DD244345A5 - Neue peptide - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft neue Insulinverbindungen und neue infizierbare Loesungen mit verlaengerter Insulinwirkung. Mit der Erfindung wird ein neues Verfahren zur Herstellung neuer Peptide zur Verfuegung gestellt, die zur Behandlung von Diabetes eingesetzt werden koennen. Aufgabe der Erfindung ist es, Verfahren zur Herstellung neuer Peptide bereitzustellen die zur Behandlung von Diabetes eingesetzt werden koennen. Insulinderivate mit einer Ladung, die positiv ist, verglichen mit der Ladung von Humaninsulin bei neutralem p H, koennen zur Herstellung von Loesungen verwendet werden, die eine verlaengerte Insulinwirkung aufweisen. In den neuen Insulinderivaten ist eine basische Aminosaeure in der B27-Position substituiert worden und/oder eine neutrale Aminosaeure in die A4-, A17, B13- und/oder B21-Position eingefuehrt worden. Darueber hinaus wurde die C-terminale Carboxygruppe der B-Kette mit einem Amido- oder Esterrest blockiert.

Description

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Verfahren zur Herstellung neuer peptide Anwendungsgebiet der Erfindung "

Die Erfindung betrifft neue Insulinverbihdungen und neue injizierbare Lösungen mit verlängerter Insulinwirkung. Mit der Erfindung wird ein neues Verfahren zur Herstellung neuer Peptide zur Verfügung gestellt, die zur Behandlung von Diabetis eingesetzt werden können.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bei der Behandlung von Diabetis mellitus sind viele Arten von insulinzubereitungen vorgeschlagen und verwendet worden. Einige der Zubereitungen sind schnellwirkend, andere Zubereitungen haben eine mehr oder weniger verlängerte Wirkungsweise. Üblicherweise sind phaVmazeutische Insulinzubereitungen mit mehr oder weniger verlängerter*Wirkung wünschenswert. Eine derartige verlängerte Wirksamkeit wird durch Verabreichung des Insulins als Suspension von Insulinkristallen erreicht. Die kristallinen Zubereitungen erhält man durch, Kristallisation von Insulin bei Anwesenheit von zink ^z. B. Lente (eingetr. Warenzeichen), siehe Schlichtkrull: Insulinkristalle, chemische und biologische Studien über Insulinkristalle und Insulin-Zink-Suspensionen, Muriksgaard, 1958_J7 oder durch Kristallisation von Insulin in Gegenwart von Zink und Protamin \/~~z. B. NPH-Insulin, siehe Rep. Steno Mem. Hosp. 1 (1946), 60J,

Ein Nachteil bei der Verwendung der bekannten Suspensionen von Zinkinsulinkristallen oder von zinkprotamininsulin ist die Notwendigkeit,'die Ampulle zu schütteln um zu sichern, daß die korrekte Insulinmenge injiziert wird und die Kon-

- la - _:- ' . ^l · · .

zentration des in der Ampulle verbleibenden Insulins bis zu dessen Verwendung konstant ist» In Penfill-Kapseln, wo der Luftabschluß gewährleistet sein muß, erfordern Insulinsuspensionen mit verlängerter Wirksamkeit das Vorhandensein eines festen Körpers in der Kapsel, um das Verrühren zu ermöglichen» Das Schütteln von Insulinsuspensionen und Insulinlösungen mit Luft ist an sich ein unerwünschtes Verfahren, da Insulin die Tendenz zur Denaturierung unter Bildung von

OO OO( \cL

Pibrillen an den Wasser-Luft-Grenzflächen hat. Es sind daher Insulinlösungen mit verlängerter Wirksamkeit wünschenswert.

Lösungen mit Insulinderivaten mit verlängerter Wirksamkeit wurden aus Insulin erhalten, das an seinen Aminogruppen durch Reaktion mit Phenylisocyanat modifiziert worden war (sogenanntes Iso-35-Insulin, siehe Hallas-Hoeller: Chemische und biologische Insulinstudien auf Basis der Reaktion zwischen Insulin und Phenylisocyanat, Kopenhagen 1945)· In ähnlicher Weise wurde berichtet, daß A 1, B?29-di-Boc-substituriertes Insulin (Boc ist tertiäres Butyloxycarbonyl) eine verlängerte Insulinwirksamkeit nach subkutaner Verabreichung zeigt (siehe Geiger und Bnzmann in: Proinsulin, Insulin, G-Peptid, Symposiumsbericht Proinsulin, Insulin, C-Peptid, Tokushima 1978; Amsterdam-Oxford 1979, 306-310). Es wurde gefunden, daß das A^l, B 29-di-Boc-substituierte Insulin eine zu gering verlängerte Wirkung aufweist, um klinisch verwendbar zu sein.

Lösungen nichtmodifizierter Insuline erfordern große Mengen an Zink-Ionen (beispielsweise. 0,4-1 mg/S Insulin), um eine verlängerte Wirksamkeit hervorzubringen (siehe J.Pharmacol. 55, (1935) 206). Bie Injektion solch großer Dosen Zink-Ionen ruft vermutlich Schmerzen hervor, und daher sind derartige Lösungen in der Iherapie nie eingesetzt worden.

Der isoelektrische Punkt von Insulin liegt etwa bei 5,5> und es sind Versuche unternommen worden, die Löslichkeit von Insulinderivaten bei neutralem pH herabzusetzen durch Verschiebung des isoelektrischen Punktes nach oben, beispielsweise durch Additionen basischer Aminosäuren wie Lysin oder Arginin am Η-Ende der B-Kette (siehe zum Beispiel DB-OS 2 042 299) oder mit dem basischen Dipeptid ArginylAArginin

(siehe Geiger und Enzmann» oben zitiert)» Die Löslichkeit

Bi—IV BO der letztgenannten Verbindung Arg ^" '-Arg -Insulin in der Nähe von deren isoelektrischen Punkt war jedoch viel höher als die des Ausgangs-Insulins«

Die japanische Patentanmeldung Nr* 55-144032 betrifft Humaninsulin-Analoge, worin die B 30-Aminosäure durch eine Aminosäure mit wenigstens fünf Kohlenstoffatomen ersetzt ist sowie Amide und Ester· davon» Diese Insulinanalogen wurden bei Patienten verwendet» die Antikörper gegen Säugetierinsuline entwickelt hatten* In der japanischen Patentanmeldung sind sechs spezielle Verbindungen beschrieben, von denen bei keiner festgestellt wird, daß sie eine verlängerte Wirksamkeit aufweist· Es wurden keine speziellen injizierbaren Zubereitungen in der japanischen Patentanmeldung beschrieben*

Die europäische Patentanmeldung 84 108 442»9 betrifft Insulinanaloge» in denen eine basische organische Gruppe an die B 30-Aminogruppe angefügt ist, wodurch eine positive Ladung bei neutralem pH hervorgerufen wird· In diesen Analogen ist die B 30-Aminosäure neutral und ist vorzugsweise Threonin wie in Humaninsulin» Die DE-Patentanraeldung 3 327 709»5 betrifft eine Kristallsuspension der in der oben genannten europäischen Patentanmeldung beschriebenen Derivate sowie eine aromatische Hydroxyverbindung» Die DE-Patentanmeldung 3 326 743,2 betrifft ein Medikament, das ein Gemisch von Insulinverbindungen enthält, von denen wenigstens eines in der oben genannten europäischen Patentanmeldung beschrieben ist»

- 3a - " Ziel der Erfindung

Mit der Erfindung wird ein neues Verfahren zur Herstellung neuer Peptide zur Verfügung gestellt* die zur Behandlung von Diabetes eingesetzt werden können, wobei der Grad der Verlängerung der Insulinwirkung verstärkt und gesteuert wird·

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, Verfahren zur Herstellung neuer Peptide bereitzustellen» die zur Behandlung von Diabetes eingesetzt werden können und bessere Eigenschaften aufweisen»

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Analoge von Humaninsulin» die von Humaninsulin abweichen durch:

a) Vorhandensein eines Amid- oder Esterrestes an der C-terminalen Carboxygruppe der.B-Kette und

b) Auftreten von wenigstens einer Ladung mehr als Humaninsulin bei pH 7, vorzugsweise nicht mehr als 4 Ladungen mehr als Humaninsulin bei pH 7·

Der Ladungswechsel wird durch Blockieren der Carbfljfr-Gruppe in der B 30-Aminasäure erzielt und gewünschtenfälls durch Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren im Vergleich zu Humaninsulin.

Im einzelnen sind die praktisch interessanten erfindungsgemäßen Verbindungen wie folgt zu kennzeichnen: einer oder mehrere der vier Glutaminsäurereste bei A 4_r A 17, B 21 stehen anstelle einer anderen natürlich .auftretenden neu-

Ir .

tralen Aminosäure, vorzugsweise Glutamin; und/ oder der Threoninrest bei B27 steht anstelle eines natürlich auftretenden basischen Aminosäurerestes, vorzugsweise L-Arginin oder L-Lysin; und/ oder der Threoninrest bei B 30 steht anstelle eines oder zweier basischer Aminosäurereste, wobei einer bevorzugt ist, und die H-terminale Carboxygruppe in der B-Kette ist geschützt.

