本申请为于2012年4月30日提交的标题为“用于提取和储存核酸的方法和组合物”的美国专利申请号13/460076和于2012年12月20日提交的标题为“用于在固体基质上稳定核酸的配方”的美国专利申请号13/721948的部分继续;所述两个申请通过引用结合到本文中。
发明概述
固体基质的一个实施方案包含至少一种蛋白变性剂和至少一种酸或酸-滴定的缓冲试剂,其以干燥状态漫布于其中;其中所述基质配置为当水化时提供酸性pH、从样品提取核酸和在环境温度下以基本上干燥的状态储存核酸。
在另一个实施方案中,RNA提取基质包含包括离液剂、去污剂或其组合在内的蛋白变性剂;和酸或酸-滴定的缓冲试剂,其以干燥状态漫布于其中,其中所述基质为多孔的不可溶性干燥材料,其配制为当水化时提供2-7的pH,用于提取RNA和稳定所提取的RNA,所述提取的RNA具有至少4的RNA完整性数值(RIN)。
在一个实施方案中,RNA提取基质包含包括离液剂、去污剂或其组合在内的蛋白变性剂;酸或酸-滴定的缓冲试剂;和包括三磷酸盐或焦磷酸盐在内的RNA酶抑制剂,其以干燥状态漫布于其中,其中所述基质包括多孔的不可溶性干燥材料,其配制为当水化时提供2-7的pH,和稳定RNA,该RNA具有至少4的RNA完整性数值(RIN)。
用于从样品提取和储存核酸的方法的一个实例包括以下步骤:向包含蛋白变性剂和酸或酸滴定的缓冲试剂的干燥固体基质提供样品;当水化时产生酸性pH用于从样品提取核酸;干燥包含所提取的核酸的基质;和在环境温度下以基本上干燥的状态在基质上储存提取的核酸。
附图
当参考附图阅读下列详述时将更好地理解本发明的这些及其它特征、方面和优点,在整个附图中相似的字符代表相似的部分,其中:
图1为P31NMR谱,其显示三(2-羧乙基)膦(TCEP)的氧化和TCEP氧化物(TCEP-O)的制备。
图2显示衍生自TCEP和TCEP-O对纤维素样品的还原活性的5,5'-二硫双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)比色测定法的条形图。
图3显示在包含TCEP或TCEP-O的化学处理的纤维素纸上收集的干燥血斑的RNA完整性数值(RIN)。
图4显示在多种化学处理的纤维素基质上收集并在Agilent2100Bioanalyzer上分析RNA之前于环境温度下储存5、6或12天的干燥血斑的RNA完整性数值(RIN)。
发明详述
本发明的实施方案提供用于环境提取和保存核酸,例如RNA的合适的基质和方法。RNA一般被认为是难以以完整形式保存的不稳定分子。本发明的一个或多个实施方案涉及一种核酸提取基质,其中所述基质配置为在单个处理步骤内从生物样品收集、提取和储存核酸达很长的时间,随后在各种应用中使用。所述基质配置为在环境温度下以基本上干燥的状态储存核酸和基本上保留核酸的完整性。
为了更清楚和简明地描述所要求发明的主题,针对在下面的描述和所附权利要求中使用的特殊术语提供下列定义。在整个说明书中,特殊术语的例示应被视为为非-限制性的实例。
单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数提及物,除非上下文另外清楚指示。近似的语言,如本文遍及说明书和权利要求所使用的,可应用于修饰任何数量表述,所述数量表述可在不导致与其相关的基本功能的改变的情况下获准变化。相应地,由术语例如“约”所修饰的值不限于所指定的精确值。在一些情况下,近似的语言可相应于用于测量该值的仪器的精密度。必要时,提供范围,并且那些范围包含其间的所有亚范围。
