CN1711357A - 用于广泛检测工业产品中的生物体的一步实时rt pcr试剂盒 - Google Patents

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CN1711357A CN200380103046.6A CN200380103046A CN1711357A CN 1711357 A CN1711357 A CN 1711357A CN 200380103046 A CN200380103046 A CN 200380103046A CN 1711357 A CN1711357 A CN 1711357A
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Abstract

本发明涉及一种用于一步实时逆转录酶聚合酶链式反应(RT－PCR)的新的样本制备、探针、成对引物组，用于广泛检测药物、化妆品和非临床样本中的活细菌和/或真菌－酵母的方法和试剂盒。

Description

用于广泛检测工业产品中的生物体的一步实时RTPCR试剂盒
发明领域
本发明涉及用于检测存在于药物、化妆品和非临床样本中的细菌和真菌-酵母的方法和试剂的领域。
更加特别地，本发明涉及用于24小时内广泛检测灭菌或非灭菌的工业产品中的活细菌和真菌-酵母的一步实时RT PCR试剂盒的样本制备、引物组、探针组以及方法。
发明背景
使用特定的多核苷酸序列或肽核酸作为引物和/或探针来识别污染物和感染试剂已经成为问题诸多的生长需求分析、可见(菌落)生长特征、显微形态学、染色反应和生化特性的重要替代。在大多数情况下，这些方法过于漫长，以致不能真正用于工业控制。
例如，1984年7月19日公开的PCT申请WO84/02721中描述了在杂交过程中使用与目标核酸序列互补的核酸探针来检测目标核酸序列，这些目标序列由核糖体RNA、转运RNA或其他RNA组成。虽然这些方法具有比已知的DNA杂交分析更高的灵敏度和特异性，但是杂交过程需要使用互补探针，这通常依赖于对试验生物体的培养，因此，不适合于快速分析。
这些探针在用逆转录酶聚合酶链式反应(RT PCR)扩增的RNA杂交中是有用的。RT-PCR是一种有效的核糖核酸扩增方法，可以被用于检测少量来自体外培养困难或费时的细菌和/或真菌-酵母的核糖核酸靶点。RT PCR要求具有用于检测的活样本。在其最简单的形式中，RT PCR是酶促合成特定cDNA序列的体外方法。使用一种与RNA链杂交并且位于目标cDNA的有意义区域的寡核苷酸引物，通过逆转录酶合成多种cDNA。重复一系列循环包括模板变性、引物退火和通过DNA聚合酶延伸被退火的引物，使得特定的片段指数性积累，该片段的末端由引物的5’端限定。PCR以10-12的倍数选择性地富集特定的DNA序列。PCR方法在Saiki等，1985，Science 230：1350中被描述，是美国专利4,683,195、4,683,202和4,800,159的申请主题(这些参考文献在此引入作为参考)。这种方法被用于检测与镰刀状细胞贫血症相关的β-球蛋白基因(Saiki等，1985，同上文)和人免疫缺陷病毒(HIV)RNA(Byrne等，1988，Nuc.Acids Res.16：4165)中存在的异常序列。
为了成功地去除灭菌或非灭菌的工业产品中由细菌或真菌-酵母引起的污染，需要快速和精确的检测。通常通过纯培养物分离，接着通过借助样本来源、生长需求、可见(菌落)生长特征、显微形态学、染色反应和生物化学特性的知识的鉴别过程来检测细菌和真菌-酵母。
显然，对于目前所使用的方法来说，检测工业样本中的细菌和真菌-酵母时具有与培养方法相同灵敏度，并且少于24小时的快速诊断方法是一个显著进步。
发明概述
本发明涉及用于少于24小时内快速检测灭菌和非灭菌的产品中的细菌和真菌-酵母的方法和试剂。
在优选实施方案中，来自RNA的一步逆转录酶聚合酶链式反应的目标区域以及得到的被扩增DNA用探针处理，该探针能够与被扩增的细菌或真菌-酵母DNA杂交，但是不与其他生物体(哺乳动物、植物、昆虫……)或病毒的DNA杂交。
Tth DNA聚合酶是一种热稳定性酶，具有RNA-依赖的逆转录酶活性和DNA-依赖的聚合酶活性，可以在单一试管反应中进行RT和PCR，从而可以较快地分析细菌、真菌-酵母的RNA的存在。
采用一步实时逆转录酶聚合酶链式反应，无论在RT和PCR之间开启试管以及来自由于先前在实验室中进行的在先扩增反应而存在的可能PCR产物环境污染物造成假阳性，本发明使得用户能够实施快速RT-PCR，同时通过监控实时聚合酶链式反应扩增中的荧光来检测和定量细菌和/或真菌-酵母的RNA的存在。
发明详述
因此，本发明的方法能够比现有技术中的检测方法更加快速地确定细菌和/或真菌-酵母的存在。
采用一步实时逆转录酶聚合酶链式反应，无论在RT和PCR之间开启试管以及来自由于先前在实验室中进行的在先扩增反应而存在的可能PCR产物环境污染物造成假阳性，本发明使得用户能够实施快速RT-PCR，同时通过监控实时聚合酶链式反应扩增中的荧光来检测和定量细菌和/或真菌-酵母的RNA的存在。
基本的RT PCR操作按如下实施。
提供需要被测试或者怀疑含有特定有意义的核酸序列的样本，“目标序列”。含有在样本中的核酸首先被反转录为cDNA(使用酶如Tth DNA聚合酶作为被纯化的酶以及寡核苷酸或PNA)，然后采用本领域技术人员知晓的物理方法使cDNA变性。用于链分离的优选物理方法包括加热核酸直到其完全(＞99％)变性。采用热稳定性DNA聚合酶扩增RNA目标的方法被描述在1990年12月21日申请的PCT/US90/07641中，其在此引入作为参考。
