合酶。反应条件和扩增结果的证实如上述(1)所述。
结果当使用浓度范围为1-22U/50μl的Bca BEST DNA聚合酶时,获得目的扩增片段。
实施例6
与PCR方法的比较
比较本发明扩增方法与PCR方法。约150bp或约250bp的DNA片段***pUC19质粒DNA多克隆位点的DNA用作模板。如下制备模板。
分别具有序列表SEQ ID NO:10、11和6所示序列的pUC19上游150引物、pUC19上游249引物和pUC19下游NN引物用来利用100pg的pUC19质粒DNA作模板进行PCR反应。采用pUC19上游150引物和pUC19下游NN引物的组合获得约150bp的扩增片段。采用pUC19上游249引物和pUC19下游NN引物的组合获得约250bp的扩增片段。应用DNA平端化试剂盒(Takara Shuzo)平端化末端的Microcon-100纯化各所述扩增片段,然后使之亚克隆入pUC19质粒的HincII位点。其中***一种所述扩增片段的质粒用来转化大肠杆菌JM109。培养获得的转化体,应用QIAGEN质粒微量试剂盒(Qiagen)从所述大肠杆菌细胞纯化具有***DNA的质粒。具有***DNA的质粒用作模板。
在本实施例中使用的引物序列示于序列表的SEQ ID NO:18和19。其中3’-末端的第一个至第三个碱基被核糖核苷酸取代的引物用于本发明的扩增方法。反应混合物的组成如下。
27mM磷酸盐缓冲剂(pH7.3)、0.01%牛血清白蛋白(BSA)、5%DMSO、1mM各dNTP、8mM醋酸镁、60pM各引物、1ng模板DNA,加入无菌蒸馏水至反应体积为48μl。
反应混合物于98℃加热变性1分钟,然后冷却至55℃。然后向其中加入5.5U Bca BEST DNA聚合酶和60U大肠杆菌核糖核酸酶H,使混合物于55℃温育60分钟。然后使混合物于90℃加热2分钟灭活所述酶。取3μl反应混合物在4%NuSieve 3∶1琼脂糖(Takara Shuzo)凝胶上进行电泳。
另一方面,作为对照进行使用PCR方法的扩增。所述反应应用PCR扩增试剂盒(Takara Shuzo)、10pM具有序列表的SEQ ID NO:18或19所示序列的不含核糖核苷酸的各引物、1ng模板DNA,加入无菌蒸馏水至反应体积为50μl。反应条件为25个循环的94℃30秒、55℃30秒和72℃40秒。完成反应后,取3μl反应混合物在4%NuSieve3∶1琼脂糖(Takara Shuzo)凝胶上进行电泳。
结果与PCR方法相比,在本发明的扩增方法中由用作模板的具有150bp或249bp***片段的各质粒扩增获得更多的目的片段。用Microcon-100纯化20μl反应混合物,应用Beckman DU-640分光光度计(Beckman)定量扩增产物的量,以便用数字表示扩增产物的量。证实在本发明的扩增方法中由用作模板的具有150bp***片段的质粒扩增的片段量比PCR方法高约60倍。还证实在本发明的扩增方法中由用作模板的具有250bp***片段的质粒扩增的片段量比PCR方法高约40倍。基于这些结果证实,与常规PCR方法相比,本发明的方法能够更优选用于制备需要大量DNA片段的DNA芯片。
实施例7
(1)制备RNA探针
研究用于检测用本发明的扩增方法获得的扩增片段的方法。制备其中两种不同荧光物质连接到探针的两个末端的核糖核苷酸组成的检测探针。应用DNA合成仪(Applied Biosystems)合成用于检测的RNA探针。所述探针的核苷酸序列示于序列表的SEQ ID NO:20。6-FAM(Glen Research)和TAMRA(Glen Research)分别用作于5’-末端和3’-末端标记探针的荧光物质。
(2)扩增反应和检测
0.1或1ng的pUC19DNA用作模板。其中引物的3’末端的第一个和第二个碱基被核糖核苷酸取代、分别具有序列表的SEQ ID NO:10和8所示序列的pUC19上游150引物和pUC19下游542引物用作引物。
反应混合物的组成如下。
27mM磷酸盐缓冲剂(pH7.3)、0.01%BSA、5%DMSO、1mM各dNTP、8mM醋酸镁、60pM各所述引物、0.1或1ng的模板DNA、0.1μg的RNA探针,加入无菌蒸馏水至48μl反应体积。还制备用作对照的没有模板DNA的反应混合物。
使反应混合物于98℃加热变性1分钟,然后冷却至55℃。向其中加入22U Bca BEST DNA聚合酶或无菌水和60U大肠杆菌核糖核酸酶H,使混合物于55℃温育60分钟。然后在所述混合物中加入5μl10%十二烷基硫酸钠(SDS;Nacalai Tesque)灭活所述酶。用等体积的无菌水稀释50μl反应混合物,然后将其转移到微量板中。应用图象分析仪FM BIO II Multi-View (Takara Shuzo)于激发波长505nm进行检测。
结果当不加入Bca BEST DNA聚合酶时,采用其中任何一种模板均没有检测到荧光信号。当不加入模板DNA时,在含有Bca BEST DNA聚合酶的反应混合物中也没有检测到荧光信号。另一方面,当加入0.1ng或1ng的模板DNA时,均检测到荧光信号。此外,只有当在存在Bca BEST DNA聚合酶下加入0.1ng或1ng模板DNA时,才在含0.00003%溴化乙锭的3%琼脂糖凝胶上经电泳观测到约190bp的目的扩增片段。也就是说,应用RNA探针的检测方法和常规电泳检测方法获得相同的结果。因此,建立了用于检测应用RNA探针通过本发明的扩增方法获得的扩增片段的方法。
实施例8
研究脱氧核糖核苷酸组成的引物用作本发明方法中的所述两种引物之一。具有序列表的SEQ ID NO:19所示序列的MR1N3(30)和具有序列表的SEQ ID NO:58所示序列的M4引物(Takara Shuzo)用作引物。在MR1N3引物中,3’-末端的第一个至第三个碱基被核糖核苷酸取代。反应混合物的组成如下。
27mM磷酸盐缓冲剂(pH7.3)、0.01%牛血清白蛋白(BSA)、5%DMSO、1mM各dNTP、8mM醋酸镁、30pM各引物、1ng的模板DNA,加入无菌蒸馏水至24μl反应体积。
反应混合物于98℃加热变性2分钟,然后冷却至55℃。向其中加入11U Bca BEST DNA聚合酶和30U大肠杆菌核糖核酸酶H使得反应体积为25μl。使反应混合物于55℃温育60分钟。然后使混合物于90℃加热2分钟灭活所述酶。取5μl反应混合物在4%NuSieve 3∶1琼脂糖凝胶上进行电泳。结果观测到目的扩增片段。
实施例9
本发明的方法用来检测出血型大肠杆菌O-157。
在本实施例中使用的引物的序列示于序列表的SEQ ID NO:21-24。为了检测编码大肠杆菌O-157的Vero细胞毒素1或Vero细胞毒素2序列,按照Rinsho To Biseibutsu的介绍(Clinical Microbiology),18(4):507-513(1991)构建具有SEQ ID NO:21或22的序列的引物组合和具有SEQ ID NO:23或24的序列的引物组合。其中3’-末端的第一个至第三个碱基被核糖核苷酸取代的引物用于本发明的扩增方法。如下制得的热提取物用作模板:收获出血型大肠杆菌O-157(ATCC保藏号43895)的培养物,用无菌水以合适细胞密度悬浮,于98℃处理10分钟。反应混合物的组成如下。
27mM磷酸盐缓冲剂(pH7.3)、0.01%牛血清白蛋白(BSA)、5%DMSO、1mM各dNTP、8mM醋酸镁、60pM各引物、相当于104-106细胞的模板DNA(热提取物),加入无菌蒸馏水至48μl反应体积。
反应混合物于98℃加热变性1分钟,然后冷却至55℃。向其中加入5.5U Bca BEST DNA聚合酶和60U大肠杆菌核糖核酸酶H。使反应混合物于55℃温育60分钟。然后使混合物于90℃加热2分钟灭活所述酶。取3μl反应混合物在4%NuSieve 3∶1琼脂糖(Takara Shuzo)凝胶上进行电泳。
结果应用所述两种引物对中的任何一对和相当于104细胞的模板DNA可检测到O-157 Vero细胞毒素1和2,证实本发明的方法可用作检测有毒细菌的方法。
实施例10
研究本发明的方法对长链DNA片段的扩增。如下制备用作模板的双链DNA。首先,按照常规方法应用Uni-ZAP XR载体(Stratagene)由从正常胃组织获得的mRNA构建文库。筛选文库,以选择具有约2.1kbp或约4.3kbp的***片段的克隆。克隆用来通过体外切割获得pBluescript SK(-)嗜菌体载体。应用用作模板的质粒、分别具有序列表SEQ ID NO:25和26所示序列的MCR-F引物和MCR-R引物以及PCR扩增试剂盒(Takara Shuzo)获得约2.2kbp和约4.4kbp的扩增片段。这些PCR片段用作本发明扩增方法的模板。其中3’-末端的第一个至第三个碱基被核糖核苷酸取代、分别具有序列表SEQ ID NO:27和28所示序列的MF2N3(24)引物和MR1N3(24)引物用作引物。反应混合物的组成如下。
