CN1140762A - 在硫代磷酸酯化引物存在下用核酸外切酶进行聚合酶链反应扩增前消毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了PCR扩增靶核酸的混合物和方法,其中用含有硫化磷酸酯化寡聚核苷酸引物和一种核酸外切酶的PCR反应混合物增加扩增效率。本发明还提供了扩增靶核酸的药盒。
Description
聚合酶链反应(PCR)能够扩增和测定少量的靶核酸。PCR的实际操作局限性包括由前次反应遗留的扩增核酸造成的污染,导致假阳性结果,以及其它非特异性产物如引物二聚体的生产和扩增导致假阴性结果。本发明提供了一种能克服这些局限性的PCR方法,这种PCR方法使用了硫代磷酸酯化的引物,并且在核酸外切酶存在下进行了扩增前的消毒。
PCR技术能够扩增并随后测定少量的靶核酸。现有技术如Mullis等的U.S 4,683,195,Mullis等人的US 4,683,202和Mullis等的4,965,188中详细描述了PCR的细节。一般是把寡聚核苷酸引物退火形成靶核酸的变性链,用聚合酶聚合三磷酸脱氧核苷形成引物扩大产物。典型的PCR方法包括在一种热稳定性聚合酶作用下重复循环模板核酸变性,引物退火和该退火引物的扩大。这些步骤使得靶核酸指数扩增,并由此可以测定以非常低的浓度存在于样品中的靶物质。
PCR可广泛应用于各种不同领域如生物技术研究,临床诊断和法医中。尽管如此,该方法因受到使用局限性的影响而不能达到最理想的效率和特异性。具体来说,在PCR实验的第一步循环(即″零循环″)前,一般要混合扩增试剂并在室温或更低温度下存放。因为象Thermus aquaticus (Taq)聚合酶这样的热稳定性聚合酶即使在0℃下仍有残存的活性,经低约束的活化和扩大能够形成相对大量的非特异性产物。已知是零循环人为构造的这些非特异性产物包括连接在3'-末端有同源性的引物所形成的引物二聚体。由于相对于通常靶物质的低浓度而言PCR中所用引物只是毫摩尔浓度,引物二聚体的形成是显著的。因此引物-二聚体是尤其普遍的零循环人为构造。基于其他引物的扩增***,如固相扩增,同样也会受到引物-二聚体人为构造的影响。
在扩增过程中形成零循环人为构造会带来实际操作的后果。一些试剂,包括引物和脱氧核苷,会被减少。而非特异性副产物就靶物质而言会作为聚合酶的竞争性抑制剂和该反应的其他限制性成份。结果,放大效率降低,而检测的准确性也降低。同样,由于以前放大样本遗留下来造成的引物-二聚体的存在也是有害的。任何扩增效率的降低都会不利地影响这种测定方法的测定限度,并且由此可能会引起假阴性结果。引物二聚体的形成能够把靶物质扩增效率降低到这样一种程度,即所扩增的产物在染色凝胶上测定不到。在病原体如HIV的检测试验中,这种结果很明显是不理想的。
在同源性PCR反应中特异性是非常重要的。参见,如Mitoma的EPA 487218;Higuchi的EPA 512334。在同源的测定中,扩增过程中或扩增后把反应混合物与一种荧光颜料接触就能够偶联PCR扩增和测定反应,其中的荧光颜料一旦与双股核酸反应就能够产生可测定的荧光变化。例如,在溴化乙锭存在下进行PCR时,双股DNA的产生与游离溴化乙锭***双股DNA中形成的荧光增强相关联。通常在同一容器中进行扩增和测定。荧光的变化可用分光光度测定测得,因此这样的测定既不需要分离PCR的产物也不需要杂交。因为测定一般是以双股DNA的形成为基础的,并且在靶DNA和非特异性产物之间难以辨别,所以双股人为构造引物二聚体的形成对同源测定法的特异性是影响极大的。
PCR的其它显著的操作局限性是由实验室环境中的外源DNA污染或者由能在后扩增中作模板的前次扩增DNA(扩增子)携带所产生的污染造成的。扩增子遗留物一般会造成假阳性结果,而引物二聚体的遗留会造成假阴性结果。
人们已经开发了各种方法来克服这些局限性,并且因此也增加了PCR的特异性和效率。理论上认为选择无3′-互补性的引物就能把引物二聚体人为构造降到最低。但是,实际上,特别是在使用所需的引物混合物中,一些3′-互补性是不可避免的。通常在共同扩增许多菌株或靶物质等位基团时要使用大量的引物。
通过增加严格性条件,例如通过增加退火温度或加入变性剂也能够改良特异性。但是,由于降低了对在较低严格性条件下可以扩增的靶物质突变型的实验检测能力,所以增加严格性条件会产生假阴性结果。
在减少零循环人为构造的其它方法中,所谓的PCR热启动方法,是向热试剂混合物中加入聚合酶来开始反应的。(参见,如Erlich等人(1991)
Science 252:1642)。因为引物间的交叉反应所形成的反应中间体对热不稳定,所以减少了引物二聚体。尽管如此,这种方法却在室温下制备是不方便的,并且把聚合酶手工加入多个(一般是96个)PCR试管所造成的时间误差会带来复杂性。另外,因加入酶必须打开试管,所以″热启动″会增加由扩增子和/或引物二聚体携带污染的可能性。
人们已经利用热不稳定物理障碍,如石蜡珠或包裹层(overlays)把一种或多种PCR组份与其它组份进行物理分离,直到达到适合高严格条件下活化的温度为止(参见,如Hebert等(1993)
Molecular andCellular Probes I:249)。但是,这些方法一般都不很方便,并且需要很好的手工熟练性。
人们已经使用Taq聚合酶的热不稳定抗体在低温下抑制Taq聚合酶,来试图限制零循环的人为构造(参见,如Sharkey等(1994)Bio/Technology 12:506;Scalice等的US 5,338,671)。在PCR热循环中升高温度时,该抗体会发生热变性,并且释放出活性聚合酶。但是,即使亲合性的抗体也不能完全抑制聚合酶的活性。例如,1毫摩尔具有1010M-1亲和力的抗体作用于100毫升10纳摩尔浓度的聚合酶达到平衡时会留下6千万个游离活性聚合酶分子。由于PCR中所用的引物浓度相对较大,因而不管怎样都会形成并扩增数目可观的引物二聚体中间体。
人们已经开发出各种扩增前消毒的方法来把扩增子遗留降到最低。在扩增前步骤中,已经使用尿嘧啶-N-糖基酶(UNG)来裂解在零循环过程中掺入尿嘧啶残余物时所制备的产物。(参见,如,Longo等(1990)
Gene 93:125;Espy等(1993)
J.Clin Microbiol 31:2361。)在PCR中三磷酸脱氧尿苷(dUTP)取代了三磷酸脱氧胸苷(dTTP),这样能够将模板DNA与PCR的产物区别开。把UNG酶包括在预混物中,并且由它催化从PCR第一循环前反应中存在的单胶或双胶DNA上切割尿嘧啶。所得到的非碱性(abasic)聚核苷酸容易水解,并且在PCR过程中不能起模板作用。当UNG经热变性显示出失活性,残余的活性仍可以降低PCR过程中所合成产物的扩增。而且,Longo等已比较过有UNG处理和无UNG处理时扩增产物的相对量,并且已报道在有UNG处理的反应中该扩增靶物的密度下降。所以不能期望UNG处理来解决产物扩增效率低的问题。此外,据报道UNG不能有效地作用于少于100个碱基对的扩增子,例如引物二聚体(Espy等)。
也有报道用核酸外切酶进行扩增前消毒。Muralidhar等人(1992)
Gene 117:107公开了噬菌体T7核酸外切酶能使PCR携带产物的分子失活,但据报道它却能使基因组DNA靶物质完整无损。由于污染的扩增子相对于基因组靶分子是对称的几何学结构,所以据报道它优先失活。Zhu等人(1991)
Nucleic Acids Res,19:251报道在PCR前用核酸外切酶III(ExoIII)消毒能降低扩增子和引物二聚体的延续。Exo III能够催化5个单核苷酸从双螺旋DNA的3′羟基端的顺序裂解,并且据报道由于侧链DNA序列的长度也能使基因组DNA保持较大程度的完整。
扩增前用核酸外切酶如Eox III消毒是基于已报道的该核酸外切酶对双股DNA的特异性。特别是就Exo III而言,现有技术已经清楚ExoIII不能降解单股靶DNA。参见,如Zhu等人;PromegaCatalog,1994,136。任何单股核酸外切酶活性都能降解单一的引物链,因而降低了扩增效率,并增加了假阴性结果的可能性。
按照本发明人们已经发现由Zhu等所描述的扩增前用核酸外切酶如ExoIII消毒会导致来自低含量基因组靶物质信号的降低。这种信号降低的后果是增加了假阴性结果的可能性,特别在疾病的诊断中它会伴随着严重的一系列影响。靶信号的损失,归因于基因组靶物质的降解。按照本发明人们已经发现扩增效率的下降应归因于单股引物的降解,与本领域教导的有关Exo III的双股特异性相反。所以本发明提供了对以前未意识到的问题的识别,并且还针对该问题提供了一种解决办法以及一种增加PCR效率的方法。
本发明教导了一种扩增靶核酸的方法,它包括把一种可能含有靶核酸的样品与至少两种寡聚核苷酸引物接触,这些引物与杂交到其上的靶核酸区充分互补。其中各个寡聚核苷酸引物含有至少一个硫化磷酸酯键,另外该样品还要与至少四个不同的三磷酸核苷,一种热稳定性聚合剂以及一种核酸外切酶接触来形成一种反应混合物;把该反应混合物加热使核酸外切酶失活,并且形成引物扩大产物。
本发明还提供了一种扩增靶核酸的药盒,它在同一个或不同的容器中含有一种热稳定性聚合剂,一种核酸外切酶以及至少两种引物,该引物与杂交到其上的核酸区充分互补,其中各个寡核苷酸引物至少含有一个硫化磷酸酯键。
在另外一个实施方案中,本发明提供了一种用于PCR的混合物,它含有一种核酸外切酶和至少两种寡聚核苷酸引物,其中各个寡聚核苷酸引物含有至少一个硫化磷酸酯键。该混合物也含有一种热稳定性聚合剂,三磷酸核苷,抗该聚合剂的一种单克隆抗体以及PCR的其它试剂。
