DE2253327A1

DE2253327A1 - Verfahren zur herstellung von insulin, insulin-analogen und -derivaten

Info

Publication number: DE2253327A1
Application number: DE2253327A
Authority: DE
Inventors: Rolf Dipl Chem Dr Geiger; Georg Dipl Chem Dr Jaeger
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1972-10-31
Filing date: 1972-10-31
Publication date: 1974-05-09
Also published as: ATA916173A; FR2204618A1; JPS4980091A; US3883500A; BE806833A; AU6192273A; FR2204618B1; NL7314754A; DD109868A5; IL43495A0

Description

FAHbVJERK-S iiOECiiST AG vormals Meister Lucius-& Brünin.y;

Aktenζ eiehen:

HuK .72 /F 330

■Datum-: 2'6. Oktober 1972 Dr. Hg/s ti

Verfahren zur Herstellung von Insulin, Insulin-Analogen und -Derivaten - - . :

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Insulin, Insulin-Analogen und -Derivaten," das dadurch gekennzeichnet ist, .daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel I

Y-

R-

s.x

GIy

A-Kette

üx~

. B-Kette

•0-

s,x

SX SX

Ly s

in der X Wasserstoff oder eine S-Schutzgruppe und Y Wasserstoff, einen Alkanoylrest mit;! bis 4 C-Atomen, einen Phenyl-alkanoylrest mit 1 bis 3 C-Atomen im Alkarioylteil, Benzoyl oder einen Alkyl-oxycarbonyl- bzw. Aralkyl~oxycarbonylrest, wobei der Alkylteil 1 bis 4 C-Atome enthält j einen Amino-aeylrest, der sich von den natürlich vorkommenden^ - oder ß-Aminosäuren'oder gegebenenfalls deren D-Enantiomeren ableitet, oder Acyl-aminoaeylrest bedeutet·und Γ einen Rest der allgemeinen Formel II

_{3 3}

-C-(CH₂)_n-C-CH CH

darstellt, in der η für 2 bis 4 steht, durch Abspaltung von X und Dehydrierung in eine Verbindung der allgemeinen· Formel III 409819/1121

BAD ORIGINAL

iiOE- τ,ι/yyy.)

0 CO-

o-l

GIy

Λ-Kette

Y- L,

B-Kette

ill

überführt, in der Y und R die obengenannte Bedeutung besitzen, und aus dieser Verbindung die -CO-O-R-O-CO- Brücke durch Behandeln mit einer Säure, z.B. einer Trifluoressigsäure herausspaltet.

Gegenstand der Erfindung sind ferner Verbindungen der allgemeinen Formeln I und III, in denen R, X und Y die oben angegebene Bedeutung besitzen.

Die intramolekulare Vernetzung des Insulins über* die beiden Aminogruppen N und N ist schon aus Z. Makromol, Chem. _2β (1958), Seiten 153 bis 166, bekannt. Mit der Aufklärung der Tertiärstruktur des Insulins wurde der kurze, durch bifunktionelle Reagentien überbrückbare Abstand der beiden Aminogruppen bestätigt. Es gelang seither auch, die beiden Aminogruppen durch eine Succinoyl- bzw. AdipinoyIbrücke zu verbinden.

Man erhielt dadurch neue Insulinderivate, die jedoch nicht mehr in Insulin zurück verwandelt v/erden können.

Demgegenüber bietet das erfindungsgemäße Verfahren die Möglichkeit, Insulin aus einem solchermaßen intramolekular vernetzten Molekül

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BAD

3 ^H0]:' ^i2/F -^⁰

zu i'CoC·!"".'}'.! eren,-da die Brücke -CO-O-R--0-CO-- durch saure Reagent! ^r; z.B. Trifluoressiooaure leicht zu eliminieren ist.

Das erfinduhgsc-eiiulßo Verfahren und die erfindungsgenHßcn Insulin-Deri vate der allgemeinen Formel III erhalten ihren Wert dadurch* daß sie in guter Ausbeute aus getrennt synthetisierten A- und B--Ketten hergestellt werden können.. Sie übernehmen bei der Komblna- · tion der beiden Ketten in hoher Verdünnung die Funktion, die bei der Biosynthese des Insulins das C-Peptid hat, nämlich, eine forme] cere cn te Kombination herbeizuführen.

Das gelingt zwar nicht in dem Maße und-mit derselben Ökonomie, mit der bei der Biosynthese des Insulins' die beiden Ketten kombiniert werden, doch ist die Ausbeute merklich höher als dies bei den bischerigen Verfahren der Kettenkombination der Fall ist.

Die heute fast ausschließlich angewandte Methode der Kettenkorabination nach Scientia Sinica 10· (1961), Seite 84, liefert unter günstigen Umständen etwa 10 % Ausbeute. Hiervon können etwa kO "% in kristalliner Forin erhalten v/erden. Gelegentliche Angaben über höhere Ausbeuten waren nie reproduzierbar. Die Konbinationsausbeute konnte bisher nur gesteigert werden, wenndie A-Kette in etxtfa 5-fächern molarem Überschuß eingesetzt würde* Diese Reaktiönsbedingungen sind aber nicht mehr-wirfcschaftlich (Advances Anzymology J53 (1970), Seite 455) > und die Ausbeute an kri'ställisierbarem Material bleibt auch hier noch gering. - ' ■■ . '

Demgegenüber liefert das erfindungsgemäßeVerfahren Ausbeuten von mehr als 25 % bei einem Kettenverhältnis 1:1._; Darüber hinaus lassen sich: falsch kombinierte Produkte nach Reduktion erneut der Kombination unterwerfen, da hier A-.und B-Kette zunächst unver- / ändert über die erfindungsgemäße Brücke miteinander verbundenbleiben. - ,

Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit einen auch technisch gangbaren Weg zur Synthese von Insulin dar.. . Außer Insulin selbst können Mt dem erfindungsgemäßen Verfahren auch Insulin-Analoga und -Derivate hergestellt werden, unter

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HOE 72/I·¹

Insulin-Analoga werden Verbindungen vorstanden, in denen eine oder mehrere Aminosäuren gef;en andere, \ orzugsv/eise einfachere Aminosäuren ausgetauscht sind, ferner Insuline nit veränderter, vorzugsweise verkürzter Kettenlänge.

So kennen, wie bereits aus der Literatur bekannt ist, Z.B. in der Α-Kette GIn⁵ und GIn¹⁵ durch GIu, Sei·¹², Tyr¹^, Asn und Asn²¹ durch Ala, VaI durch Leu oder eine andere hydrophobe Aminosäure, ferner Tyr durch-Phe ersetzt sein.

In der B-Kette ist der Ersatz von Phe¹, VaI², Asn⁵, Gin , His⁵, Ser , His , Thr und Pro durch einfachere Aminosäuren, vorzugsweise Alanin, möglich. Die Aminosäuren 1 bis 3 und 30 können auch eliminiert se.
durch AIa möglich.

Λ 7 B7 auch eliminiert sein. Selbst der Ersatz von Cys und Cys ist

AXs Aminosäure-Derivate gelten Verbindungen, die substituierte funktioneile Gruppen tragen. So kann z.B. die -Aminogruppe der BfKette durch einen Acylrest analog DOS 2 0Ί2 299 substituiert spin. Dasselbe gilt für die oben definierten InsuÜn^-Analoga.

Voraussetzung jist 3tets, daß durch Austausch oder Substitution die biologische Wirkung der Insuline nicht oder nicht wesentlich verringert wird.

Die den bifunktionellen Brückenreagentien zugrunde liegenden Alkohole

HO-C-(CH₂J_n-C-OH

CH₁, vii,

mit η = 2 bis H sind bekannt. Man führt sie mit Chlorameisensäure-, nitrophenyl-, trichlorphenyl-, pentachlorphenyl-, pentafluorphenyl- oder N-Hydroxysuccinimidester in die entsprechenden aktivierten Kohlenaäureester über. Bevorzugt verwendet man die einfach zugänglichen Nitrophenylester. Die anderen Ester sind jedoch völlig gleichwertig.

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HOE 72/F 330

Y kann ein leicht abspaltbarer Acylrestwie z.B. der Trifluoracetylrest (TFA) sein, der nach beendete Insulinsynthese durch verd. NaOH entfernt wird, ferner Boc oder ein anderer Acylrest analog DOS 2 0^2 299» eier nach der Synthese erhalten bleibt und ein entsprechendes Insulin-Derivat liefert.

Als S-Schutzgruppe X dienen die bereits bekannten Reste wie z.B. der Trityl-, Diphenylmethyl-, Acetamidomethyl- oder Tetrahydropyranyl-rest, ferner Alkylmercaptogruppen wie Äthyl-, Isopropyl- oder tert. Butylmer cap tores te und AminoäthjLcarbamoyl-schutzgruppen analog DOS 1 930 330, ferner der Äthylcarbamoyl-rest. Auch die Sulfogruppe kann vorübergehend zum-Schutz der SH-Grupperi dienen; sie wird bekanntlich durch Einwirkung überschüssiger Mer-

captoverbindungen entfernt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren geht man beispielsweise so vor, daß man ein nach bekannten Methoden hergestelltes Insulin-A-Ketten-SuIfonat mit überschüssigem Aktivester,· z.B. M-Nitrophenylester der nachstehenden Formel umsetzt

0 CH, CH_x 0

-O-C-O-C-CH₀-CH₀-C-O-C-O- \ 2 2 J

CH, CH,

Geeignete Lösungsmittel sind Dimethylformamid oder DimethyIsulfoxi.d. Man fällt das Reaktionsprodukt mit einem organischen Lösungsmittel wie Äther oder Essigester aus und erhält als Zwischenprodukt z.B.

0 CH, CH, 0

Qr ' 3 · 3 n
-O-C-C-CHg-CH^C-O-C-A-Kettensulfonat

CH, CH, 3 3

Nun löst man wieder, bevorzugt in Dimbhylformamid, Phosphorsäure- £ris-dimethylamid oder Dimethylsulfoxid, und bringt mit einer etwa äquimolaren Menge B-Ketten SuIfonat in Anwesenheit von einer für die Neutralisation der sauren Gruppen hinreichenden Menge N-Äthyl-

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⁶ , HOE γ2/F JiJO

morpholin oder Triäthylamin bei etwa pH 8 bis 10 und von etwa 1 Äquivalent 1-Hydroxybenzotriazol zur Reaktion. Die c -Aninogruπρο in Lya der eingesetzten B-Kette ist frei, die-^ -Aminocruppe von Phe . kann z.B. durch einen Boc-Rest geschützt sein. .Die Herstellung einer solchen Kette ist in Beispiel 1 b "beschrieben.

Man erhält nach etwa 30 bis 120 Minuten bei Raumtemperatur al3 Reaktionsprodukt eine schwerlösliche Verbindung der Formel I mit X = SO ~ R = CH₃ CH₃

-C-CH₀-CH₀-C-1 ²²I
CH CH₃

und Y - Boc.

Dip beschriebene Verknüpfung von A- und B-Ketten kann auch in umgekehrter Reihenfolge vorgenommen werden.

Nun behandelt nan das Reaktionsprodukt mit Äther und nimmt ' die getrocknete Substanz in soviel Wasser von pH 5 bis 8 auf, daß eine etwa 0.1 bis 0.5-proz. Lösung entsteht. Man versetzt unter Stickstoff bei 0 bis 6O⁰C mit einem 10 bis 200-fachen Überschuß an Thioglycol, extrahiert nach 5 bis 100 Minuten Reaktionszeit bei Raumtemperatur mit Essigester, trennt ab und vertreibt restlichen Essigester mit Stickstoff. Dann stellt man das pH auf etwa 10.6 ein und rührt über Nacht bei 0 bis 20°C im langsamen Luftstrom. Anderntags stellt man mit 1 η HCl auf pH 5-5 und lyophilisiert oder dampft im Vakuum zur Trockene ein.

Zur Reinigung wird in 0.5 bis 2n Ammonacetat bei etwa pH 7.5

über Sephadex-Q 50^^R* oder G 75 in einer Säule von 1 bis 2m Länge chromatographiert. Der "Insulinpeak" (*ΙΟ %) wird wie folgt weiterverarbeitet, falsch kombiniertesProdukt (ca 30 %) nach Reduktion erneut der Rekombination zugeführt.

Das vernetzte Ron-Insulin der allgemeinen Formel III wird etwa 1 bis 2 Stunden mit der 5 bis 10-fachen Menge Trifluoressigsiiure bei etwa 10 bis 25°C behandelt. Das rohe Insulin wird mit Äther ausgefällt, in 1 bis 2n Essigsäure über eine Säule Sephadex G-50 oder Ο-75 von 1 bis 2 m Länge chromatographiert und in üblicher

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⁷ HOE 72/P 330

Weise direkt aus der Lösung unter Zusatz von Zn-Ionen bei pH 5·^ bis 5·5 kristallisiert. Ausbeute an kristallisierten Material 15 bis 25 % der Theorie (erneut reduziertes, falsch kombiniertes Material nicht eingerechnet).

Das kristallisierte, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Insulin besitzt bei der Bestimmung der biologischen Wirkung. durch Messen der Blutzuckersenkung am Kaninchen 23 I.E./mg. Die Aminosäureanalyse ist korrekt. Es wird anstelle des aus 'Pankreas gewonnenen Materials zur Behandlung des Diabetes mellitus eingesetzt.

Anstelle der in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Synthesen von A- und B-Ketten mit Hilfe der Pestkörpertechnik können auch die bekannten Methoden der Fragmentkondensäticn, wie z.B. Carbodiimid-Methode, gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid, 1-Hydroxybenzotriazolen, 3-Hydroxy-'J-oxo-3>ⁱJ-ⁱdihydrol>2,3-benzotriazin oder der Azid-Methode zur Herstellung der "" jeweils als Ausgangsmaterial benützten A- und B-Ketten herangezogen werden.

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- O - hoe 72/P 330

Beispiel 1 Rinder- Insulin

a) Α-Kette - S-Tetrasulfonat (Rind)

Die Rinder-Insulin-A-Kette wird analog Hoppe Seyler's Z.Physiol. Chem. 35^ ₁ (1971), Seiten 419 bis H?.9 nach der Festkörpermethode, ausgehend von Polystyrolhar?, mit 1 % Vernetzung, hergestellt. Die erste Aminosäure, Asparagin, wird als Boc-Asn(Mbh)-OH (hergestellt aus H-A3n(Mbh)-0H (Chem. Ber. 103 (1970), Seiten 20^Jll bis 2051 mit Boc-azid) mit den Hydroxygruppen desHarzes in bekannter Weise vereestert.

Alle folgenden Aminosäuren werden als Boc-Aminosäure-1-nitrophenylester eingesetzt. Carboxylgruppen in den Seitenketten liegen als Benzylester vor, Hydroxygruppen von Serin und Tyrosin als Benzylather. Die SH-Gruppe des Cysteine wird durch die S-tert.-Butylmercaptogruppe geschützt (Peptides 1969, North Holland Publishing Comp., Amsterdam 1971, Seite 30).

Jeder Kondensationsschrxtt wird in Anwesenheit von 1-Hydroxybenzotriazol analog dem Verfahren der älteren Deutschen Patentanmeldung P 22 02 613.7 (HOE 72/P 016) vorgenommen, um Reaktionsgeschwindigkeit und Spezifität zu steigern.

Nach beendeter Synthese wird die A-Kettein bekannter Weise mit Fluorwasserstoff vom Harz abgespalten und durch SuIfitoylse der asymmetrischen Disulfide analog Hoppe Seyler^fs Z-Physiol.Chem. 352 (197I), Seiten 119 bis 129 in das S-Tetrasulfonat überführt und gereinigt. Das auf diese Weise hergestellte und gereinigte A-Ketten-Sulfonat (Ausbeute der Synthese 65 %> Ausbeute der Sulfitolyse 28 %) ist von einer aus natürlichem Insulin hergestellten Verbindung elektrophoretisch nicht zu unterscheiden.

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HOE 72/F 330

b) N°^-Boc-B-Kette-S-disulfonat

Die Rinder-Insulin-B-Kette wird analog Hoppe Seyler's Z.Physiol.-Chemie ^M (1967), Seite 1355 und 352. (197D, Seite 419, nach Merrifield (Biochemistry _3 (1964), Seite 1385), ausgehend von Polystyrolharz mit 1 % Vernetzung, hergestellt. Lysin wird als Boc-Lys(Pht)-ONp eingesetzt, alle weiteren Aminosäuren ebenfalls als Boc-Nitrophenylester, weitere Carboxylgruppen in den Seitenketten liegen analog der Vorschrift von Merrifield als Benzylester vor, Hydroxygruppen von Serin und Tyrosin als Benzylather. Die SH-Gruppe des Cysteins wird durch die S-tert.-Butylmercaptogruppe geschützt (Peptides·1969> North Holland Publishing Comp., Amsterdam 1971, Seite 30).

Jeder Kondensationsschritt wird in Anwesenheit von 1-Hydroxybenzotriazol analog dem Verfahren der älteren Deutschen Patentanmeldung P 22 02 613«7 (HOE 72/P 016) vorgenommen, um Reaktionsgeschwindigkeit und Spezifitat zu steigern.

Nach beendeter Synthese wird die B-Kette in bekannter Weise mit Fluorwasserstoff vom Harz abgespalten. Ausb. 55 %» bezogen auf die erste Aminosäure AIa . 3,6 g (Im Mol) der noch S-geschützten N * -Pht-B-Kette wird nun in 100 ml Dimethylformamid mit 300 mg (1.2 m Mol) Boc-ONp in Anwesenheit von 135 mg 1-Hydroxybenzotriazol während 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum bis auf ein Restvolumen von 10 ml und Versetzen mit Essigester erhält man 3,5 g Boc-S-tert.-butylmercapto-N£ Pht-B-Kette, Zur Abspaltung der Phthaloylgruppe löst man die Verbindung in 100 ml 80-proz. Phenol und erwärmt nach Zusatz von k ml Hydrazinhydrat 16 Stunden auf 40⁰C. Dann fällt man mit 1 1 Isopropanol-äther (1 + 5) 3.3 g der von der Phthaloylgruppe befreiten Verbindung aus. Die überführung in das Disulfonat erfolgt analog Beispiel la), Ausbeute 3.0 g

c) Herstellung eines Brückenreagens

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BAD OBIGlNAL

- 10 - HOE γ2/P 330

2. 5~Bi-3-Nitropheny loxycarbony loxy-2 . 5-dimethyl-n-hexan

Die Lösung von k.Ob g Chlorameisensäure-ll-nitrophenylester in 10 ml absol. Dioxan unter Rühren bei 0 C in die Lösung von 1.^6 g 2.5-Dimethyl-n-hexan-diol-2.5 und 2.'12 ral N-Methylmorpholin in 20 ml absol. Dioxan eingetropft. Nach zweistündigen iJachrühren bei Raumtemperatur wird vom Niederschlag abgesaugt und das Piltrat im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigester/Petroläther umkris

(Zersetzung)

d) Rinder-Insulin

äther umkristallisiert. Ausbeute 2.10 g, Schrnp. I¹JO bi3 I'll C

2.8 g des nach a) hergestellten Α-Ketten tetrasulfonats werden in 100 ml 90-proz. Dimethylformamid unter Zugabe von N-Sthyl-rnorpholin auf pH 7.5 gebracht und mit 1.9 g des nach Ic) hergestellten Nitrophenylester gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2.5 g Mono-A-Ketten-tetraaulfonat des 2.5-üia-oxycarbonyl-2.5-dimethyl-n-hexan-mononitrophenolats, Nun nimmt man wieder in 100 ml Dimethylformamid auf gibt 3.0 g des nach Beispiel Ib) hergestellten N^-Boc-B-Kettendisulfonats, 120 mg 1-Hydroxybenzotriazol' und etwas Triäthylamin (bi3 pH 9) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5-35 g.

Das Produkt wird in O.5 Liter Wasser von pH 7.5 aufgenommen. Man 3etzt 50 ml Thioglykol zu, bewahrt 1 Stunde unter Stickstoff auf, erwärmt noch 1 Stunde auf ca. iJO°C, kühlt wieder auf ca. 20⁰C ab und extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigester. Der Essigester wird abgetrennt, der Rest durch einen Stickstoff3trom vertrieben. Dann verdünnt man auf 5 Liter und stellt mit 1 η NaOH auf pH 10.6 rührt 18 Stunden im leichten Luftstrom bei 10⁰C, gibt 1 η HCl bis pH 5.5 zu und lypholisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 5-proz. Ammonacetat (pH 7.5) nach Filtration über eine Säule 4 χ 100 cm Sephadex G-75, fine, Chromatograph! er t. Die Säule ist mit Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak (■I.55 g) erscheint der Insulinpeak (2.7 g). Der Vorpeak wird nach

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BAD ORIGINAL

. .· :· HOE 72/P

J. Am. Chem. "Soc. 9_3 (1971), Seite 3080 mit M-Dithiothreitol in fluss. Ammoniak reduziert und in 1,5 Liter V/asser v/ie oben bei pH 10.6 oxydiert.

Die nach Chromatographie erhaltenen 2,7 g Vernetztes Hohinsulin werden nach Trocknen 2 Stunden in 20 ml Trifluoressigsäure bei 15^GC aufbewahrt. Man fällt mit 200 ml Äther 2.2 g Roh-Insulin aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephadex G-75 wie oben erhält man eine Insulinfraktion, die in üblicher Weise nach Zugabe von ZnCl₃ Und Einstellen des pH auf 5.JJ amorph ausfällt, aber im Verlauf von 1 bis 2 Tagen kristallin wird. Man schleudert vorsichtig von nichtkristallisiertem Material ab, wiederholt die Kristallisation und erhält 1.25 g (21 %, bezogen auf eingesetzte Α-Kette) mit 23 bis 2k I.g./mg.

Beispiel 2 -

Des-(Phe-Val)^B1~²-des-Ala^B3O-/Ala^A12>lM'^l8'²¹J Insulin (Schwein)

a) ZÄla^12il4>l8*²¹J--Insulin~A-Kette~S-tetrasulfonat (Schwein)

Man stellt analog Beispiel 1 a) nach der Pestkörpermethode die Schweine-Insulin-Α-Kette her, wobei als erste Aminosäure (A21) Boc-Ala-OH mit den Hydroxygruppen des Harzes Verestert wird. In den Positionen 18, IM und. 12 werden Boc-Ala-ONp anstelle der in der natürlichen Kette hier stehenden Aminosäuren eingeführt. Der weitere Synthesegang und Aufarbeitung folgt Beispiel la). Ausbeute der Synthese 70 %\ der Sulfitolyse 30?.

b) N°^-Boc-des-(Phe-Val)^B1"²-des-Ala^B50-Insulin-B-Kette-S-disulfonat (Schwein)

Die Rinder-Insulin-B-Kette wird analog Hoppe' Seyler's Z,_; Physiol. Chemie 3M (1967), Seite 1355 und _35_2 (197D_S Seite 419* nach Merrifield (Biochemistry _3 (1964), Seite 1385) ₅ ausgehend von Polystyrolharz mit 1 % Vernetzung, hergestellt. Lysin wird als Boc-Lys(Pht>-OH eingesetzt, alle: weiteren Aminosäuren als Boc-Nitrophenylester, weitere -Carboxylgruppen in den Seiteri-

ketten lagen analog der Vorschrift von Merrifield als Benzy!ester vor, Hydroxygruppen von Serin und Tyrosin als ßenzylather. Die SH-Gruppe des Cysteins wurde durch die S-tert.-Butylmercaptogruppc geschützt (Peptides 1969, ilorth Holland Publishing Comp., Amsterdam 1971, Seite 30). Die Synthese endet Kit Z-Asn-Ol-Jp^{v ;}.

Jeder Konden^ationsschritt wird in Anwesenheit von 1-Hydroxy-benzotriazol analog dem Verfahren der Deutschen Patentanmeldung P 22 02 6I3.7 (HOE'72/F OI6) vorgenommen, um Reaktionsgeschwindigkeit und Spezifität zu steigern.

Nach beendeter Reaktion spaltet,man die B-Kette in bekannter Weise mit Fluorwasserstoff v<
auf die erste Aminosäure Lys

Weise mit Fluorwasserstoff vom Harz ab. Ausbeute 57 %_t bezogen

.B29

3,6 g (1 m Hol) der noch S-geschützten NtL--Pht-B-Kette wird nun in ldo ml Dimethylformamid mit 300 mg (1.2 m Mol) Boc-ONp in Anwesenheit von 135 mg 1-Hydroxybenzotriazol während 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum bis auf ein Restvolumen von 10 ml und Versetzen mit Essigester erhält man 5.5 g der entsprechenden Boc-Srtert.-butylmercapto-N £-Pht-B-Kette.

Zur Abspaltung der Phthaloylgruppe 103t man die Verbindung in 100 ml 80-proz. Phenol und erwärmt nach Zueatz von Ί ml Hydrasinhydrat 16 Stunden auf ¹IO C. Dann fällt man mit 1 Liter Isopropanoläther (1 + 5) 3.3 g der von der Phthaloylgruppe befreiten Verbindung aus. Die überführung ins Disulfonat erfolgt analog Beispiel la). Ausbeute 3,1g.

c) Des-(Phe-Val)^B1~²-des-Ala^B3O-ZÄla^{A12lli<il8i21}7-Insulin (Schwein)

2.8 g des nach a) hergestellten A-Ketten-tetrasulfonats werden in 100 ml 90-proz. Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf pH 7#5 gebracht und mit 2 g de3 nach Ic) hergestellten Nitrophenylesters gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2.6 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des 2,5-Bis-

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¹³ ~ . HOE 72/F 330 -

carbonyl-2,5-dimethyl-n-hexan-mononitrophenolats (87 %). Nun nimmt man wieder in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 3.0 g des nach Beispiel 2b) hergestellten B-Kettendisulfonats, 120 mc 1-Hydroxybenzotriazol und etwas Triäthylamin (bis pH 9) zu und rührt J Std. bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5,3 g.

Das Produkt wird in 0,5 Liter Wasser von pH 7»5 aufgenommen. Man setzt 50 ml Thioglykol zu, bewahrt 1 Stunde unter Stickstoff auf, erwärmt noch 1 Stunde auf ca. ¹IO⁰C, kühlt wieder auf ca. 20°C ab, und extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigester. Der Essigester wird abgetrennt, der Rest durch einen Stickstoffstrom vertrieben. Dann verdünnt man auf 5 Liter und stellt mit 1 η NaOH auf pH 10,6 rührt 18 Stunden im leichten Luftstrom bei 10⁰C, gibt In HCl bis pH 5.5 zu und lyophilisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 5~proz. Ammonacetat (pH 7.5) nach Filtration über eine Säule H χ 100 cm Sephädex G-75, fine, chromatographiert. Die Säule ist mit Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak (1.59 g) erscheint der Insulinpeak (2.59 g) ■· Der Vorpeak wird nach J. Am. Chem. Soc. 91 (1971), Seite 3080 mit Dithiothreitol in flüssigem Ammoniak reduziert und in 1.5 Liter Wasser wie oben bei pH 10.6 oxydiert.

Die nach Chromatographie erhaltene 2.59 g vernetztes Rohinsulinderivat werden nach Trocknen 2 Stunden in 20 ml Trifluoressigsäure bei 15°C aufbewahrt. Man fällt mit 200 ml Äther 2.2g Roh-"Insulin" aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephädex G-75 wie oben erhält man eine ^!lInsulin"-fraktion von 1.56 g. (2-6 £}, bezogen auf eingesetzte Α-Kette mit ca. 20 I.E./mg.

Beispiel 3

Bl
Des-Phenylalanin -Insulin (Rind)

a) A-Kette-S-tetrasulfonat (Rind)

.'»09 8 197-112t

- l'< - HOE72/F 330

Die Verbindung wird analog Z. Naturforschung 2/Ib (I969), Seiten II27 bis 1139, mit den in Hoppe Seyler's Z.Physiol. Chem. 352 (I97I), Seite 2, beschriebenen Verbesserungen hergestellt. Die Abspaltung der Schutzgruppen, auch der S~Trity!gruppen, erfolgt durch Lösen des Peptids in Trifluoressigsäure und Eingießen in Wasser nach 1 Stunde. Nach Filtration und Extraktion nit Äther wird gefriergetrocknet und analog Z. Naturforschung 24b (1969), Seite II38 ins S-Tetrasulfonat überführt.

b) N^o6-Boc-des-Phe¹-B-Kette-S-disuronat (Rind)

Synthese der B-Kette analog nach Beispiel Ib). Die Synthese endet nach Aufknüpfen von Boc-Val.

Nach beendeter Synthese spaltet man die B-Kette in bekannter Weise mit Flurowasserstoff vom Harz ab. Ausbeute 55 %, bezogen auf die erste Aminosäure AIa . 3,6 g (1 in Mol) der noch S-geschützten N£~Pht-B-Kette wird nun in 100 ml Dimethylformamid mit 300 mg (1.2 m Mol) Boc-OMp in Anwesenheit von 135 mg 1-Hydroxybenzotriazol während 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Abdestiliieren des Lösungsmittels im Vakuum bis auf ein Restvolurr.en von 10 ml und Versetzen mit Essigester erhält man 3,5 g N -Boc-S-tert.-buty1-roercapto-N^ -Pht-B-Kette.

Zur Abspaltung der Phthaloylgruppe löst man die Verbindung in 100 ml 80-proz. Phenol und erwärmt nach Zueatz von H ml Hydrazinhydrat 16 Stunden auf 40⁰C. Dann fällt man mit 1 Liter Isopropanol/ Äther (1 + 5) 3.3 g der von der Phthaloylgruppe befreiten Verbindung aus: Überführung ins Disulfonat analog Beispiel la). Ausbeute 3.0 g.

c) Des-Phe^B1-Insulin (Rind)

2.8 g des nach a) hergestellten A-Ketten-tetrasulfonats werden in 100 ml 90-proz. Dimethylformamid unter Zugabe von H-Kthylmorpholin auf pH 7,5 gebracht und mit 2 g des nach Beispiel Ic) hergestellten Nitrophenylesters gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Esaigester gefällt. Man erhält 2,65 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat

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ί BAD ORIGINAL

■ - 15 - .

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des 2,5-Bis-0xycarbonyl-2,5-dimethyl-n-hexan-mononitrophenolatG . Nun nimmt man wieder in 100 ml Dimethylfonainid auf, gibt 3.0 nach Beispiel 3 b) hergestellten rP^-Boc-Des-Phe·-B-Kettendisulfonats, 120 mg 1-Hydroxybenzotriazol und wenig Triethylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5.42 ε.

Bas Produkt wird in 0,5 Liter Wasser von pH 7.5 aufgenommen. Man . setzt 50 ml Thioglykol zu, bewahrt 1 Stunde unter Stickstoff auf, erwärmt noch 1 Stunde auf ca. ^0⁰C, kühlt wieder auf ca. 20°C ab und extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigester. Der Essigester wird abgetrennt, der Rest durch einen Stickstoffstrom vertrieben. Dann verdünnt man auf 5 Liter und stellt mit 1 η NaOH auf pH 10.6, rührt 18 Stunden im leichten Luftstrom bei 10⁰C, gibt 1 η HCl bis pH 5-5 zu und lyophilisiert. .

Der Rückstand wird in 50 ml 5-pros. Ammönacetat (pH 7.5) nach Filtration über eine Säule ¹J χ 100 cm Sephadex G-75, fine, chromatographiert. Die Säule ist mit Insulin geeicht. Nach einem Vorpeak (i»55 ß) erscheint der Insulinpeak (2.52 g). Der Vorpeak wird nach J.Am.Chem. Soc. 9j5 (1971), Seite 3080 mit Dithiothreitol in flüssigem Ammoniak reduziert und in 1,5 Liter Wasser wie oben bei

pH 10.6 oxydiert. Die nach Chromatographie erhaltenen 2.52 g veröl
netztes rohes Des-Phe -insulin werden nach Trocknen 2 Std. in 20 ml Trifluoressigsäure bei 15°C aufbewahrt. Man fällt mit 200 ml Äther 2.28 g Roh-"Insulin" aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephadex G-75 wie oben erhält man eine Insulinfraktion, die in üblicher Weise nach Zugabe von ZnCl^ und Einstellen des pH auf 5Λ amorph ausfällt, aber im Verlauf von 1 bis 2 Tagen kristallin wird. Man schleudert vorsichtig von nichtkristallisiertein Material ab, wiederholt die Kristallisation und erhält 1.18, g Des-Phe -Insulin (Rin<
mit 23 bis 2h I.E./mg.

Beispiel M

Bl-Acetyl-Insulin (Schwein)

Bl
Des-Phe -Insulin (Rind) (20 %., bezogen auf eingesetzte A-Kette)

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BAD OBlGIHAl

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a) A-Kette-S-tetrasulfonat (Schwein)

Die Herstellung erfolgt analog Beispiel la) unter Berücksichtigung des Aminosäuresequenz der Schweine-Insulin-A-Kette ι Ausbeute der Synthese 68 %_y der Sulfitolyse 32 %.

b) Bl-Acetyl-B-Kette-S-disulfonat

Die Synthese der Kette erfolgt analog Beispiel Ib), man setzt jedoch Lys als Z(Cl)

Boc-Lys-ONp
und Phe^B1 als N-Acetyl-Phe-ONp ein.

; ■

Nach beendeter Synthese spaltet man die B-Kette in bekannter Weise mit Fluorwasserstoff vom Harz ab. Ausbeute 59 %₃ bezogen auf die erste Aminosäure AIa ^J . Die überführung ins Disulfonat erfolgt analog Beispiel la).

c) Bl-Acetyl-Insulin (Schwein)

2.8 g des nach a) hergestellten A-Ketten-tetrasulfonats werden in 100 ml 90-proz. Dimethylformamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf pH 7.5 gebracht und mit 1.8 g des nach Ic) hergestellten Nitrophenyle3ters gerührt. Nach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2,6 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des 2,5-Bisoxycarbonyl-2,5-dimethyl-n-hexan-mononitrophenolats. Nun nimmt man wieder in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 3.0 g des nach b) hergestellten N-Acetyl-B-Ketten-disulfonats, 120 mg 1-Hydroxybenzotriazol und wenig Triethylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5.^5 g.

Das Produkt wird in 0.5 Liter Wasser von pH 7.5 aufgenommen. Man setzt 50 ml Thioglykol zu, bewahrt 1 Stunde unter Stickstoff auf, erwärmt noch 1 Stunde auf ca. 'JO⁰C, kühlt wieder auf ca. 20°C ab und extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigester. Der Essigester

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' "- HOE 72/F 33Q

wird abgetrennt, der Rest durch einen Stickstoffstrom vertrieben. Dann verdünnt man auf 5 Liter und stellt mit 1 η NaQH auf pH 10,6, rührt 18. Stunden im leichten. Luftstrom bei 10⁰C₁ gibt 1 η HCl bis pH 5,5 zu und lyophilisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 5-proz_. Ammonacetat (pH. 7,5) nach Filtration.über eine· Säule ¹I χ 100 cm Sephadex G-75» fine, chroinatographiert. Die Säule ist'mit Insulin, geeicht. Nach einem Vorpeak (1.55 6) erscheint der Insulinpeak. (2.75 &)· Der Vorpeak wird nach J.Amer, Chem. Soc. 35 (1971), Seite 3080 mit Dithiothreitol in flüssigem Ammoniak reduziert und in 1.5 Liter Wasser wie oben bei pH 10.6 oxydiert. .

Die nach Chromatographie erhaltenen 2,75 g vernetztes Rohinsulin werden 2 Stunden in 20 ml Trifluoressigsäure bei 15⁰C aufbewahrt. Man fällt mit 200 ml Äther- 2.0 g Roh-Insulin -aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephadex G-75 wie oben erhält man eine Insulinfraktion, die in üblicher Weise nach Zugabe von ZJiCl₂ und Einstellen des pH auf 5.4 amorph ausfällt, aber im Verlauf von einigen Tagen kristallin wird. Man schleudert vorsichtig von nichtkrisfcallisiertem Material ab, wiederholt die Kristallisation und erhält 1,05 g (17 %), bezogen auf eingesetzte Α-Kette mit 22 bis 2k I.E./mg.

Beispiel 5 , '

Human-Insulin

a) A-Kette-S-tetrasulfonat (human) > _

Herstellung analog den Beispielen 1 a und 4 a. Ausbeute der Synthese 55 %» der Sulfitolyse 3.3 %.

b) N^-Boc-B-Kette-S-disulfonat (human)

Synthese analog Beispiel Ib). Als erste Aminosäure wird jedoch

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- .18 -

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Boc-Thr-OH mit den Hydroxygruppen de3 Harzes verer.tert. Aucbeute 62 Jf,

Nach beendeter Reaktion spaltet man die 3-Kette in bekannter Weise mit Fluorwasserstoff vom Harz ab. Ausbeute 58 %, bezogen auf die erste Aminosäure Thr . 3.6 c (1 ^m Mol) der noch S-geschiltzten N^-Pht-B-Kette wurde nun in 100 ml Dimethylformamid mit 370 ng (1,2 in Mol) Boe-ONp in Anwesenheit von 135 rng 1-Hydroxybenzotriazol während 1 Stunde bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum bis auf ein Hestvoluneri von 10 ml und Versetzen mit Essigester erhält nan 3,5 g Doc-S-tert.-butylmercapto-N -Pht-B-Kette.

Zur Abspaltung der Phthaloy!gruppe löste man die Verbindung in 100 ml βθ-proz. Phenol und erwärmt nach Zusatz von h ml Hydrazinhydrat 16 Stunden auf ^0⁰C. Dann fällt man mit 1 Liter Isopropanol/ Äther (1+5) 3·3 g der von der Phthaloy!gruppe befreiten Verbindung aus: überführung ins Disulfonat analog Beispiel 1 a) Ausbeute 3.0 g

c) Human-InsuIiη

2.8 g des nach* a) hergestellen A-Ketten-tetrasulfonats werden in 100 ml 90-proz. Dimethylformamid unter Zugabe von N-Athylmorpholin auf pH 7.5 gebracht und mit 1.8 g des nach Beispiel 1 c) hergestellen Nitrophenylesters gerührt. Mach 20 Stunden wird mit Easigester gefällt. Man erhält 2.6 g Mono-A-Ketten-tetrasulfonat des 2,5-Bis-Oxyearbonyl-2,S-dimethyl-n-hexan-mononitrophenolata. Nun nimmt man wieder in 100 ml Dimethylformamid auf gibt 3.0 g des nach Beispiel Ib) hergestellten iP^-Boc-B-Ketten-disulfonats, 120 mg 1-Hydroxybenzotriazol und etwas Triäthylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Stunde bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5>58 g.

Das Produkt wird in 0.5 Liter V/asser von pH 7.5 aufgenommen. Man setzt i>0 ml Thioglykol zu, bewahrt 1 Stunde unter Stickstoff auf, erwärmt noch 1 Stunde auf ca. ¹JO⁰C, kühlt wieder auf ca. 20 C ab und extrahiert zweimal mit je 300 ml Essigester. Der Easigester wird abgetrennt, der Rest durch einen Stickstoff3trom vertrieben.

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Dann verdünnt man auf 5 Liter und stellt mit 1 η NaOH auf pH 10.G, rührt 18 Stunden im leichten
pH 5·5 zu und lyophilisiert.

rührt 18 Stunden im leichten Luftstrom bei 10⁰C, gibt 1 η HCl bis

Der Rückstand wird in 50 ml 5~proz. Ammonacetat (pH.7,5) nach Filtration über eine Säule M χ 100 cm Sephadex G-75, fine, chromatographiert. Die Säule ist mit Insulin- geeicht. Mach einen Vorpeak (1.6 g) erscheint der Insulinpeak (2.M5 g) nach Eindampfen im Vak.. Der Vorpeak wird nach J. Amer. Chem. Soc. 9_3 (1971), Seite 3O8O mit Dithiothreitol in flüssigem Ammon&k reduziert und in 1.5 Liter Wasser wie oben bei pH 10.6 oxydiert.

Die nach Chromatographie erhaltenen 2.^5 g Rohinsulin-Derivat werden, nach Trocknen 2 Stunden in 20 ml Trifluoressigsäure bei 15⁰C aufbewahrt. Man fallt mit 200 ml Äther 2.25 g Roh-Insulin aus. Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephadex G-75 wie oben erhält man eine Insulinfraktion, die in üblicher Weise nach Zugabe von ZnCl„ und Einstellen des pH auf 5.¹J amorph ausfällt, aber im Verlauf von 1 bis 2 Tagen kristallin wird. Man schleudert vorsichtig von nichtkristallisiertem Material ab, wiederholt die Kristallisation und erhält 1.22 g (20 %) bezogen auf eingesetzte Α-Kette mit 23> bis 2k I*E./mg.

Beispiel 6

Bl-Acetyl-Human-Insulin

a) S-Tetra-tert.-butylmer.capto-A-Kette (human) .

Herstellung der geschützten Α-Kette analog Beispiel la). Die S-Schutzgruppen werden jedoch nicht abgespalten. Ausbeute 62 %.

b) N-Acetyl~S-di-tert.-butylmercapto-B-Kette (human)

Herstellung der B-Kette analog Beispiel Mb) unter Berücksichtigung der Aminosäuresequenz wie bei Beispiel 5b). Die überführung ins Sulfonat entfällt (Ausbeute 6Mi).

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c) Bl-Acetyl-Human-Insulin

2.8 g des nach a) hergestellten A-Ketten-derivats werden in 100 ml 90-proz. Dimethyli'ormamid unter Zugabe von N-Äthylmorpholin auf
pH 7·5 gebracht und mit 1.8g des nach Beispiel 1 c) hergestellten Nitrophenylesters gerührt, flach 20 Stunden wird mit Essigester gefällt. Man erhält 2.6 g geschütztes Mono-A-Ketten-2,5-bisoxycarbonyl~2,5-dimethyl-n-hexan-mononitrophenolat. Nun nimmt man
wieder in 100 ml Dimethylformamid auf, gibt 2.9 g des nach b)
hergestellten N -Acetyl-B-Ketten-derivats, 120 mg 1-Hydroxybenzotriazol und etwas Triäthylamin (bis pH 9) zu und rührt 1 Stunde
bei Raumtemperatur. Dann wird mit Essigester gefällt. Ausbeute 5.22 g.

Das Produkt wird analog J. Amer. Chem. Soc. £3 (1971), Seite 3080, in 1 Liter flüssigem Ammoniak gelöst. Man gibt 15 g Dithiothreitol zu und rührt 1 Stunde bei -33 C. Dann wird Ammoniak verdampft, der Rückstand mit Essigester extrahiert. Kun löst man den Rückstand
in 5 Liter Wasser und 3tellt mit 1 η NaOH auf pH 10.6, rührt
18 Stunden im leichten Luftstrom bei 10⁰C, gibt 1 η HCl bis pH 5.5 zu und lyophilisiert.

Der Rückstand wird in 50 ml 5-proz. Ammonacetat (pH 7.5) nach
Filtration über eine Säule ¹J χ 100 cm Sephadex G-75, fine, chromatographiert. Die Säule ist mit Insulin glicht. Nach einem Vorpeak
(1.8 g) erscheint der Insulinpeak (2.3 g). Der Vorpeak wird wie
oben mit Dithiothreitol in flüssigem Ammoniak reduziert und in
1.5 Liter Wasser bei pH 10.6 oxydiert.

Die nach Chromatographie erhaltenen 2.3 g Rohinsulin werden

nach Trocknen 2 Stunden in 20 ml Trifluoressigsäure bei

15°C aufbewahrt. Man fällt mit 200 ml Äther 2.16 g Rohinsulin aus.

Nach erneuter Reinigung durch Chromatographie über Sephadex G-75 wie oben erhält man eine Insulinfraktion, die in üblicher Weise nach

Zugabe von ZnCl„ und Einstellen des pH auf 5.4 amorph ausfällt,

aber im Verlauf von 1 bis 2 Tagen kristallin wird. Man schleudert

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BAD ORIGINAL

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vorsichtig von nichtkristallisiertem Material ab j wiederholt die Kristallisation und erhält 1.06 g (18 %), bezogen auf eingesetzte Α-Kette, Bl-Acetyl-Human-Insulin mit 23 bis 2'i I.E./rag.

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Claims

Patentansprüche

I. Verfahren zur Herstellung von Insulin, Insulin-Analogen und -Derivaten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß nan eine Verbindung der allgemeinen Formel I

Γ η 0 CO Α-Kette O=C- SX
I B-Kette Y-

in der X Wasserstoff oder eine S-Schutzgruppe und Y Wasserstoff, einen Alkanoylrest mit 1 bis ¹J C-Atomen, einen Phenyl-alkanoy 1-reet mit 1 bis 3 C-Atomen im Alkanoylteil, Benzoyl oder einen Alkyl-oxycarbonyl- bzw. Aralkyl-oxycarboxylrest, wobei der Alkylteil 1 bis ¹J C-Atome enthält, einen Amino-acylrest, der sich von den natürlich vorkommenden^ - oder ß-Aminos'iuren oder gegebenenfalls deren D-Enantiomeren ableitet, oder Acyl-aminoacy 1-rest bedeutet und R einen Rest der allgemeinen Formel II

?^H3 S¹¹J

■C-<CH₂)_n-f-

CH.

daretellt, in der η für 2 bis 4 steht, durch Abspaltung von X und Dehydrierung in eine Verbindung der allgemeinen Formel III

R I B-Kette O CO- 1 S
S A-Kette O=C- IQIy φ »-I

III

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überführt, in der Y und R die obengenannte Bedeutung besitzen, und aus dieser Verbindung die -CO-O-R-O-CO- Brücke durch Behandeln mit einer Säure, z.B. Trifluoressigsäure herausspaltet.

2. Verbindungen der allgemeinen Formel I, in der R₅X und Y die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.
3. Verbindungen der allgemeinen Formel III, in der R und Y die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.

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