DE2439296A1 - Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten - Google Patents

Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten

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DE2439296A1 DE2439296A DE2439296A DE2439296A1 DE 2439296 A1 DE2439296 A1 DE 2439296A1 DE 2439296 A DE2439296 A DE 2439296A DE 2439296 A DE2439296 A DE 2439296A DE 2439296 A1 DE2439296 A1 DE 2439296A1
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Description

Verfahren zur Herstellung von Insulin, Insulin-Analogen
und - Derivaten
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Kerstel3_ujig von Insulin, Insulin-Analogen und -Derivaten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I
Y- Lyä Insulin-B-Kette
.S S R
Y ι
Insulin-A-Kette
in der Y H oder einen Acylrest und R
den Sulfonyldiäthylbisoxycarbonyl-Rest (Sdc-Rest)
-C-O-CH2-CH2-SO2-CH2-CH2-O-C-O^ 0
(I)
bedeutet, mit Alkali oder quartärcn organischen Basen
oberhalb pH 13 behandelt.
609803/0945
ORIGINAL INSPECTED
Nach Biochem Biophys. Res. Commun. j5J5£i973) Seite 60, kann Insulin aus seinen Ketten dadurch, hergestellt werden, daß man die ^-Aminogruppe der Α-Kette und die £-Aminogruppe der B-Kette über eine { ,?[ '-Diaminodicarbonsäure miteinander verbindet, durch Dehydrierung die Disulfidbrücken des Insulins formelgerecht schließt und anschließend die *Q, , £'-Diaminodicarbonsäure durch Edman-Abbau herausspaltet.,
Mit diesem Verfahren konnten erstmals die beiden Ketten des Insulins in hoher Ausbeute vereinigt werden. Auch der Edinan-Aobau gelang, jedoch war ein gewisser Abfall der Ausbeute unvermeidlich.
Ein in Patent ... (Patentanmeldung P 2k 23 ki2.6) (HOE 7^/F Λ 6k) beschriebenes Verfahren verwendet zur Kettenvereinigung ein me-•thioninlialtiges Briickenreagens ; dj e anschließende Herausspalttmgdes Restes R geschieht dabei mit Bromcyan in saurem Medium. Die Ausbeute an Insulin liegt höher als bei den Reagentien, die durch Edman-Abbau abgespalten werden.
Das erfirdangsgemäße Verfahren gestattet nun die Vereinigung der beiden Ketten in gleicher hoher Auebeute. Beim Herausspalten des Brückenreagens lassen sich aber noch höhere Ausbeuten erzielen als in den oben genannten Fällen, da die Spaltung in einer einzigen, sehr schnellen Reaktion über einen baseiikatalysierten ß-Eliminierungs mechanismus verläuft. Dabei beeinträchtigen nur geringe Nebenreaktionen und deren Folgeprodukte die Ausbeute. Auch die Reinigung des Reaktionsproduktes gestaltet sich damit einfacher.
Während beim Edman-Abbau auch die erste Aminosäure der B-Kette, z.B. Phenylalanin, gleichzeitig abgespalten wird, wenn di<? «C-Aminogruppe nicht mit einer Schutzgruppe versehen i'St, ist dies bei Anwendung des Sdc-Restes nicht der Fall, Jedoch kann es auch hier für einen glatten Reaktionsablauf vorteilhaft sein, die 1C -Arainogruppe der B-Kette zu schützen.
Das Prinzip der Reaktion bei der Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I durch Aufeinanderfolge der Verknüpfungen des bifuiiktionellen Brückengliedes R mit der A- bsv. B-Kette des Insulin* ist bereits in
609509/0945 P
der oben genannten Literaturstelle, sowie in der Deutschen Offen legungsschrift 2 252 157 beschrieben.
Zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel 1 wird eine Insulin-A-Kette, deren SH-Gruppen durch eine der bekannten S-Schutzgruppon wie z.B. Trityl, Diphenylmethyl, S-Alkyl mit 1 _ 4 C-Atomen, Picolyl, Acetamidomethyl oder Sulfonat blockiert, ist, mit überschüssigem Reagens der allgemeinen Formel II
umgesetzt, in der R die angegebene Bedeutung besitzt und OV den Rest eines Esters der SuIfonyldiäthylbisoxycarbonyl-Komponente, z.B. des N-Hydroxysuccinimidesters, Nitrophenyl-, Trichlorphenyl-, Pentachlorphonyl- oder Fentafluorphenylestors dargestellt.