然后，在杂交条件下，在同一试管中，用所选择的寡核苷酸引物温育被变性的DNA链，该杂交条件使得引物能够结合到单一的DNA链上。如本领域所知，选择引物，以至于它们在双链序列上的相对位置使得由一条引物合成的延伸产物从其补体上分离时可以作为另一条引物延伸的模板，从而获得特定长度的复制链。
引物必须具有足够长度。以在存在聚合试剂时能够起始延伸产物的合成。引物的准确长度取决于多种因素，包括温度、引物来源以及所用的方法。
用于本发明的优选寡核苷酸引物从如下选择：
Seq ID No 1  TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA          [正向引物]
Seq ID No 2  TGCGGGACTTAACCCAACA             [反向引物]
Seq ID No 3  AGAGTTTGATCATGGCTCAGA           [正向引物]
Seq ID No 4  TTACCCCACCTACTAGCTAAT           [反向引物]
Seq ID No 5  GYGGAGCATGTGGYTTAATTCG          [正向引物]
Seq ID No 6  TTGCGCTCGTTRCGGGACTT            [反向引物]
Seq ID No 7  GGGAAACTCACCAGGTCCA             [正向引物]
Seq ID No 8  CGTTATCGCAATTAAGCAGACA         [反向引物]
Seq ID No 9  GGTAACGGGGAATWAGGGTTC          [正向引物]
Seq ID No 10 TTGGGTAATTTGCGCGCCTG           [反向引物]
通用密码子：Y＝(C/T)，R＝(A/G)，W＝(A/T)
然后，在由适当的盐、金属阳离子和pH缓冲体系组成的反应液中，通过聚合试剂催化寡核苷酸引物的模板依赖的延伸(存在足量的四种脱氧核糖核苷三磷酸盐(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)或其类似物)。
合成产物是由模板链和引物延伸链组成的双链分子，包括目标序列。这些产物轮流作为另一轮复制的模板。在第二轮复制中，第一个循环的引物延伸链与其互补引物退火；合成“短”产物，通过引物序列或其补体被结合到5’端和3’端上。重复变性、引物退火和延伸的循环，导致由引物限定的目标区域指数性聚集。进行足够的循环来获得期望含量的含有目标的核酸区域的多核苷酸。期望的含量是变化的，由产物多核苷酸所起的功能来决定。
以一步同时加入所有试剂的方式来实施PCR方法。
在优选方法中，以采用具有热稳定性酶如Tth的自动操作来进行RTPCR反应。
所用的机器的类型可以从Roche Diagnostics(LigthCycler)、Cepheid(Smart Cycler，GeneXpert)、BioRad(Icycler)、CorbettResearch(Rotor-Gene)……购买得到以及被开发用于实时PCR分析和商业使用的最合适设备。
本领域的那些技术人员也将会意识到来自于预前存在用于缓冲液的水中的细菌的核酸引起的污染并导致非特异性扩增的问题。减少这些问题的方法是采用适当的过滤***来去除大于100bp的DNA链片段。使用前，所有用于RT PCR反应的试剂必须被处理过。
在PCR扩增过程中，通过用探针多核苷酸杂交来直接检测目标多核苷酸，在严紧条件到低严紧条件和洗涤条件下，探针核苷酸与目标序列形成稳定的杂合物。
探针通常用非放射性标记体系标记，例如荧光素和衍生的体系。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及用于确定在怀疑含有所述细菌和/或真菌的样本中是否存在细菌或真菌-酵母核糖核酸(RNA)的方法和试剂盒，其中所述多核苷酸含有所选择的目标区域，所述方法包括：
(a)在用DNA酶温育后，在膜和/或DEAE树脂上进行离心过滤，从多达1000ml的样本中提取细菌或真菌-酵母核糖核酸(RNA)。
(b)在允许多核苷酸杂交到核糖核苷酸目标区域和所述聚合酶或如同Tth的酶用于cDNA合成的逆转录酶活性的条件下，用具有RNA依赖的逆转录酶活性和DNA依赖的聚合酶活性的热稳定性酶，使得在单一试管反应中进行RT和PCR，例如Tth DNA聚合酶或类似于Tth DNA聚合酶的酶，以及具有选自如下的核酸序列的多核苷酸序列来温育细菌或真菌-酵母核糖核酸(RNA)
Seq ID No 2  TGCGGGACTTAACCCAACA           [反向引物]
Seq ID No 4  TTACCCCACCTACTAGCTAAT         [反向引物]
Seq ID No 6  TTGCGCTCGTTRCGGGACTT          [反向引物]
Seq ID No 8  CGTTATCGCAATTAAGCAGACA        [反向引物]
Seq ID No 10 TTGGGTAATTTGCGCGCCTG          [反向引物]
以及
(c)用所述聚合酶例如Tth DNA聚合酶以及具有选自如下核苷酸序列的多核苷酸引物和探针，通过聚合酶链式反应扩增cDNA到可检测水平
Seq ID No 1  TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA        [正向引物]
Seq ID No 2  TGCGGGACTTAACCCAACA           [反向引物]
Seq ID No 3  AGAGTTTGATCATGGCTCAGA         [正向引物]
Seq ID No 4  TTACCCCACCTACTAGCTAAT         [反向引物]
Seq ID No 5  GYGGAGCATGTGGYTTAATTCG        [正向引物]