本发明提供了一种扩增靶核酸的方法,该方法在不影响扩增效率的前提下比PCR的常规法降低了扩增子和引物二聚体以及零循环的其它人为构造的携带污染。具体地说,本发明方法在扩增前步骤中使用一种核酸外切酶来降解携带的DNA和零循环人为构造,并且使用硫化磷酸酯化引物来避免在这之前因核酸外切酶产生的意外引物降解。
在本领域中大家都熟知PCR的原理和扩增及测定靶核酸的条件,并且它们都可在本领域熟练技术人员所熟知的大量文献中找到,例如Mullis等的US4,683,195,Mullis等的US 4,683,202以及Mullis等的US 4,965,188。简要地说,在能够与扩增区侧面的靶序列互补的两种寡聚核苷酸引物存在下,把可能含有靶核酸的样本加热使双股核酸变性。引物退火形成分离的靶链,并用一种聚合剂如一种热稳定性聚合酶从各个3′羟基端延伸。用PCR能够扩增双股或单股的DNA。经过RNA反转录成cDNA的方法,RNA也能作为一种靶物质。在不连续的温度下进行变性,引物退火和DNA合成步骤,并且重复这一循环使得该靶核酸呈指数累积。PCR的容器一般是一种带塞的塑料容器或一种小杯或者如美国专利US 5,229,297中所描述的小盒。PCR扩增试剂典型地混合在一个容器中,一般包括引物,三磷酸核苷(一般是dATP,dCTP,dGTP和dTTP或dUTP),热稳定性DNA聚合酶,含镁的缓冲液以及靶核酸。PCR的试剂和条件对本领域普通技术人员是熟知的,并且能在如Guatelli等(1989)
Clin Microbiol Rev 2:217中找到。对RNA靶物质的扩增来说,除了热稳定性DNA聚合酶外还可以使用一种反转录酶或者用反转录酶替代热稳定DNA聚合酶。特别适用的是热稳定性反转录酶,具有反转录酶活性的热稳性DNA聚合酶也是适用的。RNA靶物质的PCR扩增方法对本领域普通技术人员是熟知的,并且在例如美国专利US 5,176,995,5,310,652和5,322,770中进行了描述。本发明也可用于以其它引物为主的核酸扩增方法,例如在国际专利中请WO 9300447中所述的LCR和缺隙LCR中使用。
本发明提供了一种已知核酸扩增方法的改良方法,从而提高了靶核酸的扩增效率,并减少了假阴性和假阳性结果。具体地说,本发明方法降低了零循环人为构造的形成,包括引物二聚体的形成,同时增加了靶DNA的扩增效率。引物二聚体可以是由两个引物及其互补序列组成的双股PCR产物。引物间可以***其它碱基。(Erlich等人,(1991)
Science 252:1643)。当引物在3′端有互补性时特别有利于引物二聚一体的形成,引物二聚体的形成使扩增效率降低到这样一种程度,即测定不出所扩增的靶物,从而造成了假阴性结果。用本发明方法克服的PCR常规方法的其它局限性是样品携带污染的扩增。PCR样品可被前次PCR中产生的扩增子或可扩增的产物分子或引物二聚体分子所污染。这类分子的扩增常常会造成错误的结果。
所以本发明方法也使假阴性和假阳性结果得到减少并使扩增的效率得到提高。
按照本发明的方法,在一种3′核酸外切酶存在下进行扩增前消毒。优选优先降解双股DNA的核酸外切酶。这种扩增前消毒是降解双螺旋结构的人工产物如引物二聚体以及携带的扩增子。在一个优选方案中,3′核酸外切酶选自于核酸外切酶I,核酸外切酶III(ExoIII),核酸外切酶VIII以及核糖核酸酶II。在最佳方案中核酸外切酶是Exo III。这些核酸外切酶对本领域普通技术人员是熟知的,并且从商业上可以得到。
按照本发明意外地发现对双股DNA具有特异性的核酸外切酶还能够降解单股DNA引物。对单股引物的降解可以达到这种程度,即减少或中止靶序列的扩增,从而导致无效扩增或假阴性结果。本发明方法在PCR中使用硫化磷酸酯化引物解决了这个问题。由于保护了硫化磷酸酯化引物不受核酸外切酶的消化,所以PCR中使用这类引物可以在每个样品中使用增加量的核酸外切酶和/或增加孵育时间。反过来,使用增加量的核酸外切酶和/或增加孵育时间。提高了核酸酶前处理的效率,从而进一步提供保护,不受引物二聚体分子和PCR产物遗留的有害影响。
硫化磷酸酯化引物是寡聚核苷酸引物,其中用硫取代了核苷酸磷酸基团中的一个或两个非桥接的氧。寡聚核苷酸中硫代磷酸酯核苷酸间键合的存在可引起对核酸外切酸的抑制,因此减缓或中止了硫化磷酸酯化引物的降解。硫化磷酸酯化引物可由本领域中熟知的化学或酶的方法制得,并且已公开于例如Eckstein(1985)
Ann, Rev Biochem 54:367,Zon等(1991)
Anti-Canc,Drug Des 6:539,和Olsen等(1990),
Proc Natl Acad Sci USA 87:1451,以及US 5,003,097中。硫化磷酸酯化的核苷酸衍生物也可以从商业上获得。
该引物的一个或多个或全部核苷酸间键合可以是硫化磷酸酯部分。在一个优选方案中,该寡聚核苷酸含有一到四个硫化磷酸酯键。在距该引物的3′末端,次末端,第三位,第四或第五位上优选有至少一个硫化磷酸酯键。该硫化磷酸酯键可以相互间隔或相邻。在一个优选方案中,该键相邻并位于引物的3′端,在另一个优选方案中,该引物至少在距其3′端的末端和次末端位置上含有一个硫化磷酸酯键。在另一个优选方案中,该引物至少在距其3′端的末端位置上含有一个硫化磷酸酯键。在一个模型***中,如实施例1和3所述的***中,本领域普通技术人员可以通过在硫化磷酸酯化引物和一种3′核酸外切酶存在下测定扩增来确定硫化磷酸酯残基的适当数目和位置。
在本发明的方法中,PCR扩增是在一种核酸外切酶和硫化磷酸酯化引物存在下预保温所有的PCR试剂和含有靶核酸的样品来实现的。在足以使该核酸外切酶失活的条件下加热所得到的反应混合物,然后形成和扩增引物扩大产物。
本发明方法主要适用于本领域已知是同源性测试或同源性检测***的PCR扩增和测定方法中。这些***在本领域中是众所周知的,并且在例如已公布的欧洲专利申请91310062.4(487218)和92106989.4(512334)中进行了描述。在同源性***中,扩增DNA的测定是基于结合在双股DNA中的荧光化合物所产生的荧光变化而进行。因为测定一般是基于双股DNA的形成,并且一般不能分辨出靶DNA和非特异性产物,所以双股人为构造如引物二聚体的形成对该同源测定法的特异性是不利的。按照本发明,减少了引物二聚体,从而增加了该同源测定方法的特异性。
PCR所需要的试剂对本领域普通技术人员是熟知的,它一般包括至少两种足以与杂交到其上的靶核酸,保守区域互补的寡聚核苷酸引物,四种不同的三磷酸核苷,一种热稳定性聚合剂和该聚合剂所必需的任何辅助因子。优选的三磷酸核苷是三磷酸脱氧核苷dATP,dCTP,dGTP和dTTP或dUTP,共同称之为dNTPs。三磷酸核苷从商业上可以获得。
引物包括天然产生的或合成生产的寡聚核苷酸,在适当条件下,即有三磷酸核苷,一种聚合剂,适当温度,pH和缓冲液存在下,它能够使靶核酸退火并且作为核酸合成的起点。引物具有与杂交到其上的靶核酸足够互补的序列,并且足够长,一般10-60个核苷酸,能够在聚合剂存在下引导扩大产物的合成。引物可以由本领域普通技术人员所熟知的方法自动合成生产。上文已描述了硫化磷酸酯化引物的合成。
引物设计的一些因素是本领域中所熟知的。选择基本上与所扩增的具体核酸链序列互补的引物,使得由一个引物合成的扩大产物当从它的补体中分离出来时能够作为其它引物扩大产物的模板。优选的引物具有与靶区精确的互补性。
聚合剂是能够实现引物扩大产物合成的化合物,这种聚合剂是热稳定的,即在PCR中使DNA链变性的常用温度如93-95℃期间加热时并不是永久性失活的,并且优选高温时具有活性。在一个优选方案中该聚合剂是一个热稳定的DNA聚合酶,例如包括从嗜热细菌如Thermococcus Litoralis,Bacillus Stearothermophilus, Methanothermus fervidus,水生栖热菌,T.filiformis,T.flavus, T.1acteus,T.rubens,T.ruber和T.thermophilus;或者从嗜热的古细菌如Desulfurococcus mobilis,热自养甲烷杆菌,Sulfolobussolfataricus,S.acidocaldarius和
嗜酸热原体中得到的DNA聚合酶。在最佳方案中,该聚合剂是水生栖热菌(Taq)聚合酶,T.themophilus(Tth)聚合酶或
Thermococcus litoralis聚合酶。热稳定的反转录酶,有反转录酶活性的DNA聚合酶也作为聚合剂。
这种热稳定聚合酶可以从商业上获得或者用本领域中已知方法得到。特别是Taq聚合酶能以重组体和天然形式从商业上获得(Perkin Elmer-Cetus)或者用Lawyer等人(1989)
J.Biol.Chem .264:6427或美国专利US 4,889,818中所述的方法生产。Tth聚合酶在商业上可以从芬兰的Finnzyme公司和日本的Toyobo Co.公司获得。
Thermococcus litoralis聚合酶在商业上可以从NewEngland Biolabs获得,并且能够用美国专利US 5,322,785中所述的方法生产。
在扩增前步骤中可以包含有该热稳定聚合剂的特异性抗体在扩增前抑制该聚合剂。这些抗体能够用本领域普通技术人员所熟知的方法生产,并且在例如Harlowe等人(1988)
Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,NY中可以发现。按照本发明,术语抗体包括用常规方法生产的单克隆和多克隆抗体,重组法生产的抗体,以及化学方法或重组法生产的抗体片段,如Fab片段。在优选方案中该抗体是单克隆抗体。
在本发明的一个优选方案中,抗体是抗Taq聚合酶,Tth聚合酶,或者
Thermococcus litoralis聚合酶的单克隆抗体。在更为优选的方案中,抗体是抗Taq聚合酶的单克隆抗体。抗Taq聚合酶的单克隆抗体在现有技术中是已知的,并且在例如美国专利US 5,338,671中进行了描述。按照本发明,定义为对聚合剂有特异性的抗体是那些能够在20-40℃左右的温度下抑制该聚合剂酶活性的抗体。在PCR热循环中用升高温度的方法使本发明的抗体失活。用如Sharkey等(1994)
Biotechnology 12:506中所述的本领域普通技术人员已知的测定方法能够测出抗体抑制聚合酶酶活性的能力。
按照本发明中所用的核酸外切酶可以从商业上得到或者用现有技术中的已知方法获得,它包括如,核酸外切酶III(Exo III),核酸外切酶I、核酸外切酶VIII以及核糖核酸酶II。核酸外切酶对本领域普通技术人员是熟知的,并且由如Fasman ed,(1989)Practical Handbock of Biochemistry and Molecular Biology CRC Press,BocaRaton,FL.进行过描述。按照本发明优先使用3′核酸外切酶。也可以使用优先作用了双股DNA或单股DNA的核酸外切酶。优选的是优先作用于双股DNA的核酸外切酶在一个优选方案中,核酸外切酶是Exo III。在另一个优选方案中,使用一种以上的核酸外切酶。例如,把优先降解双股DNA的一种核酸外切酶混合物与优先降解单股DNA的一种核酸外切酶混合物如Exo I一起使用。在95℃使该核酸外切酶失活能进一步防止热循环过程中核酸外切酶的活性,所以该核酸外切酶必须能在95℃失活。
本发明提供了一种在可疑含有靶核酸的样品中扩增靶核酸,并可以随后测定该核酸的方法,该样品可以是怀疑含有靶核酸的任意样品,它包括如,组织样品,血,头发,体液,细菌,病毒、真菌,细菌感染的细胞,病毒感染的细胞等等。靶核酸可以是DNA或RNA。在被扩增的序列两端必须知道足够数目的碱基对以设计能够在适当位置杂交到靶核酸不同链的PCR扩增引物。在PCR前通过,例如,从样品中除去蛋白或细胞物可以把靶核酸从组织样品中提取或部分提取出来。从样品中提取核酸的方法对本领域普通技术人员来说是熟知的,并且可以在例如Sambrook等(1989)
Molecular Cloning:
A Laboratory Manual cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold,Spring Harbor,NY和Saiki等,(1985)
Bio Technology 3:1008中找到。
在本发明的扩增方法中,把样品或从该样品中提取的核酸制剂与PCR常用的试剂接触来形成一种反应混合物,这种PCR的常用试剂包括至少两种改良的含有至少一种硫化磷酸酯键,寡聚核苷酸引物,四种不同的三磷酸核苷,一种热稳定聚合剂,以及一种适当的缓冲液,并且还含有一种核酸外切酶。在另一个实施方案中,这混合物中还包含了对聚合剂有特异性的抗体。
这些常用的PCR试剂,包括引物,三磷酸核苷,聚合剂以及适当的缓冲液是以适合于PCR的常用浓度来使用的,并且对本领域普通技术人员是熟知的。在一个优选方案中,三磷酸核苷是dATP,dCTP,dGTP和dTTP。在一个优选方案中,该聚合剂是一种热稳定的DNA聚合酶,优选的DNA聚合酶是Taq聚合酶,Tth聚合酶和
Thermococcus lito- rals聚合酶。Taq聚合酶是最佳的。
对聚合剂特异性的抗体是以室温下有效抑制聚合剂的浓度来使用的。这种抗体可以是单克隆或多克隆,或一种抗体的片段。在一个优选方案中,该抗体是单克隆抗体,并且是以高于该聚合剂5到500左右的摩尔比来使用的。在一个最佳方案中,该聚合剂是Taq聚合酶;该抗体是对Taq聚合酶有特异性的单克隆抗体。
核酸外切酶可以0.001单位/微升到10单位/微升左右的浓度来使用。一个优选方案中,核酸外切酶是Exo III,并且是以0.01单位/微升到0.5单位/微升左右的浓度使用。在一个最佳的方案中,ExoIII是以0.2单位/微升使用。一个单位的ExoIII被定义为37℃30分钟内从氘标记的DNA双螺旋中生产1纳摩尔该可溶性核苷酸所需的Exo III的量。本领域熟练技术人员能够测定出核酸外切酶的适当浓度,该浓度可随靶物质的浓度和其它试验条件的变化而改变。
把样品与PCR试剂,硫化磷酸酯化引物和核酸外切酶接触之后,在热循环前,把该反应混合物加热使核酸外切酶失活。在一个优选方案中,把混合物加热到85℃-95℃约3到约10分钟。在最优选的方案中,把该混合物存放在室温下0-8小时,然后在40℃左右孵育约5分钟,再加热到85℃到95℃左右至少3分钟。
加热变性后,进行退火。续展和变性的标准PCR循环。循环参数对本领域普通技术人员是已知的,并且对特殊条件要求能够很容易地进行调整。这种扩增方法最好以一种连续自动的方式进行。进行自动PCR的适当仪器对本领域普通技术人员是熟知的,并且在例如美国专利US 4,965,188,5,089,233和5,229,297中进行了描述。本领域的熟练技术人员也能够很容易地测出所扩增的产物,例如用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,并且用溴化乙锭染色法显影,或者用能够与所扩增的核酸杂交的标记探针杂交法或者本领域普通技术人员所熟知的其它各种方法测定。
本发明还提供了一种PCR药盒,它在同一个或不同容器中含有一种热稳定聚合剂,一种核酸外切酶以及至少两种引物,各个引物含有至少一个硫化磷酸酯键。在另一个方案中,该药盒还含有一种对该聚合剂有特异性的抗体。还可以有其它容器以用于包含,例如,对PCR聚合剂特异性的其它抗体和PCR试剂,例如包括三磷酸核苷,引物和缓冲液。
在一个优选方案中聚合剂是一种DNA聚合酶。在更为优选的方案中聚合酶是Taq聚合酶,Tth聚合酶或Thermococcus litoralis聚合酶。Taq聚合酶是最佳的。优选的抗体是对Taq聚合酶有特异性的单克隆抗体。
在另一个优选方案中,核酸外切酶是核酸外切酶I,Exo III,核酸外切酶VIII或核糖核酸酶II。Exo III是最佳的。寡聚核苷酸引物最好在距3′末端的前5位的至少一个位置上,并且最好在至少距3′末端的末端位上含有一个硫化磷酸酯键。本发明的药盒可用于提高PCR试验方法中靶核酸的扩增效率。
本发明还提供了一种用于PCT扩增的混合物,特别是适用于PCR过程中减少非特异性核酸的形成和携带污染物扩增的混合物。该混合物含有一种核酸外切酶和至少两种PCR引物,其中各个引物含有至少一个硫化磷酸键。该混合物也可以含有其它PCR试剂,如一种热稳定性聚合剂,三磷酸核苷,抗该聚合剂的抗体,缓冲液等等。在一个优选方案中,该反应混合物含有Exo III和至少两种寡聚核苷酸引物,其中各个寡聚核苷酸引物至少在距其3′端的末端位置上含有一个硫化磷酸酯键。
下面实施例将进一步详细阐明本发明。
实施例 1
核酸外切酶III对PCR的影响
在一个测定HIV的模型***中检测相对较低浓度的Exo III对一种基因组靶物质的PCR扩增作用。该模型***使用了具有下列序列的引物SK 38和BW 17来检测定从含有一个HIV-1基因组单一整合拷贝的8E5 HUT/HIV细胞系获得的HIV靶物质:
引物SK 38:5′-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3′(SEQID NO:1)
引物BW 17:5′-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3′(SEQID NO:2)。按照美国专利US 5,003,097使用一台Perkin-Elmer/AppliedBiosystems Division Model 380B三粒DNA合成仪用固相磷酰胺(Phosporamidite)化学法制备寡聚核苷酸引物。按照美国专利US 5,3 38,671中所述制备对Taq聚合酶有特异性的单克隆抗体。按照EP-A-0482 714中所述以重组方法制备Taq聚合酶。
PCR混合物含有下列试剂:(1)1.0x PCR缓冲液(10mM Tris HCl,pH8.0,含有50mM KCl和5mM MgCl2);(2)SK38 PCR引物;(3)BW 17 PCR引物;(4)dATP,dCTP和dGTP各0.2mM;(5)dUTP 0.4mM;(6)每100μL PCR混合物中有8个单位的Taq聚合酶(一个单位被定义为在74℃ 30分钟内把10纳摩尔总核苷酸掺入一个扩大的核酸链中所需酶活性的量);(7)与Taq聚合酶的摩尔比为5∶1(TP4-9.2 ATCC HB11807)和50∶1(TP1-12.2 ATCCHB11127)的Taq抗体;(8)每100μl PCR混合物中有1μG的鲱鱼***DNA;(9)100个拷贝的HIV(8E5 HUT/HIV细胞系);(10)TE缓冲液(10mM Tris HCl,1mM EDTA)以下列浓度分别使用各PCR引物:(1)400mM;(2)100nM;(3)40nM;(4)20nM(5)10nM;(6)4nM;(7)1nM;(8)0.4nM;
