CN118147373A - 甲型流感病毒h1n1、h3n2、h5n1与h7n9的联合检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1与H7N9的联合检测试剂盒，所述的H1N1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的H3N2的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的H5N1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的H7N9的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。本发明所述的甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1与H7N9的联合检测试剂盒针对不同亚型的sgRNA，sgRNA均通过次优PAM设计。有效提高了CRISPR/Cas12a在检测甲型流感病毒时的特异性，并可以在1小时内完成甲型流感病毒的核酸检测。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测领域，尤其是涉及一种甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1与H7N9的联合检测试剂盒。
背景技术
甲型流感病毒是人类流感监测和临床诊断关注的重点病毒。目前已知的甲型流感病毒亚型有18种H亚型和11种N亚型，因此一共有198种不同的甲型流感病毒。其中，对人类健康具有重要影响的主要是H1N1、H3N2、H5N1和H7N9四种亚型。其中H1、H5、H7亚型为高致病性，H1N1、H5N1、H7N9尤为值得关注。
甲型流感病毒的检测方法主要包括血清学和核酸检测，血清学方法主要用标准血清对分离到的病毒株进行抗原分型，耗时费力，不适合临床快速分型诊断。目前核酸检测方法主要包括普通 PCR 法、Real-time PCR 法和环等温扩增 (LAMP) 法等。Real-time PCR法和 LAMP 法具有很好的特异性和敏感性，但前者依赖昂贵的仪器和试剂，而后者法难以实现多重检测。相比之下，普通 PCR 敏感性较差且需要琼脂糖电泳进行结果判定，不适合大规模标本的检测。因此，需要建立快速敏感、不依赖于昂贵仪器的甲型流感核酸检测方法，以提高流感监测和临床诊断水平。
CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPRs)是细菌中一种适应性免疫***，Cas蛋白通过RNA引导的核酸酶靶向降解外来核酸。CRISPR***已经超越了其以往的基因编辑应用，在过去的五年中，CRISPR***因其固有的灵敏性、特异性、灵活性和简单性而被重新调整用途，目前已被用于核酸检测和体外诊断。其中，CRISPR-Cas12a属于Cas酶第二家族，用来引导RNA指导双链DNA裂解单个RuvC催化结构域。这一过程中所涉及到两种方式的剪切，其一称为正式剪切(cis-cleavage)，即通过CRISPR RNA(sgRNA)与靶标DNA(单链DNA或双链DNA)配对后，激活Cas12a的剪切活性完成对靶标的剪切；另一种方式为Cas12a的反式剪切(trans-cleavage)，即激活的Cas12a还可以剪切其周围溶液中的非目标单链DNA(ssDNA)。
侧向流动试纸(lateral flow dipstick，LFD)作为一种能够快速、方便、简单、无需专业人员和大型仪器设备操作的一种检测核酸的即时检测(Point-of-Care Testing，POCT)方法，已经在临床诊断、环境监测和食品安全等领域得到了广泛的应用研究，LFD可作为资源匮乏的场景下一种理想的读数方式。
主流感染亚型的甲型流感病毒的保守区较短，并且存在多种点突变。传统CRISPR检测方案一般只含有一条sgRNA，可检测范围较为单一，无法满足多种亚型甲型流感病毒的检测.针对主流感染的多种亚型的甲流检测，需要开发新的CRISPR检测方案。
分子POCT核酸检测省去了诸多分区标本处理和大型仪器设备检测的步骤，也简化了数据处理等繁琐过程，可直接快速地得到可靠的结果用于指导患者治疗，从而无论在重大公共卫生事件紧急应对，还是院内感染诊治和管理中，都有为精准治疗和科学防控提供重要技术支撑和保障的前景。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1与H7N9的联合检测试剂盒。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种甲型流感病毒的CRISPR/Cas12a检测***，该***包括特异性sgRNA组、CRISPR/Cas12a蛋白和报告分子；