如本文所提及的术语“核酸”包括所有形式的RNA(例如,mRNA、miRNA、rRNA、tRNA、piRNA、ncRNA)、DNA(例如基因组DNA、mtDNA),以及重组RNA和DNA分子或使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸可为单链的或双链的。核酸可包含编码或非编码链。该术语还包括核酸的片段,例如可使用所公开的提取方法回收的天然存在的RNA或DNA。“片段”指核酸(例如,RNA或DNA)的一部分。
如本文所提及的术语“生物样品”包括,但不限于,从任何生物体,包括人,获得的血液、血清、组织和唾液。生物样品可由经受自我-诊断测试(例如,血糖监测)的个体或由受过培训的医学专业人员通过包括,例如,使用针吸血或刮或拭抹特定区域如患者皮肤上的损伤在内的多种技术获得。用于收集各种生物样品的方法为本领域所熟知。术语“样品”包括如上所定义的生物样品,但还包括,例如,组织培养的细胞和纯化的核酸。
如本文所提及的术语“还原剂”包括向另一种化学物类提供电子的任何化学物类。本领域已知多种还原剂。示例性的还原剂包括二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(2-ME)和三(2-羧乙基)膦(TCEP)。此外,可使用这些或其它还原剂的任何组合。在具体的实施方案中,还原剂为TCEP。
如本文所使用的术语“缓冲剂”包括,例如2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇(Tris)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、柠檬酸盐缓冲剂、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES),和磷酸盐缓冲剂。该潜在的缓冲剂的列表仅用于说明性目的。选择用于本文所公开组合物和方法的缓冲剂的pH通常经酸滴定在2-7的范围内。
固体基质的一个或多个实施方案包含至少一种蛋白变性剂和至少一种酸或酸-滴定的缓冲试剂,其以干燥状态漫布于其中,其中所述基质配置为当水化时提供酸性pH。所述基质还配置为从样品提取核酸和在环境温度下以基本上干燥的状态保存核酸。如本文所使用的,术语“基本上干燥的状态”指进一步干燥样品至具有约小于2%的水含量。
用于从样品提取和储存核酸的固体基质包含呈干燥状态的至少一种酸或酸-滴定的缓冲剂和蛋白变性剂。术语“基质”在本文中与“提取基质”可交换地使用。如本文所使用的术语“固体基质”指不可溶的基质。所述基质使得能够不溶解基质材料而收集、提取和储存核酸。所述固体基质包括,但不限于,诸如纤维素、醋酸纤维素、硝酸纤维素、玻璃纤维或其组合等材料。组合物至基质中的“掺入”包括,但不限于,下文所述的“浸渍”程序。在一些实施方案中,这样的方法实现组合物至干燥固体基质中的掺入。将组合物掺入干燥固体基质后,使用任何适当的方法干燥固体基质。
如所指出的,所述固体基质包含呈干燥状态的组合物并且还在干燥条件下保存提取的核酸。用于提取和储存的干燥固体基质的使用相对于液基提取具有优势,因为干燥基质保证了施用于基质的样品的最小体积稀释。本领域技术人员将理解的是液基提取在过量体积的稳定试剂中稀释样品的浓度。用于收集、提取和保存样品的干燥固体基质的使用维持样品的浓度并消除与样品在液体保存剂中不当稀释有关的问题,例如样品降解。另外,固体基质包含固定的干燥试剂的组合物,这使在水化时有效提取核酸,例如RNA,然后在环境温度下稳定提取的RNA成为可能。
术语“环境条件”或“环境温度”在后文中可交换地使用。如本文所使用的,术语“环境温度”指0℃-60℃范围内的温度。在一个或多个实施方案中,环境温度为室温。在一些实施方案中,所述基质配置为以干燥状态在环境温度下储存或保存核酸。