在如上所述的引物浓度下,并且在每μL PCR混合物有0.02单位的核酸外切酶III(Promega Lot,# 32000)[每100μL PCR混合物2个单位]存在下或无核酸外切酶III存在下进行PCR。
使用美国专利US 5,089,233中所述的原型分析仪在美国专利US 5,229,297中所述的临床诊断PCR试剂盒条件下进行PCR扩增。全部样品重复进行两次,并且在PCR前将其在室温下放置2小时,以使核酸外切酯III在PCR混合物中保持活性。孵育2小时后,为了使核酸外切酶III和Taq抗体热变性,样品要经受由95℃ 3分钟预热组成的标准PCR循环条件,然后进行40次PCR循环(每个循环95℃15秒熔化步骤和64℃ 35秒退火/扩大步骤)。用临床诊断试剂盒检测***测定该PCT产物。用从0(白色少量或无扩增)到10(深蓝色最大扩增)的蓝色增长的比色标准能直观地解读这些测定点。这些直观的结果在下列表格中以对比样品+/-核酸外切酶III(100μL PCR混合物中2个单位)的比色值表示。引物含量:
+Exo III
- Exo III400nM 7,6.5 7,6.5100nM 0,0 7,7.5
40nM 0,0 7,6.5
20nM 0,0 2,4
10nM 0,0 0,0
4nM 0,0 0,0
1nM 0,0 0,0
4nM 0,0 0,0
引物浓度下降4倍会在含有核酸外切酶III的样品中产生阴性结果,而引物浓度下降10倍对不含核酸外切酶III的样品没有影响。引物浓度下降20倍仍然在不含核酸外切酶III的样品中具有PCR扩增。从这些结果中很明显地看出当PCR混合物的引物浓度下降时核酸外切酶III对PCR扩增具有负影响。从这一结果可以推测出在有核酸外切酶III的样品中,甚至引物浓度为400nM时,PCR扩增效率会因此下降。
实施例2
Exo III降解双股和单股DNA
对与生产者所声称的和相关的科技文献(Zhu等,(1991)Nucleic Acids Res 19:251)所相反的核酸外切酶III降解单股DNA的可能性进行研究。
把单股DNA靶物质,双股DNA靶物质,和单股寡聚核苷酸引物单独或不同混合物经受有或没有核酸外切酶III存在的扩增前消毒步骤。
以1×10-10M浓度使用单股100聚体DNA靶物质,该靶物质被定义为Syn-1的一种合成模型***。Syn-1靶物质具有下列序列:
5′-AAT-CGA-GTA-AGA-CTT-CAC-TGC-TGA-GAA-TCT-CAG-AGA-ATC-TAG-ATA-TCC-TGC-ATG-TCT-AAA-TAT-TGA-ATA-CGA-CAT-TAC-ACG-AGT-CAA-GAC-TCA-CTA-GAC-A-3′
(SEO ID NO:3)以1×10-8M的浓度使用实施例1中所述的HIV模型***双股靶物质。PCR引物Syn-1正向
5′-GTA-AGA-CTT-CAC-TGC-TGA-GAA-TCT-CAG-3′(SEQ ID NO:4)Syn-1反向,
5′-TGT-CTA-GTG-AGT-CTT-GAC-TCG-TGT-AAT-3′(SEQ ID NO:5)以总浓度2μM(即含有一个引物的2μM引物样品,含有两个引物的样品各有1μM)使用SK38和BW 17。以每50μL样品,0,10或20个单位使用核酸外切酶III(Promega,Lot # 32000)。
在典型的扩增前消毒条件(30℃ 30分件)下孵育样品。通过在95℃保温5分钟来抑制酶介导的水解以使核酸外切酶III热变性。在常规条件下把少量等份反应混合物(16μL)在4%琼脂糖凝胶上电泳,并用溴化乙锭显影。在该凝胶上观察到的结果显示于表I中。
表 I
样品 | DNA | Exo III(单位) | 谱带(+/-) |
1 | 单股靶物质 | 0 | + |
2 | 单股靶物质 | 10 | 谱带迁移;弱+ |
3 | 单股靶物质 | 20 | 谱带迁移;弱+ |
4 | 双股靶物质 | 0 | + |
5 | 双股靶物质 | 10 | - |
6 | 双股靶物质 | 20 | - |
7 | 单股靶物质双股靶物质 | 0 | + |
8 | 单股靶物质双股靶物质 | 10 | - |
9 | 单股靶物质双股靶物质 | 20 | - |
10 | Syn正向引物 | 0 | + |
11 | Syn正向引物 | 10 | - |
12 | Syn反向引物 | 0 | + |
13 | Syn反向引物 | 10 | - |
表 I (续)
样品 | DNA | Exo III(单位) | 谱带(+/-) |
14 | Syn正向引物Syn反向引物 | 0 | + |
15 | Syn正向引物Syn反向引物 | 10 | - |
16 | 单股靶物质Syn正向引物 | 0 | + |
17 | 单股靶物质Syn正向引物 | 10 | - |
18 | 单股靶物质Syn反向引物 | 0 | + |
19 | 单股靶物质Syn反向引物 | 10 | - |
20 | 单股靶物质Syn正向和反向引物 | 0 | + |
21 | 单股靶物物质Syn正向和反向引物 | 10 | - |
22 | SK38和BW17引物 | 0 | + |
23 | SK38和BW17引物 | 10 | - |
在样品2和3中,凝胶上的靶物质谱带相对于样品1下移,这表明Exo III降解减少了单股靶物的分子量。样品2和3中的靶物质谱带信号也比样品1的减低,这又表明Exo III降解了单股靶物质。
该试验表明Exo III既能够降解单股DNA又能降解双股DNA。
在所有样品类型中阳性对照(与Exo III不反应)给出了强信号带。除了样品2和3外,用Exo III以每50μL样品(单股DNA,双螺旋DNA,短PCR引物和100聚体靶序列;双螺旋DNA是SK 18/BW17***中的一个PCR产物)10或20个单位处理各种DNA,它们都被降解了,并且在电泳凝胶上测定不出来。这种外切酶III对单股DNA的降解对实施例1中所见到的外切酶III对PCR的负影响提供了一种解释。在PCR反应中PCR引物这种关键的试剂的破坏降低了引物的浓度并从而降低了PCR的扩增效率。
实施例3
硫化磷酸酯化引物可以保护免遭核酸
外切酶III的降解
本实验中使用了实施例1中所述的SK 38/BW 17 HIV PCR模型***。在PCR中用硫化磷酸酯化引物代替了未改良的引物来测定改良的引物是否可以保护免遭外切酶III的降解。在没有靶DNA存在下进行平行样品的操作以排除外切酶III对靶DNA的降解。
用美国专利US 5,003,097的方法用H-磷酸盐化学方法制备距3′-羟基末端和次末端具有硫化磷酸酯键的PCR引物SK38和BW17,在technical bulletin accompanying Cat.No.40-4036-XX,Glen Research,Sterling,Va中对此进行了描述。
全部样品包括下列试剂:
含有5mM镁的1.0×PCR缓冲液;
浓度为400nM的未改良的(SOA)或硫化磷酸酯化(thio)的SK38PCR引物;
浓度为400nM的未改良的(SOA)或硫化磷酸酯化(thio)的BW17PCR引物;
dATP,dCTP和dGTP各0.2mM;
dUTP 0.4mM;
每100μL PCR混合物含8个单位的Taq聚合酶;
与Taq聚合酶摩尔比为5∶1(TP 4-9.2)和50∶1(TP1-12.2)的Taq抗体;
每100μL PCR混合物1μg的鲱***DNA;
TE缓冲液。
样品1-10含有从8E5 HUT/HIV细胞系中获得的10个拷贝的HIV基因组靶物质。
如表II所示样品含有各种浓度的外切酶III(每100μL PCR混合物中含0,5,10,15,20个单位)。
PCR扩增中使用临床诊断PCR试剂盒和原型分析仪(Prototype Analyzer)。把所有样品进行两次操作,在室温下放置1小时后进行PCR以使外切酶III在PCR混合物中保持活性。在样品11-18中,用外切酶III孵育1小时后,向混合物中加入基因组靶DNA。在1小时孵育之后,使样品经受3分钟95℃的预加热标准PCR循环条件,使外切酶III和Taq抗体热变性,然后进行40个PCR循环(每个循环包括95℃15秒的熔化步骤和64℃ 35秒的退火/续展步骤)。PCR扩增后,每个样品的一个复制品经受临床诊断试剂盒测定***的检测。用从0(白色)到10(深蓝色)的蓝色增长比色标准能直观地解读这些测定点。从PCR试剂盒中收集其它复制品中的PCR产物,并且在2/5%琼脂糖凝胶上电泳,用溴化乙锭染色,进行测定。用紫外光将这些凝胶曝光,并用于制得Polaroid照片。
表 II
样品 | 引物 | 靶物 | EXO III(单位/100μL) | 试剂盒 | 凝胶 |
1 | SOA | b | 0 | 7 | 弱阳性 |
2 | SOA | b | 5 | 0 | 阴性 |
3 | SOA | b | 10 | 0 | 阴性 |
4 | SOA | b | 15 | 0 | 阴性 |
5 | SOA | b | 20 | 0 | 阴性 |
6 | Thio | b | 0 | 6.5 | 微弱阳性 |
7 | Thio | b | 5 | 6 | 强阳性 |
