CN1192218A - 酰化蛋白粉的制备 - Google Patents

酰化蛋白粉的制备 Download PDF

Info

Publication number
CN1192218A
CN1192218A CN96195951A CN96195951A CN1192218A CN 1192218 A CN1192218 A CN 1192218A CN 96195951 A CN96195951 A CN 96195951A CN 96195951 A CN96195951 A CN 96195951A CN 1192218 A CN1192218 A CN 1192218A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
acylated
insulin
acylated protein
lipid acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN96195951A
Other languages
English (en)
Inventor
J·C·巴克
B·A·莫泽
W·E·施雷德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eli Lilly and Co
Original Assignee
Eli Lilly and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly and Co filed Critical Eli Lilly and Co
Publication of CN1192218A publication Critical patent/CN1192218A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins

Abstract

一种提取粉末状酰化蛋白质的方法,特别适用于难以通过等电位沉淀法从蛋白质水溶液中制备的酰化蛋白质,该方法包括调节水溶液使之接近蛋白质等电位pH值,同时提供合适的醇浓度,以使蛋白质在所调节的pH值下以可滤的颗粒物形态沉淀。

Description

酰化蛋白粉的制备
发明背景
1.发明领域
本发明主要涉及一种以粉末状回收酰化蛋白质的方法，特别是那些难以通过沉淀或结晶作用并进而从水溶液中过滤出来的酰化蛋白质，尤其是可回收某些酰化胰岛素原，酰化胰岛素或酰化胰岛素类似物。另外，本发明还特别涉及到从水溶液中提取自由流动粉末状酰化胰岛素原，胰岛素和胰岛素类似物。
2.有关技术描述
用胰岛素治疗来模仿正常人体中内生胰岛素分泌的型式是一个长期的目标。每天对胰岛素的生理需求是不定的，可以分为两个阶段：(a)吸收阶段，需要一剂用量的胰岛素来降低与膳食有关的血葡糖，(b)后吸收阶段，需要持续量的胰岛素调整肝葡糖的产生以维持最佳的稳定血葡糖。因此，有效治疗一般涉及到两种外生胰岛素配合使用：利用大剂量注射提供速效进食时间胰岛素和每天注射一次或两次来供给起长效作用的基底胰岛素。
近来，一类酰化胰岛素有望用于长效基底胰岛素治疗，这类酰化胰岛素是通过有选择的用活化脂肪酸衍生物，带游离氨基的单体胰岛素，包括胰岛素原、胰岛素和某些胰岛素类似物进行酰化而制得的。有效的脂肪酸衍生物包括至少具有6个碳原子链长的活性脂肪酸型化合物以及那些在链上含有8到21个碳原子的脂肪酸衍生物。用棕榈酸衍生物一酰化的正常人胰岛素是特别有希望的候选者，属于此类的胰岛素在日本专利申请1-254,699中已有介绍。
正像那些经验丰富的专家对此工艺所了解的那样，回收固体蛋白质，尤其是自由流动粉末状蛋白质的方法，在多方面的应用是有优点的，虽然不是最主要的优点。制备粉末状蛋白质，可扩大贮存和配给。更确切的说，应大量生产用于胰岛素治疗的多种组合物以满足需求。很早以前偶然发现，正常胰岛素包括牛胰岛素、猪胰岛素和人胰岛素，可以通过沉淀或者更准确地说以结晶方法，从较稀的胰岛素水溶液中以锌的络合物或以钠晶体来提取。一般说来，所谓锌胰岛素是由含锌离子的缓冲水溶液中结晶出来并通过过滤分离而得到。
遗憾的是，意在通过过滤提取用长链脂肪酸衍生物酰化的胰岛素并未取得成功。事实上，许多使脂肪酸酰化的胰岛素生成结晶的试验一律未获得成功。曾认为在这类胰岛素单体上所含的长链脂肪酸部分具有疏水特性而造成上述困难，特别是干扰了生成合格晶体所需要的蛋白质-蛋白质间的相互反应。因此，必须寻找其他途径来制备这类固体粉末状酰化胰岛素。
一种技术上可行的生产酰化蛋白质如粉末状酰化胰岛素的方法，是将蛋白质水溶液冻干。虽然制备粉末状脂肪酸酰化的胰岛素可采用这种方法，但生产大量商用胰岛素采用冻干技术很不方便。对于大容量的冻干操作，操作人员的安全和产品管理都存在很多问题。
其他可能的对策涉及到等电位沉淀法。早已知道，当介质pH值调节到接近蛋白质的等电位点时，水溶液中蛋白质的溶解性变小。这种普遍现象早被运用在蛋白质纯化和提取工艺中。一旦降低可溶性，这类蛋白质往往可从形成的悬浊液中利用重力沉降或真空助滤和压力助滤来提取。
遗憾的是，当试图用简单的调节酰化蛋白质水溶液pH值接近等电位点的方法来提取脂肪酸酰化蛋白质时却生成了类似乳浊液的组合物，用重力沉降或真空助滤或压力助滤很难使固-液分离，故必须找到一种新方法来提取这类粉末状酰化胰岛素。