Dabei entstehen Verbindungen der allgemeinen Formel jlII
„, sx sx
Insulin-A-Ke 11 e
SX SX
(in)
in der X eine S-Schutzgruppe bedeutet. Als Lösungsmittel für diese Reaktion verwendet man bevorzugt DimethyisuliOxid (DMSO) oder ein Dialkylcarbonsäureamid, insbesondere Dirnechylformamid (DMF) oder Phosphorsäuretrisdimethylamid. Die Umsetzung läuft bei Raumtemperatur ab, jedoch kann auch leicht erhöhte Temperatur angewandt werden.
In entsprechender Weise setzt man dann die Verbindung der allgemeinen Formel IJ.I mit einer Insulin-3-Kotte "bei einem pH von etwa 8-11 bzw. unter Zusatz einer tert, organischen Baso wie N-Äthylmorpholin in DMSO oder DMF um und erhält Verbindungen
609809/09/.0
/k COPY
der allgemeinen Formel IV
R
SX SX		 Insulin-A-Kette Y- Phe- Lys Insulin-B-Kette
GIv- SX SX
SX SX
in der R und Y die oben genannte Bedeutung besitzen. .4Is N-N-Schutzgruppe (Υ) kommen z.B. tert.-Eutylox}rcarbony.l (Boc)-, Phtaloyl- , Tolyl- bzw. Methylsulfonyläthyloxycarbonyl- oder Trifluoracetylreste in Betracht.
Venn Y eine N-Schutsgruppe ist, kann die bescliriebene Reaktionsfolge auch in der umgekehrten Reihenfolge, d.h. zunächst Verknüpfung mit der B-Kette und anschließend Verknüpfung mit der Α-Kette, voi-genommen werden.
Man nimmt das Reaktionsprodukt, ggf. nach Abspal tting noch vorhandener Schutzgruppen und evtl. chromatographischer Reinigung, in 8 M wässriger Harnstofflösung oder Wasser von pH 5-9 auf. Vexin X z.B. -SO„H ist, versetzt man unter Stickstoff bei 0 - όΟ mit einem 50 - 100-fachen Überschuß an Thioglycol oder der 1 - 5-fachen berechneten Menge an Trialky!phosphin, z.B. Tribu~ tylphosphin, fällt nach beendeter Reduktion mit essigsaurem . Aceton, zentrifugiert u. wäscht mehrmals mit essigsaurem Aceton. Dann löst man in möglichst wenig wässrigem NH„ und verdünnt mit 0.05 M (NHjJHCO_, eingestellt auf pH 10 - TO. 6, auf eine Peptidkonzentration von 0.01 - 1 mg/ml, und rührt über Nacht bei ο - 20 im langsamen Luftstrom. Man kann auch bei niedrigerem pH, jz.Be 8 - 10, arbeiten, benötigt dann aber läjngere Reaktionszeiten bis ca. 150 h. Anschließend stellt man mit 1 η Essigsäure auf pH 4-5· 5 ein und lyophilisiert oder dampft die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel I im Vakuum zur Trockene ein.
609809/0945
Das Rohprodukt wird mit Hilfe von Verteilungschromatographie an Sephadex LH 2O~^ im System n-Butanol : Eisessig : Wasser (2:1: 10) oder über Sephadex G 5<J^ bzw. G J^ mit 1 η bis 2 η Essigsäure gereinigt {Säule: 4x100 bis 4x200 cm). Der "Insulinpeak" (bis ca. JO c,i) wird wie folgt weiterverarbeitet, falsch rekombiniertes Produkt (bis ca. 30 ^o ) nach Reduktion erneut der Rekombination zugeführt.
Die erfindungsgemäße Abspaltung des Restes R aus den Verbindungen dei1 allgemeinen Formel I erfolgt z.B* durch kurzfristiges Behandeln mit 0,2 η bis 1 η NaOH bei 0° C.
Dazu löst man die Verbindung der allgemeinen Formel I in H_0 eventuell unter Zusatz von Dimethylformamid, kühlt die Lösung auf 0 und stellt mit eiskalter Natronlauge die gewünschte Normalität ein. Nach 2 bis 10 Minuten, vorzugsweise 2 bis 3 Minuten, wird unter Kühlen mit der äquivalenten Menge an 1 η HCl neutralisiert. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert. Den Rückstand bzw. Niederschlag nimmt man in wenig verdünnter Essigsäure auf und chromatographiert an Sephadex G 50 oder G 75*^·
6 0 9 80 9/0945
243929b
Man eluiert mit verdünnter Essigsäure, vereinigt die insulinhaltigen Fraktionen und stellt das pH auf 5·2. Dabei kristallisiert das zunächst amorph, ausgefallene Insulin innerhalb einiger Stunden ο
Ausb etwa ^Q $>, bezogen auf eingesetzte Insulin-Α- bzw. B-Kette.
Das kristallisierte, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Insulin besitzt bei der Bestimmung der biologischen Wirkung durch Messen der Blutzuckersenkung am Kaninchen 24-25 I.E./mg. Die Aminosäureanalyse ist korrekt.
Außer Insulin selbst können mit dem erfindung ε ge maß en Verfahren auch Insulin-Analoga und -Derivate hergestellt werden· Unter Insulin-Analoga werden Verbindungen verstanden, in denen eine oder mehrere Aminosäuren gegen andere, vorzugsweise einfachere Aminosäuren ausgetauscht sind, ferner Insuliaa mit veränderter, vorzugsweise verkürzter Kettenlänge,
So können, wie bereits aus der Literatur bekannt ist, z.3. in der Α-Kette GIn5 und GIn15 durch GIu, Ser12, Tyr , Asn18 und Asn21
durch Ala, VaI durch Leu oder eine andere hydrophobe Amino-
19
säure, ferner Tyr durch Phe ersetzt sein.
1 2 '* h 5 In der B-Kette ist der Ersatz von Phe , VaI , Asn", GIn , Ki s, Ser , His , Thr und Pro ' durch einfachere Aminosäuren, verzugsweise Alanin, möglich. Die Aminsäuren 1 bis k und 30 können auch eliminiert sein, ί
durch AIa ist möglich·
A ty
auch eliminiert sein. Selbst der Ersatz von Cys ' und Cys
Als Insulin-Derivate gelten Verbindungen, die substituierte funktioneile Gruppen tragen. So kann z.B. die d^-Aminogruppe der B-Kette durch einen Acylrest analog DOS 2 042 299 substituiert sein. Dasselbe gilt für die oben definierten Insulin-Analoga.
Da die Substitution der cC -Aminogruppe der Insulin-B-Kette durch einen beliebigen Rest Y hinsichtlich der biologischen Wirkung nicht kritisch ist, kann Y nicht nur eine der· typischen
609809/0945
/7
N-Schutzgruppen der Peptidchemie sein, sondern einen beliebigen, physiologisch verträglichen Acylrest darstellen, der allerdings in seiner räumlichen Ausdehnung begrenzt sein muß. Diese Grenze liegt z»B. bei aliphatischen Alkanoyl- oder Alkyloxycarbonylresten bei etwa 6 C-Atomen, bei einem Cycloalkanoylrest oder dem Rest einer aromatischen oder heterocyclischen Carbonsäure bei etwa 10 C-Atomen. Y kann auch Aminoacylreste der natürlich vorkommenden (^-Aminosäuren oder deren D-Enantiomeren und IO -Aminocarbonsäuren bis etwa 6 C-Atomen bedeuten, sowie deren N-Alkanoyl- oder N-Alkyloxycarbony!verbindungen bis etwa 4 C—Atomen, Cycloalkanoyl oder die Reste aromatischer oder heterccyclischer Carbonsäuren bis etwa 7 C-Atomen.
Voraussetzung bei solchen Substitutionen ist stets, daß die biologische Wirkung der Insuline nicht oder nicht wesentlich verringert wird. Dabei ist unter "biologischer Wirkung" nicht nur die Senkung des Blutzuckers zu verstehen, sondern z.B. auch die Fähigkeit solcher Verbindungen, als Haptene für vorhandene Anf-ikörper zu dienen. .
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Insulin oder· seine Analogen und Derivate werden anstelle des aus Pankreas gewonnenen Materials zur Behandlung des Diabetes mellitus eingesetzt bzw. ganz allgemein verwendet, wenn der Blutzucker, z,B. zur Erzeugung eines Schocks, gesenkt werden soll.