Die Erfindung betrifft ebenso Lösungen der oben eingeteilten Humsninsulin-iiMegen mit einem gesteuerten Zinkionenspiegel darin. Der Grad der Verlängerung der Insulinwirkung wird dadurch verstärkt und gesteuert. ,

Überraschenderweise wurde gefunden, daß injizierbare Lösungen mit einer kombinierten kurzen und verlängerten Insulinwirkung hergestellt werden können, wenn als aktiver Bestandteil ein einzelnes Insulinderivat mit der allgemeinen Fotcmel

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A (1-3)-Ξ¹-Α (5-6)-Cys-A (8-i6)-E²-A (18-19)-Cys-Asn (a-Kefcte) ' . ' . * . . - ·

S S

(D S S

. ' ' ^f

B (1-6)-Cys-B (8-12)-E³-B (H-18)-Gys

• (B-Kette) R-Z_n-Y_m-Lys-Pro-Z-B (26-22)-E⁴-GIy

verwendet wird, worin die Buchstaben A und B, gefolgt von den Zahlen.in Klammern, die.Peptidfragmente der A- und B-Ketten bezeichnen, entsprechend durch die Zahlen in Klammern bezeichnet, S , S , E und E⁴ sind gleich oder verschieden und stellen jeweils Glutaminsäure oder einen neutralen Aminosäurerest dar, der für Nucleotidsequenzen codieren kann, X ist ein L-Threonin-, L-Arginin- oder L-Lysinrest, Y und Z sind gleich oder verschieden und stellen jeweils einen Aminosäurerest dar, worin eine beliebige Seitenkettenaminogruppe acyliert sein kann und worin eine beliebige Seitenkettenhydroxygruppe alkyliert sein kann, und m und η sind gleich oder verschieden und stellen jeweils null oder eins dar, und R ist ein Amido- oder Ssterrest, der die C-terminale Carboxygruppe der B-Kette

•1

blockiert, mit der Maßgabe, daß nicht alle der GruppenS ,

2 3 4-E , 3 ,und E Glutaminsäurereste sind, wenn X ein Threoninrest ist oder, wenn E , E^, E und S⁴ jeweils ein Glutaminsäurerest ist und X ein Threoninrest, die Gruppe der Eormel -Y-Z-R folgende Reste darstellt:

-HH^, -Arg-NH^,-Arg-Arg-ira₂, - Ar g-Ly S-IH₂, .-Dab^Dab-IH₂, -Dap-Dap-NHg, -Lys-NHg, -Lys (LaU)-NH₂, -Lys-Arg-BILj, -Lys-LyS-IH₀, -Om-UH₉, -Om-Om-NH₉, Thr-NH₉,. -Thr-OBu oder

t t -Thr (Bu )-OBu .Lau bezeichnet Lauroy1 und Dab und Dap sind ex. t Y -Diaminobutyrsäure bzw. et,(3 -Diaminopropionsäure.

\J\J WU I I

Bine Untergruppe der Verbindungen der Formel I sind neue Verbindungen mit der allgemeinen Formel I, worin die Buchstaben A und B mit den folgenden Zahlen in Klammern die Peptidfragmente der A- und B-Ketten bezeichnen, in entsprechender Weise durch die Buchstaben in den Klammern bezeichnet, B , E ,B undPE sind gleich oder verschieden und stellen Glutaminsäure oder einen neutralen Aminosäurerest dar, der für Nucleotidsequenzen codieren kann, X ist ein L-Ihreonin-, !-Arginin- oder L-Lysinrest, Y und Z sind gleich oder verschieden und stellen jeweils einen Aminosäurerest dar, worin eine beliebige Seitenkettenaminogruppe acyliert sein kann und worin eine beliebige Seitenkettenhydroxygruppe alkyliert sein kann, und m und η sind gleich oder verschieden und stellen jeweils null oder eins dar, R ist ein Amidoesterrest, der die C-terminale Carboxygruppe der B-Kette blockiert, mit der Maßgabe, daß Ξ¹, E², Έ? und Ξ⁴ nicht alles Glutaminsäurereste sind, wenn X ein Threoninrest ist, oder wenn E ,E , S und E alles Glutaminreste sind und X ist ein Threoninrest, die Gruppe der Formel -Y_m-Z_n-R folgende Reste darstellt: -HH₂, -Arg-HH₂, -Arg-Arg^IH₂, -Arg-Lys-NH₂, -Dab-Dab-UH₂, -Dap -Dap-UH₂, -LyS-HH₂, -Lys (LaU)-HH₂, -Lys-Arg-UHg, -Lys-Lys-HH₂, -Om-HH₂ oder -Om-Om-HH₂.

In den Verbindungen der Formel I ist die C-terminale Carboxygruppe der B-Kette durch eine Estergruppe oder eine Amidgruppe blockiert, wodurch die negative Ladung der Carboxygruppe eliminiert wird. Der durch die Ester- oder Amidgruppe in Position B 30 hervorgerufene Wechsel in der Ladung kann weiter verstärkt werden durch Substituierung des Threonins in der B 27-Position mit Arginin oder Lysin und/oder durch

Substituierung eines beliebigen der vier Glütaminsäurereste in der A 4-<-, A 17-, B 13- und B21-Position mit einer neutralen Aminosäure, vorzugsweise mit einem Glutaminrest· Darüber hinaus kann eine positive Ladung durch eine basische Aminosäure in der B 30- und/oder B 31-Position eingeführt werden» Da die Verbindungen der Formel I in der Klinik als Lösungen mit verlängerter Wirksamkeit angewandt werden können, kann ein Abfall an Immunogenität auftreten, verglichen mit der üblicherweise verwendeten Suspensionen von Schweine- oder Humaninsulinen·

Der Grad der Verlängerung kann durch den Zusatz von Zink-Ionen verstärkt und gesteuert werden.

Hauptsächliche Parameter, die^ den Grad der Verlängerung der Insulinwirksamkeit steuern, sind die Konzentration von Zink und die Auswahl der Verbindung der Formel I. Mit einigen Analogen, z. B· Arg '"T Thr ^ -IHg-Humaninsulin, erhält man eine wesentlich verlängerte Y/irkung mit nur 3 Zinkatomen pro Hexameres Insulinanalog, entsprechend 8 Ag Zink/ml in einer etwa 240 nmol /ml enthaltenden Zubereitung. Mit anderen Analogen B30

z. B. Lys -UHg-Humaninsulin erhält man eine mäßige Wirkungsverlängerung mit 30 Zink pro Hexameres Insulinanaloges, entsprechend QO ju.g Zink /ml in einer 240 η mol /ml enthaltenden Zinkzubereitung. Der Bereich bevorzugter Zinkkonzentrationen erstreckt sich von 0 bis 2 mg /ml, vorzugsweise von 0 bis 200 /Ug /ml Zink mit Substitution in der B^13- und/oder B-27-Position, und vorzugsweise von 20 bis 200 Λ-g/ml mit anderen Analogen.

Die verlängerte Wirkung von Lösungen der Verbindung der Formel I in Anwesenheit von Zinkionen ist der niedrigen Löslichkeit derartiger Verbindungen bei neutralem ft-Ή zuzuschreiben. lur Lösungen von Insulinderivaten, in denen das C-Snde der

B-Kette blockiert war, zeigten eine längere Wirkung als

~» R ' - ^:

A ctrapid - Schweineinsulin.

Der pH-Wert injizierbarer erfindungsgemäßer Lösungen sollte vorzugsweise unterhalb des und so nahe wie möglich zum physiologischen pH liegen. Die obere Grenze bildet der pH-Wert, wo eine. Fällung auftritt. Man erhält stabile Lösungen mit etwa 240 n^mol/ml Verbindungen der Formeln bei "einem pH von 5,5. Die obere Grenze hängt von den Lösungsbestandteilen ab, z. B. vom Isotoniküm, vom Schutzmittel und von der Zinkkonzentration sowie von der ausgewählten Verbindung der Formel Es gibt keine niedrigere pH-Grenze der Lösungen, da jedoch die chemische Stabilität von Insulin in sauren Lösungen gering ist wegen der Desamidierungsreaktionen und der Bildung von Dimeren, wird wegen der physikalischen Stabilität der Lösung ein pH bevorzugt, der so hoch wie möglich liegt. Der bevorzugte pH-Bereich für die injizierbaren Lösungen dieser Erfindung liegt zwischen 2,5 und 8,5, insbesondere zwischen 4,5 und 8.

Bin weiterer Aspekt der Erfindung ist die verbesserte.Flexibilität für die Patienten. Mit zwei wäßrigen Lösungen, eine mit einer Verbindung der Formel I und eine Ändere mit einem Zinksalz, kann der Patient einen gewünschten Grad an verlängerter Wirksamkeit und einem gewünschten Profil durch geeignetes Mischen beider Lösungen erhalten. Somit hat der Patient durch Verwendung zweier Stammlösungen die Möglichkeit der Wahl für Wirkung und Profil der morgendlichen Injektion sowie für Wirkung und Profil der abendlichen Injektion. Vorzugsweise e<tfhalten die Zinklösungen zwischen etwa 10y&g und 20 mg Zink pro ml. Alternativ dazu können beide Stammlösungen Zink enthalten, entweder in gleichen oder unterschiedlichen Konzentrationen und/oder beide Stammlösungen können eine Verbindung der Formel I enthalten, entweder die gleiche oder verschiedene Verbindungen.

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Die Injektionslösungen der Erfindung haben vorzugsweise eine Stärke von zwischen etwa 60 und 6000 nmol/ml an Verbindung der Formel I.

Die neutrale Aminosäure (E¹bis Br) ist beispielsweise Glycin, Valin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Tryosin, Methionin oder vorzugsweise Asparagin, Glutamin, Alanin, Serin oder Threonin.

Beispiele für R sind Esterreste, beispielsweise Mederalkoxy, vorzugsweise Metho?cy, Ethoxy und am bevorzugtesten tertiäres Butoxy. Derartige Gruppen sind in Verbindungen anwesend, die bei der Synthese von Humaninsulin nützlich sind, siehe zum Beispiel US-PS 4 343 898. Derartige Ester sind Thr ^Β30-0Β^- Humaninsulin und 3Jhr ^B3° (Bu¹O-OBu*-Humaninsulin (Bu* bedeutet tertiäres Butyl).