8 | Thio | b | 10 | 6.5 | 强阳性 |
9 | Thio | b | 15 | 6.5 | 强阳性 |
10 | Thio | b | 20 | 6.5 | 强阳性 |
表 II(续)
*a:Exo III孵育后加入的靶物质;b:Exo III孵育前加入的靶物质。
样品 | 引物 | 靶物 | EXO III(单位/100μL) | 试剂盒 | 凝胶 |
11 | SOA | a | 5 | 0 | 阴性 |
12 | SOA | a | 10 | 0 | 阴性 |
13 | SOA | a | 15 | 0 | 阴性 |
14 | SOA | a | 20 | 0 | 阴性 |
15 | Thio | a | 5 | 7 | 强阳性 |
16 | Thio | a | 10 | 7 | 强阳性 |
17 | Thio | a | 15 | 7 | 强阳性 |
18 | Thio | a | 20 | 6.5 | 强阳性 |
表II中显示了试剂盒测定和凝胶观察结果。样品2-5的结果表明,当使用常规引物时,外切酶III使得PCR扩增检测不出来。外切酶III对PCR的负影响归因于未改良PCR引物的降解,与基因组靶DNA的降解相反,用样品11-14中的阴性结果可证明这一点,其中在外切酶II孵育后加入了靶DNA。
如样品6-10和15-18的结果所证实的,硫化磷酸酯化PCR引物不能抑制PCR,但它却很容易被扩增,所以能够常规使用。而且,硫化磷酸酯化PCR引物受到了保护,免遭外切酶III的降解,而未改良的引物却不能。
把外切酶III与硫化磷酸酯化PCR 引物一起使用导致了产物产率的提高,这一点用样品7-10中凝胶带的密度与样品1和6的相比得到证实。这些结果可以解释为扩增前用外切酶III降解PCR引物二聚体的能力增加了PCR的扩增效率,也归因于硫化磷酯酯化的PCR引物保护免遭核酸外切酶III降解的作用。
实施例4
外切酶III不能降解低浓度的基因组靶DNA
在该试验中使用了实施例1所述的SK 38/BW17 HIV模型***。如实施例3中所述,在不同浓度的外切酶III和未改良(SOA)或硫化磷酸酯化(thio)引物存在下扩增两种含量的基因组靶物质(来自8E5 HUT/HIV细胞系中的10个拷贝和100个拷贝的HIV基因靶物质)。
所有的样品包括下列试剂:
含有5mM镁的1.0xPCR缓冲液;
400nM的实施例3中所述的未修饰的(50A)或硫化磷酸酯化的(thio)SK 38 PCR引物;
400nM的实施例3中所述的未修饰的(SOA)或硫化磷酸酯化的(thio)BW 17 PCR引物;
各0.2mM的dATP,dCTP和dGTP;
0.4mM的dUTP;
每100μL PCR混合物8个单位的Taq聚合酶;
与Taq聚合酶摩尔比为5∶1(TP4-9.2)和50∶1(TP1-12.2)的Taq抗体;
每100μL PCR混合物1μg的鲱***DNA;
TE缓冲液。
样品1-16含有10个HIV靶物质的拷贝。样品17-32含有100个HIV靶物质的拷贝。样品1-8和17-24含有未修饰的(SOA)引物,样品9-16和25-32含有硫化磷酸酯化(thio)引物。如表III所示这些样品中含有不同浓度的外切酶III。
表 III
样品 | 引物 | 靶物(拷贝) | EXO III(单位/100μL) | 凝胶 | 试剂盒中的可见值 |
1 | SOA | 10 | 0 | 弱+ | 6 |
2 | SOA | 10 | 2 | + | 6 |
3 | SOA | 10 | 4 | + | 8 |
4 | SOA | 10 | 6 | - | 7.5 |
5 | SOA | 10 | 8 | - | 0 |
6 | SOA | 10 | 10 | - | 0 |
7 | SOA | 10 | 15 | - | 0 |
8 | SOA | 10 | 20 | - | 0 |
9 | Thio | 10 | 0 | 弱+ | 6 |
10 | Thio | 10 | 2 | + | 6 |
表 III(续)
样品 | 引物 | 靶物(拷贝) | EXO III(单位/100μL) | 凝胶 | 小袋中的可见值 |
11 | Thio | 10 | 4 | + | 7 |
12 | Thio | 10 | 6 | + | 7 |
13 | Thio | 10 | 8 | + | 7 |
14 | Thio | 10 | 10 | + | 7.5 |
15 | Thio | 10 | 15 | + | 7.5 |
16 | Thio | 10 | 20 | + | 8 |
17 | SOA | 100 | 0 | 弱+ | NA* |
18 | SOA | 100 | 2 | + | NA |
19 | SOA | 100 | 4 | + | NA |
20 | SOA | 100 | 6 | 弱+ | NA |
表 III(续)
*:不可见,样品17-25得不到试剂盒结果。
样品 | 引物 | 靶物(拷贝) | EXO III(单位/100μL) | 凝胶 | 小袋中的可见值 |
21 | SOA | 100 | 8 | 弱+ | NA |
22 | SOA | 100 | 10 | - | NA |
23 | SOA | 100 | 15 | - | NA |
24 | SOA | 100 | 20 | - | NA |
25 | Thio | 100 | 0 | 弱+ | NA |
26 | Thio | 100 | 2 | + | NA |
27 | Thio | 100 | 4 | + | NA |
28 | Thio | 100 | 6 | + | NA |
29 | Thio | 100 | 8 | + | NA |
30 | Thio | 100 | 10 | + | NA |
31 | Thio | 100 | 15 | + | NA |
32 | Thio | 100 | 20 | + | NA |
PCR扩增中使用了临床诊断试剂盒和原型分析仪。把所有样品重复操作,并且在PCR前保留在室温下2小时以激活PCR混合物中的外切酶III。孵育2小时后,在40次PCR循环(每次循环有95℃15秒的烷化步骤和64℃ 35秒退火/扩大步骤)之前,样品经经受由3分钟95℃预热组成的标准PCR循环以使外切酶III和Taq抗体热变性。PCR扩增后,每种样品的一个复制品经受该临床诊断试剂盒测定***的检测。用从0(白色)到10(深蓝)之间的颜色增长的比色标准可直观地解读出测定点。从PCR试剂盒中收集其它复制品的PCR产物,并在2.5%琼脂糖凝胶上电泳,用溴化乙锭染色来测定。用紫外光照射该凝胶,并拍得Polaroid照片。
表III显示了结果,这些结果证实实施例2的结论,即外切酶III能够降解未修饰的单股PCR引物,使得产物不可测定,而且硫化磷酸酯化PCR引物受到了保护,免遭外切酶III的消化。所以,硫化磷酸酯化PCR引物的使用使得每个样品中使用了增长量的外切酶III,并且增加了孵育时间。反过来,增长量的外切酶III提供了更多的保护,以抵抗引物二聚体分子以及PCR产物和引物二聚体形式的PCR样品遗留物的抑制作用。
在含有硫化磷酸酯化PCR引物和所试验的各个浓度的外切酶III的样品中,以及在含有SOA未修饰的引物和含每100μL PCR混合物中2或4个单位的外切酶III的样品中,与不含外切酶III的两种引物类型的样品相比较,可以看到由凝胶谱带密度所证实的产物产率的提高。这应归因于PCR开始前外切酶III降解PCR引物二聚体分子的能力,从而提高了PCR反应的PCR扩增效率。尽管如此,在含有SOA未修饰PCR引物的样品中,由于外切酶III对单股DNA的降解活性,它在稍微高的浓度时会成为PCR的一种抑制剂。
在浓度增高时,核酸外切酶III不能降解基因组靶DNA,即使样品中拷贝数较少,这一点可用对10个HIV拷贝样品的一致PCR试剂盒比色值和凝胶产物谱带得到证实,其中使用硫化磷酸酯化引物。
实施例5
用核酸外切酶III和硫化磷酸酯化引物一起
进行PCR样品携带产物的消毒
本试验测定每100μL PCR混和物中20个单位的外切酶III与硫化磷酸酯化PCR引物的消毒效率。而且,把外切酶III和硫化磷酸酯引物对PCR扩增子的消毒能力与尿嘧啶-N-糖基酶(UNG)对PCR扩增子的消毒能力进行比较,其中已报道UNG具有消毒106左右扩增子的能力(Longo等)。
将从前次扩增中收集的PCR样品携带物用SK38/BW17 HIV PCR模型***进行PCR反应。这种PCR样品携带物是全部长度的预扩增PCR产物,估计浓度为1011扩增子/μL,其中在扩增中用dUTP取代dTTP,从而使产物含有尿嘧啶而不是胸腺嘧啶。把这种预扩增产物在4%琼脂糖电泳凝胶上跑带来从非特异性产物上分离该产物。然后从该琼脂糖凝胶上切割该产物谱带,并用Qiagen氏凝胶纯化药盒进行纯化。然后进行这种PCR产物的稀释,每种烯释每μL估计有下列PCR样品样品携带物扩增子。
(1)10×稀释=每μL 1010个扩增子;
(2)103×稀释=每μL 108个扩增子;
(3)105×稀释=每μL 106个扩增子;
(4)107×稀释=每μL 104个扩增子;
(5)109×稀释=每μL 102个扩增子;
把每种样品携带物稀释液各1μL加入到100μl PCR混合物中,该PCR混合物不含有基因组靶物质,(除每100μL PCR混合物中含有10个拷贝基因组HIV靶物质的阳性对照样品之外),只含有下列常规PCR试剂:
含有5mM镁的1.0×PCR缓冲液;
SK38 PCR引物(如实施例3中所述的硫化磷酸酯化的);
BW 17 PCR引物(如实施例3中所述的硫化磷酸酯化的);
dATP,dCTP和dGTP各0.2mM;
dUTP 0.4mM;
每100μL PCR混合物8个单位的Taq聚合酶;
与Taq聚合酶摩尔比为5∶1(TP4-9.2)和50∶1(TP1-2.2)的Taq抗体;
每100μL PCR混合物中1μG的鲱***DNA;
TE缓冲液。
对不含消毒试剂的样品,或者单独或一起含有外切酶III(每100μL PCR混合物20个单位,由Promega获得的,Lot # 32000)或UNG(第100μL PCR混合物1个单位,由Perkin Elmer AppliedBiosystems获得的,Lot # 0642)的样品,如表IV所示。
表 IV
样品 | 靶物(拷贝100μL) | 扩增子 | EXO III | UNG | 试剂盒比色值 |
1 | 10 | 0 | - | - | 6.5 |
2 | 10 | 0 | + | + | 6 |
3 | 0 | 102 | - | - | 5 |
4 | 0 | 102 | + | - | 0 |
5 | 0 | 102 | - | + | 0 |
6 | 0 | 102 | + | + | 0 |
7 | 0 | 104 | - | - | 5.5 |
8 | 0 | 104 | + | - | 0 |
9 | 0 | 104 | - | + | 0 |
10 | 0 | 104 | + | + | 0 |
表 IV (续)
样品 | 靶物(拷贝100μL) | 扩增子 | EXO III | UNG | 试剂盒比色值 |
11 | 0 | 106 | - | - | 6 |
12 | 0 | 106 | + | - | 5 |
13 | 0 | 106 | - | + | 6 |
14 | 0 | 106 | + | + | 6 |
15 | 0 | 108 | - | - | 6 |
16 | 0 | 108 | + | - | 6 |
17 | 0 | 108 | - | + | 5 |
18 | 0 | 108 | + | + | 6.5 |
19 | 0 | 1010 | - | - | 6.5 |
20 | 0 | 1010 | + | - | 6.5 |
21 | 0 | 1010 | - | + | 6.5 |
22 | 0 | 1010 | + | + | 6.5 |
使用临床诊断PCR试剂盒和原型分析仪(PrototypeAnalyzetrer)进行PCR扩增。扩增前把全部样品放置在室温下2小时来激活PCR混合物中的外切酶III和UNG。孵育2小时后,使样品经受10分钟95℃的预热以使UNG,外切酶III和Taq抗体热变性。然后用PCR循环的常规条件(每次循环有95℃ 15秒的熔化步骤和64℃ 35秒的退火/扩大步骤)进行40次PCR循环。PCR扩增后,把每个样品经受临床诊断试剂盒测定***的检测。用0(白色)到10(深蓝)颜色增长的比色标准直观地解读测定位点。表IV中显示了各个样品的结果。
这些结果证实了每100μL含有硫化磷酸酯化引物的PCR混合物中20个单位的外切酶III能够消毒至少10,000个扩增子。这种消毒法可以比得上用UNG所达到的水平。表明硫化磷酸酯化引物不干扰消毒。
实施例6
UNG和外切酶III在消除引物二聚体样品携带物
方面的作用比较
从含有SK38/BW17引物但不含靶物质(即利于引物二聚体形成)的扩增混和物中得到引物二聚体样品携带物,将其以1×10到1×108的不同稀释度向PCR样品中加入。然后进行室温下孵育。用这种方法所产生的引物二聚体太弱而不能显示在溴化乙锭染色的凝胶谱带上,但它的存在是清楚显现的,正如下文所阐明的。除了用硫化磷酸酯化引物外,该PCR混合物含有如实施例1中所述的试剂。除了样品1外,所有的样品都含有从8E5 HUT/HIV细胞系中所得到的100个拷贝的HIV基因组靶物质。样品2不含有样品携带物,而把样品3暴露在环境样品携带物中。在下列条件下对样品进行三次重复测试:A)无样品携带物的预防方法;B)1单位/100μL PCR反应物中的UNG(Perkin-Elmer Lot # 0642);以及c)20单位/100μL PCR的反应物的外切酶III。在各种情况下都用硫化磷酸酯化引物。把A组中的样品在室温下孵育10分钟,然后进行PCR常规循环,在50℃2分钟孵良前把B组中的样品在室温下孵育10分钟,然后在PCR标准循环后,保持在72℃。把C组中的样品在室温下孵育2小时,然后进行PCR的常规循环。在常规条件下把各样品等分在4%琼脂糖凝胶上电泳,并用溴化乙锭染色显影。观察到下列结果。
A组-未处理
样 品 | 产物 | 引物二聚体 | |
1 | 无靶物质 | - | - |
2 | 无样品携带物 | 强+ | 微弱+ |
3 | 环境样品的携带物 | 弱+ | + |
4a | 10X | - | 强+ |
4b | 10X | - | 强+ |
4c | 10X | - | 强+ |
5a | 103 | - | 强+ |
5b | 103 | - | 强+ |
5c | 103 | - | 强+ |
6a | 104 | - | 强+ |
6b | 104 | - | 强+ |
6c | 104 | - | 强+ |
A组-未处理(续)
*数字表示引物二聚体样品携带物的稀释度。
样 品 | 产物 | 引物二聚体 | |
7a | 105 | - | 强+ |
7b | 105 | - | 强+ |
7c | 105 | - | 强+ |
8a | 106 | - | 强+ |
8b | 106 | - | 强+ |
8c | 106 | - | 强+ |
9a | 107 | - | 强+ |
9b | 107 | - | 强+ |
9c | 107 | - | 强+ |
10a | 108 | - | 强+ |
10b | 108 | - | 强+ |
10c | 108 | - | 强+ |
B组-UNG处理
样 品 | 产物 | 引物二聚体 | |
1 | 无靶物质 | - | - |
2 | 无样品携带物 | 强+ | - |
3 | 环境样品的携带物 | + | + |
4a | 10X | - | 强+ |
4b | 10X | - | 强+ |
4c | 10X | - | 强+ |
5a | 103X | - | 强+ |
5b | 103X | - | 强+ |
5c | 103X | - | 强+ |
6a | 104X | - | 强+ |
6b | 104X | - | 强+ |
6c | 104X | - | 强+ |
B组-UNG处理(续)
样 品 | 产物 | 引物二聚体 | |
7a | 105X | - | 强+ |
7b | 105X | - | 强+ |
7c | 105X | - | 强+ |
8a | 106X | 弱+ | 弱+ |
8b | 106X | 弱+ | 弱+ |
8c | 106X | 弱+ | 弱+ |
9a | 107X | + | + |
9b | 107X | 弱+ | + |
9c | 107X | + | 弱+ |
10a | 108X | 弱+ | + |
10b | 108X | 弱+ | + |
10c | 108X | 弱+ | + |
C组-EXO III处理
样 品 | 产物 | 引物二聚体 | |
1 | 无靶物质 | - | - |
2 | 无样品携带物 | + | - |
3 | 环境样品的携带物 | + | - |
4a | 10X | - | + |
4b | 10X | - | + |
4c | 10X | - | + |
5a | 103X | 弱+ | 弱+ |
5b | 103X | 弱+ | 弱+ |
5c | 103X | 弱+ | 弱+ |
6a | 104X | + | - |
6b | 104X | + | - |
6c | 104X | + | - |
C组-EXO III处理(续)
样 品 | 产物 | 引物二聚体 | |
7a | 105X | + | - |
7b | 105X | + | - |
7c | 105X | + | - |
8a | 106X | + | - |
8b | 106X | + | - |
8c | 106X | + | - |
9a | 107X | + | - |
9b | 107X | + | - |
9c | 107X | + | - |
10a | 108X | + | - |
10b | 108X | + | - |
10c | 108X | + | - |
用UNG处理,在1×106倍稀释的引物二聚体样品携带物时测定产物的谱带,比未处理的有1000倍的提高。(上述试验已证实没有处理存在时,在1×1010稀释的引物二聚体样品携带物时产物谱带可被测得)。在硫化引物存在下用Exo III处理,在1×103倍稀释引物二聚体样品携带物时测得产物谱带,比UNG处理的提高1000倍,并且比没处理的提高1×107倍。所以在消除引物二聚体样品携带物方面Exo III优于UNG或优于没有处理。
序列表(1)一般信息:
(i)申请人: Backus,John W.