本发明提供一种通过沉淀和过滤制备自由流动粉末状酯化蛋白质的简单的方法，特别适用于某些难以用沉淀和过滤来分离和提取的脂肪酸酰化蛋白质。故本发明是提供一种从水溶液中提取自由流动粉末状脂肪酸胰岛素的方法。具体的说，本发明提供一种制备粉末状脂肪酸酰化胰岛素的流程，用于较大规模生产技术中。本发明也适用于制备粉末状蛋白质。
发明的描述
在本发明中所采用的全部氨基酸的缩写均被美国专利和商标局作为规定列于37C.F.R§1.822(B)(2)中。
这里应用的术语“胰岛素”和“正常胰岛素”表示人胰岛素、猪胰岛素或者牛胰岛素。胰岛素具有三个游离氨基：B1-苯基丙氨酸，A1-甘氨酸和B29-赖氨酸。在位置A1和B1处的游离氨基为α-氨基，在位置B29处的游离氨基是∈-氨基。
这里应用的术语“胰岛素原”是适当交联的蛋白质，其化学式为：
                    B-C-A其中：
A系胰岛素的A链或其官能衍生物
B系胰岛素的B链或其具有∈-氨基的官能衍生物
C系联接在胰岛素原上的缩氨酸。优选地，胰岛素原为人胰岛素的A链，人胰岛素的B链，而C为自然联接的缩氨酸。当胰岛素原属于天然序列时，胰岛素原具有三个游离氨基：苯基丙氨酸(1)(α-氨基)，赖氨酸(29)(∈-氨基)和赖氨酸(64)(∈-氨基)。
这里应用的术语“胰岛素类似物”是显示胰岛素活性的适度交联的蛋白质，其化学式：
                      A-B式中：
A系胰岛素的A链或胰岛素A链的官能衍生物；
B为胰岛素的B链或胰岛素的B链的官能衍生物，此B链具有∈-氨基和至少A或B链之一含有来自天然系列的氨基酸变体；
优选的胰岛素类似物包括下列胰岛素；
在B28位置上的氨基酸残基为Asp，Lys，Leu，Val，或Ala；
在B29位置上的氨基酸残基为Lys或Pro；
在B10位置上的氨基酸残基为His或Asp；
在B1位置上的氨基酸残基为Phe，Asp，或单独缺失的，或与位置B2上的残基联合缺失的；
在B30位置上的氨基酸残基是Thr，Ala，或缺失的；
在B9位置上的氨基酸残基为Ser或Asp，只要B28或B29位置是Lys。
在普通熟练技工掌握的标准生物化学术语中，优先选择的胰岛素类似物为LysB28proB29-人胰岛素(B28为Lys；B29为Pro)；AspB28-人胰岛素(B28系Asp)；AspB1-人胰岛素，ArgB31，B32-人胰岛素，AspB10-人胰岛素，ArgA0-人胰岛素，AspB1，GluB13-人胰岛素，AlaB26-人胰岛素以及GlyA21-人胰岛素。
术语“酰化”表示引入的一个或多个酰基以共价结合到蛋白质的游离氨基上。
术语“脂肪酸”表示饱和或非饱和的C6-C12脂肪酸。术语“活化的脂肪酸酯”表示利用常规技术活化的脂肪酸。该常规技术已在Methods ofEnzymology，25：494-499(1972)和Lapidot在I.of Lipid Res.，8：142-145(1967)中作过介绍，其公开内容引于此以供参考。优选的脂肪酸为饱和脂肪酸，包括肉豆蔻酸(C14)，十五烷酸(C15)，棕榈酸(C16)，十七烷酸(C17)，和硬脂酸(C18)，最优选的脂肪酸是棕榈酸。活化的脂肪酸酯包括介质的衍生物如羟基苯丙三氮杂环(HOBT)，N-羟基琥珀酰亚胺及其衍生物，优选的活性酯为N-琥珀酰亚胺基棕榈酸盐。
术语“交联”表示在半胱胺酸残基之间形成二硫化物键。适当交联的胰岛素原，胰岛素，胰岛素类似物含有三个二硫化物桥。第一二硫化物桥连在A链的位置6和位置11上的半胱胺酸残基之间。第二二硫化物桥将A链位置7的半胱胺酸残基与B链位置7的半胱胺酸相连。第三二硫化物桥将A链位置20上的半胱胺酸联接到B链位置19的半胱胺酸上。
术语“沉淀”涉及一种过程，在此过程中，在液体中产生易于滤出的颗粒物，它与由于溶液中溶质的溶解度的简单改变而导致生成的稳定悬浊物和/或类似乳化物的两相混合物不同。这种可滤出的颗粒物本身称为“沉淀物”。
用语“易可滤的”和其它类似用语均与条件有关，在此条件下，固-液混合物或浆液中的颗粒可通过死端式过滤以及通过能形成易操作的含残余水物质，即滤饼的有关技术而达到分离，残余水不会使滤饼呈浆泥状，而呈固体状。在死端式过滤中，送入浆液，其滤出液基本上垂直穿过滤器的平面，这与“错流”或“切流”过滤不同，其主液流是平行流过滤器表面。重要的是，本发明的方法产生一种酰化蛋白质浆液，它可利用死端式过滤和相关的技术在平均或均值滤速超过5l/m2/hr(LMH)下过滤，通常平均或均值滤速超过20LMH。过滤终点一般是使滤饼能满足固体操作。这样的滤速对工业生产规模的运行经济是很关键的。
术语“含水的”是指含潜溶剂体系以及只用水作为溶剂。
本发明涉及一种从含水混合物中提取粉末状酰化蛋白质的方法，尤其是那些难以利用等电位沉淀从含酰化蛋白质水溶液中分离和提取的酰化蛋白质。该法包括调节酰化蛋白质水溶液pH值至使溶液中蛋白质变成不溶的，然后将足够量的醇加到蛋白质含水混合物中使之在上述pH值下形成可滤性蛋白质颗粒沉淀物。