28mM磷酸盐缓冲剂(pH7.5)、0.01%牛血清白蛋白(BSA)、1%DMSO、0.5mM各dNTP、4mM醋酸镁、30pM各引物、0.2mM腐胺,加入无菌蒸馏水至24.25μl。反应混合物于92℃处理2分钟,然后冷却至55℃。向其中加入30U核糖核酸酶H和5.5U Bca BESTDNA聚合酶使得反应体积至25μl。使反应混合物温育1小时。完成反应后,混合物于4℃冷却,向其中加入2.5μl的0.5M EDTA溶液中止反应。取5μL混合物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳。
结果用本发明的方法获得约2.2kbp或约4.4kbp的扩增片段,证实本发明的方法能够用来扩增长链DNA片段。
实施例11
生产本发明的扩增方法扩增的约400bp的λDNA片段和PCR扩增的300bp和1000bp的λDNA片段点样其上的DNA微阵列。由GenBank登录号V00636、J02459、M17233和X00906获得λDNA的核苷酸序列。在本实施例中使用的引物的序列示于序列表SEQ IDNO:25-26和29-35。如下制备用于本发明扩增方法的反应混合物。
34mM Tricine-盐酸盐缓冲剂(pH8.7)、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、0.01%牛血清白蛋白(BSA)、1%二甲亚砜、4mM醋酸镁、0.5mM各dNTP、500pM各引物、100ng用作模板的PCR扩增产物、110U Bca BEST DNA聚合酶和300U克隆的核糖核酸酶H,终反应体积为500μl。反应混合物混合至均一,于55℃温育60分钟,然后于90℃加热2分钟灭活所述酶。该溶液用于随后的步骤。点样的DNA片段如下。
1.样品:将应用λDNA作模板和具有序列表SEQ ID NO:29或30所示序列的引物组合获得的PCR扩增产物(300bp)亚克隆入pUC19载体中。然后利用具有序列表SEQ ID NO:25或26所示序列的引物经PCR扩增所述亚克隆产物。由此获得的产物用作模板以及其中所述引物3’-末端的第一个和第二个碱基被核糖核苷酸取代、具有序列表SEQID NO:31或32所示序列的嵌合寡核苷酸引物,用来通过本发明的扩增方法扩增约400bp的产物,以获得样品。5种DNA溶液用来点样,所述DNA溶液为原浓度反应混合物或用碳酸盐缓冲液(在各情况下使用50mM浓度的碳酸盐缓冲液进行稀释)稀释2倍、4倍、8倍或16倍的反应混合物。
2.样品:用Microcon-100(Takara Shuzo)处理上述1扩增的DNA片段。然后用50mM碳酸盐缓冲液将浓度调节为0.125μg/μl、0.25μg/μl、0.5μg/μl、1.0μg/μl和2.0μg/μl而制得5种DNA溶液。
3.阳性对照:以Microcon-100处理应用λ嗜菌体DNA作为模板和具有序列表SEQ ID NO:29或30所示序列的引物的组合获得的PCR扩增产物(300bp)。然后用50mM碳酸盐缓冲液将浓度调节为0.125μg/μl、0.25μg/μl、0.5μg/μl、1.0μg/μl和2.0μg/μl而制得5种DNA溶液。
4.阳性对照:以Microcon-100处理应用λ嗜菌体DNA作为模板和具有序列表SEQ ID NO:33或34所示序列的引物的组合获得的PCR扩增产物(1000bp)。然后用50mM碳酸盐缓冲液将浓度调节为0.125μg/μl、0.25μg/μl、0.5μg/μl和1.0μg/μl而制得4种DNA溶液。
5.阴性对照:将应用λ嗜菌体DNA作为模板和具有序列表SEQID NO:33或35所示序列的引物的组合获得的PCR扩增产物(300bp)亚克隆入pUC19载体中。然后应用具有序列表SEQ ID NO:25或26所示序列的引物经PCR扩增亚克隆产物。由此获得的产物用作模板以及具有序列表SEQ ID NO:31或32所示序列的引物用作引物,将它们用来通过本发明的扩增方法扩增约400bp的产物,以获得阴性对照。5种DNA溶液用来点样,所述DNA溶液为原浓度反应混合物或用碳酸盐缓冲液(在各情况下使用50mM浓度的碳酸盐缓冲液进行稀释)稀释2倍、4倍、8倍或16倍的反应混合物。
6.阴性对照:用Microcon-100(Takara Shuzo)处理上述5获得的DNA片段。然后用50mM碳酸盐缓冲液将浓度调节为0.125μg/μl、0.25μg/μl、0.5μg/μl、1.0μg/μl和2.0μg/μl而制得5种DNA溶液。
将如此制备的相应DNA溶液点样在应用制备DNA芯片的设备(Genetic Microsystems(GMS))加入氨基的载玻片(Matsunami Glass)上,而且利用UV辐射固定。载玻片用0.2%SDS洗涤,然后用蒸馏水洗涤,干燥后用作DNA阵列。
应用LabelIT Cy5R标记试剂盒(Takara Shuzo)使利用序列表SEQID NO:29或30所示序列的引物的组合获得的PCR扩增产物(300bp)标记上Cy5,以用作探针。按照IntelliGene(Takara Shuzo)附带的说明书介绍,应用一种预杂交溶液和一种杂交溶液进行杂交。首先,使DNA阵列于室温下预杂交2小时。将含有变性Cy5标记探针的杂交溶液滴在DNA阵列上。在其上盖上盖玻片。用膜密封盖玻片。密封的DNA阵列于65℃温育13小时。去除盖玻片后,所述DNA阵列以2×SSC于65℃洗涤5分钟,在含0.2×SSC和0.1%SDS的溶液中于65℃洗涤5分钟,最后在0.2×SSC中于室温下洗涤5分钟,风干。然后用微阵列扫描仪(GMS)分析DNA阵列相应斑点的荧光信号。
结果在点样PCR方法(上述3和4所述的阳性对照)和本发明方法(上述1和2所述的样品)扩增的片段的各部位观测到荧光信号。信号强度如下:样品2>阳性对照4>样品1>阳性对照3。反之,在阴性对照5和6的所有部位均未观测到信号。这些结果证实,本发明方法扩增的非纯化或纯化DNA片段可优选用作制备DNA芯片的待固定DNA片段。
实施例12
(1)研究其中PCR扩增的片段用作模板的本发明方法使用的引物的设计。首先,按照常规方法合成具有序列表SEQ ID NO:36-41所示序列之一的引物。相应引物的结构如下。
(i)R1-S1引物:自5’-末端为7个碱基的间隔序列、17个碱基的M13RV序列(或RV序列;M13RV引物的核苷酸序列(Takara Shuzo))和20个碱基的有义引物序列,用于λDNA特异性PCR;
(ii)R1-A3引物:自5’-末端为7个碱基的间隔序列、17个碱基的M13RV序列和20个碱基的反义引物序列,用于λDNA特异性PCR;
(iii)R2-S1引物:自5’-末端为25个碱基的间隔序列、17个碱基的M13RV序列和20个碱基的有义引物序列,用于λDNA特异性PCR;
(iv)R2-A3引物:自5’-末端为25个碱基的间隔序列、17个碱基的M13RV序列和20个碱基的反义引物序列,用于λDNA特异性PCR;
(v)R3-S1引物:自5’-末端为58个碱基的间隔序列、17个碱基的M13RV序列和20个碱基的有义引物序列,用于λDNA特异性PCR;和
(vi)R3-A3引物:自5’-末端为58个碱基的间隔序列、17个碱基的M13RV序列和20个碱基的反义引物序列,用于λDNA特异性PCR。
M13RV 20mer具有17个碱基的M13RV序列和5’-末端的3个碱基组成的总共20个碱基的序列。因此,当M13RV 20mer用于本发明方法时,上述引物的间隔序列长度分别为4个碱基、22个碱基和55个碱基。还制备没有间隔序列的引物用作上述引物的对照。
例如当使用引物对R1-S1引物/R1-A3引物时,获得348bp的扩增片段。在扩增片段两端的7个碱基相当于间隔部分。RV序列位于间隔部分的内部。λDNA序列位于RV序列内部。
同样,当使用引物对R2-S1引物/R2-A3引物时,获得其中扩增片段两端的25个碱基相当于间隔部分的384bp的扩增片段。另外,当使用引物对R3-S1引物/R3-A3引物时,获得其中扩增片段两端的58个碱基相当于间隔部分的450bp的扩增片段。反之,使用对照引物的扩增片段没有间隔部分。这些PCR扩增片段用作随后检测的模板。