Die Insulin-Α- und B-Ketten werden nach einem der zahlreichen in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt. Zur Demonstration des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es einfacher, von natürlichen Ketten auszugehen, die z.B. durch Sulfitolyse leicht aus Insulin erhalten werden können. Die durch. Synthese hergescell· ten Insulinketten verhalten sich wie das natürliche Material. Dies gilt auch für abgewandelte Ketten, sofern diese Ketten noch die entscheidenden strukturellen Merkmale füx· die biologische Wirkung des aus ihnen hergestellten Insulins besitzen·
6038C9/Q94S
/8
Die Reagentien der allgemeinen Formel II werden durch Umsetzung des bekannten SuIfonyldiätlianols mit Phosgen und überführen des Dichlorkohlensäuree1;ters in den gewünschten Aktivester, z.B.
Bis-N-hydroxysuccinimidester, hergestellt. Ein zweiter Darstellungsweg geht von den bekannten Chlorkohlensäureestern der
Aktivester aus. Diese werden nach bekannter ¥eise in Pyridin
mit dein SuIfonyldiäthanol umgesetzt.
Das folgende Schema beschreibt beide Reaktionen:
coci2/tiif
0-So0-CH0
2 2 2
H2C-C
-CH,.-o-g-ci
N-Hydroxysuccinimid/Pyridin
0 2
I0-CH0-O-C-O-NC 0
ν/
ί-O-C-Cl / Pyridin
11
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/9
Beispiel 1 Herstellung des Brückenrea^ens
a .; SuIfonyldiäthyl-bi s-pxycarbonyl-di-N-hydroxysucci nat
15,4 g Sulfonyldiäthanol, nach J.Org.Chem 2*3, 1ΐ4θ (1963)
hergestellt, v/erden in 90 ml Tetrahydrofuran gelöst und
innerhalb 30 Minuten unter Rühren zu einer Lösung von 22 g
Phosgen in 200 ml Tetrahydrofuran getropft. Die Temperatur wird bei -10 bis -15 gehalten. Man rührt bei -10 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur eine weitere Stunde nach. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert. Es verbleiben 26 g eines zähen Öls.
Dieses wird in 27 ml Tetrahydrofuran und 150 ml Methylerichlorid aufgenommen und eine Lösung von 12 ml Pyridin, 17 g N-Hydroxysuccinimid und 52 ml Methylenchlorid bei -10 innerhalb von 15 Minuten unter Rühren zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird 15 Stunden bei +h aufbewahrt, wobei das zunächst als Öl ausfallende Produkt kristallisiert. Es wird abfiltriert, mit eiskaltem Tetrahydrofuran gewaschen und getrocknet.
Fp. 13^-137 (Zers.). Elementaranälyse korrekt.
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/10
-ho- 2439236
Beispiel 2 Rinder-Insulin
a) Rinderinsulin-A-Ketten-tetrasulfonat
Die Herstellung aus Rinderinsulin erfolgt in bekannter Weise, z.D. nach Z. Naturforsch. 18b (1963), Seite 978.
b) N -Trifluoracetyl-B-Ketton-disulfonat (Rind) Herstellung durch Sulfitolyse von N -Trifluoracetyl-insulin (Rind) in bekannter Weise. Dieses Ausgangspx-odulct wird wie fo~gt gewonnen:
N*"· , N *- -Bis-Boc-insuiin, hergestellt nach Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. 352 (1971), Seite i4S7, wird in Dimethylformamid gelöst und mit ca. 5 Aquival. Trifluoressigsäure-methylester umgesetzt. Dabei entsteht N^Λ , N ^ -ßis-Boc -N trifluoracetyl-insulin (Rind). Nach Abspalten der Boc-Gruppen durch 45 Min. Behandeln mit Trifluoressigsäure wird das Pi-odukt durch Verteilungschromatographie an Sephadex LH-20 im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (2:1:10). gereinigt.
c) Rinderinsulin
2.82 s des nach 2a) hergestellten A-Ketten-tetrasulfonats werden in200 ml Dimethylsulfoxid unter Zugabe von 1.11 ml N-Äthylmorpholin auf pH^9 gebracht und mit 1,4 g des nach Beispiel 1c1 hergestellten N-Hydroxysuccinimidesters gerührt. Nach 20 h liira mit Äther/Methanol (10:1) gefällt.
Nun nimmt man wieder in 200 ml Dimothylsulf oxid auf, gibt 3· 45 g des nach. 2.b) hergestellten N -Trifluoracetyl-B-Ketten-disulfcnats und 1.1 ml N-Ath.ylmorph.oiin zu und rührt 6 - 24 h bei Raumtemperatur. Dann wird mit Äther/Methanol (1O:1) gefällt.