另一方面，本发明涉及到一种粉末状酰化蛋白质，特别是难以用等电位沉淀从水溶液中分离出的酰化蛋白质。尤其涉及到粉末状脂肪酸酰化的胰岛素原，脂肪酸酰化的胰岛素或脂肪酸酰化的胰岛素类似物，通过调节酰化胰岛素蛋白质水溶液的pH值使蛋白质在水溶液中变成不溶性的，然后向蛋白质水溶液中加足够量的醇使其在上述pH值下形成可过滤的粒状蛋白质沉淀。之后，通过过滤与干燥来提取无锌粉末状酰化蛋白质。利用本方法制备优选的粉末状酰化蛋白质包括N-棕榈酰LysB29人胰岛素和B28-N∈-棕榈酰-LysB28ProB29-人胰岛素(B28为酰化的Lys和B29是Pro)。
应用胰岛素原，胰岛素和胰岛素类似物制备酰化蛋白质系本发明的主要中心点，它可以利用公认的缩氨酸合成技术中任意一种方法，包括经典法(溶液法)，固相法，半合成法，以及最近的重组DNA法。例如，Chance等人的美国专利申请号07/388,201，欧洲专利申请号383472，Brange等人的欧洲专利申请214826，以及Belagaje等人的美国专利5,304,473所公布的各种胰岛素原与胰岛素类似物的制备方法，均列于此处做参考。本发明中胰岛素类似物的A链和B链也可经由一个类似胰岛素原的母体分子用重组DNA技术制备，见Frank等人.，缩氨酸：合成-结构-功能，美国第七届缩氨酸专题讨论会文集Eds.D.Rich&E.Gross(1981)，列在此处作参考。
通常，胰岛素原，胰岛素，胰岛素类似物是通过与活化的脂肪酸衍生物诸如活化脂肪酸酯反应而酰化。用脂肪酸酰化正常胰岛素在日本专利申请1-254,699中已有披露，也可见Hashimoto等人.，药物研究，6：171-176(1989)。这里引用作参考。
最好在极性溶剂中的碱性条件下进行酰化，即pH值大于9.0，最好为10.5左右。尽管酰化反应可在纯有机极性溶剂中于pKa大于或等于10.75的碱性条件下进行，但我们选择一种混合的有机与含水溶剂作为反应介质。优先选用的碱有四甲基胍、二异乙基胺或四丁基胺的氢氧化物。一种特别适用的溶剂是乙腈和水，含有约50％乙腈。其他极性溶剂包括二甲基亚砜，二甲基甲酰胺等。潜溶剂体系还包括丙酮和水，异丙基和水，以及乙醇和水。适合进行反应的时间与温度并不是狭窄的临界条件。温度为0到40℃，反应时间为15分钟至24小时一般来说应当是适宜的。制备脂肪酸酰化的胰岛素的特别可取的方法描述于共同待决的美国专利申请序列号08/341231，November 17，1994，其内容列于此作参考文献。
一旦反应完成，含有酰化蛋白质的反应混合物一般用水稀释并加酸中和碱度。酸以水溶液形式加入到酰化蛋白质中，并使溶液pH值降低到低于蛋白质的等电位点。通常该点会使蛋白质处于合适的缓冲水溶液中以便于进一步处理。此处理具体包括采用标准色层分离法，如反相或疏水色层分离，利用错流过滤浓集，通过超滤溶剂更换等。对于酰化胰岛素原，酰化胰岛素与酰化胰岛素类似物，特别是N-棕榈酰LysB29人胰岛素和B28-N∈-棕榈酰-LysB28ProB29-人胰岛素，pH值一般应调节到低于3.0，如需要，最好用酸调节到介于约1.5和2.5之间。适用的酸包括HCl，醋酸，甘氨酸，尤其是柠檬酸。发现使用浓度50mM的柠檬酸是适宜的。如有必要，pH值还能用碱，如用氢氧化钠调节使之保持在所要求的pH范围内。
这时经过分离的，最好是经过纯化的酰化蛋白质水溶液，尤其是脂肪酸酰化的胰岛素原，脂肪酸酰化胰岛素或脂肪酸酰化胰岛素类似物的水溶液可以按照本发明方法处理以提取粉末状可溶性蛋白质。根据本发明，加碱来调节蛋白质水溶液的pH值，最好是用水溶性碱如氢氧化钠，加入足够量使可溶性的蛋白质变成不溶性的。即将溶液的pH值调节到接近酰化蛋白质的等电位点，或称之为等电位pH值。在脂肪酸酰化的胰岛素原，脂肪酸酰化胰岛素和脂肪酸酰化胰岛素类似物的情况下，特别是N-棕榈酰LysB29人胰岛素，将pH值调节到4.0至6.0范围内，最好是4.5到5.5证明是适用的。在此pH范围内，酰化蛋白质的净电荷应当最少，并且其溶解度也应最小。在调节pH值期间，溶液要搅拌使之完全混合。
特别适合于按本发明方法处理的酰化蛋白质水溶液，当pH值调节到接近其等电位pH时，则形成类似乳浊液的组合物。这种情况会对大规模处理中采用诸如死端式过滤固/液分离技术提纯蛋白质产生干扰。本发明的核心点是使用醇，特别是乙醇，将其加到含水蛋白质混合液中以有助于形成易于过滤的酰化蛋白质沉淀物。
调节溶液pH值和加醇的顺序不是关键性的问题，可以在调节pH值以降低蛋白质的可溶性之前将醇加到蛋白质溶液中，最后形成沉淀物，也可以在调节蛋白质溶液的pH值后加醇。
专利申请人发现，为获得易过滤沉淀物而需加到酰化蛋白质溶液中的醇的量处在窄的范围内。专利申请人特别发现对于脂肪酸酰化的胰岛素，尤其是N-棕榈酰LysB29人胰岛素，形成易于过滤的沉淀物只与加入适量的醇，特别是乙醇有关，含水蛋白质乳浊液或浆液中最终醇浓度至少达到约20％到35％，最好是约25％到30％。虽然乙醇是所选用的醇，但其他醇类如甲醇和异丙醇在一定条件下可作为替代物。
向蛋白质水溶液中加入过量的醇会干扰形成一种合格的沉淀物，但加醇量不足时，则不足以把调节酰化蛋白质pH值所产生的类似乳浊液的组合物转化为易于过滤的浆液或乳浊液。实际醇浓度比要求的高时，蛋白质会再溶解，可能减少产额。为了促进其他脂肪酸酰化蛋白质的沉淀和过滤作用，可利用常规试验来确定加醇量，例如加乙醇的量。