如所指出的,所述固体基质配置为在干燥状态下储存或保存核酸达很长的时间。术语“配置为”或“配置用于”在本文中是指使基质能够在环境温度提取和储存核酸达一段时间的基质结构或组成。术语“储存”或“保存”在本文中关于以适于进一步分析的形式维持提取的核酸可交换地使用。更特别地,核酸可储存或保存在固体核酸提取基质中,其中所述基质确保维持分子的完整性。
在一些实施方案中,所述核酸提取基质为固相提取基质。使用固相提取方法的基质在本文中被称为固相提取基质。固相提取(SPE)技术已经被用来(leveraged)减少用于测序或其它应用的高纯度核酸的提取时间。固相提取为使用固相和液相从材料分离同一类型或不同类型的一种或多种分子的提取方法。固相提取基质用于,例如,在色谱或其它分析方法上游纯化样品。该方法的一个实例包括将样品(例如生物样品)装载到固相提取基质上,在环境温度下储存基质以达到基本上干燥的状态和用合适的缓冲剂再水化基质以从基质有差别地提取RNA。
术语“提取”指用于从样品,更具体地生物样品分离或隔离核酸的任何方法。核酸如RNA和DNA可,例如,通过细胞裂解释放。在一个实施方案中,核酸可在蒸发性细胞-裂解(evaporativecell-lysis)期间释放。在另一个实施方案中,当与包含细胞裂解试剂的基质接触时细胞被裂解。使包含细胞的生物样品接触基质,例如通过使用FTA?Elute纤维素纸,导致细胞裂解,其释放核酸。
所述固体基质可为多孔的。在一个实施方案中,所述固体基质为多孔纤维素纸,例如来自Whatman?的纤维素基质。在一个实例中,来自Whatman?的纤维素基质包括903-纤维素、FTA?或FTA?Elute。
在一个或多个实例中,所述提取基质漫布有一种或多种试剂。如所指出的,在一个示例性实施方案中,所述基质包含以干燥状态漫布的一种或多种蛋白变性剂。在一个实施方案中,所述基质进一步包含一种或多种酸或酸-滴定的缓冲试剂。在另一个实施方案中,所述基质进一步包含一种或多种还原剂。在一些实施方案中,漫布的试剂包括裂解试剂、核酸稳定试剂、核酸储存化学品及其组合。
在一些实施方案中,基质中漫布的干燥试剂通过加入缓冲剂、水或样品水化。在一个实施方案中,漫布的干燥试剂被在布置在用于提取或储存核酸的基质上的样品,更特别地生物样品水化。在一些其它的实施方案中,除了样品外,加入水或缓冲剂水化基质并重建或活化嵌入基质中的试剂。在一些实施方案中,基质的水化在基质上产生酸性pH。在一些实施方案中,水化进一步导致在基质中以干燥形式存在的试剂,例如蛋白变性剂、酸或酸滴定的缓冲试剂的重建。
在一个或多个实施方案中,所述基质包含蛋白变性剂。所述蛋白变性剂可包括离液剂或去污剂。不意在限于具体的变性剂,蛋白变性剂可根据其生物物理性质和完全抑制生物酶(例如RNA酶)活性的能力分类为弱变性剂或强变性剂。在一些实施方案中,弱蛋白变性剂(例如去污剂)可用于裂解细胞和破坏蛋白-蛋白相互作用而不变性核酸。在进一步的实施方案中,除了变性细胞和蛋白之外,强蛋白变性剂(例如离液盐)的使用还可变性核酸二级结构。多种蛋白变性剂是本领域已知的并且可选择用于本文所述的组合物和方法。不意在限于具体的蛋白变性剂,示例性的蛋白变性剂包括硫氰酸胍、盐酸胍、硫氰酸钠、硫氰酸钾、精氨酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素或其组合。示例性的去污剂可分类为离子型去污剂、非离子型去污剂或兼性离子去污剂。离子型去污剂可包括阴离子型去污剂例如,十二烷基硫酸钠(SDS)或阳离子型去污剂,例如乙基三甲基溴化铵。用于细胞裂解的非离子型去污剂的非限制性实例包括TritonX-100、NP-40、Brij35、吐温20、辛基葡糖苷、辛基硫代葡萄糖苷或洋地黄皂苷。一些兼性离子去污剂可包括3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)和3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙磺酸盐(CHAPSO)。
在一个或多个实施方案中,蛋白变性剂包括硫氰酸盐。所述基质的一个或多个实施方案包含以干燥状态漫布的酸-滴定的硫氰酸盐。示例性的硫氰酸盐包括,但不限于,硫氰酸胍、硫氰酸钠、硫氰酸钾或其组合。
从生物样品提取RNA之后所述提取基质以期需的水平维持RNA的稳定性和完整性。在一个实施方案中,所述基质漫布有核酸稳定试剂。这些稳定试剂可包括RNA酶抑制剂、酸-滴定的缓冲剂或螯合剂(例如EDTA)。所述组合物可进一步包含紫外线(UV)抑制剂或自由基清除剂。
如所指出的,所述基质进一步包含RNA酶抑制剂,其中所述RNA酶抑制剂包括氧钒基核糖核苷复合物(VRC),一种核苷酸类似物,或市售可得的RNA酶抑制剂(例如,SUPERase-In?)。RNA酶抑制剂可进一步包括焦磷酸盐化合物。在一个实施方案中,焦磷酸二钠可用作RNA酶抑制剂。RNA酶抑制剂的一个或多个实施方案可进一步包括三磷酸盐,例如三磷酸钠。在一个实施方案中,向酸-滴定的缓冲剂中加入焦磷酸钠增强液体状态和干燥形式二者的RNA稳定性。
所述基质的实施方案包含呈干燥状态的酸或酸-滴定的缓冲试剂,其可在核酸提取期间再水化。酸的实例包括,但不限于,乙酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、盐酸、三(2-羧乙基)膦-盐酸(TCEP-HCl)、氧化的三(2-羧乙基)膦-盐酸(TCEP-O-HCl)、硫酸、硝酸、香草酸、3-(N-吗啉代)丙磺酸或其组合。如所指出的,所述基质在水化时提供酸性pH,该酸性pH提取和稳定所提取的核酸,其中水化可通过加入样品、水或任何其它溶液(例如缓冲溶液)达到。所述基质的一个或多个实施方案在水化时提供2-7范围内的pH。在一些实施方案中,所述基质在水化时提供3-6范围内的pH。
提取的核酸,特别地RNA,在酸性条件下稳定,如表IV中所示。在一个实施方案中,酸-滴定的缓冲剂包括硫氰酸胍。在2-7的酸性pH时,更特别地在3-6的pH时,干燥固体基质上酸性范围内的硫氰酸胍和焦磷酸钠的干燥状态混合物在环境温度下稳定干燥血斑中的高质量RNA,如图4中由RIN分值所显示的。在一个实施方案中,酸-滴定的缓冲剂包括硫氰酸胍,其中在2-7的酸性pH下,更特别地在3-6的pH下,干燥固体基质中三磷酸钠的存在稳定高质量的RNA,如图4中由RIN分值所显示的。
如所指出的,在一些实施方案中,所示基质进一步包含UV保护剂、自由基清除剂、螯合剂或其组合。不意在限于任何具体的UV保护剂,示例性的抗氧化剂包括,例如,氢醌单甲醚(MEHQ)、氢醌(HQ)、甲苯氢醌(THQ)和抗坏血酸。在一些实施方案中,抗氧化剂为THQ。
在一些实施方案中,所示基质进一步包含至少一种还原剂,其中所述还原剂选自二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇(2-ME)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)及其组合。
提取的核酸包含核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或其组合。在一个实施方案中,提取的核酸包含RNA。所述RNA可为mRNA、tRNA、rRNA、小RNA、siRNA、miRNA、非编码RNA、动物RNA、植物RNA、病毒RNA或细菌RNA。