两种引物之一即M13RV-2N 17mer引物或M13RV-2N 20mer具有序列表SEQ ID NO:42或43所示序列,它们用于本实施例。在所述引物中,3’-末端的第一个和第二个碱基被核糖核苷酸取代。如下进行反应。5μl的20μM引物、约20ng模板和0.01%丙邻二胺的混合物于98℃变性2分钟,然后冷却至55℃。向其中加入34mM Tricine缓冲剂(pH8.7)、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、0.01%BSA、1%DMSO、4mM醋酸镁、0.5mM各dNTP、1U Bca BEST DNA聚合酶和15U核糖核酸酶H,使得终反应体积为25μl。使反应混合物于55℃温育1小时。反应完成后,使混合物冷却至4℃,然后向其中加入2.5μl 0.5M EDTA溶液中止反应。取3μl反应混合物在3%NuSieve3∶1琼脂糖(Takara Shuzo)凝胶上进行电泳。结果当使用M13RV-2N17mer时,观测到扩增效率增加与间隔序列长度关系如下:25mer>7mer>58mer>无间隔序列。当使用M13RV-2N 20mer时,观测到扩增效率增加与间隔序列长度的关系如下:22mer>4mer>55mer>无间隔序列。此外,当上述(i)-(vi)的引物中的M13RV序列被M13M4序列取代时,观测到间隔序列和扩增效率关系的相似趋势。因此证实当线性DNA片段如PCR扩增片段用作模板时,设计产生间隔序列(部分)的用于本发明方法的引物使扩增效率提高。
(2)研究利用提高反应温度以扩增核苷酸序列的方法扩增具有高GC含量的模板。首先,制备具有序列表SEQ ID NO:44或45所示序列的引物,用于PCR扩增CDC2-相关蛋白激酶PISS LRE基因(GenBank登录号AA789328)的307-bp区段(GC含量:62.5%)。另外,制备具有序列表SEQ ID NO:46或47所示序列的引物,用于PCR扩增II型细胞骨架I角蛋白基因(GenBank登录号AA706022)的284-bp区段(GC含量:61.3%)。利用这些引物和市售DNA片段(Research Genetics)用作模板进行PCR扩增。应用上述引物对获得的相应PCR扩增片段在两端具有间隔序列和M13RV序列。所述片段用作本发明的模板。
具有序列表SEQ ID NO:42所示序列的M13RV-2N 17mer引物或具有序列表SEQ ID NO:43所示序列的M13RV-2N 20mer引物用于本实施例。在所述引物中,3’-末端的第一个和第二个碱基被核糖核苷酸取代。如下进行反应。10μl的100pM引物、20ng模板和0.01%丙邻二胺的混合物于98℃变性2分钟,然后冷却至55℃或60℃。然后向其中加入34mM Tricine缓冲剂(pH8.7)、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、0.01%BSA、1%DMSO、4mM醋酸镁、0.5mM各dNTP、11U Bca BEST DNA聚合酶和30U核糖核酸酶H,使得终反应体积为50μl。使反应混合物于55℃或60℃温育1小时。反应完成后,使混合物冷却至4℃。取3μl反应混合物在3%琼脂糖凝胶上进行电泳。结果见下表1。
表1
反应温度 | 所用引物 | 基因和扩增结果 | |
CDC2-相关的 | II型细胞骨架 | ||
55℃ | M13RV-2N 17merM13RV-2N 20mer | ++++ | ++++ |
60℃ | M13RV-2N 17merM13RV-2N 20mer | +++++ | ++++ |
+至++++:以4级别评价扩增程度。
-:没有观测到扩增。
如表1所示,即使使用具有高GC含量的模板,也有效扩增目的区段。如下完成该扩增:升高反应温度(从55℃升高至60℃)和当反应于60℃进行时,使用具有高Tm值(相对于反应于55℃的最适引物)的引物。
(3)研究扩增片段的长度和在高反应温度条件下扩增核苷酸序列方法的扩增产物量之间的关系。首先,按照常规方法合成具有序列表SEQ ID NO:48或49所示序列的引物对,用于扩增λDNA的800-bp区段(Takara Shuzo),以及具有序列表SEQ ID NO:50或51所示序列的引物对,用于扩增λDNA的400-bp区段。采用这两种引物对之一和λDNA用作模板进行PCR,以获得扩增片段。还采用实施例5(1)所述的pUC19-911质粒用作模板以及MF2(24)引物和MR1(24)引物制备约1.1kbp的扩增片段,所述引物分别具有序列表SEQ ID NO:16和17所示的序列。应用上述引物对经PCR扩增获得的片段在两端具有间隔序列和M13RV或MR序列。这些片段用作本发明的模板。
具有序列表SEQ ID NO:42所示序列的M13RV-2N 17mer引物或具有序列表SEQ ID NO:43所示序列的M13RV-2N 20mer引物用作本实施例的引物。在所述引物中,3’-末端的第一个和第二个碱基被核糖核苷酸取代。具有序列表SEQ ID NO:55所示序列的M13M4-3N 20mer引物和具有序列表SEQ ID NO:43所示序列的M13RV-3N 20mer引物的组合,以及分别具有序列表SEQ ID NO:56和57所示序列的M13M4-3N 24mer引物和M13RV-3N 24mer引物的组合,用于扩增约1kbp的区段。在所述引物中,3’-末端的第一个至第三个碱基被核糖核苷酸取代。如下进行反应。使10μl的10pM引物、约20ng模板和0.01%丙邻二胺的混合物于98℃变性2分钟,然后冷却至55℃或60℃。此后向其中加入34mM Tricine缓冲剂(pH8.7)、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、0.01%BSA、1%DMSO、4mM醋酸镁、0.5mM各dNTP、11 U Bca BEST DNA聚合酶和30U核糖核酸酶H,使终反应体积为50μl。使反应混合物于55℃或60℃温育1小时。完成反应后,使混合物冷却至4℃,然后向其中加入5μl 0.5M EDTA溶液中止反应。取3μl反应混合物在3%NuSieve 3∶1琼脂糖(Takara Shuzo)凝胶上进行电泳。结果见下表2和3。
表2
反应温度 | 所用引物 | 扩增片段的长度和结果 | |
400bp | 800bp | ||
55℃ | M13RV-2N 17merM13RV-2N 20mer | ++++ | ++++ |
60℃ | M13RV-2N 17merM13RV-2N 20mer | +++++ | ++++ |
+至++++:以4级别评价扩增程度。
-:没有观测到扩增。
如表2所示,通过使扩增引物长度由17mer成为20mer和使反应温度从55℃升高至60℃有效扩增400bp和800bp区段的片段。
表3
反应温 | 所用引物 | 扩增片段的长度和结果1034bp |
55℃ | M13RV-3N20mer & M13M4-3N20merM13RV-3N24mer & M13M4-3N24mer | ++++ |
65℃ | M13RV-3N20mer & M13M4-3N20merM13RV-3N24mer & M13M4-3N24mer | +++++ |
+至++++:以4级别评价扩增程度。
-:没有观测到扩增。
此外,如表3所示,通过使扩增引物长度由20mer延长为24mer和使反应温度从55℃升高至65℃有效扩增约1kbp区段的片段。另外,利用更长的引物和反应温度升高,与实施例10所述一样,对长链DNA片段的扩增获得相似的结果。当扩增约2kbp或更长的区段时,观测到扩增效率提高。
实施例13
(1)研究耐热DNA聚合酶而不是Bca BEST DNA聚合酶在本发明方法中的应用。Bst DNA聚合酶(New England Biolabs)用作耐热DNA聚合酶。按照常规方法合成分别具有序列表SEQ ID NO:52和53所示序列的一对引物5’-ID引物和3’-ID引物。应用所述引物对和A细胞周期蛋白基因的市售DNA片段(Research Genetics)用作模板进行PCR,获得约300bp的扩增片段。应用所述引物对获得PCR扩增片段在两端具有M13RV序列。所述片段用作本发明的模板。
具有序列表SEQ ID NO:42所示序列的M13RV-2N 17mer引物用作本实施例的引物。在所述引物中,3’-末端的第一个和第二个碱基被核糖核苷酸取代。如下进行反应。使10μl的20μM引物、约20ng模板和0.01%丙邻二胺的混合物于98℃变性2分钟,然后冷却至55℃。此后向其中加入34mM Tricine缓冲剂(pH8.7)、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、0.01%BSA、1%DMSO、4mM醋酸镁、0.5mM各dNTP、4、8、12或16U Bst DNA聚合酶和30U核糖核酸酶H,使终反应体积为50μl。作为对照,制备与上述反应混合物组成相同的反应混合物,不同的是使用11U Bca BEST DNA聚合酶。使反应混合物于55℃温育1小时。完成反应后,使混合物冷却至4℃,然后向其中加入5μl 0.5M EDTA溶液中止反应。取3μl反应混合物在3%NuSieve 3∶1琼脂糖(Takara Shuzo)凝胶上进行电泳。结果应用各所述不同单位的Bst DNA聚合酶获得目的扩增片段。因此证实耐热DNA聚合酶优选用于本发明的方法。