事实上本发明的基本观点是，要制备一种自由流动粉末状酰化蛋白质，特别是从蛋白质水溶液中难以通过等电位沉淀和过滤来分离和制备的那种酰化蛋白质，在制备时应当具有以下综合条件，(a)pH应在或接近蛋白质的等电位pH值，(b)足够量的醇浓度促使形成易于过滤的颗粒物有助于蛋白质的沉淀和过滤。如上所述，在N-棕榈酰LysB29人胰岛素情况下，乙醇浓度约为浆液体积的20％到35％，最好是大约25％到30％对促使蛋白质形成易于过滤的颗粒沉淀物特别有利。
总而言之，制备有所要求的醇(如乙醇)浓度及酰化蛋白质的等电位pH值的含水蛋白质混合物的方法不是关键。例如，可用水稀释已调好pH但醇浓度高于所需值的蛋白质水溶液以得到这种混合物，即在N-棕榈酰LysB29人胰岛素的情况下可将醇体积浓度超过35％如40-45％的乙醇稀释到所要求的浓度范围。最好对醇浓度和pH在所需限值内的组合物进行缓慢地搅拌(混合)以促使沉淀物形成。
根据本发明，在处理前，溶液中酰化蛋白质的浓度也不是关键问题。但在酰化胰岛素也包括酰化胰岛素原和酰化胰岛素类似物的情形下，浓度至少应为1mg/ml左右，通常最好至少采用浓度为5mg/ml的溶液，尽管采用蛋白质浓度高达35到50mg/ml和更高的溶液，可得到在更满意的滤速下过滤的蛋白质沉淀。如上所述，通过pH调节和加醇联合处理产生的蛋白质浆液应具有平均或均值滤速至少约为5LMH，而最好的均值滤速约为15LMH。意外的是，当按本发明来处理N-棕榈酰LysB29人胰岛素溶液时，发现均值滤速约为20LMH甚至更高。
虽然对于获得最好的结果并没有严格的条件，但过滤期间温度应保持在20℃到30℃之间。无论如何过滤时应避免温度为0℃或低于0℃，因为这样低的温度会在所要求的高滤速下影响操作。虽然实际上最好是在环境温度下进行过滤，预先的调节pH和加乙醇可在高于浆液冰点以上任何温度下完成。
这时含水蛋白质组合物即可进行过滤以分离沉淀的蛋白质。有时，在过滤前进行重力增浓或使含水蛋白质组合物或浆液沉降有利于最大地降低过滤装置的液压负荷。当大规模生产时，例如，批量生产大于0.5Kg，采用离心过滤含水蛋白质组合物将是有益的，但根据本发明广泛的实践，任何用于液/固分离的手段，包括真空助滤和压力助滤都能用来回收沉淀的蛋白质。规模较小时，例如批量生产低于0.3到0.5Kg，利用装配有多孔烧结陶瓷过滤表面的压力助滤装置过滤具有优越性。通过额定孔径约5.0μm的多孔烧结陶瓷过滤证明是十分有效。对用来过滤浆液的设备要求不太高，任何适合于处理药物组合物的各种类型过滤***都可采用。
过滤后回收滤饼并干燥，一般用真空助蒸法干燥。根据本发明的广泛实践，任何用于干燥浓稠的固态膏状物的方法，只要不损害分离出来的蛋白质都可应用。回收滤饼的方法和干燥滤饼的其他方法均应是技术上成熟的且不是关键问题。
本发明的酰化胰岛素粉末可作为大批量药材(BDS)用于制备胰岛素治疗的药物组合物，也就是说，满足病人的需要(即生高血糖症的病人)。此类药物组合物中含有有效量的粉末并配入一种或多种药物上合格的赋形剂或载体。为此目的，药物组合物应按标准配方配制，含约100单位/mL或含有效量的酰化胰岛素粉末的类似浓度。这类组合物属于典型的非肠胃吸收的药物，但也未必如此，可采用任一种所熟知的制备普通赋形剂或载体的工艺来制备非肠胃吸收的药物。例如可参见Remington’sPharmaceutical Sciences.17版.Mack出版公司，Easton，PA，美国(1985)。举例来说，对于非肠胃吸收的用药形式，可将规定量的蛋白质粉末悬浮或溶解在无毒的适合于注射的液体媒介物中如水相介质，然后再对悬浮液或溶液进行消毒。另一方法是将量过的粉末置于小药瓶中；并将小药瓶和内盛物进行消毒和密封。可同时提供小药瓶或媒介物，供给药前混合用。
适应非肠胃吸收用法的药物组合物可使用稀释剂，赋形剂和载体如水和与水混溶的有机溶剂，如甘油，芝麻油，花生油，水相丙二醇，N，N-二甲基甲酰胺等。这类药物组合物的样品包括无菌、等渗压的粉末的盐水溶液，这种粉末盐可用药物上合格的缓冲剂进行缓冲，并不需加热。此外，非肠胃吸收药物的配方中还含有防腐剂如甲醇，以及调节最终产品pH的其他试剂如氢氧化钠或盐酸以及稳定剂如锌盐。
提出以下示例来描述和解释本项发明。这里仅参照制备粉末状N-棕榈酰LysB29人胰岛素来叙述本发明，但本发明的应用范围不应受本示例的限制。除另有说明外，所有提到的份额和百分数均为重量百分数，所有的温度都以摄氏度来表示。示例
脂肪酸酰化的生物合成人胰岛素(N-棕榈酰LysB29人胰岛素)水溶液(8.8L)含蛋白质浓度50mg/ml，在pH2.6、温度2-8℃下用530ml 10％的氢氧化钠处理使pH值提高到5.7。接着搅拌调节过pH的溶液达到彻底混合，然后在缓慢的搅拌下向每升调过pH的溶液中加入0.46L无水乙醇(达到总溶液体积13L)，促使酰化胰岛素沉淀。酰化蛋白质用配有标称孔径为5μ的不锈钢烧结物的压力助滤器去水。均值滤速测量值约为25LMH。弃去滤液。然后用30％体积的乙醇溶液洗涤滤饼，并从过滤器上取下洗好的滤饼在真空下干燥制成无锌粉末。该粉末具有极好的贮存稳定性，故适合于作为大批量药材。实质上，在滤饼中回收了全部蛋白质，经由滤液的损耗很小。
本项发明的原理，优选实例和操作模式按上述技术要求作了详细的说明，主要以脂肪酸酰化的胰岛素原，胰岛素和胰岛素类似物，特别是以N-棕榈酰LysB29人胰岛素为参照例，受到保护的本发明并不受限于公开的特定内容，因为这些内容是做为实例而不是约束。在不违反本发明权利要求的精神下，可做出变革和修改。