Seq ID No 6  TTGCGCTCGTTRCGGGACTT          [反向引物]
Seq ID No 7  GGGAAACTCACCAGGTCCA           [正向引物]
Seq ID No 8  CGTTATCGCAATTAAGCAGACA        [反向引物]
Seq ID No 9  GGTAACGGGGAATWAGGGTTC         [正向引物]
Seq ID No 10 TTGGGTAATTTGCGCGCCTG          [反向引物]
Seq ID No 11 TGCATGGYTGTCGTCAGCTCGTG       [正向探针]
Seq ID No 12 GAGTGGCGGACGGGTGAGTAA         [正向探针]
Seq ID No 13 ACAGGTGGTGCATGGTTGTC          [正向探针]
Seq ID No 14 TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT        [正向探针]
Seq ID No 15 ACAGGTGCTGCATGGCTGTC          [正向探针]
Seq ID No 16 TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTT        [正向探针]
Seq ID No 17 AGGATTGACAGATTGAGAGCTCTT      [正向探针]
Seq ID No 18 CGGAGAGGGAGCCTGAGAA           [正向探针]
Seq ID No 19 CGGCTACCACATCCAAGGAA          [正向探针]
通过Tth或者类似于Tth的酶的逆转录酶活性来合成cDNA目标序列，并且借助一步实时RT-PCR，在同一试管中通过DNA聚合酶的DNA依赖的聚合酶活性扩增该目标序列。
更加特别地，用于检测细菌的组合物包括由如下序列组成的多核苷酸引物和探针
Seq ID No 1  TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA        [正向引物]
Seq ID No 2  TGCGGGACTTAACCCAACA           [反向引物]
Seq ID No 11 TGCATGGYTGTCGTCAGCTCGTG       [正向探针]
可替代地，用于检测细菌的组合物包括由如下序列组成的多核苷酸引物和探针
Seq ID No 3  AGAGTTTGATCATGGCTCAGA         [正向引物]
Seq ID No 4  TTACCCCACCTACTAGCTAAT         [反向引物]
Seq ID No 12 GAGTGGCGGACGGGTGAGTAA         [正向探针]
还使用包含如下组成的多核苷酸引物和探针的检测细菌的组合物来实施本发明
Seq ID No 5  GYGGAGCATGTGGYTTAATTCG        [正向引物]
Seq ID No 6  TTGCGCTCGTTRCGGGACTT          [反向引物]
Seq ID No 13 ACAGGTGGTGCATGGTTGTC          [正向探针]
Seq ID No 14 TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT        [正向探针]
Seq ID No 15 ACAGGTGCTGCATGGCTGTC          [正向探针]
Seq ID No 16 TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTT        [正向探针]
本发明还涉及所述方法和试剂盒，其中用于检测真菌-酵母的组合物包含由如下序列组成的多核苷酸引物和探针
Seq ID No 7  GGGAAACTCACCAGGTCCA          [正向引物]
Seq ID No 8  CGTTATCGCAATTAAGCAGACA       [反向引物]
Seq ID No 17 AGGATTGACAGATTGAGAGCTCTT     [正向探针]
可替代地，用于检测真菌-酵母的组合物包含由如下序列组成的多核苷酸引物和探针
Seq ID No 9  GGTAACGGGGAATWAGGGTTC        [正向引物]
Seq ID No 10 TTGGGTAATTTGCGCGCCTG         [反向引物]
Seq ID No 18 CGGAGAGGGAGCCTGAGAA          [正向探针]
Seq ID No 19 CGGCTACCACATCCAAGGAA         [正向探针]
用于检测所有细菌和/或真菌-酵母的引物和探针的优选组合由如下序列组成：
Seq ID No 1+Seq ID No 2+Seq ID No 11
或
Seq ID No 3+Seq ID No 4+Seq ID No 12
或
Seq ID No 5+Seq ID No 6+Seq ID No 13+Seq ID No 14+SeqID No 15+Seq ID No 16
或
Seq ID No 7+Seq ID No 8+Seq ID No 17
或
Seq ID No 9+Seq ID No 10+Seq ID No 18+Seq ID No 19
或
Seq ID No 1+Seq ID No 2+Seq ID No 11+Seq ID No 7+Seq IDNo 8+Seq ID No 17
或