Darüber hinaus kann R eine Gruppe der allgemeinen Formel

12- 1 2 -HR R sein, worin R und R gleich oder verschieden sind und jeweils Wasserstoff oder Hiederalkyl darstellen* Der hier verwendete Begriff "nieder¹¹ bedeutet, daß die fragliche Gruppe weniger als 7 Kohlenstoffatome enthält, vorzugsweise weniger als 5 Kohlenstoffatome. Ein Beispiel für eine solche Grup-

Ή30

pe ist in Thr ^J -UH₂-Humaninsulin zu finden, das als Zwischenprodukt in einer Synthese von Humaninsulin bekannt ist (siehe Carlsberg Res. Oommun, 49 (1984), 463). In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist R gleich -IH₂. Darüber hJaaus kann R ein Lactamrest sein, der vorzugsweise weniger als 8 Atome im Lactamring enthält, zum Beispiel ein Lactam einer Diaminocarbonsäure.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist R nicht geladen.

OO OOί \C

Bei neutralem pH ist die Ladung von -X²⁷-Pro²⁸-Lys²⁹-Y_m-Z_n-R plus eine (+1) in Thr^B30-HH₂-Humaninsulin, Thr^-ÖB^-Humaninsulin, TlIr²³⁰CBu*)-OBu*-Humaninsulin und LyS-IH₂, des-(B30)-Humaninsulin, plus zwei (+2) in Lys ³ HH₂-Humaninsulin, Arg^B30-HH2-Humaninsulin, Orn^B3O-IH₂-Humaninsülin, Lys^B27, Thr^B30-HH₂-Humaninsulin und Arg³³²⁷, Thr^B3°-

B30 IH₂-Humaninsulin und plus drei (+3) in Lys ^ -IH₂-Humaninsulin, Lys^B27, Arg^B30-IH₂rHumaninsttlin, Arg^B27,L·ys^B30-IH₂-Humaninsu-

Arg^B27, Arg^°-IHo-Humaninsulin, Lys^B30-Lys^B3^-IH₀-Humaninsulin, Arg^B3O-Lys^B31 -IHg-Humaninsulin,Arg^B39^iH₂Humaninsülin, Orn^B3O-Orn^B31 -Humaninsulin, Dab^B3O-Dab^B31 -IHg-Humaninsulin und Dap^B30-Daf>^B31 -IHg-Humaninsulin.

lach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die mit Y und Z bezeichneten Aminosäurereste Reste vonl-L-Aminosäuren, die für lucleotidsequenzen codieren.

Sine beliebige Seitenkettenaminogruppe der mit Y und Z bezeichneten Aminosäurereste kann durch eine Säure acyliert werden, die 2 bis 18 Kohlenstoffatome enthält, vorzugsweise eine Fettsäure,mit 6 bis 18 Kohlenstoffatomen, beispielsweise Laurinsäure. Somit kann -Y -Z -R der Rest -LyS(LaU)-IH₂ sein.

Beispiele für bevorzugte alkylierte Hydroxygruppen sind Methozy, Ethoxy und tertiäres Butoxy.

In einer Gruppe bevorzugter Verbindungen der Formel I sind Y und/ oder Z ein basischer Aminosäurerest, worin die Seitenkettenaminogruppe gegebenenfalls acyliert ist (m=1).

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11 .

In einer anderen Gruppe bevorzugter Verbindungen der 3?ormel I ist η null und Y ist ein basischer Aminosäurerest.(m=1)· Inί einer weiteren Gruppe bevorzugter Verbindungen der Formel ί sind Y und Z beide basische Aminosäurereste (m=1, n=1).

Bevorzugte Verbindungen der Formel I sind jeweils die folgen den :Gln^A17,Arg²²⁷,Thr^B30-HH₂-Humaninsulin, Gln^A17, Gln^B13 j Thr^B30-IiH₂-Humaninsulin, Gln^A17,L·ys^B27,Ihr^B30-IH_^-Humaninsulin, Gln^A17,Lys^B30~IH₂-Humaninsulin, Gln^A17,0?hr^B3O-IH₂-Humaninsulin, Gln^B13 ,Arg⁸²⁷ _tThr^B30-NH₂-Humaninsulin, Gln^Ba3,Lys^B27,Thr^B30-HH₂-Humaninsülin, Gln^B13,Lys^B30-nH₂-Humaninsulin, Gln^B13,Thr^B30-IH₂-Humaninsulin, Arg⁵²⁷,Arg^B30-IH₂-Humaninsulin, Arg^B27,Iys^B30-IH₂-Humaninsulin, Arg³²⁷,Thr^B30-lH₂-Humaninsulin, Lys^B27,Arg^B30-UH₂-Humaninsulin, Lys^B27,Lys^B30-IH₂-Humaninsulin, Lys^B27,Thr^B30-SH₂-Humaninsulin, Lys^B29-NH₂,des-(B30)-Humaninsulin, Thr^B30-HH₂-Humaninsulin, Lys^B30-EIH₂-Humaninsülin, Lys^B30(Lau)-HH₂-Humaninsulin, Lys^B3O-Arg^B31 -IH₂-Humaninsulin, Iffs^B3O-Lys^B31-IHg-Humaninsulin, Arg^B3O-IH₂-HumaHinsulin, Arg^B3O-Arg^B31-HH₂-Humaninsulin, oder Arg^:B30-L·ys^B31-IH₂-Hümaninsulin.

Bine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung sind

1 Zubereitungen mit einer Verbindung der Formel I, worin S , S Ξ und/oder B ein Glutaminrest ist und/oder Σ ist Lys oder Arg«, und innerhalb dieser Unterklasse der Verbindungen der Formel I sind eine weitere bevorzugte Ausfuhrungsform Zubereitungen mit einer Verbindung der Formel I, worin die Gruppe -Y_m-Z_n-R die Bedeutung -Thr-UH₂ oder -LyS-IH₂ hat· Bevor-

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. .. " " ^{tr a} '· . .'. . .:. -. · .-. .·

zugte Verbindungen sind Gln^B—,Ihr^B^°-]5iH2-Humaninsulin, Gln^A17,Thr^B30-ITH₂-Humaninsulin, Lys^B27,Thr^B30-HH₂-Humaninsulin und Arg^B27,Thr^B30-lTH₂-Humaninsulin.

In einer weiteren Gruppe bevorzugter Verbindungen der Formel I ist S , B und B^ jeweils ein Glutaminsäurerest·

In einer anderen Gruppe bevorzugter Verbindungen der Formel I ist E ein Glutaminsäurerest· ·

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In einer weiteren Gruppe bevorzugter Verbindungen der Formel I ist X ein Arginin- oder Lysinrest.

Wie aus dem Stand der Technik bekannt, sind nicht alle der Aminosäurereste im Humaninsulin für die Insulinwirkung wesentlich.

Es hat sich auch erwiesen, daß Schweineinsulin und Rinderinsulin, die sich vom Humaninsulin hinsichtlich der Aminosäurereste unterscheiden, für die Behandlung von Diabetis eignen· Es existieren im Insulinmolekül beträchtliche Variationen von Spezies zu Spezies. Daher können viele Peptidreste im Humaninsülinmolekül ohne unangemessene Verringerung bei der Insulinaktivität verändert werden, einschließlich einiger Peptidreste, die für den isoelektrischen Punkt des Moleküls wichtig sind.

Es ist offensichtlich, die als Ξ¹, Ε², Έ?, Ξ⁴, Σ, Y, Z und H bezeichneten Gruppen so ausgewählt werden können, daß die erhaltene Verbindung der Formel I pharmazeutisch wirksam ist·

Bei den bekannten zweiphasigen Insulinen ist es üblich, schnell wirkendes lösliches Insulin mit länger wirkendem, kristallinen Insulin in derselben Injektion zu kombinieren· Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I wird eine schnelle und verlängerte Wirksamkeit mit einer Lösung einer einzigen Verbindung der Formel I erreicht. Das Verhältnis zwischen schneller und langer Wirkung verringert sich mit dem Abfall der Zinkionenkonzentration in der Lösung.

Verbindungen der Formel I können durch eine Transpeptidisierungsreaktion hergestellt werden, bei der Schweineinsulin oder sonst eine biosynthetische Precursor-Verbindung mit den korrekten Insulin-Disulfidbrücken und mit der allgemeinen Formel II B(i-32)-E³-B(14-20)-E⁴-B(22-26)-X-B(28-29)-(Q_q-R)_r-A(1-3)-

E¹-A(5-16)-S²-A(18-21) (II)

worin die Buchstaben A und B, denen die Zahlen in den Klammern folgen, die entsprechenden Peptidfragmente der A- und B-Ketten

.... .-.' ' ^;· ¹³ ' ^:"' ' ' ' '.-' '

bezeichnen, wie '.in des Buchstaben in Klammern angezeigt, Q ist eine Peptidkette mit q Aminosäuren, q ist eine ganze Zahl von 0 bis 33, R ist Lys oder Arg und r ist null oder eins, und B ,B , E , B⁴ und X haben die oben genannte Bedeutung, mit einer Aminoverbindung der allgemeinen Formel III

^ΗΛι-^Ζη-^Ε (III)

worin Y, Z, R, m und η jeweils die oben genannte Bedeutung haben und worin die Seitenkettenaminogruppen und Hydroxygruppen in Y und Z gegebenenfalls mit Amino- und Hydroxyschutzgruppen blockiert sein können,

unter Verwendung von Trypsin oder einem Trypsin-ähnlichen Enzym als Katalysator im Gemisch mit Wasser und organischen Lösungsmitteln umgesetzt wird, wie in der US-PS 4 343 898 beschrieben. -Bevorzugte Verbindungen der Formel III für den Einsatz in diesem Verfahren sind Thr-IH_O, Lys(Boc)-NH₀, ThT-(Ba )-OBu , Thr-OBu, AIa-IH₂ und' Arg(Boc)-NH₂. Aminogruppen können durch Acylierung mit einer Fettsäure derivatisiert werden. Hydroxygruppen können durch Alkylierung geschützt werden. Wenn Y und Z Gruppen enthalten sind, die reversibel durch Aminoschutzgruppen blockiert sind, können diese Gruppen zu einem späteren Zeitpunkt entfernt werden, wenn dies erwünscht ist, nachdem das Amino-geschützte Zwischenprodukt vom Trypsin oder Trypsin-ahnlichen Enzym getrennt worden ist. Von den Trypsin-ähnlichen Enzymen ist Lysylendopeptidase von Achromobacter lyticus nützlich.