Claims (19)

1.一种从水相混合物中提取粉末状酰化蛋白质方法，该方法包括将蛋白质的水溶液pH值调节到使溶液中所含蛋白质转化为不溶性的，然后向水相蛋白质混合物中加入足够量的醇，促使蛋白质在所述pH值下以可滤的颗粒形态沉淀。
2.权利要求1的方法，其中蛋白质是用脂肪酸衍生物酰化了的蛋白质。
3.权利要求1的方法，其中酰化蛋白质包括难以用等电位沉淀法从蛋白质水溶液中分离出来的蛋白质。
4.权利要求3的方法，其中酰化蛋白质选自脂肪酸酰化胰岛素原，脂肪酸酰化胰岛素和脂肪酸酰化胰岛素类似物。
5.专利要求4的方法，其中水溶液的pH值调节到大约4.0到6.0左右。
6.权利要求5的方法，其中酰化蛋白质是N-棕榈酰LysB29人胰岛素。
7.权利要求6的方法，其中醇是乙醇，其加入量产生的浓度按水相混合物体积计为20％到35％(体积)。
8.专利要求7的方法，其中醇浓度为25％到30％(体积)。
9.一种从蛋白质水溶液中提取粉末状酰化蛋白质的方法，该方法包括调节该水溶液使之接近蛋白质的等电位pH值，并提供合适的醇浓度以助于蛋白质在该pH值下以可滤的颗粒形式沉淀。
10.权利要求9的方法，其中酰化蛋白质是难以用等电位沉淀法从所述水溶液中分离的酰化蛋白质。
11.权利要求10的方法，其中酰化蛋白质选自脂肪酸酰化胰岛素原，脂肪酸酰化胰岛素和脂肪酸酰化胰岛素类似物。
12.权利要求10的方法，其中水溶液被调节到pH约4.0到6.0。
13.权利要求12的方法，其中酰化蛋白质是N-棕榈酰LysB29人胰岛素。
14.权利要求13的方法，其中醇是乙醇，其加入量产生的醇浓度按水相混合物体积计为25％到30％(体积)。
15.一种粉末状酰化蛋白质，其制备方法是(a)调节酰化蛋白质水溶液达到或接近蛋白质的等电位pH值，与(b)向该酰化蛋白质水溶液组合物中提供合适的醇浓度以助于在该pH值下形成可滤的蛋白质颗粒，接着通过水相蛋白质组合物的过滤和干燥来回收沉淀出的蛋白质粉末的可滤颗粒。
16.权利要求15的粉末状酰化蛋白质，其中该酰化蛋白质包括难以由等电位沉淀从水溶液中分离出来的蛋白质。
17.权利要求16中的粉末状酰化蛋白质，其中酰化蛋白质选自脂肪酸酰化胰岛素原，脂肪酸酰化胰岛素和脂肪酸酰化胰岛素类似物。
18.权利要求17的粉末状酰化蛋白质，其中水溶液被调节到pH约4.0到6.0。
19.权利要求18的酰化蛋白质，其中醇是乙醇，其加入量产生的醇浓度按水相蛋白质组合物体积计为25％到30％(体积)。
CN96195951A 1995-06-07 1996-06-04 酰化蛋白粉的制备 Pending CN1192218A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/484,220 US5700904A (en) 1995-06-07 1995-06-07 Preparation of an acylated protein powder
US08/484,220 1995-06-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1192218A true CN1192218A (zh) 1998-09-02