Seq ID No 3+Seq ID No 4+Seq ID No 12+Seq ID No 7+Seq IDNo 8+Seq ID No 17
或
Seq ID No 5+Seq ID No 6+Seq ID No 13+Seq ID No 14+SeqID No 15+Seq ID No 16+Seq ID No 9+Seq ID No 10+Seq IDNo 18+Seq ID No 19
如上所述，多核苷酸引物和探针可以是天然核酸或与核酸(DNA和RNA)杂交的肽核酸(PNA)。
RNA还可以被定量，并与来自例如大肠杆菌和假丝酵母属的被定量的外链RNA比较。
为了提高特异性，提供如下探针核酸碱基对数据。用于本发明的优选寡核苷酸探针选自如下构成的组
Seq ID No 11 TGCATGGYTGTCGTCAGCTCGTG        [正向探针]
Seq ID No 12 GAGTGGCGGACGGGTGAGTAA          [正向探针]
Seq ID No 13 ACAGGTGGTGCATGGTTGTC           [正向探针]
Seq ID No 14 TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT         [正向探针]
Seq ID No 15 ACAGGTGCTGCATGGCTGTC           [正向探针]
Seq ID No 16 TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTT         [正向探针]
Seq ID No 17 AGGATTGACAGATTGAGAGCTCTT       [正向探针]
Seq ID No 18 CGGAGAGGGAGCCTGAGAA            [正向探针]
Seq ID No 19 CGGCTACCACATCCAAGGAA           [正向探针]
由于在一步RT-PCR中，探针不会结合到RNA序列中逆转录酶合成cDNA的条带上，因此，反向探针是不合适的。
本发明的优选寡核苷酸引物和探针的序列基于rRNA基因。用于检测来自各种微生物的核酸的寡核苷酸rRNA基因已经在科技文献中被描述。例如，通用的细菌探针在Wilson等，1990，J.ClinicalMicrobiology 28：1942-1946和Chem等，1989，FEMS MicrobiologyLetters 57：19-24中被描述。
属间和种间特异性探针的例子已经被描述在Barry等，1990，Biotechnology 8：233-236，Atlas和Bej，“PCR操作：方法和应用的指导”(PCR protocols：A guide to method and application)，第399-406页和基因探针(Gen-probe)国际专利申请WO88/03957(这些文献在此引入作为参考)。本申请要求保护的发明在所检测的目标范围(所有细菌-真菌-酵母)和应用重点(非临床)方面区别于这些发明。
使用一组rRNA探针，包括通用细菌探针、革兰氏阳性和革兰氏阴性探针和种间和组间特异性探针，产生了临床上有用的信息，而不是单一的通用细菌探针；由于不同的病理学、药物和抗体治疗方法被推荐用于各种细菌-真菌-酵母感染。
在这些在先专利中，通用的细菌探针仅被用于阳性对照。用于细菌-真菌-酵母的通用引物被用于扩增产物克隆和测序后的鉴定或者DNA芯片上的杂交。在本发明之前，还没有描述过将rRNA目标用于灭菌对照来检测灭菌或非灭菌工业产品中的活细菌和真菌-酵母。
用于细菌和真菌-酵母的一步RT PCR检测的优选通用成对引物包括选自如下构成的组的探测核碱基序列(probing nucleobasesequence)
Seq ID No 1  TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA        [正向引物]
Seq ID No 2  TGCGGGACTTAACCCAACA           [反向引物]
Seq ID No 3  AGAGTTTGATCATGGCTCAGA         [正向引物]
Seq ID No 4  TTACCCCACCTACTAGCTAAT         [反向引物]
Seq ID No 5  GYGGAGCATGTGGYTTAATTCG        [正向引物]
Seq ID No 6  TTGCGCTCGTTRCGGGACTT          [反向引物]
Seq ID No 7  GGGAAACTCACCAGGTCCA           [正向引物]
Seq ID No 8  CGTTATCGCAATTAAGCAGACA        [反向引物]
Seq ID No 9  GGTAACGGGGAATWAGGGTTC         [正向引物]
Seq ID No 10 TTGGGTAATTTGCGCGCCTG          [反向引物]
用于检测细菌和真菌-酵母的优选通用探针包含选自如下构成的组的探测核碱基序列
Seq ID No 11 TGCATGGYTGTCGTCAGCTCGTG       [正向探针]
Seq ID No 12 GAGTGGCGGACGGGTGAGTAA         [正向探针]
Seq ID No 13 ACAGGTGGTGCATGGTTGTC          [正向探针]
Seq ID No 14 TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT        [正向探针]
Seq ID No 15 ACAGGTGCTGCATGGCTGTC          [正向探针]