Die Verbindungen der Formel II können in einem Wirtsorganismus wie Hefe exprimiert werden, ähnlich der Beschreibung in der europäischen Patentanmeldung 163 529, unter Einsatz eines Gens mit den korrekten Codons für die fraglichen Aminosäuren. Das das neue Insulinderivat verschlüsselnde Gen wird dann in einen geeigneten Expressionsvektor insertiert, der bei Übertragung in Hefe in der Lage ist, die gewünschte Verbindung zu exprimieren.

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Das exprimierte Produkt wird dann von den Zellen oder der Kulturbrühe isoliert, in Abhängigkeit davon, ob es von den Zellen ausgeschieden wurde oder nicht.

Bin Beispiel für eine reversible Aminoschutzgruppe ist tertiäres Butoxycarbonyl, und eine reversible Hydroxyschutzruppe ist tertiäres Butyl. Derartige Gruppen werden unter Bedingungen entfernt, die keine unerwünschte Veränderung indt» der Verbindung der Formel I hervorrufen, zum Beispiel durch Trifluoressigsäure.

Insulinverbindungen in der Formel I können auch durch eine Kupplungsreaktion hergestellt werden, bei der eine Verbindung der allgemeinen Formel IV

A(1-3)-B¹-A(S-O)-OyS-ACe-I6)-B²-Ä(18-19)-Cys-Asn (A_rKette)

S S

t ' f ·."..

S S (IV)

£(1-6)-Cys-B(8-12)-E³-B(H-18)-Gys

Ti " ' _A ^f (B-Kette)

Lys-Pro-X-B(16-22)-ST-GIy

worin Ξ , E , E , E tmdk jeweils die oben definierte Bedeutung, aufweist,', an eine Aminoverbindung der obigen Formel III gekuppelt wird, mit Hilfe von Trypsin oder einem Trypsin-ähnlichsn Snzym unter Bedingungen, die denen in der europäischen Patentschrift 17 938 beschriebenen ähnlich sind.

Wenn Insulin mit Hilfe der Gentechnik hergestellt wird, kann die eine oder können die beiden zusätzlichen positiven Ladungen in geeigneter Weise in das Innere des Insulinmoleküls eingeführt werden, d. i. in die A4-, A17-, B13-, B21- oder B27-Position unter Hinterlassung einer Trypsin-katalysierten halbsynthetischen Blockierung der C-terminalen Carboxygruppe der B-Kette mit einem Aminosäureamid oder einem Aminosäureester.

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Der Vorteil der Einführung positiver Ladungen in den Rahmen der 51 Aminosäuren des Insulinmoleküls, um die neuen Verbindungen der Formel I zu bilden, in anderer Weise als durch Verlängerung; der B-Kette über die 30 Reste des menschlichen Insulins hinaus besteht in einer leichteren Herstellung. Bei der V halbsynthetischen Transpeptidisierung wird ein großer molarer Überschuß des Aminosäureamids oder des Aminosäureesters eingesetzt. Wenn bei der Transpsptidie^erungsreaktion ein Dipeptidamid oder -ester verwendet wird, verhindern entweder Preis oder Löslichkeit oder beide den Einsatz in großem Überschuß und dementsprechend verringert sich die Produktausbeute. Selbst wenn der gleiche äquimolare Überschuß von beispielsweise Lys(Boc)-IH₂ und Lys(Boc)-Lys(Boc)-IH₂ bei der Transpeptidierungsreaktion unter ähnlichen Bedingungen verwendet wird, erhöht sich die Ausbeute mit dem Aminosäureamid wesentlich gegenüber der mit dem Dipeptidamid· .

Erfindungsgemäße Insulinzubereitungen werden durch Lösen einer Verbindung der FormeIjII in einem wäßrigen Medium bei leicht sauren Bedingungen, beispielsweise in einer Konzentration yqja 340 oder 600 nmol/ml hergestellt. Das wäßrige Medium wird isötonisch gemacht, beispielsweise mit Natriumchlorid oder Glycerol. Darüber hinaus kann das wäßrige Medium Zinkionen in einer Konzentration von bis zu etwa 20/ig Zn⁺⁺ pro Insulinaktivitätseinheit enthalten, sowie Puffer wie Acetat- oder Citrat-Puffer und Schutzmittel wie m-Kresol oder Phenol« Der pH-Wert der Lösung wird in Richtung auf Neutralität eingestellt, ohne dem isoelektrischen Punkt der Verbindung der Formel I zu nahe zu kommen, um eine Fällung zu vermeiden. Der pH-Wert der endgül-. tigen Insulinzubereitung hängt von der Anzahl der Ladungen ab, die in der Verbindung der Formel I verändert worden sind, von

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der Konzentration der Zink-Ionen, von der Konzentration der Verbindungen der Formel I und von der ausgewählten Verbindung der Formel I. Die Insulinzubereitung wird durch Sterilfiltration steril gemacht.

Die erfindungsgemäßen Insulinzubereitungen werden in ähnlicher Weise verwendet wie die bekannten Insulinzubereitungen.

Sin beliebiges hier beschriebenes neues Merkmal oder eine Kombination von Merkmalen wird als wesentlich für diese Erfindung angesehen.

Die hier verwendeten Abkürzungen für die Aminosäuren sind jene, die in J. Biol. ehern» 243 (1968), 3558 aufgeführt sind. Die hier genannten Aminosäuren befinden sich in L-Form. In der Formel I und an anderen Stellen hier ist A(1-3) gleich Gly-Ile-Val, A(5-6) ist Gln-Cys usw., die Aminosäuresequenz von Humaninsulin. Wenn nicht anders ausgeführt,sind die hier genannten Insulinspezies solche des Menschen.

Synthese der Insulinverbindungen

Das Insulin rührte entweder her aus Schweine-Insulin oder aus einem in Hefe exprimierten Insulin-Precursor, wie in letztgenannten Patentanmeldung beschrieben.

Die Insulin-Precursoren wurden aus der Fermentationsbrühe durch Adsorption an LiChroprep RP-18 (eingetr. Warenzeichen) gewonnen, wie im Beispiel 7 derselben dänischen Patentanmeldung beschrieben. Die Precursoren wurden aus der Säule mit 0,2 M KOl, 0,001 M HGl in 33% (Vol/Vol) Ethanol eluiert. Die Insulin-Precursoren wurden aus dem Pool durch nacheinanderfolgende Zugaben von Wasser (IVolumenteil pro Volumenteil des Pools) festes Trinatriumcitrat bis zum Erreichen

-17 -

von 0,05 M und schließlich Zinkacetat bis zum Erreichen von 0,006 M kristallisiert* Der pH-Wert wurde auf 6,8 eingestellt^ und man ließ das Gemisch über Nacht bei 4 C stehen. Die Kristalle wurden durch Zentrifugieren isoliert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet«

Geschützte Aminosäuren und geschützte Peptide für enzymatische Halbsynthesen wurden entweder nach Standardmethoden hergestellt oder von Nova Biochem oder Bachern, beide Schweiz» bezogen·

Ausführunpsbeispiel Beispiel 1

Synthese von Lys -NHp-Humaninsulin

Lösungen von Ig Schweine-Insulin, gelöst in 4 ml 7>5 M Essigsäure und 6,1 g Lys(Boc)-NH₂f CH₃COOH (N-Epsilon-Boc-L-Lysin-amid, Hydrogenacetatsalz), gelöst bis 15 ml mit Ν,Ν-Dimethylacetamid, wurden vermischt und das Gemisch auf 12 ⁰C gekühlt* Eine Lösung von 0,1 g Trypsin in 2,08 ml einer 0,05 M Lösung von Calciumacetat wurde hinzugegeben. Nach 96 Stunden bei 12 ⁰C wurden die Proteine durch Zugabe von 200 ml Aceton gefällt und der Niederschlag durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Niederschlag wurde einmal mit 100 ml Aceton gewaschen, durch Zentrifugieren abgetrennt und im Vakuum getrocknet»

Der Niederschlag wurde in 50 ml 0,01 N Salzsäure in Ethanol/

' ' . ." . - 17a - '.' ' .. ·.: ·.-.. "

Wasser (28/72 Teile pro Volumen) gelöst und die Lösung auf eine 5 χ 30 cm preparative Hochdruck-Flüssigchromatografie (als HPLC bezeichnet)-Säule gegeben, die mit Octadecyldimethylsilyl-substituierten Kieselgelteilchen gepackt war

' . « . ο

(Hauptteilchengröße 15 Mikrometer, Porengröße 100 AngstrjzJtn).