所述基质配置为在基本上完整的情况下于环境温度以干燥形式储存核酸。RNA的情况是指RNA的质量或RNA的完整性。RNA的稳定性和质量可基于以下评估:mRNA靶的定量RT-PCR扩增;28s:18s核糖体RNA(rRNA)的比率,其折中(compromise)总细胞RNA的量,和Agilent2100Bioanalyzer上的RIN分析。如所指出的,RNA质量作为28S与18S核糖体RNA强度值的比率测定,其中该比率通过经由所提取rRNA的凝胶电泳接着溴化乙锭染色获得28S和18SrRNA的强度计算。高质量细胞RNA一般显示大于1的28s:18srRNA比率。此外,高质量细胞RNA支持低丰度和大(例如,大于1kB)mRNA二者的有效扩增。为方便起见,rRNA信号强度和28s:18srRNA的比率经常用于通过凝胶电泳快速筛查和鉴定具有强健RNA储存性质的样品。
如所指出的,在一个实施方案中,RNA质量经由所提取RNA的毛细管电泳通过生物分析仪测定。照例,RNA质量作为RIN定量,其中RIN通过所提取RNA中存在的各种RNA的量的算法评估计算。高质量的细胞RNA一般显示接近10的RIN值。在一个或多个实施方案中,从干燥基质提取的RNA具有至少4的RIN值。在一些实施方案中,所述基质提供生物样品的环境提取和稳定并且产生RIN值在4-10范围内的完整、高质量的RNA,或在一个实施方案中,RIN值在5-8的范围内。
用于从样品提取和储存核酸的方法的一个实例包括以下步骤:将样品提供至包含蛋白变性剂和酸或酸-滴定的缓冲试剂的固体基质上,当用样品或任何外部加入的液体水化固体基质时产生酸性pH用于从样品提取核酸,干燥包含所提取的核酸的基质,和在环境温度下以基本上干燥的状态在基质上储存提取的核酸。术语“提供样品”的非限制性实例包括,使用吸量管、导管、注射器或管道将样品施用于提取基质上或将样品布置在提取基质上。样品可请到在基质上。
所述方法包括在环境温度时以干燥状态在基质上储存提取的核酸。在一些实施方案中,核酸可储存超过一个月的时期。在一些实施方案中,核酸可储存超过六个月的时期。由于RNA一般易于降解,使用该基质提取和保存RNA是有用的并且可进一步用于各种下游应用。
所述方法的一个或多个实施方案包括通过固相提取技术从基质回收核酸。在一个或多个实施方案中,通过在水溶液、缓冲剂或有机溶液中再水化基质从固体基质回收核酸,并且其中所述核酸经受进一步的分析。可采用导致核酸,特别地RNA从样品(例如,未纯化的生物样品)提取的任何方法。上述方法可任选包括在从固体基质回收核酸用于进一步分析之前洗涤基质的步骤。例如,基质可用合适的缓冲剂或水洗涤一次或多次,然后回收核酸。可通过在水溶液、如上所定义的缓冲溶液或有机溶液中再水化固体基质(例如,纤维素纸)回收核酸。在一些实施方案中,通过电洗脱从固体基质回收核酸。
在一个实施方案中,用于提取和保存核酸(例如,RNA、DNA或其组合)的方法包括以下步骤:提供固体基质,其中组合物包含以干燥形式掺入在固体基质中的至少一种蛋白变性剂、酸或酸-滴定的缓冲试剂和任选自由基清除剂;将样品(例如,生物样品)施用于固体基质以在酸性pH下提取核酸;干燥固体基质;和在环境温度下以基本上干燥的状态在固体基质上储存核酸。
在所述方法的某些实施例中,基质允许在环境温度下以干燥形式(例如,在固体基质上)储存核酸,特别地众所周知对于储存是不稳定生物分子的RNA。该方法中利用的样品包括,但不限于,生物样品例如从任何生物体包括人获得的血液、血清、组织和唾液。