Family

ID=23923252

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN96195951A Pending CN1192218A (zh) 1995-06-07 1996-06-04 酰化蛋白粉的制备

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5700904A (zh)
EP (1) EP0747391B1 (zh)
JP (1) JP3844504B2 (zh)
KR (1) KR19990022590A (zh)
CN (1) CN1192218A (zh)
AT (1) ATE263185T1 (zh)
AU (1) AU703032B2 (zh)
BR (1) BR9608729A (zh)
CA (1) CA2223389A1 (zh)
CZ (1) CZ388197A3 (zh)
DE (1) DE69631996T2 (zh)
DK (1) DK0747391T3 (zh)
EA (1) EA199800042A1 (zh)
ES (1) ES2216039T3 (zh)
HU (1) HUP9900877A3 (zh)
IL (1) IL122460A0 (zh)
NO (1) NO975583D0 (zh)
NZ (1) NZ309371A (zh)
PL (1) PL323994A1 (zh)
TR (1) TR199701528T1 (zh)
WO (1) WO1996040730A1 (zh)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9316895D0 (en) 1993-08-13 1993-09-29 Guy S And St Thomas Hospitals Hepatoselective insulin analogues
US5986050A (en) * 1996-12-26 1999-11-16 Poly-Med, Inc. Peracylated proteins and synthetic polypeptides and process for making the same
US5898067A (en) * 1997-02-07 1999-04-27 Novo Nordisk A/S Crystallization of proteins
AU5749198A (en) * 1997-02-07 1998-08-26 Novo Nordisk A/S Crystallisation of proteins
WO1998042749A1 (en) * 1997-03-20 1998-10-01 Novo Nordisk A/S Zinc free insulin crystals for use in pulmonary compositions
US5898028A (en) * 1997-03-20 1999-04-27 Novo Nordisk A/S Method for producing powder formulation comprising an insulin
US6310038B1 (en) * 1997-03-20 2001-10-30 Novo Nordisk A/S Pulmonary insulin crystals
EP0911035A3 (en) * 1997-10-24 2002-08-21 Eli Lilly And Company Insoluble insulin compositions
EP1039920A4 (en) * 1997-10-24 2003-05-28 Lilly Co Eli INSULIN ANALOGS ACYLATED BY FATTY ACID
ZA989744B (en) * 1997-10-31 2000-04-26 Lilly Co Eli Method for administering acylated insulin.
US6531448B1 (en) * 1997-12-23 2003-03-11 Eli Lilly And Company Insoluble compositions for controlling blood glucose
EP1396272A1 (en) * 1997-12-23 2004-03-10 Eli Lilly & Company Insoluble Insulin Compositions for Controlling Blood Glucose
US6855260B1 (en) * 1999-06-07 2005-02-15 Roe-Hoan Yoon Methods of enhancing fine particle dewatering
US6526675B1 (en) * 1999-06-07 2003-03-04 Roe-Hoan Yoon Methods of using natural products as dewatering aids for fine particles
US7169889B1 (en) 1999-06-19 2007-01-30 Biocon Limited Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin
US6799682B1 (en) 2000-05-16 2004-10-05 Roe-Hoan Yoon Method of increasing flotation rate
US6663602B2 (en) 2000-06-16 2003-12-16 Novo Nordisk A/S Injection device
US6828297B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6835802B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
US6713452B2 (en) * 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6858580B2 (en) * 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7713932B2 (en) 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US6828305B2 (en) 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7166571B2 (en) 2001-09-07 2007-01-23 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US6770625B2 (en) 2001-09-07 2004-08-03 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7030082B2 (en) * 2001-09-07 2006-04-18 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of drug-oligomer conjugates and methods of treating disease therewith
US7312192B2 (en) 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US6913903B2 (en) 2001-09-07 2005-07-05 Nobex Corporation Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
TWI329105B (en) 2002-02-01 2010-08-21 Rigel Pharmaceuticals Inc 2,4-pyrimidinediamine compounds and their uses
DE60302454T2 (de) * 2002-04-19 2006-08-17 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Beta-agonisten-verbindungen mit stickoxid-donatoren-gruppen und reaktionsfähige sauerstoffspezies-fängergruppen und ihre verwendung bei der behandlung von atemwegsstörungen
EP1562975A2 (en) * 2002-10-25 2005-08-17 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Steroid compounds comprising superoxide dismutase mimic groups and nitric oxide donor groups, and their use in the preparation of medicaments
CA2820537C (en) 2003-04-23 2015-10-20 Valeritas, Inc. Hydraulically actuated pump for fluid administration
KR101201603B1 (ko) 2003-07-30 2012-11-14 리겔 파마슈티칼스, 인크. 자가면역 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한2,4-피리미딘디아민 화합물
US9089636B2 (en) 2004-07-02 2015-07-28 Valeritas, Inc. Methods and devices for delivering GLP-1 and uses thereof
CA2580313C (en) 2004-07-19 2016-03-15 Biocon Limited Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof
DK1804865T3 (da) 2004-10-21 2010-02-01 Novo Nordisk As Neddrejeindstillingsmekanisme til en pen med fjederoptræk
JP4022595B2 (ja) * 2004-10-26 2007-12-19 コニカミノルタオプト株式会社 撮影装置
US8007754B2 (en) 2005-02-04 2011-08-30 Mineral And Coal Technologies, Inc. Separation of diamond from gangue minerals
CN101163514B (zh) 2005-04-24 2012-01-25 诺和诺德公司 注射装置
US7491732B2 (en) 2005-06-08 2009-02-17 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of the JAK pathway
US20070203161A1 (en) 2006-02-24 2007-08-30 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of the jak pathway
US7741281B2 (en) * 2005-11-03 2010-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Hepatitis C virus inhibitors
US8962643B2 (en) * 2006-02-24 2015-02-24 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of the JAK pathway
CN101400394B (zh) 2006-03-10 2012-07-04 诺沃-诺迪斯克有限公司 具有传动部件的注射装置
JP5062768B2 (ja) 2006-03-10 2012-10-31 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 注射装置および該装置のカートリッジを交換する方法
US8088900B2 (en) 2006-03-30 2012-01-03 Novo Nordisk A/S Two-phase precipitation of proteins
ES2566058T3 (es) 2006-03-30 2016-04-08 Valeritas, Inc. Dispositivo de suministro de fluidos de múltiples cartuchos
US7714025B2 (en) * 2006-05-10 2010-05-11 Arizona Biomedical Research Commission Modified chalcone compounds as antimitotic agents
DE602007004972D1 (de) 2006-05-16 2010-04-08 Novo Nordisk As Getriebemechanismus für ein injektionsgerät
CN102327655B (zh) 2006-05-18 2013-06-19 诺沃-诺迪斯克有限公司 具有模式锁定装置的注射装置
CN101641126B (zh) 2007-03-23 2014-06-04 诺沃-诺迪斯克有限公司 包括锁定螺母的注射装置
BRPI0818004B8 (pt) 2007-10-16 2021-05-25 Biocon Ltd composição farmacêutica sólida administrável por via oral e o processo da mesma.
DK2389372T3 (en) 2009-01-23 2015-12-14 Rigel Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITION OF JAK pathway
EP2504019A2 (en) 2009-11-25 2012-10-03 ArisGen SA Mucosal delivery composition comprising a peptide complexed with a crown compound and/or a counter ion
BR112013001632B1 (pt) 2010-07-28 2021-05-25 Rigel Pharmaceuticals composto, composição farmacêutica, e, método de fabricar um composto
CA2861706A1 (en) 2011-12-29 2013-07-04 Novo Nordisk A/S Dial-up/dial-down mechanism for wind-up pen
NZ629898A (en) 2012-03-23 2016-04-29 Oxigene Inc Compositions and methods for inhibition of cathepsins
US11206846B2 (en) 2017-05-02 2021-12-28 Leprino Foods Company High purity alpha lactalbumin and methods of making
WO2019064125A1 (en) 2017-09-26 2019-04-04 Biocon Limited INTEGRATED AUTOMATED FILTRATION FOR THE SEPARATION, WASHING AND DRYING OF PEPTIDE CRYSTALS
WO2020092845A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Method and composition embodiments for treating acute myeloid leukemia
WO2020243612A1 (en) 2019-05-29 2020-12-03 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Method of preventing and treating thrombosis
CN114698370A (zh) 2019-08-08 2022-07-01 里格尔药品股份有限公司 用于治疗细胞因子释放综合征的化合物和方法
EP4013420B1 (en) 2019-08-14 2023-11-01 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Method of blocking or ameliorating cytokine release syndrome
US20230303555A1 (en) 2022-03-23 2023-09-28 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Pyrimid-2-yl-pyrazole compounds as irak inhibitors