(2)研究嗜温DNA聚合酶在本发明方法中的应用。5’-3’外切活性(-)的Klenow片段(Takara Shuzo)用作嗜温DNA聚合酶。上述(1)制备的DNA用作本发明方法的模板DNA。
具有序列表SEQ ID NO:54所示序列的M13RV-2N 16mer引物用作本实施例的引物。在所述引物中,3’-末端的第一个和第二个碱基被核糖核苷酸取代。如下进行反应。使10μl的20μM引物、约20ng模板和0.01%丙邻二胺的混合物于98℃变性2分钟,然后冷却至40℃。此后向其中加入34mM Tricine缓冲剂(pH8.7)、10mM氯化钾、10mM硫酸铵、0.01%BSA、1%DMSO、4mM醋酸镁、0.5mM各dNTP、0、2、4、6或8U Klenow片段和30U核糖核酸酶H,使终反应体积为50μl。使反应混合物于40℃温育1小时。完成反应后,使混合物冷却至4℃,然后向其中加入5μl 0.5M EDTA溶液中止反应。取3μl反应混合物在3%NuSieve 3∶1琼脂糖(Takara Shuzo)凝胶上进行电泳。结果除了不加入Klenow片段时之外,应用不同单位的Klenow片段均获得目的扩增片段。因此证实嗜温DNA聚合酶可优选用于本发明的方法。
实施例14
研究将用于本发明方法的嵌合寡核苷酸引物。如实施例1(1)所述合成模板DNA和引物。用于本实施例的引物的结构详细介绍如下:
引物对1:具有序列表的SEQ ID NO:2或3所示核苷酸序列而且全部由脱氧核糖核苷酸组成的引物组合;
引物对2:其中3’-末端的第六个和第七个脱氧核糖核苷酸被核糖核苷酸取代的具有序列表SEQ ID NO:59或60所示核苷酸序列的引物组合;
引物对3:其中3’-末端的第五个和第六个脱氧核糖核苷酸被核糖核苷酸取代的具有序列表SEQ ID NO:61或62所示核苷酸序列的引物组合;
引物对4:其中3’-末端的第四个和第五个脱氧核糖核苷酸被核糖核苷酸取代的具有序列表SEQ ID NO:63或64所示核苷酸序列的引物组合;
引物对5:其中3’-末端的第三个和第四个脱氧核糖核苷酸被核糖核苷酸取代的具有序列表SEQ ID NO:65或66所示核苷酸序列的引物组合;
引物对6:其中3’-末端的第二个和第三个脱氧核糖核苷酸被核糖核苷酸取代的具有序列表SEQ ID NO:67或68所示核苷酸序列的引物组合;
引物对7:其中3’-末端的第一个和第二个脱氧核糖核苷酸被核糖核苷酸取代的具有序列表SEQ ID NO:2或3所示核苷酸序列的引物组合;以及
引物对8:其中3’-末端的第二个和第三个脱氧核糖核苷酸被核糖核苷酸取代而且3’-末端第三个核糖核苷酸的5’-末端侧的磷酸键被硫代磷酸键取代、具有序列表SEQ ID NO:67或68所示核苷酸序列的引物组合。
扩增条件和检测方法如实施例1(2)和(3)所述。结果各引物对2-8观测到具有目的长度的扩增片段。对于引物对2-7,扩增产物量随3’-末端的脱氧核糖核苷酸数的减少而增加。在3’-末端没有脱氧核糖核苷酸的引物对7观测到最高量的扩增产物。尤其是观测到在3’-末端没有脱氧核糖核苷酸的引物对7的扩增产物最多。反之,在引物对1没有观测到扩增片段。此外,在引物对6和8二者均观测到目的扩增片段的事实证实,修饰核糖核苷酸和非修饰核糖核苷酸二者均可优选用作本发明方法中的引物含有的核糖核苷酸。
工业适用性
本发明提供扩增核苷酸序列的常规有效方法,其特征在于在存在嵌合寡核苷酸引物下进行DNA合成反应。本发明提供大量供应扩增DNA片段的方法。还通过联合本发明的扩增核苷酸序列的方法和另一种核酸扩增方法,提供扩增核苷酸序列的有效方法。此外,本发明提供用于检测或定量微生物如病毒、细菌、真菌和酵母的检测核苷酸序列的方法以及实时检测本发明方法获得的扩增DNA片段的方法。另外,本发明提供大规模基因测序的方法。
序列表独立文本
SEQ ID NO:1:用作模板的相当于人转铁蛋白受体编码序列的一部分的合成DNA。
SEQ ID NO:2:设计用于扩增人转铁蛋白受体编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:3:设计用于扩增人转铁蛋白受体编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:4:设计用作检测人转铁蛋白受体编码序列的扩增部分的探针的寡核苷酸。
SEQ ID NO:5:设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物,称为pUC19上游(2)NN。
SEQ ID NO:6:设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物,称为pUC19下游NN。
SEQ ID NO:7:设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:8:设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物,称为pUC19下游542。
SEQ ID NO:9:设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:10:设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物,称为pUC19上游150。
SEQ ID NO:11:设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物,称为pUC19上游249。
SEQ ID NO:12:设计用于扩增人转铁蛋白受体编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:13:设计用于扩增人转铁蛋白受体编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:14:设计用于扩增人转铁蛋白受体编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:15:设计用于扩增人转铁蛋白受体编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:16:设计用于扩增质粒pUC19-249或质粒pUC19-911的一部分的寡核苷酸引物,称为MF2N3(24)。
SEQ ID NO:17:设计用于扩增质粒pUC19-249或质粒pUC19-911的一部分的寡核苷酸引物,称为MR1N3(24)。
SEQ ID NO:18:设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:19:设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物,称为MR1N3。
SEQ ID NO:20:用作检测质粒pUC19的扩增部分的探针的合成RNA。
SEQ ID NO:21:设计用于扩增出血型大肠杆菌O-157的Vero细胞毒素1编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:22:设计用于扩增出血型大肠杆菌O-157的Vero细胞毒素1编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:23:设计用于扩增出血型大肠杆菌O-157的Vero细胞毒素2编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:24:设计用于扩增出血型大肠杆菌O-157的Vero细胞毒素2编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:25:设计用于扩增长DNA片段的寡核苷酸引物,称为MCR-F。
SEQ ID NO:26:设计用于扩增长DNA片段的寡核苷酸引物,称为MCR-R。
SEQ ID NO:27:设计用于扩增长DNA片段的寡核苷酸引物,称为MF2N3(24)。
SEQ ID NO:28:设计用于扩增长DNA片段的寡核苷酸引物,称为MR1N3(24)。
SEQ ID NO:29:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:30:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:31:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:32:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:33:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:34:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:35:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:36:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物,称为R1-S1。