18

Die Säule wurde mit Sthanol/0,2 M Lösung von Ammoniumsulfat, auf pH3,5 mit Schwefelsäure eingestellt, in einem Verhältnis von 38/62 (!Teilen pro Volumen)equilibriert. Die Proteine wurden aus der Säule mit demselben Puffer bei der Rate von 2 l/h eluiert. Lys(Boc) ^J - Humaninsulin wurde in einem aus der Säule zwischen "60·und 75 Minuten eluiertem Seak gefunden, nach Eluierung von nichtumgesetztem Schweine-Insulin. Das Ethanol wurde im Vakuum eingedampft und die Eindampfung solange fortgeführt, bisjdas Volumen auf

B30 etwa 125 ml reduziert worden war· Das Lys(Boc) ^J -Humaninsulin wurde durch nacheinanderfolgende Zugaben von 25 ml Aceton, 100 ml Zitronensäure (Monohydrat,p.a·) und 9 mg Zinkchlorid (p,a·) isoliert. Der pH wurde auf 6,5 eingestellt, und nach 1 Stunde bei Zimmertemperatur wurde die Kristallisation bei 4⁰G über 24h unter mäßigem Rühren fortgesetzt. Die Kristalle wurden abgeschleudert (spun down), mit 5 ml eiskaltem Wasser einmal gewaschen, wieder abgeschleudert und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 456 mg Lys(Boc)^B30-UH₂-Humaninsulin.

456 mg Lys(Boc)^B30-HH₂-Humaninsulir|i7ürden in 15 ml Trifluoressigsäure gelöst und 3 Stunden bei Zimmertemperatur belassen. Die Trifluoressigsäure wurde durch Lyophilisieren entfernt. Das Lyophylisat wurde in 50 ml Wasser gelöst, der pH auf 2,5 eingestellt und 10g natriumchlorid hinzugegeben.

Ή30

Der Salzkuchen aus LyS-IH₂-Humaninsulin wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Salzkuchen wurde in 125 ml wasser gelöst und das Ly.s -HH₂-Humaninsulin durch aufeinanderfolgende Zugaben von 25 ml Aceton, 100 mg Zitronensäure (Monohydrat, p.a.) und 9 mg Zinkchlorid (p.a.) kristallisiert unter Einstellung des pH-Wertes auf 7,0. lach einer Stunde bei Zimmertemperatur wurde die Kristallisation bei 4⁰O für 24 Stunden fortgesetzt unter mäßigem Rühren. Die

66 687 12

19

Kristalle wurden abgeschleudert, einmal mit 5 ml eiskaltem Wasser gewaschen, wiederum abgeschleudert und getrocknet. Ausbeute: 387 mg rohes LyS-NH₂-Humaninsulin.

Die Kristalle wurden in 50 ml 0,005 I Salzsäure in Ethanol/ Wasser (20/80 Volumenteile) gelöst und die Lösung auf eine präparative HPLC-Säule, wie oben beschrieben, gegeben, diesmal mit Sthanol/0,3 M Lösung von Kaliumchlorid und 0,001 H Salzsäure in einem Verhältnis von 35,5/64,5 (VoIumena»£eile)equilibriert. Die Eluierung mit dem gleichen Puffer bei einer Rate von 2 Litern/h führte zu einem Peak der Lys ^ -HH₂, die aus der Säule zwischen 55 und-90 Minuten austrat. Die Produkte wurden von dem Pool nach der für •DTA

Lys(Boc) -HHp-Humaninsulin in oben beschriebener Weise isoliert, mit der Ausnahme, daß der pH bei der Kristallisation im Zink enthaltenden Citratpuffer auf 7,0 eingestellt wurde, ni&ht auf 6,5. Ausbeute: 262 mg reines Lys- -HHp-. Humaninsulin.

Die Aminosäurezusammensetzung war in Übereinstimmung mit der Theorie, Alanin betrug IRest/Molekül und Lysin betrug 2 Reste/Molekül. Das Produkt war bei DISC PASE-Elektrophorese bei pH 8,9 rein, die Migrationsrate lag bei 55% von der von Schweine-Insulin, entsprechend einer Ladungsdifferenz von etwa 2. Für details zur DISC PAGE-Elektrophorese siehe Horm. Metab.Res. Supplenent Series Hr. 5 (1974) 134.

Beispiel 2

con "R'in

Synthese von Arg -HHo-Humaninsulin und Arg -Ar -Human in s ulin

Lösung^von 1g Schweine-Insulin in 3,32 ml 8 M Essigsäure und 3,9g Arg-HH₂,(CHoCOOH)₂'(L-Argininamid-Dihydroacetatsalz),

66 687 12

20

gelöst zu 10 ml mit N,N-Dimethylformamid (hier als DMP)bezeichnet) wurden vermischt und das Gemisch auf 12 ⁰C gekühlt· Eine Lösung von 0,1 g Trypsin in 1,2 ψΐ einer 0,05.-M Lösung von Oalciümacetat wurde hinzugegeben· Nach 144 Stunden bei 12 ⁰G wurden die Proteine durch Zugabe von 200 ml Aceton gefällt und das Pällungsprodukfr durch Zentrifugieren abgetrennt. Der Niederschlag wurde einmal mit 100 ml Aceton gewaschen, äureh Zentrifugieren isoliert und im Vakuum getrocknet·

Der Niederschlag wurde in 50 ml 0,01 N Salzsäure in Ethanol/ Wasser ;(27/73 Volumenteile) gelöst und die Proteine auf eine präparative Säule gegeben, wie im Beispiel 1 beschrieben· Zuerst wurde ein Eluierungsmittel, bestehend aus Ethanol/ 0,3 M Lösung von Kaliumchlorid und 0,001 N Salzsäure in einem Verhältnis von 35/65 (Volumenteile) bei einer Rate von *· *

2 Litern/h vier Stunden lang hindurchgepumpt· Ss wurden drei ungeklärte Peaks gut aufgezeichnet, von ässss. etwa 60 bis Minuten, von 120 bis 150 und von 150 bis 180 Minuten· Die Proteine in den Pools wurden wie für Lys ^J -NH₂ in Beispiel 1 beschrieben gut voneinander getrennt· Ausbeute 414 mg, 142 mg und 107 mg für die Pools I, II und III·

Die Aminosäureanalyse kombiniert mit DISC PAGE-Blektrophorese zeigte, daß die Insulinmoleküle von Pool I mit zwei bis einigen Argininresten gekoppelt vorlagen. Die Hauptkomponente von Pool II war Insulin, gekoppelt an einen einzigen Arginin-

Ή30 amidrest, d.i· Arg"^ .-NH₉-Humaninsulin· Pool. III war ein Gemisch von Schweine-Insulin,des(B30)-Humaninsulin, Arg -

Ή3Ο

Humaninsulin und Arg -NH₂-Humaninsulin·

Arg * -NH₂-Humaninsulin

Die Proteine von Pool II wurden gelöst in 10 ml SthanolA^asser 3/2 (Vol/Vol) bei pH 2. Nach Zugabe von 12 mg EDTA wurde der

66 687 12

21

pH-Wert auf 10 erhöht mittels eine 0,1 Έ Lösung von Natriumhydroxid· Die Lösung wurde auf eine 2,5 x 25 cm QAB^Sephadex A-25-Säüle gegeben, die mit einem Puffer equilibriert war, der aus 0,5 M HH^, 0,05 S Salzsäure und 0,04 M Lösung aus natriumchlorid in 60% Ethanol (VoI/VoI) bestand· Die Säule wurde mit 30 ml/h mit einem linearen Gradienten in natriumchlorid von 0,04 M bis 0,1 M eluiert unter Verwendung von insgesamtjeinem Liter Eluierungsmittel, während der pH-Wert konstant bei etwa 10,0 gehalten wurde. Es wurden Fraktionen von 10 ml gesammelt· Mit den Fraktionen Ir, 58 - 74 trat Arg ³ H^-Humaninsulin aus der Säule aus· Das Produkt wurde aus dem Pool durch Verdampfung mit anschließender Kristallisation bei pH 7 in einem Zink enthaltenden Gitratpuffer, der 15% -, Aceton (Vol/Vol) enthielt, isoliert, wie für Lys^B3°-NH₂ in Beispiel"1 beschrieben· Ausbeute 53 mg» Das Produkt wurde in der DISC PAGE-Blektrophorese bei pH 8,9 homogen, die Migrations· rate betrug 55% von der des Insulini· Die Aminosäurezusammensetzung war in Übereinstimmung mit der Theorie für Arg ^PJ Humaninsülin und zeigte 2 Argininrestenund 1 Rest Alanin pro Insulinmolekül·

Arg^B3O-Arg^B31-HHo-Humaninsülin

C.

Die Proteine des Pools I wurden gelöst und der Ionenaustausch-Chromatografie über QSA-Sephadex A25 unterworfen, wie für die

Β3Ω B31 Proteine in Pool II beschrieben· Arg ^PJ -Arg ^PJ -HHg-Hümaninsulintrat aus der Säule in den Fraktionen Kr· 34 - 47 aus· Das Produkt wu£de isoliert wie für Lys ^ -ΗΗ_Λ-Humaninsulin in Beispiel 1 beschrieben· Ausbeute 10 mg·'

Das Produkt wurde nach DISC PAES-Blektrophorese bei pH 8,9 homogen, die Migrationsrate betrug 35 % von der des Insulins· Die Aminosäurezusammensetzung zeigte 3 Argininreste und einen Hest Alanin pro Insulinmolekül.

UU UO /

Beispiel 3 . " ,· :.