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR1468831A (fr) * 1965-10-05 1967-02-10 Roussel Uclaf Procédé de préparation de nouveaux composés polypeptidiques et produits en résultant
DE1902865A1 (de) * 1968-02-01 1969-09-11 American Home Prod Substituierte Insulin-Derivate,Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in pharmazeutischen Zubereitungen
US3591574A (en) * 1968-05-29 1971-07-06 American Home Prod Tri-n-phenylglycyl derivatives of insulin
US3528960A (en) * 1968-10-07 1970-09-15 Lilly Co Eli N-carboxyaroyl insulins
US3823125A (en) * 1969-10-14 1974-07-09 American Home Prod N-aminoacyl-substituted insulins
US3752798A (en) * 1969-12-02 1973-08-14 G Amird Tris-na1,nb1,nepsilonb29 - (3-x-3-oxo - 1-y-prop-1-en-1-yl)(ndelta-(4-z-6-r-pyrimidin - 2 - yl) ornithine b22)-insulins and their preparation
US3869437A (en) * 1970-05-08 1975-03-04 Nat Res Dev Mono-, di, and N{HD A1{B , N{HU B1{B , N{HU B29{B -tri-acylated insulin
US3950517A (en) * 1970-05-08 1976-04-13 National Research Development Corporation Insulin derivatives
GB1381274A (en) * 1971-01-28 1975-01-22 Nat Res Dev Insulin derivatives
GB1381273A (en) * 1971-01-28 1975-01-22 Nat Res Dev Insulin derivatives
US3864325A (en) * 1971-11-18 1975-02-04 Nat Res Dev (N{HU Al{b , N{HU Bl{b , N{HU B29{B , carbamoyl)-(O{HU A14{B , O{HU B16{B , O{HU B26{B aryl) insulin derivatives
BE791949A (fr) * 1971-11-27 1973-05-28 Schering Ag Derives d'insuline, leur preparation et leur utilisation
US3843815A (en) * 1972-02-10 1974-10-22 Gen Foods Corp Inhibiting gel formation in meat-in-gravy products
US3755569A (en) * 1972-07-25 1973-08-28 American Home Prod Acyl substituted insulins
DE2252157C3 (de) * 1972-10-25 1976-03-18 Hoechst Ag Zwischenprodukte zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten und verfahren zur herstellung von insulin, insulin analogen und derivaten
NL7314766A (zh) * 1972-10-31 1974-05-02
DE2253327A1 (de) * 1972-10-31 1974-05-09 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten
DE2428412A1 (de) * 1974-06-12 1976-01-15 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten
DE2439296A1 (de) * 1974-08-16 1976-02-26 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten
GB1492997A (en) * 1976-07-21 1977-11-23 Nat Res Dev Insulin derivatives
EP0014815A3 (de) * 1978-12-20 1980-10-29 Ciba-Geigy Ag Peptidderivate, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte sowie pharmazeutische Präparate mit einer dieser Verbindungen
US4486458A (en) * 1982-09-07 1984-12-04 A. E. Staley Manufacturing Company Non-gelling corn steep liquor
PH25772A (en) * 1985-08-30 1991-10-18 Novo Industri As Insulin analogues, process for their preparation
JPS6255096A (ja) * 1986-06-12 1987-03-10 Nippon Shinyaku Co Ltd 新規な脂肪酸アシル化合物
JPH01254699A (ja) * 1988-04-05 1989-10-11 Kodama Kk インスリン誘導体及びその用途
NZ232375A (en) * 1989-02-09 1992-04-28 Lilly Co Eli Insulin analogues modified at b29
AU8091091A (en) * 1990-07-26 1992-02-18 University Of Iowa Research Foundation, The Novel drug delivery systems for proteins and peptides using albumin as a carrier molecule
US5304473A (en) * 1991-06-11 1994-04-19 Eli Lilly And Company A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production
WO1994012530A1 (en) * 1992-11-30 1994-06-09 Biosignal Kutató Fejlesztó Kft. Polyunsaturated fatty acyl-peptide composition