Patterson,David R.
Sutherland,John W.H
(ii)发明名称:在硫化磷酸酯化引物存在下用核酸外切酶进行
聚合酶链反应扩增前的消毒方法
(iii)序列数: 5
(iv)联系地址:
(A)地址:Johnson和Johnson
(B)街道:One Johnson和Johnson Plaza
(C)城市:New Brunswick
(D)州:New Jersey
(E)国家:U.S.A
(F)邮区编号:08933
(V)计算机可读形式:
(A)媒介类型:软盘
(B)计算机:IBM PC兼容机
(C)操作***:PC-DOS/MS-DOS
(D)软件:Patent In Release #1.0,Version #
1.25(Vi)当前申请数据
(A)申请号:
(B)申请日:
(C)分类(Viii)律师/代理人资料:
(A)姓名:Ciamporcero,Audley A.
(B)登记号:26,051
(C)资料/案卷:CDS-19(ix)通讯资料:
(A)电话:(908)524-2803
(B)电传:(908)524-2803(2)SEQ ID NO:1的资料(i) 序列特征:
(A)长度:28个碱基对
(B)类型:核酸
(C)股数:单股
(D)拓扑学结构:线性(ii)分子类型:DNA(基因组)(xi)序列描述:SEQ ID NO:1:
ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT 28(2) SEQ ID NO:2的资料:
(i)序列特征:
(A)长度:28个碱基对
(B)类型:核酸
(C)股数:单股
(D)拓扑学结构:线性
(ii)分子类型:DNA(基因组)
(xi)序列描述:SEQ ID NO:2:
TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC 28(2) SEQ ID NO:3资料;
(i)序列特征:
(A)长度:100个碱基对
(B)类型:核酸
(C)股数:单股
(D)拓扑学结构:线性
(ii)分子类型:DNA(基因组)
(xi)序列描述:SEQ ID NO:3:
AATCGAGTAA GACTTCACTG CTGAGAATCT CAGAGAATCTAGATATCCTG CATGTCTAAA 60
TATTGAATAC GACATTACAC GAGTCAAGAC TCACTAGACA 100(2) SEQ ID NO:4的资料:
(i)序列特征:
(A)长度:27个碱基对
(B)类型:核酸
(C)股数:单股
(D)拓扑学结构:线性
(ii)分子类型:DNA(基因组)
(xi)序列描述:SEQ ID NO:4:
GTAAGACTTC ACTGCTGAGA ATCTCAG 27(2)SEQ ID NO:5的资料:(i)序列特征:
(A)长度:27个碱基对
(B)类型:核酸
(C)股数:单股
(D)拓扑学结构:线性(ii)分子类型:DNA(基因组)(xi)序列描述:SEQ ID NO:5:
TGTCTAGTGA GTCTTGACTC GTGTAAT 27
Claims (32)
1.一种扩增靶核酸的方法,它包括:
(a)把怀疑含有该靶核酸的样品与(i)至少两种寡聚核苷酸引物,它们足以与杂交到其上的杂交靶核酸区域互补,其中各个寡聚核苷酸引物至少含有一个硫化磷酸酯键,(ii)至少四种不同的三磷酸核苷,(iii)一种热稳定性聚合剂,以及(iv)至少一种3′核酸外切酶接触来形成一种反应混合物;
(b)把该反应混合物加热使该核酸外切酶失活;以及
(c)形成引物扩大产物。
2.根据权利要求1的方法,其中所述的靶核酸是DNA或RNA。
3.根据权利要求1的方法,其中所述的三磷酸核苷是dATP,dGTP,dCTP和dTTP。
4.根据权利要求1的方法,其中所述的聚合剂是一种DNA聚合酶。
5.根据权利要求4的方法,其中所述的DNA聚合酶是选自于水生栖热菌(Taq)聚合酶,
Thermus thermophilus聚合酶和Thermococcus litoralis聚合酶。
6.根据权利要求1的方法,还包括把该样品与该聚合剂的特异性抗体相接触来形成所述的反应混合物。
7.根据权利要求6的方法,其中所述的聚合剂是Taq聚合酶,所述的抗体是Taq聚合酶的一种单克隆抗体。
8.根据权利要求1的方法,其中所样的3′核酸外切酶选自于核酸外切酶I,核酸外切酶III,核酸外切酶VIII和核糖核酸酶II。
9.根据权利要求1的方法,其中所述的引物至少在距该引物3′端的末端含有一个硫化磷酸酯键。
10.根据权利要求1的方法,其中各个引物至少在距该引物3′端的末端和次末端含有一个硫化磷酸酯键。
11.根据权利要求1,9和10中任何一种方法,其中所述的3′核酸外切酶是核酸外切酶III。
12.根据权利要求11的方法,其中所述的核酸外切酶III是以每毫升反应混合物约0.001个单位到约10个单位的浓度存在的。
13.根据权利要求12的方法,其中所述的核酸外切酶III是以每毫升反应混合物中约0.2个单位的浓度存在的。
14.根据权利要求1的方法,其中所述的反应混合物含有两种3′核酸外切酶。
15.根据权利要求14的方法,其中所述的一个3′核酸外切酶优先降解双股DNA,而另一个优先降解单股DNA。
16.根据权利要求1的方法,其中所述的加热是从85℃左右到95℃左右。
17.根据权利要求1的方法,还包括测定引物扩大产物。
18.根据权利要求17的方法,其中所述的测定是用测量结合到双股DNA中的荧光化合物所产生的荧光变化来实现的。
19.一种扩增靶核酸的药盒,它在同一个或不同容器中含有一种热稳定聚合剂,至少一种3′核酸外切酶以及至少两种寡聚核苷酸引物,这些引物应当足以与杂交到其上的所述核酸的区域互补,其中各个寡聚核苷酸引物至少含有一个硫化磷酸酯键。
20.根据权利要求19的药盒,它在同一或不同容器中还含有所述聚合剂的一种特异性抗体。
21.根据权利要求19的药盒,其中所述的聚合剂选自Taq聚合酶,Thermus thermophilus聚合酶,和
Thermococcus litoralis聚合酶。
22.根据权利要求19的药盒,其中所述的核酸外切酶选自核酸外切酶I,核酸外切酶III,核酸外切酶VIII和核糖核酸酶II。
23.根据权利要求19的药盒,其中所述的3′核酸外切酶是核酸外切酶III。
24.根据权利要求19的药盒,其中各个引物至少在距其3′端的末端位置上含有一个硫化磷酸酯键。
25.根据权利要求19的药盒,其中所述的各个引物至少在距其5′端的次末端和末端位置上含有一个硫化磷酸酯键。
26.一种用于PCR的混合物,它包括至少一种3′核酸外切酶和至少两种寡聚核苷酸引物,其中所述的各个寡聚核苷酸引物至少含有一个硫化磷酸酯键。
27.根据权利要求26的混合物,它还含有一种热稳定的聚合剂。
28.根据权利要求27的混合物,其中所述的热稳定聚合剂是一种DNA聚合酶。
29.根据权利要求28的混合物,其中所述的聚合酶选自于水生栖热菌(Taq)聚合酶,
Thermus thermophilus聚合酶和Thermococcus litoralis聚合酶。
30.根据权利要求26的混合物,它还含有至少四种不同的三磷酸核苷。
31.根据权利要求26的混合物,其中所述的核酸外切酶是选自于核酸外切酶I,核酸外切酶III,核酸外切酶VIII以及核糖核酸酶II。
32.一种用于PCR的混合物,它含有核酸外切酶III和至少两种寡聚核苷酸引物,其中所述的各个寡聚核苷酸引物至少在距其3′端的末端位置含有一个硫化磷酸酯键。
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104379763A (zh) * | 2012-03-22 | 2015-02-25 | Lgc基因组学有限公司 | 使用包含硫代磷酸酯基的寡核苷酸的聚合酶链式反应检测*** |
CN105051212A (zh) * | 2013-03-06 | 2015-11-11 | Lgc基因组学有限公司 | 聚合酶链式反应检测*** |
CN107406884A (zh) * | 2015-03-06 | 2017-11-28 | 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 | 核酸扩增和文库制备 |
Families Citing this family (29)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6482590B1 (en) | 1996-12-20 | 2002-11-19 | Aventis Behring Gmbh | Method for polynucleotide amplification |
WO1999034014A2 (en) * | 1997-12-23 | 1999-07-08 | Roche Diagnostics Gmbh | A method for the determination of a nucleic acid |
US6274353B1 (en) | 1999-09-22 | 2001-08-14 | Genecopoeia, Inc. | Method and compositions for improved polynucleotide synthesis |