所述的特异性sgRNA组包括H1N1的sgRNA、H3N2的sgRNA、H5N1的sgRNA与H7N9的sgRNA；
所述的H1N1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的H3N2的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的H5N1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的H7N9的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
通过数据库比对分析甲型流感病毒多个亚型的通用序列，在保守区域设计了通用型检测的RPA引物对，根据分析不同亚型的差异设计相对应的CRISPR/Cas12a sgRNA组合。sgRNA的设计 采用非规范性结构PAM的方式获得sgRNA序列，同时针对不同亚型病毒设计突变位点，拓宽CRISPR方法应用的范围。当sgRNA组合和Cas12a结合形成核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)时，对靶标以及报告基团进行剪切，通过报告基团产生的信号变化可以判断是否有病毒的检出。这一方法可准确、特异、灵敏的快速检测甲型流感病毒，并具有所需设备轻巧便携、使用方便等特点，可以广泛用于多亚型甲型流感病毒的快速检测。
所述的特异性sgRNA组的制备方法，包括如下步骤：筛选能特异性甲型流感病毒保守序列设计RPA扩增引物并对甲型流感病毒靶标进行扩增，得到扩增产物；在扩增产物区域内，根据CRISPR/Cas12a***中sgRNA的设计原则，分析每个亚型的基因，设计出能够特异性识别甲型流感病毒不同亚型靶标的sgRNA，然后合成sgRNA。
进一步，所述的特异性sgRNA组中的sgRNA均采用次优PAM设计；所述的次优PAM为VTTV、TCTV、TTVV、TRTV、TTNT或YYYN中的至少一种。
进一步，所述的报告分子包括单链ssDNA或双链dsDNA中的至少一种。
进一步，所述的CRISPR/Cas12a为LbCas12a蛋白。
进一步，标记在所述的报告分子上的基团包括荧光基团与淬灭基团或基于试纸条方式检测的基团中的至少一种。所述的基团为官能团、分子或微纳米粒子中的任一种。
所述的甲型流感病毒的CRISPR/Cas12a检测***的构建方法，具体包括如下步骤：
（1）选取甲型流感病毒通用保守序列： H1N1、H3N2、H5N1、H7N9；
（2）设计RPA引物：选择通用型的保守区域，设计引物，可满足不同亚型的扩增需求；
（3）针对待测基因保守序列或其扩增产物，设计与之特异性结合的sgRNA(为防止个别sgRNA不工作或效率低)，并设计了突变型sgRNA，放入同一体系进行反应，兼顾了SGISPR/Cas12a体系中sgRNA的设计原则(目标区域上游需要TTTN的PAM区)；sgRNA识别靶标基因特定的序列后可以激活Cas12a的正切和反切能力；
（4）设计报告基团，根据检测方选取不同基团修饰的报告分子；
所述的报告分子为短的单链DNA(ssDNA)为进行荧光检测或者短的双链DNA（dsDNA）；若是通过荧光检测时，将报告分子采用FQ探针，例如5'-FAM和3'-BHQ1；通过试纸条(LFD)检测时，根据试纸条上修饰的基团设计与之对应的基团进行检测，如将报告分子修饰生物素与FAM基团，与试纸条上的链霉亲和素和FAM的抗体分别结合等；
（5）信号检测：通过荧光检测时，基于CRISPR-Cas12a的sgRNA对靶标进行识别后激活Cas12a并剪切报告分子，然后利用荧光检测设备或试纸条进行读数，实时检测结果。通过LFD检测时，观察试纸条显色或者消线，对结果进行定性判读。
一种包含所述的检测***的甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1与H7N9的联合检测试剂盒，所述的试剂盒还包括特异性引物与探针。
进一步，所述的特异性引物包括上游引物与下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步，所述的探针的核苷酸序列为TTATTATT。
一种所述的检测***的非规范性结构PAM的sgRNA设计方法，所述的sgRNA设计方法采用次优PAM设计；
所述的次优PAM为VTTV、TCTV、TTVV、TRTV、TTNT或YYYN中的至少一种。
一种使用所述的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
步骤1是从待测样本中提取核酸；
步骤2是利用等温扩增引物扩增待测样品中提取出的核酸，得到特异性产物；
步骤3是将所述的特异性产物加入到所述的CRISPR/Cas12a检测***中，于37-43℃反应10-30min；
步骤4是利用荧光检测法或侧向流动试纸条检测样品中甲型流感病毒核酸。
在使用荧光定量分析仪检测时：当CRISPR/Cas12a检测***中存在甲型流感病毒基因时，在特异性sgRNA介导下激活CRISPR/Cas12a的核酸内切酶活性。激活后的CRISPR/Cas12a会切割由荧光基团和淬灭基团标记的ssDNA或dsDNA报告分子，从而使荧光基团释放出荧光，荧光分析仪可以检测到较强的荧光值。相对应的，待检测样品中不存在甲型流感病毒基因序列时，荧光读数显示为基底值。
在使用侧向流动试纸条检测时：采用生物素与FAM或地高辛等为标记物，标记在检测探针的两端，以抗FAM抗体作为检测线（T线）包被在硝酸纤维素膜上，以链霉亲和素抗体作为质控线（C线）包被在硝酸纤维素膜上；采用胶体金标记链霉亲和素，结合探针一端的标记物生物素，当结合的探针-金标蛋白复合物层析到质控线时，可被C线包被的链霉亲和素抗体截留，金粒子富集显色；
当反应体系中的探针层析到T线时，探针一端标记的FAM与预先包被的抗-FAM抗体发生抗原抗体的特异性反应，截留在检测线（T）上，探针另一端的生物素与金标链霉亲和素（SA）结合，同时会一起截留在检测T线上，则SA上标记的金粒子富集显色，此时T线、C线同时显色。当反应启动时，由于检测探针会发生切割，一条探针被剪开后，则两端的标记物发生分离变成游离状态，分开后FAM抗体继续结合3’端的FAM，而缺少另一端生物素标签，使得可富集的金标SA减少，T线颜色降低，剪切越多，断裂的探针越多，可截留在T线上的完整探针越少，T线颜色越浅甚至消线。
相对于现有技术，本发明具有以下优势：
本发明所述的甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1与H7N9的联合检测试剂盒针对不同亚型的sgRNA，有效提高了CRISPR/Cas12a在检测甲型流感病毒时的特异性，并可以在1小时内完成甲型流感病毒的核酸检测。
附图说明
图1为本发明实施例1所述的甲型流感病毒阳性参考品及阴性参考品及阴性参考品荧光检测结果（采用规范性设计原则设计的sgRNA）；
图2为本发明实施例1所述的甲型流感病毒阳性参考品及阴性参考品及阴性参考品荧光检测结果（采用非规范性设计原则设计的sgRNA）；
图3为本发明实施例2所述的甲型流感病毒阳性参考品及阴性参考品经消线法侧流层析胶体金试纸检测结果（采用规范性设计原则设计的sgRNA）；
图4为本发明实施例2所述的甲型流感病毒阳性参考品及阴性参考品经消线法侧流层析胶体金试纸检测结果（采用非规范性设计原则设计的sgRNA）。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明。
实施例1 构建用于甲型流感病毒核酸检测的CRISPR/Cas12a荧光检测***
1、RPA引物设计根据RPA引物设计原则，为H1N1、H3N2、H5N1、H7N9 4个亚型查询通用的保守区域。将引物3’端做甲氧基修饰，降低在样本反应中的引物非特异性扩增消耗。
为了验证并选择出最适合的引物序列，使用RPA试剂盒对4种亚型进行扩增，对扩增产物进行凝胶电泳分析。
2、特异性sgRNA设计与制备
将靶标核酸进行RPA扩增后，采取CRISPR技术对靶标进行检测。利用CRISPR/Cas12a***在sgRNA与靶标配对后可以激活其反式剪切的活性，将荧光和淬灭基团双标记的报告分子进行剪切，从而释放出强荧光实现检测。
本发明对4种甲型流感病毒靶标序列的保守序列设计了一系列sgRNA。设计基本原则为：含有最优PAM序列TTTN；PAM序列后的20个核苷酸不含有AAA，综合考虑RPA引物的位置与sgRNA所在的区域，确保扩增的产物中有sgRNA对应识别的序列。此外，针对不同的亚型，根据非规范性设计原则，设计次优PAM序列，如VTTV、TCTV和TTVV以及部分TRTV、TTNT和YYYN等，对比测试，确保多条sgRNA在同一体系中，无互相之间的交叉干扰，提高反应的灵敏度。根据以上原则，针对H1N1、H3N2、H5N1、H7N9甲型流感病毒设计了以下sgRNA序列。通过实验验证所设计的sgRNA是否可以与Cas12a结合形成复合物，之后剪切靶标及报告分子，且与其他sgRNA无干扰。证明设计的非规范性sgRNA可以与Cas12a结合形成复合物，完成目的基因的检测，且互相之间无交叉反应。
3、CRISPR/Cas12a检测***的灵敏度测试