SEQ ID NO:37:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物,称为R1-A3。
SEQ ID NO:38:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物,称为R2-S1。
SEQ ID NO:39:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物,称为R2-A3。
SEQ ID NO:40:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物,称为R3-S1。
SEQ ID NO:41:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物,称为R3-A3。
SEQ ID NO:42:称为M13RV-2N 17mer的设计寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:43:称为M13RV-2N 20mer的设计寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:44:设计用于扩增CDC2相关蛋白激酶PISSLRE基因的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:45:设计用于扩增CDC2相关蛋白激酶PISSLRE基因的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:46:设计用于扩增II型细胞骨架11角蛋白基因的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:47:设计用于扩增II型细胞骨架11角蛋白基因的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:48:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:49:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:50:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:51:设计用于扩增λ嗜菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:52:设计用于扩增A细胞周期蛋白DNA的一部分的寡核苷酸引物,称为5’ID。
SEQ ID NO:53:设计用于扩增A细胞周期蛋白DNA的一部分的寡核苷酸引物,称为3’ID。
SEQ ID NO:54:称为M13RV-2N 16mer的设计寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:55:称为M13M4-3N 16mer的设计寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:56:称为M13M4-3N 24mer的设计寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:57:称为M13RV-3N 24mer的设计寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:58:称为M13M417mer的设计寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:59:设计用于扩增人转铁蛋白受体编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:60:设计用于扩增人转铁蛋白受体编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:61:设计用于扩增人转铁蛋白受体编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:62:设计用于扩增人转铁蛋白受体编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:63:设计用于扩增人转铁蛋白受体编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:64:设计用于扩增人转铁蛋白受体编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:65:设计用于扩增人转铁蛋白受体编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:66:设计用于扩增人转铁蛋白受体编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:67:设计用于扩增人转铁蛋白受体编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
SEQ ID NO:68:设计用于扩增人转铁蛋白受体编码序列的一部分的寡核苷酸引物。
序列表
<110>Takara Shuzo Co..Ltd.
<120>用于扩增核苷酸序列的方法
<130>661724
<150>JP 11-076966
<151>1999-03-19
<150>JP 11-370035
<151>1999-12-27
<160>68
<210>1
<211>99
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用作模板的相当于一部分的人转铁蛋白受体编码序列的合成DNA
<400>1
ggacagcaac tgggccagca aagttgagaa actcacttta gagaattctg ctttcccttt 60
ccttgcatat tctgagcagt ttctttctgt ttttgcgag 99
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增一部分的人转铁蛋白受体编码序列的寡核苷酸引物
<400>2
cagcaactgg gccagcaaag tt 22
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增一部分的人转铁蛋白受体编码序列的寡核苷酸引物
<400>3
gcaaaaacag aaagaaactg ct 22
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用作检测人转铁蛋白受体编码序列的扩增部分的探针的寡核苷酸
<400>4
tgctttccct ttccttgcat attctg 26
<210>5
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物,称为pUC19上游(2)NN
<400>5
attgcttaat cagtgaggca cctat 25
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物,称为pUC19下游NN
<400>6
gataacactg cggccaactt acttc 25
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物
<400>7
actggcgaac tacttactct agctt 25
<210>8
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物,称为pUC19下游542
<400>8
agtcaccaga aaagcatctt acggat 26
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物
<400>9
gctcatgaga caataaccct gataa 25
<210>10
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物,称为pUC19上游150
<400>10
ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatg 25
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物,称为pUC19上游249