EP1088891B1 (en) | 1999-09-28 | 2005-01-12 | Roche Diagnostics GmbH | Thermostable enzyme promoting the fidelity of thermostable DNA polymerases - for improvement of nucleic acid synthesis and amplification in vitro |
DE10061166A1 (de) * | 2000-11-30 | 2002-06-06 | Attomol Gmbh Molekulare Diagno | Verfahren und Kit zum direkten Nachweis von Nukleotidsequenzen, Aminosäuresequenzen oder Antigenen |
US8507662B2 (en) | 2001-01-19 | 2013-08-13 | General Electric Company | Methods and kits for reducing non-specific nucleic acid amplification |
US8361712B2 (en) | 2007-12-17 | 2013-01-29 | General Electric Company | Contamination-free reagents for nucleic acid amplification |
EP1277841B1 (en) * | 2001-07-11 | 2009-08-26 | Roche Diagnostics GmbH | New composition and method for hot start nucleic acid amplification |
EP1275735A1 (en) | 2001-07-11 | 2003-01-15 | Roche Diagnostics GmbH | Composition and method for hot start nucleic acid amplification |
CA2409775C (en) * | 2001-12-03 | 2010-07-13 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Reversibly modified thermostable enzymes for dna synthesis and amplification in vitro |
EP1327682B1 (de) * | 2002-01-11 | 2009-05-13 | BioSpring Gesellschaft für Biotechnologie mbH | Verfahren zur Herstellung von DNA |
US20030190626A1 (en) * | 2002-04-09 | 2003-10-09 | Vasulinga Ravikumar | Phosphorothioate monoester modified oligomers |
WO2004003228A1 (en) * | 2002-07-01 | 2004-01-08 | Unisearch Limited | Genotyping method |
AU2003257013A1 (en) * | 2003-07-29 | 2005-03-07 | Sigma Aldrich Co. | Methods and compositions for amplification of dna |
EP1502958A1 (en) * | 2003-08-01 | 2005-02-02 | Roche Diagnostics GmbH | New detection format for hot start real time polymerase chain reaction |
EP1502961B1 (en) * | 2003-08-01 | 2010-09-08 | Roche Diagnostics GmbH | New detection format for hot start real time polymerase chain reaction |
DE102005047617A1 (de) * | 2005-10-05 | 2007-04-19 | Qiagen Gmbh | Polymerase-Kettenreaktions-Verfahren unter Einsatz einer DNA-Polymerase mit Proofreading-Eigenschaft |
ES2364983T3 (es) | 2006-02-27 | 2011-09-20 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Reacción en cadena de polimerasa con arranque en caliente por secuestro de magnesio. |
US20130323795A1 (en) | 2007-01-10 | 2013-12-05 | General Electric Company | Endonuclase-assisted isothermal amplification using contamination-free reagents |
CA2658520C (en) | 2008-03-19 | 2016-11-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Nucleic acid amplification in the presence of modified randomers |
US8586310B2 (en) * | 2008-09-05 | 2013-11-19 | Washington University | Method for multiplexed nucleic acid patch polymerase chain reaction |
US9909170B2 (en) | 2008-09-05 | 2018-03-06 | Washington University | Method for multiplexed nucleic acid patch polymerase chain reaction |
US11111514B2 (en) | 2008-09-05 | 2021-09-07 | Washington University | Method for multiplexed nucleic acid patch polymerase chain reaction |
US7910720B2 (en) | 2008-09-09 | 2011-03-22 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Polyanion for improved nucleic acid amplification |
JP5457222B2 (ja) | 2009-02-25 | 2014-04-02 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 小型化ハイスループット核酸分析 |
US9347092B2 (en) | 2009-02-25 | 2016-05-24 | Roche Molecular System, Inc. | Solid support for high-throughput nucleic acid analysis |
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CA2101119A1 (en) * | 1992-08-17 | 1994-02-18 | George T. Walker | Exonuclease decontamination method |
US5338671A (en) * | 1992-10-07 | 1994-08-16 | Eastman Kodak Company | DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody |
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Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN104379763A (zh) * | 2012-03-22 | 2015-02-25 | Lgc基因组学有限公司 | 使用包含硫代磷酸酯基的寡核苷酸的聚合酶链式反应检测*** |
CN104379763B (zh) * | 2012-03-22 | 2017-04-19 | Lgc基因组学有限公司 | 使用包含硫代磷酸酯基的寡核苷酸的聚合酶链式反应检测*** |
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