"Π"2Λ

Synthese von Thr -NH₂-Humaninsulin

Sine Lösung von 1g Schweine-Insulin in 5ml 10 H Essigsäure und eine Suspension von 2,'365g Thr-NH₂(L-Threoninamid, frsie BaSe)₁ZU einem Volumen von 13 ml mit Ν,Ν-Dimethylacetamid suspendiert,wurde vermischt. Nach dem Mischen wurde das Thr-NH₂gelöst. Das Gemisch wurde auf 12⁰C gekühlt und eine Lösung von 0,1g Trypsin in 2 ml einer 0,05 M Lösung aus Calciumacetat wurde hinzugegeben. Nach 72 Stunden bei 12⁰C wurden die Proteine durch Zusatz von 200 ml Aceton gefällt und der Niederschlag durch Zentrifugieren isoliert. Der Niederschlag wurde einmal mit 100 ml Aceton gewaschen, durch Zentrifugieren isoliert und im Vakuum getrocknet.

Ή3Ο

Die Reinigung von Thr ^J -NH₂-Humaninsulin von Trypsin und nicht umgesetztem Schweine-Insulin erfolge wie für Ester von Humaninsulin beschrieben (siehe Markussen: Methoden bei der Diabetisforschung, Bd. 1,"Hrsg. Larner u. Pohl 1984, S. 408) Ausbeute 599 mg. ' .

Das Produkt wurde nach DISC PAGE-Blektrophorese bei pHjB,9 homogen, die Migrationsrate betrug 75% von der von Insulin. Die Aminosäurezusammensetzung war in Übereinstimmung mit der Theorie,'d. h. drei Reste Threonin und ein Rest Alanin pro Insulinmolekül.

Als Ausgangsmaterial (Qq-R)„der Formel II in den Beispielen 4 bis 10 wurde Ala-Ala-Lys gewählt und so konstruiert, wie es für Hefeplasmid pMT6iO im Beispiel 10 der dänischen Patent-. anmeldung Nr. 582/85 beschrieben wurde. Die für Gln^B13,. Gln^A17, Arg ' und Lys 'codierenden Nucleotide wurden in ρΜΤβΙΟ durch stellenspezifische Mutagenese substituiert nach dem in Nucl. Acids.. Res. ü (1983), 5103-5112 beschriebenen Verfahren.

bb böY Vd 23

Beispiel 4 .

Synthese von Gln^A17, Thr^B30-]!IH₂-Humaninsulin

Zu.einer Suspension von 3,12 g Gln^A1',B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Insulinprecursor in 15 ml Sssigsäure/PMF/Yifasser (11,4 ml Essigsäure, 65,1 ml DMF, Wasser bis 100 ml) wurden 30 ml 1. M fhr-HH₂ in DMP gegeben. Das Gemisch wurde auf 12⁰C gekühlt, und es wurden 0,3 g Schweine-Trypsin, gelöst in 7,5 ml 0,05 M Calciumacetat, hinzugegeben· Das Rühren wurde bis zur Lösung des Insulinprecursors fortgeführt. Nach. 48 Stunden bei 12⁰O wurden die Proteine durch Zugabe von 400 ml Aceton gefällt. Die Proteine wurden durch Zentrifugieren abgetrennt, einmal mit 100 ml Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Der liederschlag wurde in 70 ml 0,04 H HOl gelöst, der pH-Wert auf 2,-5 eingestellt und das Derivat durch HPLO gereinigt, wie im Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, daß ein Eluierungsmittel für die Eluierung eingesetzt wurde, das aus 35 Teilen Ethanol und 65 Teilen 0,3 M KCl,0,001 H HCl bestand. Das Derivat trat aus der Säule nach etwa drei Säulenvolumina aus, und es wurde durch nacheinanderfolgende Zugabe von 1 Volumen Wasser, festem Trinatriumcitrat bis zur Erreichung, von 0,05 M und festem Zinkacetat-bis zur Erreichung von 0,006 M: isoliert. Itfaeh Einstellung des §E auf 6,5 und Rühren über lacht'bei 4⁰C wurden Kristalle durch Zentrifugieren gesammelt, mit Wasser/ gewaschen und getrocknet. Ausbeute 1,64 g=53%. Weitere Reinigungen durch Anionenaustauschehromatogräfie wie für Humaninsulinester beschrieben (siehe Markussen. ibid, 410). Endausbeute: 1,15 g=37%. Das Produkt war nach DISC PAGE-Slektrophorese bei pH 8,9 nahezu homogen, die Migrationsrate lag bei 55% von der des Insulins. Bei der analytischen Umkehrphase«.-HPLC (siehe Markussen, ibid, 410) elüierte das Produkt bei etwa der gleichen Kate wie Schweine-Insulin. Die Reinheit betrug etwa 95$· ^Die Aminosäurezusammensetzungsanalyse zeigte Identität mit der vorgegebenen Formel. .

24

Beispiel 5 - .

Synthese von Gin ',Lys ^ -HH₂-Humaninsulin

Zu.einer Suspension von 3,15 g GIn,B(1-29)-Ala-Äla-Lys-A(1-21)-Insulinprecursor in 15 ml Essigsäure/DMP/Wasser (4,57 ml Essigsäure, 71,9 ml DMP, Wasser bis 100 ml) wurden 30 ml 0,4 M LyS(BOc)-IfH₂ in DMP gegebene Das Gemisch, wurde auf 12 ⁰G gekühlt und 0,3 g Trypsin, gelöst in 7,5 ml 0,05 M Calciumacetat, wurden hinzugegeben· Das Ruhren wurde fortgesetzt bis der Insulinprecursor gelöst war· Uach 48 Stunden bei

12 C wurden die Proteine wie im Beispiel 4 beschrieben isoliert.

Der Niederschlag wurde in 70 ml 0,04 I HCl gelöst, der pH auf 2,5 eingestellt und Gln^A1^,Lys(Boc ^⁰Hm₂-Humaninsulin durch HPLC wie im Beispiel 1 beschrieben gereinigt, mit der Ausnahme, daß die Sluierung zuerst mit 2,3 1 eines Eluierungsmittels durchgeführt, wurde, das aus 37 Teilen Ethanol und 63 Teilen 0,3 M KCl, 0,oo1 JT HCl bestand, gefolgt von e. inem Eluierungsmittel, bestehend aus 39 Teilen Ethanol und 61 Teilen wäßrigem 0,3 M KCl, 0,001 35 HCl. Das Derivat trat 25 Minuten nach dem Wechsel des Eluierungsmittels aus und wurde isoliert wie für Gln^A17,Thr^B-^3O-IH -Humaninsülin in Beispiel 4 beschrieben* Die Ausbeute an GIn^ ^,Lys(Boc)^B^⁰-NH₂_Humäninsulin betrug 906 mg = 29 %. "

Gln^A17,Lys(Boc)^B30-IiH₂Humaninsulin (1,55 g) wurden in 30 ml Trifluoressigsäure (TPA) gelöst und'bei Zimmertemperatur 2 Stunden stehen gelassen. Die TPA wurde durch Lyophilisieren entfernt» Der Rest wurde in 15 ml Wasser gelöst, der pH auf 3 eingestellt mittels 1 Έ UaOH, und 22.ml Ethanol wurden hinzugegeben. Die Lösung wurde auf eine 2,5 χ 20 cm Säule SP- ' Sephadex C-25 gegeben, equilibriert mit einem Sthanol/Wasser 3/2 (Vol/Vol)-Puffer, enthaltend 0,01 M Citronensäure, 0,03 M UaCl, mit IaOH auf pH 4,5 eingestellt. Die Säule wurde mit

66 68? 12 25

dem gleichen Puffer eluiert unter Verwendung eines linearen Gradienten in IaCl von 0,03 M bis O|4 M mit insgesamt 1,6 1 Bluierungsmittel* Das Derivat eluierte in 440 ml als der Gradient o,2 M HaCl erreichte· Es wurde durch Zugabe von 1100 ml Wasser, festem Trinatriumcitrat bis zum Erreichen von 0,05 M und festem Zinkacetat bis zum Erreichen von 0,006 M kristallisiert· Der pH-Wert wurde schließlich auf 6,8 eingestellt·- Hach Rühren über Nacht bei 4⁰C wurden die Kristalle durch Zentrifugieren isoliert, einmal mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet· Ausbeute 1,00 g, entsprechend 65 % über den letzten Schritt und 19 % von dem Gln^A1<7,B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Insulinprecursor· Das Produkt war"nach DISC PAGE-Elektropiioa?ese bei pH 8,9 nahezu homogen, die Migrationsrate betrug 35 % von der von Insulin· Bei analytischer HPLG tra-fe, das Produkt vor Schweine»Insulin aus, die Reinheit lag bei etwa 97 %· Die Aminosäurezusammensetzungsanalyse zeigte 2 Lysinreste pro Molekül und in anderer Hinsicht Identität mit Humaninsulin·

Beispiel 6

Synthese von Arg^B2'⁷,Thr^:B-^5O-IH₂-Humaninsülin

Zu einer Suspension von 3,8 g Arg^B2^,B(1-29)-Alä-Ala-Lys-A(1-21)-Insulinprecursor in 18 ml Essigsäure/Wasserpffi? (11,4 ml Essigsäure, 35 ml Wasser, DME bis 100 ml) wurden 36 ml 1 M Thr-HHg in DIO¹ gegeben. Das Gemisch wurde auf 12 ⁰C gekühlt, und 0,38 g Schweinetrypsin in 6,84 ml 0,05 M Calciumacetat wurde hinzugegebto· Nach 48 Stunden bei 12 ⁰C wurden die Proteine mit Aceton gefällt wie in Beispiel 4 beschrieben·

Das Derivat wurde durch HPLC gereinigt wie in Beispiel 1 beschrieben unter Verwendung von anfangs 1800 ml Eluierungsmittel, bestehend aus 35 Teilen Ethanol und 65 Teilen wäßrigem. 0,3 M KCl, 0,001 Έ HCl, gefolgt von einem Eluierungsmittel,