Seq ID No 16 TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTT        [正向探针]
Seq ID No 17 AGGATTGACAGATTGAGAGCTCTT      [正向探针]
Seq ID No 18 CGGAGAGGGAGCCTGAGAA           [正向探针]
Seq ID No 19 CGGCTACCACATCCAAGGAA          [正向探针]
本发明的探针和引物组、方法和试剂盒特别适合用于单一的或多元的一步RT PCR分析，其中样本中的所有细菌和/或真菌-酵母活着被检测并被定量。可以直接测定细菌和/或真菌-酵母的菌落形成单位(CFU)的总数。
如下的实施例用于说明本发明的各种方法和组合物的目的。
实施例1
用于通过简单过滤(可过滤液体)分析样本的优选方法。
在用DNA酶温育后，通过离心过滤，从多达1000mL的样本中提取细菌或真菌-酵母核糖核酸的特异性。
1-通过以2000g离心(旋转马达)或真空泵，使液体样本(多达1000mL)通过聚碳酸酯膜(达0,45μm)或PVDF膜(达0,45μm)或PES膜(达0,45μm)
酶促溶解
2-将滤膜转移到含有1mL酶促溶解缓冲液的50mL灭菌试管中，然后在35℃±2℃下温育1小时。
3-以2000g离心液体(溶解缓冲液)5分钟。
或者机械溶解
2-在600μL的培养液中复苏细菌和/或真菌-酵母。在37℃±1℃下温育1小时。
3-加入xmg酸洗玻璃珠(直径为100-500μm)和xμL溶解缓冲液。在Mixer Mills MM300(Retsch)中以最大速度破坏细胞90分钟。
4-用商业试剂盒处理溶解产物来进行RNA纯化。本发明的优选RNA提取试剂盒是工作台MagNaPure LCTM(Roche Diagnostics)上的“MagNaPure LC RNA分离试剂盒II”。洗脱体积达100μL。在纯化过程中用DNA酶温育。
5-2μL(达5μL)的纯化RNA提取物被用于一步实时RT-PCR(LightCyclerTM)，采用如Tth的酶和如下具有Taqman探针的程序：
I：反转录            61℃/20分钟(20℃/秒)
II：变性             95℃/30秒(20℃/秒)
III：PCR(35个循环)  95℃/5秒(20℃/秒
                    60℃/30秒(20℃/秒)
在60秒后，测定发射的荧光。
6-2μL(达5μL)的纯化RNA提取物被用于一步实时RT-PCR(LightCyclerTM)，采用如Tth的酶和如下具有杂交探针(HybridizationProbe)的程序：
I：反转录           61℃/20分钟(20℃/秒)
II：变性            95℃/30秒(20℃/秒)
III：PCR(35个循环)  95℃/2秒(20℃/秒
                    58℃/8秒(20℃/秒)
                    72℃/16秒(20℃/秒)
在8秒后，测定发射的荧光。
实施例2
用于通过离心分析样本的优选方法(非可过滤液体)。通过离心，从多达1000mL的样本中提取细菌或真菌-酵母核糖核酸的特异性。酶促溶解
1-以11000g离心样本5分钟，弃去上清液。
2-将沉淀重悬在xμL溶解缓冲液中。摇晃并在37℃±1℃下温育1小时。
3-加入xμL溶解缓冲液。摇晃并在50℃±2℃下温育30分钟。
或者机械溶解
1-以11000g离心样本5分钟，弃去上清液。
2-将沉淀重悬在xμL溶解缓冲液中。
3-加入xmg酸洗玻璃珠(直径为100-500μm)和xμL溶解缓冲液。在Mixer Mills MM300(Retsch)中以最大速度破坏细胞90分钟。
4-用商业试剂盒处理溶解产物来进行RNA纯化。本发明的优选RNA提取试剂盒是工作台MagNaPure LCTM(Roche Diagnostics)上的“MagNaPure LC RNA分离试剂盒II”。洗脱体积达100μL。在纯化过程中用DNA酶温育。
5-2μL(达5μL)的纯化RNA提取物被用于一步实时RT-PCR(LightCyclerTM)，采用如Tth的酶和如下具有Taqman探针的程序：
I：反转录               61℃/20分钟(20℃/秒)
II：变性                95℃/30秒(20℃/秒)
III：PCR(35个循环)      95℃/5秒(20℃/秒
                        60℃/30秒(20℃/秒)
在60秒后，测定发射的荧光。
6-2μL(达5μL)的纯化RNA提取物被用于一步实时RT-PCR(LightCyclerTM)，采用如Tth的酶和如下具有杂交探针(HybridizationProbe)的程序：
I：反转录               61℃/20分钟(20℃/秒)
II：变性                95℃/30秒(20℃/秒)
III：PCR(35个循环)      95℃/2秒(20℃/秒
                        58℃/8秒(20℃/秒)
                        72℃/16秒(20℃/秒)
在8秒后，测定发射的荧光。
实施例3
用于通过直接溶解并在DiEthylAminoEthyl纤维素DEAE膜上回收RNA来分析样本的优选方法(非可过滤液体)。在用DNA酶温育后，通过在DEAE膜上离心溶解产物，从多达1000mL的样本中提取细菌或真菌-酵母核糖核酸的特异性。
酶促溶解
1-在样本中加入xmL溶解缓冲液。摇晃并在35℃±2℃下温育1小时。
2-加入xmL溶解缓冲液。摇晃并在50℃±2℃下温育30分钟。
或者机械溶解