Also Published As

Publication number Publication date
DE69631996D1 (de) 2004-05-06
CZ388197A3 (cs) 1998-05-13
EP0747391B1 (en) 2004-03-31
DK0747391T3 (da) 2004-07-19
IL122460A0 (en) 1998-06-15
AU5951396A (en) 1996-12-30
ATE263185T1 (de) 2004-04-15
JPH11506738A (ja) 1999-06-15
NO975583L (no) 1997-12-03
WO1996040730A1 (en) 1996-12-19
CA2223389A1 (en) 1996-12-19
HUP9900877A3 (en) 1999-11-29
KR19990022590A (ko) 1999-03-25
TR199701528T1 (xx) 1998-03-21
NO975583D0 (no) 1997-12-03
BR9608729A (pt) 1999-06-29
NZ309371A (en) 1999-09-29
PL323994A1 (en) 1998-04-27
JP3844504B2 (ja) 2006-11-15
EA199800042A1 (ru) 1998-08-27
EP0747391A3 (en) 1997-05-21
DE69631996T2 (de) 2005-01-27
AU703032B2 (en) 1999-03-11
MX9709657A (es) 1998-07-31
EP0747391A2 (en) 1996-12-11
US5700904A (en) 1997-12-23
HUP9900877A2 (hu) 1999-07-28
ES2216039T3 (es) 2004-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1192218A (zh) 酰化蛋白粉的制备
DE69632224T2 (de) Reduzierung von Gelation von Fettsäureacylierten Proteinen unter Nutzung von Zitratpuffer
US8101712B2 (en) Purification processes for echinocandin-type compounds
DD244345A5 (de) Neue peptide
CN105636979B (zh) 胰岛素类似物的新衍生物
US4918059A (en) Low molecular weight alkali metal huminates, method for their preparation and applications thereof
RU2303040C2 (ru) Очистка пептидов
CN110054662B (zh) 一种固相合成Etelcalcetide的方法
US20040242460A1 (en) Stabilized acylated insulin formulations
WO2021252829A1 (en) Process for preparing a glp-1/glucagon dual agonist
RU2075509C1 (ru) Способ выделения рекомбинантного соматотропина
JPS62501501A (ja) 相当するｓ−スルホネ−トからインシユリン前駆体の折りたたみに際し得られる反応混合物からのインシユリン前駆体の取得法
EP0966482B1 (en) Crystallisation of proteins
SE443790B (sv) Nya angiotensin-ii-analoger, som i l-stellningen innehaller en alfa-aminooxisyra och som har angiotensinantagoniserande verkan
RU2252782C2 (ru) Способ приготовления готовой лекарственной формы инсулина пролонгированного действия
CN1167766A (zh) 头孢烯和异噁头孢烯衍生物的制备方法
CN101437849B (zh) 胰岛素衍生物
Chibnall et al. Determination of the N-terminal residues in proteins with methoxycarbonyl chloride
CN1522235A (zh) 制备无定形西司他汀钠的方法
RU2261108C2 (ru) Способ получения комбинированного препарата инсулина человека
RU2261107C2 (ru) Способ приготовления готовой лекарственной формы инсулина короткого действия
CN1355173A (zh) 醋酸奥曲肽的液相合成方法
CN107163105B (zh) 一种天然利那洛肽的结晶方法
US3728326A (en) Hypocalcemic peptide and process of preparing it using a two-phase n-butanol-pyridine-acetic acid-ammonium acetate-water system
CN112279895A (zh) 一种化学合成酸性多肽的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication