RU2261108C2 - Способ получения комбинированного препарата инсулина человека - Google Patents
Способ получения комбинированного препарата инсулина человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2261108C2 RU2261108C2 RU2002135041/15A RU2002135041A RU2261108C2 RU 2261108 C2 RU2261108 C2 RU 2261108C2 RU 2002135041/15 A RU2002135041/15 A RU 2002135041/15A RU 2002135041 A RU2002135041 A RU 2002135041A RU 2261108 C2 RU2261108 C2 RU 2261108C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insulin
- preparation
- crystals
- combined
- reaction
- Prior art date
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в производстве высококачественных комбинированных препаратов инсулина человека. Способ характеризуется тем, что включает получение эфира инсулина человека транспептидацией свиного инсулина при избытке ди-трет-бутилового эфира треонина в водно-органической среде в присутствии трипсина, ингибирование реакции закислением, хроматографическую очистку полученного эфира инсулина, снятие защитных групп трифторуксусной кислотой и очистку полученного сырого инсулина человека, приготовление части комбинированного препарата короткого действия путем растворения 15, 25 или 50% полученного инсулина в разбавленной кислоте и смешивания с растворами консерванта, изотонического агента и веществами с буферной емкостью, приготовление части комбинированного препарата пролонгированного действия путем растворения оставшегося инсулина также в разбавленной кислоте с последующей добавкой кислых растворов ионов цинка и прота-минсульфата, смешиванием с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживанием раствора до образования кристаллов и соединением полученных частей комбинированного препарата инсулина, при этом реакцию транспептидации проводят при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина, равном 1:300-1000, перед закислением реакционной среды осуществляют дополнительное ингибирование реакции разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза, а очистку эфира инсулина человека осуществляют путем проведения ВЭЖХ с последующим осаждением фракций эфирной производной в присутствии ионов цинка, снятием защитных групп и получением кристаллов сырого инсулина, которые очищают повторным проведением ВЭЖХ, причем оба процесса очистки проводят с использованием в качестве неподвижной фазы сорбент DIASOGEL ODS (С 18) с размером частиц от 15 мкм и размером пор 120 А, а в качестве подвижной фазы на первом этапе используют 0,06 М-глицин HCL буфер, содержащий 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20 до 35% и рН 2,5, а на втором - 0,05 М ацетатный буфер с содержанием пропанола-2 от 10 до 20% при рН 2,5, и при приготовлении обеих частей комбинированного препарата растворение кристаллов инсулина в разбавленной кислоте проводят поэтапно, причем сначала получают мелкодисперсную суспензию кристаллов инсулина в воде, а потом к ней добавляют разбавленную кислоту, причем при приготовлении части комбинированного препарата пролонгированного действия смесь, полученную после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживают при температуре 18-21°С в течение 20-22 часов. Технический результат - создание эффективного, экономичного способа получения комбинированного препарата инсулина человека с низкими иммунологическими свойствами, который позволяет увеличить выход инсулина в процессе производства.
Description
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в производстве высокоочищенных комбинированных препаратов инсулина человека.
Известен способ получения комбинированного препарата инсулина путем получения субстанции инсулина из поджелудочной железы животных, очистки полученного экстракта от балластных белков, приготовления кристаллической и аморфной частей комбинированного препарата и их смешивания (1951, Hallas-Moller 1956).
Полученный таким образом комбинированный препарат инсулина содержит большое количество вредных для здоровья человека примесей, которые вызывают нежелательные аллергические реакции и осложнения. Для этого способа также характерны значительные потери инсулина при приготовлении его лекарственной формы и нестабильность физического состояния, потому что аморфная часть препарата конгломерируется в процессе хранения, что значительно ухудшает качество препарата.
Известен также "Способ получения полусинтетического инсулина человека" (патент США №4400465 от 1983 года), в котором эфир инсулина человека получают в две стадии: на первой стадии с помощью карбоксипептидазы А от свиного инсулина отщепляют аланин в позиции В30, а на второй трипсин пришивает эфир треонина. Реакция проводится при молярном избытке производной треонина по отношению к дезаланининсулину от 5:1 до 1000:1, в присутствии трипсина или трипсиноподобного фермента. Полученный эфир инсулина очищают хроматографией низкого давления, снимают защитные группы и осаждают человеческий инсулин, 15, 25 или 50% которого затем растворяют в разбавленной кислоте и смешивают с растворами консерванта, изотонического агента и веществами с буферной емкостью для получения части комбинированного препарата короткого действия, а для получения части комбинированного препарата пролонгированного действия оставшийся инсулин человека также растворяют в разбавленной кислоте, смешивают с необходимыми добавками, выдерживают раствор до образования кристаллов и соединяют обе части комбинированного препарата инсулина. Но, как известно, такое двухстадийное получение эфирной производной инсулина приводит к увеличению количества примесей в реакционной смеси и к снижению выхода инсулина.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ, описанный в патенте США №4601852 А, опубликованном в 1986 году, в котором рассматривается способ приготовления препаратов инсулина, при котором получают эфир инсулина человека транспептидацией свиного инсулина при молярном избытке ди-трет-бутилового эфира треонина в водно-органической среде в присутствии трипсина. Молярный избыток эфира треонина по отношению к инсулину заявляется 10:100-кратным. Весовое соотношение свиного инсулина и трипсина равняется 1:1-100. Затем ингибируют реакцию закислением реакционной среды, выделяют эфир инсулина человека, проводят его хроматографическую очистку низкого давления (гель-фильтрацией), выделяют очищенный эфир инсулина концентрированием и осаждением, снимают защитные группы известным способом (например, трифторуксуной кислотой) и выделяют сырой инсулин человека, который растворяют в разбавленной кислоте для получения части комбинированного препарата короткого действия, а для получения части комбинированного препарата пролонгированного действия к раствору полученного инсулина добавляют кислые растворы ионов цинка и протаминсульфата, смешивают с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина и выдерживают полученную смесь до образования суспензии кристаллов. Этот способ позволяет увеличить выход эфира инсулина человека, который определяет выход инсулина человека в процессе производства, до 60% (а при определенных условиях даже до 90%) и существенно снизить количество вредных примесей (до 7%).
Задачей изобретения является создание эффективного способа получения комбинированного препарата инсулина с низким содержанием примесей, который гарантирует увеличение выхода инсулина в процессе производства.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения комбинированного препарата инсулина человека, включающем получение эфира инсулина человека транспептидацией свиного инсулина при избытке ди-трет-бутилового эфира треонина в водно-органической среде в присутствии трипсина, ингибирование реакции закислением, хроматографическую очистку полученного эфира инсулина, снятие защитных групп трифторуксусной кислотой и очистку полученного сырого инсулина человека, приготовление части комбинированного препарата короткого действия путем растворения 15, 25 или 50% полученного инсулина в разбавленной кислоте и смешивания с растворами консерванта, изотонического агента и веществами с буферной емкостью, приготовление части комбинированного препарата пролонгированного действия путем растворения оставшегося инсулина также в разбавленной кислоте с последующей добавкой кислых растворов ионов цинка и протаминсульфата, смешиванием с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживанием раствора до образования кристаллов и соединением полученных частей комбинированного препарата инсулина, согласно изобретению реакцию транспептидации проводят при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина, равном 1:300-1000, перед закислением реакционной среды осуществляют дополнительное ингибирование реакции разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза, а очистку эфира инсулина человека осуществляют путем проведения ВЭЖХ с последующим осаждением фракций эфирной производной в присутствии ионов цинка, снятием защитных групп и получением кристаллов сырого инсулина, который очищают повторным проведением ВЭЖХ, причем оба процесса очистки проводят с использованием в качестве неподвижной фазы сорбента обращенно-фазового типа, например DAISOGEL ODS (C18), с размером частиц от 15 мкм и размером пор 120 , и в качестве подвижной фазы на первом этапе используют 0,06 М-глицин HCl буфер, содержащий 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20 до 35% при рН 2,5, а на втором - 0,05 М ацетатный буфер с содержанием пропанола-2 от 10 до 20% при рН 2,5, и при приготовлении обеих частей комбинированного препарата растворение кристаллов инсулина в разбавленной кислоте проводят поэтапно, причем сначала получают мелкодисперсную суспензию кристаллов инсулина в воде, а потом к ней добавляют разбавленную кислоту, причем при приготовлении части комбинированного препарата пролонгированного действия смесь, полученную после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживают при температуре 18-21°С в течение 20-22 часов.
Сопутствующими родственными примесями свиного инсулина являются свиной проинсулин и продукты модификации и деградации свиного инсулина.
Водно-органическая среда представляет собой воду со смесью апротонных (например, диметилацетамид) и протонных (например, 1,2 этандиол, 1,4 бутандиол, 1,5 пентадиол) растворителей.
Трипсин в представленном техническом решении может быть свиным или бычьим.
В реакции транспептидации может использоваться ди-трет-бутиловый эфир треонина или его соль.
Дополнительное ингибирование реакции транспептидации разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза перед закислением позволяет непосредственно наносить разбавленную смесь на колонку системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), что устраняет необходимость выполнения ряда технологических операций, которые описаны в прототипе: то есть осаждения реакционной смеси, отделения осадка центрифугированием, растворения осадка, и позволяет эффективно очистить эфир инсулина человека от свиного инсулина, который не прореагировал, и от примесей-спутников реакции транспептидации.
Повторное использование ВЭЖХ для очистки полученных кристаллов инсулина человека также проводится на колонке системы высокоэффективной жидкостной хроматографии и позволяет достичь еще лучших результатов.
В качестве неподвижной фазы заявитель использует сорбент обращенно-фазового типа, например DAISOGEL ODS (С 18), с размером частиц от 15 мкм и размером пор 120 , а в качестве подвижной фазы при очистке эфира инсулина использует 0,06 М-глицин НС1 буфер, содержащий 0,015 М аммония сульфат с концентрацией пропанола-2 от 20 до 35% при рН 2,5, а при очистке полученных кристаллов инсулина - 0,05 М ацетатный буфер с содержанием пропанола-2 от 10 до 20% при рН 2,5.
Условия реакции транспептидации, в частности, заявляемое фермент-субстратное соотношение, равное 1:300-1000, позволяет увеличить степень конверсии свиного инсулина или выход эфира инсулина человека, который характеризует выход конечного продукта, до 98% и уменьшить количество трудноудаляемых примесей до 1,5%. На повышение степени устранения примесей направлена и дополнительная очистка полученных кристаллов инсулина человека - до 0,9%.
Для приготовления частей комбинированного препарата как короткого, так и пролонгированного действия используются кристаллы инсулина, очищенные ВЭЖХ. На приготовление части комбинированного препарата короткого действия затрачивается 15, 25 или 50% всех кристаллов, а части комбинированного препарата пролонгированного действия - оставшиеся кристаллы. В обоих случаях кристаллы инсулина человека сначала суспендируют в воде и перемешивают до получения мелкодисперсной суспензии, а потом добавляют к ней 1 М HCl. Приготовление мелкодисперсной суспензии на первом этапе, то есть обеспечение такого состояния, когда каждая отдельная мелкая частичка инсулина оказывается со всех сторон окруженной водой, создает условия для их быстрого растворения в разбавленной кислоте на втором этапе. Таким образом, время контакта кристаллов инсулина с кислотой уменьшается, что, в соответствии с исследованиями авторов, приводит к уменьшению количества образующегося А21-дезамида инсулина и, следовательно, к увеличению чистоты препарата. Так получают часть комбинированного препарата инсулина короткого действия. Для получения части комбинированного препарата инсулина пролонгированного действия к разбавленной в слабой кислоте части кристаллов добавляют кислые растворы ионов цинка и протаминсульфата, смешивают с забуференными растворами, которые содержат м-крезол, фенол и глицерин. Полученный раствор выдерживают при температуре 18-21°С в течение 20-22 часов. Такой режим выращивания кристаллов позволяет получить кристаллическую суспензию с более однородными по размеру кристаллами тетрагональной формы длиной от 1 до 25 мкм, что обеспечивает более равномерное освобождение инсулина в организме человека (в Европейской фармакопее 2002 г., 4-е издание, стр.1374, длина кристаллов допускается от 1 до 60 мкм).
Комбинированные препараты в соответствии с данным способом могут выпускаться с разными пропорциями растворимой и кристаллической частей инсулина, например, 15/85, 25/75, 50/50. Такие препараты сохраняют свои химические и физические свойства, независимо от соотношения растворимой и кристаллической частей, и обеспечивают упрощение процедуры введения препарата и увеличение точности дозировки.
Решение поставленной задачи иллюстрируется примерами конкретного выполнения.
Пример 1.
6 г сырого свиного инсулина суспендировали в 24 мл воды, добавили 3,0 мл уксусной кислоты, 180 мл 0,7 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилацетамида и 1,4 бутандиола, 19 мг трипсина в 12 мл 0,05 М кальция ацетата, реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов при температуре 23°С. Реакцию ингибировали разбавлением водой в 2 раза по отношению к объему реакционной смеси и рН смеси довели до 2,5 10% HCl. Разбавленную реакционную смесь профильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм для нанесения на колонку системы ВЭЖХ. В качестве неподвижной фазы использовали сорбент обращенно-фазового типа DAISOGEL ODS (С 18) с размером частиц от 15 мкм и размером пор 120 . Для подвижной фазы использовали 0,06 М глицин-HCl буфер, который содержал 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20 до 35% при рН 2,5. Фракции эфирной производной осадили в присутствии ионов цинка при рН от 6,8 до 7,0, отцентрифугировали, полученный осадок промыли водой и высушили в вакуумном сушильном шкафу. 5,0 г полученного эфира инсулина человека растворили в 60 мл трифторуксусной кислоты, выдержали 40 минут при температуре 25°С, трифторуксусную кислоту отогнали на роторном испарителе при температуре не выше 30°С, полученный сырой инсулин человека растворили в воде и провели прямую цитратную кристаллизацию при рН 5,8.
Кристаллическую суспензию отфильтровали, кристаллы промыли водой, растворили в 0,25 М уксусной кислоте и нанесли на колонку системы ВЭЖХ. В качестве подвижной фазы использовали 0,05 М ацетатный буфер, который содержал пропанола-2 от 10 до 20% при рН 2,5. Фракцию инсулина человека кристаллизовали при рН 5,8, суспензию кристаллов профильтровали, промыли водой и лиофильно высушили. Выход инсулина человека составил 4,5 г. Методом иммуноферментного анализа было установлено, что содержание свиного проинсулина в полученном инсулине человека было менее 1 мкг/г. Что касается остальных родственных примесей, то с помощью аналитической системы ВЭЖХ было установлено их содержание - 0,85%.
Приготовление кристаллической части комбинированного препарата пролонгированного действия, которая составляет 85% от общего количества инсулина.
Кристаллы инсулина человека в количестве 2,295 г поместили в 170 мл воды, а затем перемешали до получения мелкодисперсной суспензии, добавили такое количество 1 М HCl, чтобы рН раствора было не ниже 3,1. 0,189 г протаминсульфата растворили в 31 мл воды, добавляя 1 М HCl до такого же рН. 0,0135 г цинка хлорида добавили в раствор протаминсульфата. Потом смешали все приготовленные кислые растворы. Дальше приготовили буферный раствор из 3,125 г натрия фосфорнокислого однозамещенного двухводного в 1,235 л воды, добавили 23,8 г глицерина, 2,23 м-крезола и 0,895 г фенола, перемешали в течение 30 минут и рН смеси довели до 7,8. Потом буферный раствор подвергли стерилизующей фильтрации и профильтровали туда смесь кислых растворов протаминсульфата, цинка хлорида и инсулина. Полученную смесь выдерживали, перемешивая, при температуре 20°С в течение 21 часа для получения кристаллической суспензии.
Приготовление растворимой части комбинированного препарата короткого действия, которая составляет 15%.
Кристаллы инсулина человека в количестве 0,405 г поместили в 52,5 мл воды, а затем хорошо перемешали до получения мелкодисперсной суспензии. Добавили такое количество 1 М HCl, чтобы рН раствора было не ниже 3,1. Потом приготовили буферный раствор из 0,55 г натрия фосфорнокислого однозамещенного двухводного в 210 мл воды, добавили 4,2 г глицерина, 0,39 г м-крезола и 0,157 г фенола, перемешали в течение 30 минут и рН смеси довели до 7,4. Раствор инсулина смешали с буферным раствором и провели стерилизующую фильтрацию в емкость с кристаллической суспензией, перемешали в течение часа и разлили в асептических условиях во флаконы. Исследования комбинированного препарата инсулина с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что препарат имел общую активность 39,9 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений составляло 0,3%, сопутствующих родственных примесей 0,9%, А21-дезамида инсулина 0,4%, активность супернатанта составляла 6,5 МЕ/мл. Кристаллы, исследованные под микроскопом при 400-кратном увеличении, имели тетрагональную форму и длину от 3 до 21 мкм.
Пример 2.
Условия получения комбинированного препарата инсулина человека, как в примере 1, за исключением того, что соотношение растворимой и кристаллической частей составляло 25/75. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 2 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата, содержание высокомолекулярных соединений, сопутствующих родственных примесей, А21-дезамида инсулина и размеры кристаллов были на уровне, описанном в примере 1, но в пределах ошибки определения. При этом активность супернатанта составляла 10,3 МЕ/мл.
Пример 3.
Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что соотношение растворимой и кристаллической частей составляло 50/50. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 3 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата, содержание высокомолекулярных соединений, сопутствующих родственных примесей, А21-дезамида инсулина и размеры кристаллов были на уровне, описанном в примере 1, но в пределах ошибки определения. При этом активность супернатанта составляла 21 МЕ/мл.
Пример 4.
Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что на первой стадии процесса добавили 30 мг трипсина в 12 мл 0,05 М кальция ацетата, а реакцию проводили в течение 10 часов при температуре 23°С. Выход инсулина составил 3,76 г. Исследования комбинированного препарата инсулина с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата составляла 39,2 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,7%, сопутствующих родственных примесей 4,1%, А21-дезамида инсулина 2,0%, а активность супернатанта 6,4 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 2-23 мкм.
Пример 5.
Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что на первой стадии процесса добавили 4,8 мг трипсина в 12 мл 0,05 М кальция ацетата, а реакцию проводили в течение 20 часов при температуре 20°С. Выход инсулина составил 3,395 г. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 5 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата составляла 38,5 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,8%, сопутствующих родственных примесей 1,8%, А21-дезамида инсулина 0,8%, а активность супернатанта 6,8 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 2-25 мкм.
Пример 6.
Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что в качестве неподвижной фазы использовали сорбент DAISOGEL ODS (С 18) размером частиц 15 мкм и размером пор 200 . Иммуноферментный анализ полученных кристаллов инсулина человека показал содержание свиного проинсулина менее 1 мкм/г. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 6 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата составляла 39,3 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,7%, сопутствующих родственных примесей 1,8%, А21-дезамида инсулина 0,9%, а активность супернатанта 7,0 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 1-25 мкм.
Пример 7.
Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что в качестве неподвижной фазы использовали сорбент DAISOGEL ODS (С 18) размером частиц от 40 до 60 мкм и размером пор 120 . Иммуноферментный анализ полученных кристаллов инсулина человека показал содержание свиного проинсулина 2,1 мкм/г. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 7 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата составляла 39,3 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,6%, сопутствующих родственных примесей 4,1%, А21-дезамида инсулина 1,9%, а активность супернатанта 5,9 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 2-27 мкм.
Пример 8.
Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что в качестве подвижной фазы при очистке эфира инсулина человека использовали 0,1 М глицин-HCl буфер, который содержал 0,1 М аммоний сульфат и пропанол-2 с концентрацией 20-35% при pH 2,5. Иммуноферментный анализ полученных кристаллов инсулина человека показал содержание свиного проинсулина менее 1 мкм/г. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 8 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата составляла 39,6 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,5%, сопутствующих родственных примесей 2,1%, А21-дезамида инсулина 1,7%, а активность супернатанта 5,9 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 2-28 мкм.
Пример 9.
Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что в качестве подвижной фазы при очистке полученных кристаллов инсулина человека использовали 0,1 М ацетатный буфер, который содержал пропанол-2 с концентрацией 20 - 35% при рН 2,5. Иммуноферментный анализ полученных кристаллов инсулина человека показал содержание свиного проинсулина 2,2 мкм/г. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 9 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата составляла 39,4 МЕ/мл, содержание высокомолекулярных соединений 0,7%, сопутствующих родственных примесей 3,1%, А21-дезамида инсулина 0,9%, а активность супернатанта 5,9 МЕ/мл. Длина кристаллов составляла 2-26 мкм.
Пример 10.
Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что раствор, полученный после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживали при температуре 14°С. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 10 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата, содержание высокомолекулярных соединений, сопутствующих родственных примесей, А21-дезамида инсулина и активность супернатанта были на уровне, описанном в примере 1, но в пределах ошибки определения. Однако при этом 95% кристаллов имели длину от 1 до 55 мкм.
Пример 11.
Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что раствор, полученный после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживали при температуре 25°С. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 11 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата, содержание высокомолекулярных соединений, сопутствующих родственных примесей, А21 -дезамида инсулина были на уровне, описанном в примере 1, но в пределах ошибки определения. При этом длина кристаллов составляла от 1 до 50 мкм и активность супернатанта 8,3 МЕ/мл, что свидетельствовало о неполном процессе кристаллизации.
Пример 12.
Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что раствор, полученный после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживали в течение 17 часов. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 12 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата, содержание высокомолекулярных соединений, сопутствующих родственных примесей, А21-дезамида инсулина и активность супернатанта были на уровне, описанном в примере 1, но в пределах ошибки определения. Количество кристаллов длиной от 1 до 25 мкм составляло только 55%.
Пример 13.
Условия получения комбинированного препарата инсулина, как в примере 1, за исключением того, что раствор, полученный после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживали в течение 25 часов. Исследования комбинированного препарата инсулина по примеру 13 с помощью аналитической системы ВЭЖХ показали, что активность препарата, содержание высокомолекулярных соединений, сопутствующих родственных примесей, А21-дезамида инсулина и активность супернатанта были на уровне, описанном в примере 1, но в пределах ошибки определения. Количество кристаллов длиной от 1 до 25 мкм составляло 95%. Такой же результат получается при выдерживании раствора 22 часа, то есть здесь процесс просто необоснованно затягивается.
Итак, анализ примеров конкретного выполнения (примеры 1-3) свидетельствует о том, что заявляемым способом могут быть получены комбинированные препараты инсулина с различным соотношением кристаллической и растворимой частей. Использование данного способа позволяет увеличить выход инсулина человека, уменьшить количество примесей, то есть увеличить чистоту препарата. В то же время анализ примеров 4 и 5 показывает, что выход за пределы заявляемого фермент-субстратного соотношения приводит к увеличению количества примесей в препарате и к снижению выхода инсулина; отклонение от заявляемых параметров очистки эфира инсулина человека и полученных кристаллов инсулина человека - примеры 6-9 - также приводит к снижению чистоты препарата, а несоблюдение заявляемого режима выращивания кристаллов (примеры 10-13) не позволяет получить более однородные по длине кристаллы, и следовательно, обеспечить более равномерное освобождение инсулина в организме человека, то есть получить препараты инсулина более высокого качества.
Claims (1)
- Способ получения комбинированного препарата инсулина человека, включающий получение эфира инсулина человека транспептидацией свиного инсулина при избытке ди-трет-бутилового эфира треонина в водно-органической среде в присутствии трипсина, ингибирование реакции закислением, хроматографическую очистку полученного эфира инсулина, снятие защитных групп трифторуксусной кислотой и очистку полученного сырого инсулина человека, приготовление части комбинированного препарата короткого действия путем растворения 15, 25 или 50% полученного инсулина в разбавленной кислоте и смешивания с растворами консерванта, изотонического агента и веществами с буферной емкостью, приготовление части комбинированного препарата пролонгированного действия путем растворения оставшегося инсулина также в разбавленной кислоте с последующей добавкой кислых растворов ионов цинка и протаминсульфата, смешиванием с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживанием раствора до образования кристаллов и соединением полученных частей комбинированного препарата инсулина, отличающийся тем, что реакцию транспептидации проводят при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина, равном 1:300-1000, перед закислением реакционной среды осуществляют дополнительное ингибирование реакции разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза, а очистку эфира инсулина человека осуществляют путем проведения ВЭЖХ с последующим осаждением фракций эфирной производной в присутствии ионов цинка, снятием защитных групп и получением кристаллов сырого инсулина, которые очищают повторным проведением ВЭЖХ, причем оба процесса очистки проводят с использованием в качестве неподвижной фазы сорбент DIASOGEL ODS (С 18) с размером частиц от 15 мкм и размером пор 120 Å, а в качестве подвижной фазы на первом этапе используют 0,06 М-глицин HCL буфер, содержащий 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20 до 35% и рН 2,5, а на втором - 0,05 М ацетатный буфер с содержанием пропанола-2 от 10 до 20% при рН 2,5, и при приготовлении обеих частей комбинированного препарата растворение кристаллов инсулина в разбавленной кислоте проводят поэтапно, причем сначала получают мелкодисперсную суспензию кристаллов инсулина в воде, а потом к ней добавляют разбавленную кислоту, причем при приготовлении части комбинированного препарата пролонгированного действия смесь, полученную после смешивания с забуференными растворами м-крезола, фенола и глицерина, выдерживают при температуре 18-21°С в течение 20-22 ч.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
UA2001129231 | 2001-12-29 | ||
UA2001129231A UA46668C2 (en) | 2001-12-29 | 2001-12-29 | Method for preparing combined dosage form of human insulin |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2002135041A RU2002135041A (ru) | 2004-07-20 |
RU2261108C2 true RU2261108C2 (ru) | 2005-09-27 |
Family
ID=35850192
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2002135041/15A RU2261108C2 (ru) | 2001-12-29 | 2002-12-26 | Способ получения комбинированного препарата инсулина человека |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2261108C2 (ru) |
UA (1) | UA46668C2 (ru) |
-
2001
- 2001-12-29 UA UA2001129231A patent/UA46668C2/uk unknown
-
2002
- 2002-12-26 RU RU2002135041/15A patent/RU2261108C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
KURTZ et al. Circulating IgG antibody to protamine in patients tretated with protamin-insulins. Diabetologia, 1983, 25, р.322-324. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
UA46668C2 (en) | 2006-01-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11083796B2 (en) | Peroxide removal from drug delivery vehicle | |
JP3844504B2 (ja) | アシル化タンパク質粉末の製造 | |
JPH11502856A (ja) | 単量体インスリン類似体製剤 | |
AU666465B2 (en) | Growth hormone crystals and a process for production of these GH-crystals | |
JP2002521340A (ja) | 有機溶媒含有または非含有溶液を利用した軟骨部抽出物を得る方法およびそれから分離された抽出物 | |
PT81012B (pt) | Processo para a recuperacao de hormonas de crescimento purificadas a partir de microrganismos tratados por engenharia genetica | |
KR20040018458A (ko) | Cetuximab 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산에스테르를 포함하는 액형 제제 | |
RU2261108C2 (ru) | Способ получения комбинированного препарата инсулина человека | |
FR2810667A1 (fr) | Procede d'isolement et de purification d'une proteine, et proteine obtenue | |
JPH08505127A (ja) | 成長ホルモンの結晶体を製造する方法およびそれにより得られる結晶体 | |
RU2252782C2 (ru) | Способ приготовления готовой лекарственной формы инсулина пролонгированного действия | |
JP2023075249A (ja) | 安定なペプチド製剤を調製するための方法 | |
RU2261107C2 (ru) | Способ приготовления готовой лекарственной формы инсулина короткого действия | |
KR20220140487A (ko) | 단백질 생물 공정 | |
EA045889B1 (ru) | Способ получения стабильных пептидных составов | |
RU2350945C2 (ru) | Регенерация хроматографической стационарной фазы | |
EP4070817A1 (en) | Liquid preparation containing anti-il-17 antibody | |
WO2004024753A1 (en) | Process for manufacturing crystals of growth hormone | |
CN114555622A (zh) | 蛋白质的纯化和病毒灭活 | |
US3326764A (en) | Chemically and biologically pure secretin polypeptide and unit dosage containing the polypeptide | |
CN1280856A (zh) | 一组稳定生物活性物质组合物及其制备方法 | |
UA57689C2 (en) | Method for producing substance of insulin suitable for immediate release dosage form | |
MXPA97009657A (en) | Preparation of an acil protein dust |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20071227 |