1-加入xmg酸洗玻璃珠(直径为100-500μm)和xμL溶解缓冲液。
2-在Mixer Mills MM300(Retsch)中以最大速度破坏细胞90分钟。
3-在完全溶解后，将溶解产物加到预过滤膜(聚丙烯10μm)上来截留大小超过10μm的颗粒。被过滤的溶液含有核酸。
4-将溶解产物加到预洗涤的DEAE膜上来截留所有核酸。离心并洗涤膜。
5-通过离心或使用真空泵，加入盐(达1mL)来在灭菌的干净试管中回收核酸。
6-用商业试剂盒处理溶解产物来进行RNA纯化。本发明的优选RNA提取试剂盒是工作台MagNaPure LCTM(Roche Diagnostics)上的“MagNaPure LC RNA分离试剂盒II”。洗脱体积达100μL。在纯化过程中用DNA酶温育。
7-2μL(达5μL)的纯化RNA提取物被用于一步实时RT-PCR(LightCyclerTM)，采用如Tth的酶和如下具有Taqman探针的程序：
I：反转录              61℃/20分钟(20℃/秒)
II：变性               95℃/30秒(20℃/秒)
III：PCR(35个循环)     95℃/5秒(20℃/秒
                       60℃/30秒(20℃/秒)
在60秒后，测定发射的荧光。
8-2μL(达5μL)的纯化RNA提取物被用于一步实时RT-PCR(LightCyclerTM)，采用如Tth的酶和如下具有杂交探针(HybridizationProbe)的程序：
I：反转录              61℃/20分钟(20℃/秒)
II：变性               95℃/30秒(20℃/秒)
III：PCR(35个循环)     95℃/2秒(20℃/秒
                       58℃/8秒(20℃/秒)
                       72℃/16秒(20℃/秒)
在8秒后，测定发射的荧光。
                       序列表
<110>吉诺生命公司
<120>用于广泛检测工业产品中的生物体的一步实时RT PCR试剂盒
<130>D20782
<150>US 60/425,327
<151>2002-11-12
<160>19
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(22)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>1
tggagcatgt ggtttaattc ga
22
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(19)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>2
tgcgggactt aacccaaca
19
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(21)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>3
agagtttgat catggctcag a
21
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(21)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>4
ttaccccacc tactagctaa t
21
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(22)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>5
gyggagcatg tggyttaatt cg
22
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(20)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>6
ttgcgctcgt trcgggactt
20
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(19)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>7
gggaaactca ccaggtcca
19
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(22)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>8
cgttatcgca attaagcaga ca
22
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(21)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>9
ggtaacgggg aatwagggtt c
21
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(20)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>10
ttgggtaatt tgcgcgcctg
20
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(23)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>11
tgcatggytg tcgtcagctc gtg
23
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(21)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>12
gagtggcgga cgggtgagta a
21
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(20)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>13
acaggtggtg catggttgtc
20
<210>14
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(22)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>14
tcagctcgtg tcgtgagatg tt
22
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(20)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>15
acaggtgctg catggctgtc
20
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(22)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>16
tcagctcgtg ttgtgaaatg tt
22
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(24)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>17
aggattgaca gattgagagc tctt
24
<210>18
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(19)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>18
cggagaggga gcctgagaa
19
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<221>来源
<222>(1)..(20)
<223>/注释＝″人工序列的描述：寡核苷酸引物″
<400>19
cggctaccac atccaaggaa
20

Claims (10)

1.用于检测在怀疑含有所述细菌和/或真菌的样本中存在的细菌或真菌-酵母核糖核酸(RNA)的方法和试剂盒，其中所述多核苷酸包含所选择的目标区域，所述方法包括：
(a)在用DNA酶温育后，在膜和/或DEAE树脂上进行离心过滤，从多达1000ml的样本中提取细菌或真菌-酵母核糖核酸(RNA)，
(b)在允许多核苷酸杂交到核糖核苷酸目标区域和所述聚合酶和用于cDNA合成的所述的DNA聚合酶的逆转录酶活性的条件下，用具有RNA依赖的逆转录酶活性和DNA依赖的聚合酶活性的热稳定性酶，使得在单一试管反应中进行RT和PCR，例如Tth DNA聚合酶，以及具有选自如下的核苷酸序列的多核苷酸引物来温育细菌或真菌-酵母核糖核酸(RNA)：
Seq ID No 2    TGCGGGACTTAACCCAACA      [反向引物]
Seq ID No 4    TTACCCCACCTACTAGCTAAT    [反向引物]
Seq ID No 6    TTGCGCTCGTTRCGGGACTT     [反向引物]
Seq ID No 8    CGTTATCGCAATTAAGCAGACA   [反向引物]
Seq ID No 10   TTGGGTAATTTGCGCGCCTG     [反向引物]
以及
(c)用所述DNA聚合酶以及具有选自如下核苷酸序列的多核苷酸引物和探针，通过聚合酶链式反应扩增cDNA到可检测水平：
Seq ID No 1    TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA    [正向引物]
Seq ID No 2    TGCGGGACTTAACCCAACA       [反向引物]
Seq ID No 3    AGAGTTTGATCATGGCTCAGA     [正向引物]
Seq ID No 4    TTACCCCACCTACTAGCTAAT     [反向引物]
Seq ID No 5    GYGGAGCATGTGGYTTAATTCG    [正向引物]
Seq ID No 6    TTGCGCTCGTTRCGGGACTT      [反向引物]
Seq ID No 7    GGGAAACTCACCAGGTCCA       [正向引物]
Seq ID No 8    CGTTATCGCAATTAAGCAGACA    [反向引物]
Seq ID No 9    GGTAACGGGGAATWAGGGTTC     [正向引物]
Seq ID No 10   TTGGGTAATTTGCGCGCCTG      [反向引物]
Seq ID No 11    TGCATGGYTGTCGTCAGCTCGTG   [正向探针]
Seq ID No 12    GAGTGGCGGACGGGTGAGTAA     [正向探针]
Seq ID No 13    ACAGGTGGTGCATGGTTGTC      [正向探针]