<400>11
cgcctccatc cagtctatta attgt 25
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增一部分的人转铁蛋白受体编码序列的寡核苷酸引物
<400>12
ctgattgaga ggattcctga gt 22
<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增一部分的人转铁蛋白受体编码序列的寡核苷酸引物
<400>13
tagggagaga ggaagtgata ct 22
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增一部分的人转铁蛋白受体编码序列的寡核苷酸引物
<400>14
caacttcaag gtttctgcca gc 22
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增一部分的人转铁蛋白受体编码序列的寡核苷酸引物
<400>15
aatagtccaa gtagctagag c 21
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增质粒pUC19-249或质粒pUC19-911的一部分的寡核苷酸引物,称为MF2N3(24)
<400>16
gctgcaaggc gattaagttg ggta 24
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增质粒pUC19-249或质粒pUC19-911的寡核苷酸引物,称为MR1N3(24)
<400>17
ctttatgctt ccggctcgta tgtt 24
<210>18
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物
<400>18
ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta 30
<210>19
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增质粒pUC19的一部分的寡核苷酸引物,称为MR1N3
<400>19
tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt 30
<210>20
<211>30
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223>用作检测质粒pUC19的扩增部分的探针的合成RNA
<400>20
ugauccccca uguugugcaa aaaagcgguu 30
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增出血型大肠杆菌0-157的Vero细胞毒素1编码序列的一部分的寡核苷酸引物
<400>21
agttaatgtg gtggcgaa 18
<210>22
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增出血型大肠杆菌0-157的Vero细胞毒素1编码序列的一部分的寡核苷酸引物
<400>22
gactcttcca tctgcca 17
<210>23
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增出血型大肠杆菌0-157的Vero细胞毒素2编码序列的一部分的寡核苷酸引物
<400>23
ttcggtatcc tattcccg 18
<210>24
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增出血型大肠杆菌0-157的Vero细胞毒素2编码序列的一部分的寡核苷酸引物
<400>24
tctctggtca ttgtatta 18
<210>25
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增长DNA片段的寡核苷酸引物,称为MCR-F
<400>25
ccattcaggc tgcgcaactg tt 22
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增长DNA片段的寡核苷酸引物,称为MCR-R
<400>26
tggcacgaca ggtttcccga ct 22
<210>27
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增长DNA片段的寡核苷酸引物,称为MF2N3(24)
<400>27
gctgcaaggc gattaagttg ggta 24
<210>28
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增长DNA片段的寡核苷酸引物,称为MR1N3(24)
<400>28
ctttatgctt ccggctcgta tgtt 24
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物
<400>29
aacaacaaga aactggtttc 20
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物
<400>30
gcaatgcatg acgactgggg 20
<210>31
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物
<400>31
gttttcccag tcacgac 17
<210>32
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物
<400>32
caggaaacag ctatgac 17
<210>33
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物
<400>33
gtacggtcat catctgacac 20
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物
<400>34
gcaatcggca tgt taaacgc 20
<210>35
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物
<400>35
cgccatcctg ggaagactcc 20
<210>36
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物,称为R1-S1
<400>36
tttcacacag gaaacagcta tgacaacaac aagaaactgg tttc 44
<210>37
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物,称为R1-A3
<400>37
tttcacacag gaaacagcta tgacgcaatg catgacgact gggg 44
<210>38
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物,称为R2-S1
<400>38
attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acaacaacaa gaaactggtt 60
tc 62
<210>39
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物,称为R2-A3
<400>39
attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acgcaatgca tgacgactgg 60
gg 62
<210>40
<211>95
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物,称为R3-S1
<400>40
cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 60
ggaaacagct atgacaacaa caagaaactg gtttc 95
<210>41
<211>95
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物,称为R3-A3
<400>41
cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 60
ggaaacagct atgacgcaat gcatgacgac tgggg 95