建立对单一靶标的检测体系，为了测试检测体系对于已提取的病毒培养物的灵敏度，对单一靶标RNA(H1N1、H3N2、H5N1、H7N9)被稀释到100000cp/ml、10000cp/ml、1000cp/ml分别并进行测试。将Cas12a，sgRNA和缓冲液混合，将靶标RNA或缓冲液(1-10μL)和FAM-TTATTATT-BHQ1加入体系中形成50μL反应溶液，在37-43℃下孵育10-30分钟，用荧光光谱仪测得荧光值。
4、RPA-LFD快速高灵敏检测甲型流感病毒
将甲流四个亚型（H1N1、H3N2、H5N1、H7N9）靶标序列同时进行扩增。分别将靶标RNA稀释到100000cp/ml、10000cp/ml、1000cp/ml，并进行测试。RPA扩增反应液由引物、和模板RNA和ddH2O组成，将上述反应液加入到RT-RPA酶反应管中，在盖上加MgOAc，离心后在37-43℃下孵育10-30分钟。将靶标RNA进行RT-RPA扩增后，将产物放入CRISPR/Cas12a反应管中，同时加入四种靶标的sgRNA，在37-43℃下孵育10-30分钟，采用荧光光谱仪测定荧光强度。
将不同亚型的sgRNA混合放置于同一反应体系，同时对比最优PAM设计的sgRNA复合物与次优PAM设计的sgRNA复合物对四种亚型病毒同时检测的测试效果。可见FAM荧光通道处的荧光值随着浓度的增加而增强，采用不同亚型的病毒培养物测试，均能得到与单一亚型检测的结果，可证明组合式sgRNA不受混合体系的影响，可同时检出多种甲流型别，且灵敏度均可达到1000cp/ml。
建立对单一靶标的检测体系，为了测试试纸检测体系对于已提取的病毒培养物的灵敏度，对单一靶标RNA(H1N1、H3N2、H5N1、H7N9)被稀释到100000cp/ml、10000cp/ml、1000cp/ml分别进行扩增测试。取RPA反应产物，将Cas12a，sgRNA和缓冲液混合，将靶标RNA或缓冲液和FAM-TTATTATT-Biotin加入体系中形成20μL反应溶液，在37-43℃下孵育10-30分钟，将反应产物用样本稀释液稀释后滴加入试纸条加样孔中，以检测T线消线或明显浅于质控C线为阳性，检测结果灵敏度可达到1000 cp/ml。
5、荧光型乙型流感病毒核酸检测
5.1 实验材料：混合型甲型流感病毒培养物（H1N1、H3N2、H5N1、H7N9）（RNA:100000cp/ml、10000cp/ml、1000cp/ml）；RT-RPA试剂，Cas12a蛋白；醋酸镁激活剂（MgOAc，100-500µM）；引物及sgRNA如表1-2所示（表1为常规设计引物与常规设计sgRNA，表2为采用非规范性原则针对各个亚型设计含有次优PAM的sgRNA）。
表1 常规设计引物与常规设计sgRNA
表2 非规范性原则针对各个亚型设计含有次优PAM的sgRNA
5.2 实验方法：按表3-4预混液配制RPA反应体系与CRISPR反应体系。
表3 RPA反应体系
表4 CRISPR反应体系
等温扩增试剂前期添加后混匀，将反应管放入恒温荧光仪37-43℃中孵育10-30分钟，然后将反应扩增产物添加到CRISPR反应液内，反应10-30分钟每分钟采集2次荧光信号。
5.3 实验结果：
针对不同亚型，采用规范性设计原则设计含最优PAM的sgRNA的结果如图1所示，通过荧光法检测，荧光信号成直线型而非曲线，代表检测出现非正常结果。判断几种sgRNA存在相互干扰，无法完成多亚型在同一体系中被同时检测。
针对不同亚型，采用非规范性设计原则设计含次优PAM的sgRNA的结果如图2所示，结果表明，荧光信号成曲线，结果可被正常判读。证明本发明可以同时有效检出多种亚型的甲流病毒RNA，结果证明了采用次优PAM设计的sgRNA，几种sgRNA之间无相互干扰，该sgRNA组合优于规范性设计的sgRNA组合。并且检测下限低至1000copy/ml。
实施例2 构建用于甲型流感病毒核酸检测的CRISPR/Cas12a胶体金试纸检测***
1、实验材料：混合型甲型流感病毒培养物（H1N1、H3N2、H5N1、H7N9）核酸标准物质（RNA: 100000cp/ml、10000cp/ml、1000cp/ml）；RT-RPA试剂，Cas12a蛋白；醋酸镁激活剂（MgOAc，100-500µM）；引物及sgRNA，如表5-6所示（表5为常规设计引物与常规设计sgRNA，表6为采用非规范性原则针对各个亚型设计含有次优PAM的sgRNA），核酸侧流层析胶体金试纸。
表5 常规设计引物与常规设计sgRNA
表6 非规范性原则针对各个亚型设计含有次优PAM的sgRNA
2、实验方法：按表7-8预混液配制RPA反应体系与CRISPR反应体系。
表7 RPA反应体系
表8 CRISPR反应体系
等温扩增试剂前期添加后混匀，将反应管放入恒温荧光仪37-43℃中孵育10-30分钟，然后将反应扩增产物添加到CRISPR反应液内，放入恒温荧光仪37-43℃中孵育10-30分钟，将反应产物按1:4与稀释液充分混匀加入到侧流层析胶体金试纸加样孔中，静置3-15分钟肉眼观察并拍照记录结果。
3、实验结果：
针对不同亚型，采用规范性设计原则设计含最优PAM的sgRNA的结果如图3所示，阳性样本无法消线，证明该方案无法检测阳性样本。通过试纸条检测结果同样证明基于规范设计的sgRNA组合可能存在相互干扰，影响CRISPR检测反应，无法完成多亚型在同一体系中的检测。
针对不同亚型，采用非规范性设计原则设计含次优PAM的sgRNA组合的检测结果如图4所示，通过试纸条检测可以检测1000cp/ml的多亚型甲型流感核酸；当核酸浓度大于10000copy/ml时可以完全消线；采用次优PAM设计的sgRNA组合，可以有效检出多亚型甲型流感病毒。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种甲型流感病毒的CRISPR/Cas12a检测***，其特征在于：该***包括特异性sgRNA组、CRISPR/Cas12a蛋白和报告分子；
所述的特异性sgRNA组包括H1N1的sgRNA、H3N2的sgRNA、H5N1的sgRNA与H7N9的sgRNA；
所述的H1N1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的H3N2的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述的H5N1的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的H7N9的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的甲型流感病毒的CRISPR/Cas12a检测***，其特征在于：所述的特异性sgRNA组中的sgRNA均采用次优PAM设计；所述的次优PAM为VTTV、TCTV、TTVV、TRTV、TTNT或YYYN中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的甲型流感病毒的CRISPR/Cas12a检测***，其特征在于：所述的报告分子包括单链ssDNA或双链dsDNA中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的甲型流感病毒的CRISPR/Cas12a检测***，其特征在于：所述的CRISPR/Cas12a为LbCas12a蛋白。
5.根据权利要求1所述的甲型流感病毒的CRISPR/Cas12a检测***，其特征在于：标记在所述的报告分子上的基团包括荧光基团与淬灭基团或基于试纸条方式检测的基团中的至少一种。
6.一种包含权利要求1-5中任一项所述的检测***的甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1与H7N9的联合检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括特异性引物与探针。
7.根据权利要求6所述的甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1与H7N9的联合检测试剂盒，其特征在于：所述的特异性引物包括上游引物与下游引物，所述的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
8.根据权利要求6所述的甲型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1与H7N9的联合检测试剂盒，其特征在于：所述的探针的核苷酸序列为TTATTATT。
9.一种权利要求1-5中任一项所述的检测***的非规范性结构PAM的sgRNA设计方法，其特征在于：所述的sgRNA设计方法采用次优PAM设计；所述的次优PAM为VTTV、TCTV、TTVV、TRTV、TTNT或YYYN中的至少一种。
10.一种使用权利要求6-8中任一项所述的试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1是从待测样本中提取核酸；
步骤2是利用特异性引物扩增待测样品中提取出的核酸，得到特异性产物；
步骤3是将所述的特异性产物加入到所述的CRISPR/Cas12a检测***中，于37-43℃反应10-30min；
步骤4是利用荧光检测法或侧向流动试纸条检测样品中甲型流感病毒核酸。
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