Ausbeute 5f2 g.
/11
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Nach SäulenchromatograpMe an Sephadex G 50 (Säule: l= 0=4cm) in 0.05 M (NH^)HCO -Puffer pH 8.5 - 9, und Gefriertrocknung wird das Produkt in 0.25 1 Wasser von pH 8.6 aufgenommen. Man setzt 50 ml Thioglycol zu, bewahrt 6 h unter Stickstoff auf, fällt mit der 10 - 20-fachen Menge essigsaurem Aceton, zentrifugiert und wäscht mit essigsaurem Aceton frei von Thioglycol. Dann löst man in wenig IN NH„, verdünnt auf 25 1> stellt auf pH 9 und rührt etwa 100 Stunden im leichten Luftstrom bei Raumtemperatur,
Unter diesen Bedingungen wird gleichzeitig die Trifluoracetylgruppe abgespalten. Man stellt mit Essigsäure auf pH 5·5 txnd lyophilisiert.
Der Rückstand wird in 50 ml 10 ^iger Essigsäure oder Ameisensäure gelöst und über eine Säule 4 χ 200 cm Sephadex G 50 oder
G 75Jι fine, chromatographiert. Auch Verteilurigschromatographic
(E)
an Sephadex LH 20 im System n-Dutanol-Essigsäure-Vasser (2:1:10) ergibt eine gute Reinigung (Säule k- χ 100 bis k χ 20ü). Die Säulen werden mit vernetzten! Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak wird nach J.Amer.Chem.Soc. 21C1 ?"?1)» Seite 3080,mit 1.4-Dithiothreitol in flüssigem NH„ oder mit Tributylphosphin in verdünntem wässrigem NH„ bei pH 8-10 reduziert und wie oben in Wasser bei pH 9 oxydiert.
Zur Abspaltung des Vernetzungsreagens löst man in 75 ml Wasser/ Dirnethylformamid (2:i), kühlt auf 0 und gibt 25 ml einer eisgekühlten h η NaOH zu. Nach 2-5 Minuten neutralisiert man unter intensivem Kühlen mit 50 ml 2 η HCl und destilliert das Lösungsmittel im Vakuum ab. Der Rückstand wii-d in 10 ^oiger Essigsäure aufgenommen und über eine Säule (4x200 cm) Sephadex G 5O^ gereinigt; als Blvitionsmittel dient 10 folge Essigsäure. Man vereinigt die Insulin enthaltenden Fraktionen, engt im Vakuum auf ca. 4o ml ein, stellt das pH unter Zugabe von etwas ZnCl auf 5,2 ein und läßt 1 Tag bei Raumtemperatur stehen. Die gebildeten Kristalle werden durch Abschleudern von nichtkristallisierendem Material getrennt und die Kristallisation wiederholt. Ausbeute 2>97 S (^9/0· Biologische Wirkung des Insulins 25 I.E./mg.
609809/0945 " /12

Claims (3)

HOE ,235 Patentansprüche
1.)Verfahren zur Herstellung von Insulin, Insulin-Analogen und -Derivaten, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I
,S-
Insulin-A-Kette
(D
in der Y H oder einon Acylrest und R
den SuIfonyldiäthylbisoxycarbonyl-Rest
-C-O-CII0-CH0-SO0-CH^-CH-O-C-
ti (C ei ^- Λ «C
bedeutet, mit Alkali oder quartären organischen Basen oberhalb pH 13 be halide 11.
2.)Insulin-Derivat der allgemeinen Formel I
,S-
-S
Insulin-A-Ke fcte
S i
Lys
Insuiin-B-Ke tto
(D
609809/0945
/13
in der Y H oder einen Acylrest und R Sulfonyldiäthylbisoxycarbonyl
-C-O-CH-SO-CH-CK-O-C-ti (L d d. d. n '
0 0
bedeutet,
3.) Verbindungen dex* allgemeinen Formel II
VO-R-OV . . (Il)
in denen R SuIfonyidiäthylbisoxycarbonyl bedeutet und OV den Rest eines aktiven Esters der SuIfonyldiäthyIbisoxycarbonyl-Komponente wie N-Hydrcxysuccinimid-, Nitrophei^l-, Triclilorphenyl-, Pentachlorphenyl- oder Pentafluorphenylester darstellt.
9 80 9/09 4 5 0R5G1NAL INSPECTED
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