<210>42
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物,称为M13RV-2N 17mer
<400>42
caggaaacag ctatgac 17
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物,称为M13RV-2N 20mer
<400>43
acacaggaaa cagctatgac 20
<210>44
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增CDC2相关蛋白激酶PISSLRE基因的一部分的寡核苷酸引物
<400>44
gagttcgtgt ccgtacaact atttcacaca ggaaacagct atgacccaac aagagcctat 60
agcttcgctc 70
<210>45
<211>67
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增CDC2相关蛋白激酶PISSLRE基因的一部分的寡核苷酸引物
<400>45
tcgaaatcag ccacagcgcc atttcacaca ggaaacagct atgacccgct gtctttgagt 60
tgtggtg 67
<210>46
<211>70
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增II型细胞骨架角蛋白11基因的一部分的寡核苷酸引物
<400>46
gagttcgtgt ccgtacaact atttcacaca ggaaacagct atgacgctat tctgacatca 60
ctttccagac 70
<210>47
<211>66
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增II型细胞骨架角蛋白11基因的一部分的寡核苷酸引物
<400>47
tcgaaatcag ccacagcgcc atttcacaca ggaaacagct atgacgaatt ccactggtgg 60
cagtag 66
<210>48
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物
<400>48
attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acgtacggtc atcatctgac 60
ac 62
<210>49
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物
<400>49
attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acatgcgccg cctgaaccac 60
ca 62
<210>50
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物
<400>50
attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acctgctctg ccgcttcacg 60
ca 62
<210>51
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增λ噬菌体DNA的一部分的寡核苷酸引物
<400>51
attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg acgcaatcgg catgttaaac 60
gg 62
<210>52
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增A细胞周期蛋白DNA的一部分的寡核苷酸引物,称为5’ID
<400>52
tcgaaatcag ccacagcgcc atttcacaca ggaaacagct atgacatgtt ttgggagaat 60
taagtctga 69
<210>53
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增A细胞周期蛋白DNA的一部分的寡核苷酸引物,称为3’ID
<400>53
gagttcgtgc cgtacaacta tttcacacag gaaacagcta tgacttacag atttagtgtc 60
tctggtggg 69
<210>54
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物,称为M13RV-2N 16mer
<400>54
aggaaacagc tatgac 16
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物,称为M13M4-3N 16mer
<400>55
agggttttcc cagtcacgac 20
<210>56
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物,称为M13M4-3N 24mer
<400>56
cgccagggtt ttcccagtca cgac 24
<210>57
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物,称为M13RV-3N 24mer
<400>57
tttcacacag gaaacagcta tgac 24
<210>58
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计的寡核苷酸引物,称为M13M4
<400>58
gttttcccag tcacgac 17
<210>59
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增一部分的人转铁蛋白受体编码序列的寡核苷酸引物
<400>59
cagcaactgg gccagcaaag ttgagaa 27
<210>60
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增一部分的人转铁蛋白受体编码序列的寡核苷酸引物
<400>60
gcaaaaacag aaagaaactg ctcagaa 27
<210>61
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增一部分的人转铁蛋白受体编码序列的寡核苷酸引物
<400>61
cagcaactgg gccagcaaag ttgaga 26
<210>62
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增一部分的人转铁蛋白受体编码序列的寡核苷酸引物
<400>62
gcaaaaacag aaagaaactg ctcaga 26
<210>63
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增一部分的人转铁蛋白受体编码序列的寡核苷酸引物
<400>63
cagcaactgg gccagcaaag ttgag 25
<210>64
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增一部分的人转铁蛋白受体编码序列的寡核苷酸引物
<400>64
gcaaaaacag aaagaaactg ctcag 25
<210>65
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增一部分的人转铁蛋白受体编码序列的寡核苷酸引物
<400>65
cagcaactgg gccagcaaag ttga 24
<210>66
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增一部分的人转铁蛋白受体编码序列的寡核苷酸引物
<400>66
gcaaaaacag aaagaaactg ctca 24
<210>67
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增一部分的人转铁蛋白受体编码序列的寡核苷酸引物
<400>67
cagcaactgg gccagcaaag ttg 23
<210>68
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>设计用于扩增一部分的人转铁蛋白受体编码序列的寡核苷酸引物
<400>68
gcaaaaacag aaagaaactg ctc 23
Claims (46)