Seq ID No 14    TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT    [正向探针]
Seq ID No 15    ACAGGTGCTGCATGGCTGTC      [正向探针]
Seq ID No 16    TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTT    [正向探针]
Seq ID No 17    AGGATTGACAGATTGAGAGCTCTT  [正向探针]
Seq ID No 18    CGGAGAGGGAGCCTGAGAA       [正向探针]
Seq ID No 19    CGGCTACCACATCCAAGGAA      [正向探针]。
2.根据权利要求1所述的方法和试剂盒，其中通过如同Tth聚合酶的酶的逆转录酶活性来合成的cDNA目标序列，通过一步实时RT-PCR，在同一试管中通过DNA聚合酶的DNA依赖的聚合酶活性来扩增。
3.根据权利要求1和2所述的方法和试剂盒，其中用于检测细菌的组合物包括由如下序列组成的多核苷酸引物和探针
Seq ID No 1    TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA      [正向引物]
Seq ID No 2    TGCGGGACTTAACCCAACA         [反向引物]
Seq ID No 11   TGCATGGYTGTCGTCAGCTCGTG     [正向探针]。
4.根据权利要求1和2所述的方法和试剂盒，其中用于检测细菌的组合物包括由如下序列组成的多核苷酸引物和探针
Seq ID No 3    AGAGTTTGATCATGGCTCAGA       [正向引物]
Seq ID No 4    TTACCCCACCTACTAGCTAAT       [反向引物]
Seq ID No 12   GAGTGGCGGACGGGTGAGTAA       [正向探针]。
5.根据权利要求1和2所述的方法和试剂盒，其中用于检测细菌的组合物包含由如下序列组成的多核苷酸引物和探针
Seq ID No 5    GYGGAGCATGTGGYTTAATTCG      [正向引物]
Seq ID No 6    TTGCGCTCGTTRCGGGACTT        [反向引物]
Seq ID No 13   ACAGGTGGTGCATGGTTGTC        [正向探针]。
Seq ID No 14    TCAGCTCGTGTCGTGAGATGTT    [正向探针]
Seq ID No 15    ACAGGTGCTGCATGGCTGTC      [正向探针]
Seq ID No 16    TCAGCTCGTGTTGTGAAATGTT    [正向探针]。
6.根据权利要求1和2所述的方法和试剂盒，其中用于检测真菌-酵母的组合物包含由如下序列组成的多核苷酸引物和探针
Seq ID No 7    GGGAAACTCACCAGGTCCA        [正向引物]
Seq ID No 8    CGTTATCGCAATTAAGCAGACA     [反向引物]
Seq ID No 17   AGGATTGACAGATTGAGAGCTCTT   [正向探针]。
7.根据权利要求1和2所述的方法和试剂盒，其中用于检测真菌-酵母的组合物包含由如下序列组成的多核苷酸引物和探针
Seq ID No 9    GGTAACGGGGAATWAGGGTTC      [正向引物]
Seq ID No 10   TTGGGTAATTTGCGCGCCTG       [反向引物]
Seq ID No 18   CGGAGAGGGAGCCTGAGAA        [正向探针]
Seq ID No 19   CGGCTACCACATCCAAGGAA       [正向探针]
8.根据权利要求1-6的任何一项所述的方法和试剂盒，其中用于检测所有细菌和/或真菌-酵母的引物和探针的优选组合由如下序列组成：
Seq ID No 1+Seq ID No 2+Seq ID No 11
或
Seq ID No 3+Seq ID No 4+Seq ID No 12
或
Seq ID No 5+Seq ID No 6+Seq ID No 13+Seq ID No 14+SeqID No 15+Seq ID No 16
或
Seq ID No 7+Seq ID No 8+Seq ID No 17
或
Seq ID No 9+Seq ID No 10+Seq ID No 18+Seq ID No 19
或
Seq ID No 1+Seq ID No 2+Seq ID No 11+Seq ID No 7+Seq ID
No 8+Seq ID No 17
或
Seq ID No 3+Seq ID No 4+Seq ID No 12+Seq ID No 7+Seq IDNo 8+Seq ID No 17
或
Seq ID No 5+Seq ID No 6+Seq ID No 13+Seq ID No 14+SeqID No 15+Seq ID No 16+Seq ID No 9+Seq ID No 10+Seq IDNo 18+Seq ID No 19。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法和试剂盒，其中多核苷酸引物和探针可以是天然核酸或与核酸(DNA和RNA)杂交的肽核酸(PNA)。
10.根据权利要求1-9的任何一项所述的方法和试剂盒，还定量这种RNA来与来自例如大肠杆菌和假丝酵母属的被定量的外链标准RNA比较。
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