66 687 12 26

bestehend aus 37 teilen Ethanol und 63 teilen der wäßrigen Lösung» Das Derivat trat 10 Minuten nach Umstellung des EIu- , ierungsmittels aus und wurde isoliert wie for Gin ',Thir -HHo-Insulin in Beispiel 4 beschrieben. Schließlich wurde es

2 ^c A17

auf einer Säule-SP-Sephadex C-25 gereinigt, wie für GIn ', Lys ³ -IH₂-Humaninsulin in Beispiel 5 beschrieben» Die Ausbeute an Arg ',Thr ^ -HHg-Humaninsulin war 1,63 g , entsprechend 43 %· Bei der DISC PAGE-Elektrophorese war im wesentlichen ein Streiken zu- sehen, die Migrationsrate betrug 55 % von der von Insulin» Bei der analytischen HPLG trat das Produkt vor Schweine-Insulin aus, die Reinheit lag bei etwa 96 %♦ Die Aminosäurezüsammensetzungsanalyse zeigte 2 Argininreste pro Molekül und in anderer Hinsicht Identität mit Humaninsuline

Beispiel 7

-' ·.- B27 B30

Synthese von Arg ',Lys f -HH₂-Humaninsulin Die Verbindung wurde aus 3,61 g .Arg^B2^,B(1-29)-Ala-Ala-Iys-A(1-21)-Insulinprecursor synthetisiert unter Verwendung der

Ή27

im Beispiel 5 beschriebenen Verfahren» Die Ausbeute an Arg ',

Lys^B30-HH₂-Humaninsulin betrüg 0,78 g = 22 %_m Ein Hauptstreifen bei der DISC PAGE-Elektrophorese migrierte 35 % von der Entfernung der Insulinmigration· Zwei kleine Streifen sind sichtbar» Die Reinheit bei der analytischen HPLC betrug 92 %\ das Produkt trat vor Schweine-Insulin aus. Die Aminosäurezusammensetzungsanlyse zeigte 2 Arginin- und zwei Lysinreste pro Molekül und in anderer Hinsicht Identität mit Humaninsulin·

Beispiel 8

Synthese von Lys^B27,Thr^B:30-HH₉-Humaninsulin

C-

Die Verbindung wurde aus 7,0 g Lys^B2',B(1-29)^Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Insulinprecursor synthetisiert unter Verwendung der

66 687b12

Verfahren, die im Beispiel 6 beschrieben worden sind· Die Ausbeute an Lys^B27,0}nr^B3O-M₂-Huiiianinsulin betrug 3,15 g, entsprechend 45 %· Die DISC PAGB^Elektrophorese zeigte einen Hauptstreifen und zwei kleine Streifen; der Hauptstreifen migrierte 55 % von der Entfernung vom Insulinreferenzstreifen· Die Reinheit bei analytischer HPLC betrug 96 %· Die Verbindung trat früher als Schweine_Insulin bei Umkehrphasen-HPLC aus· Die Aminosäurezusammensetzungsanalyse zeigte 2 Lysinreste pl?o Molekül und in anderer Hinsicht Identität mit Human-Insulin.

Beispiel 9

Synthese von Lys ,Lys ^J -NHg-Humaninsulin

Die Verbindung wurde synthetisiert aus 7,0 g Lys. ',B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)-Insulinprecursor unter Verwendung der

66 687 12 27

B27 im Beispiel 7 beschriebenen Methoden· Die Ausbeute an Lys , Lys^B3°-iIH₂-Humaninsulin betrug 1,57 g, entsprechend 22 %* Die DISC PAGE-Elektrophorese zeigte einen Hauptstreifen, der in einer Entfernung von 35 % von der von Schweine-Insulin migrierte. Eine geringe Verunreinigung ist sichtbar. Die Reinheit bei analytischer HPLG betrug 94 %_t die Verbindung eluierte gut vor Schweine-Insulin· Die Aminosäurezusammensetzungsanalyse zeigte 3 Lysinreste pro M^olekül und in anderer Hinsicht Identität zu Humaninsulin· .

Beispiel 10 ,

Synthese von Gln^B13,Thr^B3°-HH₂-Humaninsulin

Die Verbindung wurde aus 3,05 g GIn ,BCI

synthetisiert unter Einsatz der im Beispiel 6^beschriebenen Verfahren· Die Ausbeute des Endproduktes betrug 0,88 g, e&ntsprechend 29 %. Die DISC PAGE-Elektrophorese zeigte einen Hauptstreifen, der 55 % von der Entfernung migrierte, von der Schweine-Insulin migriert« Die Reinheit nach HPLG betrug 95 %, die Verbindung eluierte später als Schweine-Insulin» Die Aminosäurezusammensetzungsanalyse zeigte Identität zu der von Humaninsulin·

Beispiel 11

Herstellung in.jizierbarer Lösungen von Verbindungen der Formel I

Sterile injizierbare Lösungen der Verbindungen der Formel I zur Testung des Grades der verlängerten Wirkung wurden hergestellt durch Verwendung von 0,9 % (Masse/Vol) natriumchlorid als Isotonikum und 0,15 % (Vol/Vol) m-Kresol als Schutzmittelr Bs wurden auch injizierbare Lösungen hergestellt unter Verwendung von 1,6 % (Masse/Vol) Glycerol als Isotonikum und 0,3% (Masse/Vol) m-Kresol ato Schutzmittel, die mit 0,01 M Hatriumäcet&t gepuffert waren. Die Konzentration der Zink-Ionen

66 687 12 28

wurde von 0 bis 160 ng/ml variiert. Die pH-Werte der Lösungen wurden ausreichend entfernt vom isoelektrischen Punkt der Verbindungen der Formel I eingestellt, um die Lösungen bei Lagerung bei 3& 4 ⁰C klar zu halten· Die Lösungen enthielten :- 240 nmol/ml der Verbindungen der Formel I. Die Konzentration von 240 nmol/ml wurde erreichtdurch Messung der Absorption bei 276 nm einer konzentrierteren Stammlösung ohne m-Kresol unter Verwendung des molaren Extinktionskoeffizienten für Schweine-Insulin von 6100 für diese Derivate (siehe Handbuch der Inneren Medizin, Bd. 7/Teil 2A, Hrsg. Oberdisse 1975»113) und -Verwendung der festgestellten Stärke für monokomponentes Schweine-Insulin von 28,5 E/mg Trockensubstanz (siehe Diabetesvorsorge Bd.6, Anhang 1, 1983, 4). 1 E entspricht 5,95 nmol.

Es wurden injizierbare Lösungen hergestellt, die 240 nmol/ml an Verbindungen der Formel I gemäß Tabelle 1 enthielten und die pH-Werte und Zinkgehalte aufwiesen, die in der Tabelle angegeben sind.

Test zur Verlängerung der Insulinwirkung

Die Verlängerung der hypoglykämischen Wirkung', die durch injizierbare -Insulinlösungen hervorgerufen wurden, wurde gemäß British Pharmacopeia 1980, A 142, getestet am unbeweglichen Kaninchen. Jede Testlösung wurde subkutan in einer Dosis von 15,5 nmol pro Kaninchen in 6 oder 12 Tieren verabreicht, die 3-4 kg wogen, und der Verlauf der Hypoglykämie wurde über $ Stunden verfolgt. Zum Vergleich wurde die schnell wirkende Zubereitung Actrapid (eingetr. Warenzeichen) Schweine-Insulin in die Uests miteinbezogen· Die Ergebnisse der Tests sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt.

Das Ergebnis der Tests zur verlängerten Wirkung bestimmter Verbindungen in Kaninchen ist in der unteren Tabelle 1 aufgeführt. Der Glücosewert ist der Hauptwert von 6 Kaninchen des Glucosewertes in Prozent des Anfangswertes. Die E..sungen wurden mit 0,9 % Had unter Verwendung von 0,15% (Vol/Völ) m-Kresol als Schutzmittel isotonisch gemacht.

66 687. 12 29

Tabelle 1	Zn++ fig/ml	. 160	PH	Glucose	in	% d.	Anfangswertes	bh - .
Verbindung d· Formel I	O	.15		.1/2 h	1k	2h	4h	100
	80		4,5	53	54	49	79	80
iysB3°-HH2-Insulin	160	4,5	63	62	63	73	93
IysB3O-EfH2-Insulin	o -;	4,5	87	80	68	90	81
LysB30-IH2-Insulin	80	4,5	57	53	51	65	78.
ArgB3°-IiH2-Insulin	0	4,5	76	68	63	73	91
ArgB3O-35H2-Insulin	160	4,2	46	46	39	64	69
IhrB30-HH2-Insulin	0	4,2	64	58	50	70	100
ThrB30-HH2t-Insulin	160	4,0	59	65	59	79	88
Thr3 /QiH2-Insulin	Thr J (Bu )-OBu -Insulin 0	4,0	81	75	62	66	82 .
Thr^-OBu^-Insulin	ArgB3O-ArgB31-HH9-Insulin 0 - - - _ w . ...	4,0	64	60	54	71	68
ArgB3O-ArgB31-HH2-Insul	4,5	Ί2	70	Ö8	ßl	68
Actrapid-Schweine-Insul	4,5	91	87	78	73	98
7	53	48	42	70

Das Ergebnis der Tests zur verlängerten Wirksamkeit bestimmter Erfindungen in Kaninchen ist in Tabelle 2 unten aufgeführt« Der Glücosewert ist der Hauptwert von 12 Kaninchen des Glucosewertes in Prozent des Anfangswertes". Die Testlösungen wurden mit 1,6 % (Masse/Vol) Glycerol isotonisch gemacht unter Verwendung von 0,3 % (Masse/Vol) m-Kresol als Schutzmittel und durch Pufferung mit 0,01 M Uatriumacetat.

66 687 12 30

v Tabelle	2	Zn++ /ig/ml	pH \	Glucose in % des Anfangswertes 1h 2h 4h	63	68	6h
Verbindung der Formel J	80	4,5	65	56	73	83
GlnA17,ThrB30-lH2-Insulin	80	4,5	60	92	92	86
GlnA17,LysB30-IH2-Insulin	6,7	4,5	91	86	85	90
GlnB13,ThrB30-KH2-Insulin	80	4,5	88	64	66	81
ArgB27,ThrB30-HH2-Insulin	8,5	4,5	62	83	81 '	67
ArgB27,ThrB30-IH2-Insulin	80	4,5	85	73	69	79
ArgB27,LysB3°-HH2-InS ulin	10,9	4,5	78	55	62	67
ArgB27, Ly sB30-IiH2-Ins ulin	7,4	4,5	56	65	65	61
LysB27, ThrB30-UH2-Insulin	9,5	4?5	72	83	80	60
LysB27,LysB30-UH2 Insulin	80	4,5	74	56	87	82
LysB^°-IH2-Insülin	15	7	58		100
Bezugs-Insulin Actrapid-Schweine-Insulin

Die Stärken der Insulinverhindungen wurden mit.dem Mäuseblutzucker-Srschöpfungstest (British Pharmacopeia 1980, A 141-A142) bestimmt. Um das Problem'des Abschätzens der Insulistärke auf ein Minimum zu beschränken und einen Zeitablauf unterschiedlich vom Standard zu haben, wurden die InsulMösungen für die Stärkenbestimmungen ohne Zusätze von Zink hergestellt. Die Lösungen wurden so hergestellt, daß sie 240 nmol/ml enthielten, bezogen aaf. die Absorption bei 3,76 mn· Der Zinkgehalt der Lo-. sungen betrug 8-10 /ig/ml, sich abhebend von den Kristallderivaten· Die geschätzten Stärken einiger Insulinverbindungen sind aus Tabelle 3 unten zu entnehmen·

66 687 12 31

Tabelle 3

Stärke relativ Sicherheitsgrenzen

zu Insulin (P=O,05)

' * - %

Gln^A17,Thr^B3O-HH^-Insulin 67 Gln^A17,Lys^B30-]iH₂ -Insulin 62

Arg^B27,Lys^B30-HH₂-Insulin 84 74 - 94

58 - 75 51-72 - 145

Claims (10)

1. Erfindungsanspruch

   1. Verfahren zur Herstellung von verbindungen der allge- meinerf Formel I

   A( 1-3 )-E¹-A( 5-6 )-Cys-A(8-16)-E²-A( 18-19 )-Cys-Asn (A-Kette)

   ' . ^s . ' · ^s -^%

   B(l-6)-Cys-B(8-12^-E³-B(14-18)-GYS '

   ;. . " " : ' "... ν ' ', ". -(.B-Kette) R-Z_n-Y_m-Lys-Pro-X-B(26-22)-E⁴-Gly

   worin die Buchstaben A und B mit den folgenden Zählen Klämaern die Peptidfragmente der¹ A- und B-Ketten

   bezeichnen, in entsprechender Weise durch dieBuch-

   12 3

   staben-in den Klammern bezeichnet, E , E , E und E sind gleich oder verschieden und stellen Glutaminsäure oder einen neutralen Aminosäurere9t dar, der für Nucleotidsequenzen codieren kann, X ist ein L-Threonin-, L-Arginin- oder L-Lysinrest, Y und Z sind gleich oder verschieden und stellen jeweils einen Aminosäurerest dar, worin eine beliebige Seitenkettenaminogruppe acyliert sein kann und worin eine beliebige Seitenkettenhydroxygruppe alkyliert sein kann, und m und η sind gleich oder verschiedeiXand stellen jeweils null oder eins dar, R ist ein Amidorest, der die C-terminale Carboxygruppe der B.Kette blockiert, mit der Maßgabe, daß E , E , E³ und E nicht alles Glutaminsäurereste sind) wenn X ein Threoninrest, die Gruppe der Formel -Y-Z-R folgende Röste darstellt: -NH₂, -Arg-NH₂, -Arg-Arg-MHg, -Arg-Lys-NRp, -Dab-Dab-NH₂» Dap-Dap-NH₂, -Lys(Lau)-NH₂, -Lys-*Arg-NH₂, -

   r 33

   -Orn-Örn-NH₂, -THr-NH₂* -Thr-OBu* oder -ThT(Bu*J-gekennzeichnet durch ^

   a) Transpeptidisieren von Schweine-Insulin oder einer Verbindung der allgemeinen l=ormel Il ' ".

   ' ' .- . . ' . ·. ·. ^; . - ^: -^; '

   B(1-12)-E³-B(14-20)-E⁴-B(22-26)-X-B(28-29)-(Q -R)_r-A(1-3) ³(S-IS )-E²-A( 18-21) :

   worin A und B die Fragmente der A- und B-Ketten bezeichnen; angezeigt durch die Nummern in Klammern, Q ist eine ". ' PeptidkettQ mit q Aminosäuren, q ist eine ganze Zahl von O bis 33, H ist l_ys oder Arg und r ist null oder eins und E , E , E » E· und X sind jeweils wie vorab definiert-, mit. einer Verbindung der allgemeinen Formel III

   worin Y, Z, R, m und η jeweils die bereits genannte Bedeutung haben und worin Seitenketten-aminogruppen und Hydroxygruppen in Y und Z gegebenenfalls mit Amino- und Hydroxyschutzgruppen blockiert sind, unter Verwendung von Trypsin oder einem Trypsin-ähnlichen Enzym als Katalysator; oder

   b) Kuppeln einer Verbindung der Formel IV

   A(1-3)-E¹-A(5-6)-CyS-A(8-16)-E²-A(18-19)-Cys-Asn (A-Kette)

   B (1-6 )-Cys-B (8-12 )-E³-B (14-18 )-Cys

   .·'. (B-Kette) Sys-Pro-X-B(22-26)-E⁴-Gly

   worin E₁ E , E , E. und X die vorab genannte Bedeutung haben, mit einer Verbindung der Formel Hl durch Trypsin oder ein Trypsin-ähnliches Enzym. ^!

   ' ^{: ;} ''" ' 1
2. 2. verfahren nach Punkt 1* gekennzeichnet dadurch,, daß E , E

   und E jeweils einen Glutaminsäurerest darstellen.
3. 3. Verfahren nach einem der Punkte 1 oder 2, gekennzeichnet

   .'. · . · . ο - .- . '

   dadurch, daß E ein Glutaminsäurerest darstellt, ,
4. 4. Verfahren nach einem der Punkte i bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß Y und/oder ζ ein basischer Aminosäurerest ist, worin die Seitenkettenaminogruppe gegebenenfalls

   ' acyliert ist (m=l).
5. 5. Verfahren nach einem der Punkte-1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß η gleich null ist und Y ein basischer Aminosäurerest ist (ra β 1).
6. 6. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß Y und Z beide basische Aminosäurereste sind (m = 1,_ η a I);
7. 7. Verfahren nach'einem der Punkte 1 bis 6, gekennzeichnet da-

   12 durch, daß R eine Gruppe der allgemeinen Formel -NR R

   ist, worin R und R gleich oder verschieden sind und jeweils Wasserstoff oder Niederalkyl darstellen, worzugsvveise ist R gleich -
8. 8. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß R gleich Niederalkoxy ist, vorzugsweise tertiäres Butyloxy.
9. 9. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß R ein Rest eines Lactams ist, der vorzugsweise weniger als S Atome im Lactamring aufweist-.
10. 10. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß sie Gln^A17,Arg^B27,Thr⁹³⁰-NH₂ - Huraaninsulin, Gln^A17,GIn⁸¹³VThr^B30-NH₂ - Humaninsulin, v Gln^A17.Lys^B27,Thr^B30-NH_o - Humaninsulin, Gln^A17,Lys^B3p-

    * ' A17 - R"?O

    iSJH₂-Humaninsulin, Gin ,Thr -NH₂ - Humaninsulin,. Gln^B13,Arg^B27iThr^B30-NH₂ - Humaninsulini Gln^B13,Lys^B27,Thr^B30-NH₂ - Humaninsulin, Gin^B13,Lys^B30-NH₂ - Humaninsulin, Gin⁸¹³iThr^B30-NHo-Humaninsulin,- Arg⁸²⁷,Arg^B30-NH_P-Humaninsulin, Arg ,Lys -NHg-Humaninsulin, Arg^B27,Thr⁸³⁰-NH₂-Humaninsulin, Lys^B27,Arg^B30-NH₂ ^ Humaninsulin , Lys⁸²⁷,Lys^B30-NH_C)-Huraaninsulin, Lys⁸²⁷,Thr^B3°-

    DOQ .<

    NH_a-Humaninsulin, Lys

    PKTC)

    Thr^D -IS!H₂-Humaninsulin, γ Lys -NHo-Humaninsulin, Lys (Lau)-NH₂~Humaninsulin,

    Lys^B30-Arg^B31-NH,-Humaninsulin, Lys^B30)-Lys^B31-NH_P-

    R"?0 ' ' " 830 h31

    Humaninsulin, Arg -NHo-Humaninsulin, Arg -Arg -NH₉-

    3 31

    R3ö B31 '

    Humaninsulin oder Arg -Lys -NH₂-Humaninsulin

    darstellt.