1.一种扩增核苷酸序列或大量生产核酸的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)通过混合模板核酸、三磷酸脱氧核糖核苷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和切割由引物产生的延伸链的内切核酸酶制备反应混合物,其中所述引物为与所述模板核酸的核苷酸序列基本互补而且包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于所述引物的3’-末端或3’-末端侧上;以及
(b)在所述引物可特异性地退火至模板核酸上、发生延伸链合成反应和所述DNA聚合酶的链置换反应以及内切核酸酶切割延伸链的反应的条件下,温育反应混合物足够时间,以产生反应产物。
2.权利要求1的方法,其中所述内切核酸酶在含有所述核糖核苷酸的位点进行切割。
3.权利要求1的方法,其中恒温温育所述反应混合物。
4.权利要求1的方法,其中所述反应混合物还含有具有与所述模板核酸的核苷酸序列同源的序列的嵌合寡核苷酸引物。
5.一种扩增核苷酸序列或大量生产核酸的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)用至少一种与所述核酸的核苷酸序列基本互补的引物和DNA聚合酶处理模板核酸,以合成与所述模板互补的引物延伸链,其中所述引物为包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物,所述核糖核苷酸位于所述引物的3’-末端或3’-末端侧上;
(b)用所述内切核酸酶在包含所述核糖核苷酸的位点切割步骤(a)获得的双链核酸的引物延伸链;以及
(c)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸引物部分的3’-末端延伸与所述模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(b)获得的引物延伸链实现链置换。
6.权利要求5的方法,其中连续重复步骤(b)和步骤(c)。
7.权利要求5的方法,其中步骤(b)重复使用含有重新产生的引物延伸链的双链核酸,所述方法还包括下述步骤:
(d)用至少一种不同于步骤(a)使用的引物和DNA聚合酶处理步骤(c)获得的释放置换链,以合成与所述置换链互补的引物延伸链,其中所述不同于步骤(a)使用的引物为嵌合寡核苷酸引物,该引物与所述置换链的核苷酸序列基本互补而且含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸,所述核糖核苷酸位于所述引物的3’-末端或3’-末端侧上;
(e)用所述内切核酸酶在含有所述核糖核苷酸的位点切割步骤(d)获得的双链核酸的引物延伸链;以及
(f)用具有链置换活性的DNA聚合酶,从所述双链核酸的引物部分的3’-末端延伸与所述模板互补的核苷酸序列,其中切割步骤(e)获得的引物延伸链实现链置换,其中步骤(e)重复使用含有重新产生的引物延伸链的双链核酸。
8.权利要求5的方法,其中恒温进行所述相应步骤。
9.权利要求1或5的方法,其中使用一种具有链置换活性的DNA聚合酶。
10.权利要求1或5的方法,其中所述核酸核苷酸的定位便于内切核酸酶切割。
11.权利要求1或5的方法,其中所述DNA聚合酶选自大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段、嗜热脂肪芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bst DNA聚合酶和热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶。
12.权利要求1或5的方法,其中所述内切核酸酶为内切核糖核酸酶。
13.权利要求12的方法,其中所述内切核糖核酸酶为核糖核酸酶H。
14.权利要求1或5的方法,其中所述嵌合寡核苷酸引物包含2个或2个以上连续核糖核苷酸残基。
15.权利要求1或5的方法,其中所述嵌合寡核苷酸引物含有1个或1个以上修饰核糖核苷酸。
16.权利要求15的方法,其中所述嵌合寡核苷酸引物包含其中与所述核糖核苷酸的α-位磷原子键合的氧原子被硫原子取代的(α-S)核糖核苷酸。
17.权利要求1或5的方法,其中所述用作模板的核酸是单链DNA或双链DNA。
18.权利要求17的方法,它在用作模板的双链DNA转化为单链DNA后进行。
19.权利要求17的方法,其中所述用作模板的核酸为RNA通过反转录反应获得的cDNA。
20.权利要求19的方法,它在用RNA作为模板通过反转录反应合成cDNA后进行。
21.权利要求20的方法,其中选自寡聚dT引物、随机引物和特异性引物的引物用作所述反转录反应的引物。
22.权利要求19的方法,其中嵌合寡核苷酸引物用作所述反转录反应的引物。
23.权利要求19的方法,其中具有反转录酶活性的DNA聚合酶用作反转录酶。
24.权利要求19的方法,其中采用一种具有反转录酶活性和链置换活性的DNA聚合酶进行所述反转录反应以及与所述模板互补的延伸链的合成。
25.权利要求24的方法,其中所述DNA聚合酶是嗜热脂肪芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bst DNA聚合酶或热坚芽孢杆菌的缺乏5’→3’外切核酸酶的Bca DNA聚合酶。
26.权利要求19的方法,其中在所述反转录反应中用作模板的RNA是利用核酸扩增反应扩增的RNA。
27.权利要求26的方法,它在用RNA作为模板通过核酸扩增反应合成扩增RNA片段后进行。
28.权利要求26的方法,其中所述核酸扩增反应选自基于转录的扩增***(TAS)方法、自我持续序列复制(3SR)方法、基于核酸序列的扩增(NASBA)方法、转录介导的扩增(TMA)方法和Qβ复制酶方法。
29.权利要求17的方法,其中所述模板核酸为核酸扩增反应获得的DNA。
30.权利要求29的方法,它在用DNA作为模板通过核酸扩增反应合成扩增DNA片段后进行。
31.权利要求30的方法,其中所述核酸扩增反应选自聚合酶链式反应(PCR)方法、连接酶链式反应(LCR)方法和链置换扩增(SDA)方法。
32.权利要求26的方法,其中随机引物或简并引物用于所述核酸扩增反应。
33.权利要求32的方法,其中所述随机引物或简并引物是至少在3’-末端或3’-末端侧上具有随机序列或简并序列的引物。
34.权利要求29的方法,其中随机引物或简并引物用于所述核酸扩增反应。
35.权利要求34的方法,其中所述随机引物或简并引物是至少在3’-末端或3’-末端侧上具有随机序列或简并序列的引物。
36.一种用于权利要求1或5的扩增核苷酸序列或大量生产核酸的方法的嵌合寡核苷酸引物,它包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸而且具有其中所述核糖核苷酸位于所述引物的3’-末端或在3’-末端侧上的结构。
37.权利要求36的嵌合寡核苷酸引物,它含有2个或2个以上连续核糖核苷酸残基。
38.权利要求36的嵌合寡核苷酸引物,它含有1个或1个以上修饰核糖核苷酸。
39.权利要求38的嵌合寡核苷酸引物,它含有作为修饰核糖核苷酸的其中与所述三磷酸核糖核苷酸的α-位磷原子键合的氧原子被硫原子取代的(α-S)核糖核苷酸。
40.一种检测样品中的靶核酸的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)应用权利要求1或5的扩增核苷酸序列或大量生产核酸的方法扩增靶核酸;以及
(b)检测步骤(a)扩增的靶核酸。
41.权利要求40的方法,其中应用以导致猝灭状态距离定位的2个或2个以上荧光物质标记的核糖核苷酸(RNA)探针检测所述扩增的靶核酸。
42.一种生产具有固定核酸的材料的方法,其中所述核酸布局在预定区域,其特征在于所述方法包括:
(a)应用权利要求1或5的扩增核苷酸序列或大量生产核酸的方法扩增待固定的核酸;以及
(b)使步骤(a)扩增的核酸布局并固定在支持物的预定区域中。
43.权利要求42的方法,其中使不含其互补链的单链核酸扩增以及布局和固定在所述支持物的预定区域中。
44.一种检测样品中的靶核酸的方法,其特征在于所述方法包括:
(a)由样品制备怀疑含有靶核酸的核酸样品;
(b)使所述核酸样品与用权利要求42的方法生产的材料接触进行杂交;以及
(c)检测所述核酸样品中与所述材料上预定区域中排列固定的核酸具有互补的序列且与之杂交的靶核酸。
45.一种测定核酸的核苷酸序列的方法,其特征在于所述方法包括按照权利要求1或5的方法扩增核苷酸序列。
46.一种检测靶核酸中突变的方法,其特征在于所述方法包括依照权利要求1或5的方法扩增核苷酸序列。
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