CN112410465A - 新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因恒温扩增引物组及试剂盒 - Google Patents

新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因恒温扩增引物组及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的ORF1ab基因、N基因恒温扩增引物组及试剂盒，属于生物技术领域。本发明密切分析国际上公布的新型冠状病毒SARS‑CoV‑2全基因组序列，开展新型冠状病毒SARS‑CoV‑2 ORF1ab基因、N基因种内保守性比对、种外同源性比对以及差异位点分析，针对每个基因分别设计并筛选确定了2条内引物、2条外引物及2条环引物为核心技术，增强了实时荧光恒温RT‑PCR检测试剂盒的特异性和灵敏度。性能指标与荧光定量RT‑PCR具有同等水平，检测时间可在30分钟‑45分钟完成，操作简便、快捷。

Description

新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因恒温扩增引物组及 试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab和 N基因恒温扩增引物组及试剂盒。
背景技术
为提供即时公共卫生支持，中国在新型冠状病毒国家科技资源服务***(http://nmdc.cn/#/nCoV)发布了43组SARS-CoV-2基因组序列，全球共享禽流 感数据库倡议组(GISAID)数据库中发布了病毒基因组序列。在撰写本案时， SARS-CoV-2的人际传播程度尚不清楚，但有证据表明存在某种人际传播，也有 新冠病毒通过消化道传播的证据(在粪便、胃肠道破损黏膜、出血处分离出病毒)， 提示各界需注意预防下水道污染引起的新冠病毒传播。
目前，新型冠状病毒肺炎疫情仍十分严峻，及时、早期地识别COVID-19 患者是控制疫情的关键步骤。按照中国国家卫生健康委员会与国家中医药管理局 发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》，确诊病例需有病原学证据 阳性结果，即新型冠状病毒核酸阳性，或病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒 高度同源。截止2020年3月5日，通过国家绿色通道审批检测SARS-CoV-2的 试剂有14家公司产品，其中核酸检测的荧光定量RT-PCR检测试剂和恒温扩增 芯片法检测试剂9家。郭元元等人对我国生产第一批的6种SARS-CoV-2荧光定 量RT-PCR试剂盒的检测性能进行了比较与分析，其结果显示弱阳性患者的核酸 可能不易检出，各试剂的结果还存在一定的差异。
基于病毒基因保守序列的荧光定量RT-PCR检测方法，是呼吸道病毒检测的 常用方法，本次新冠病毒检测也同样适用。该方法通过对病毒RNA进行提取、 逆转录、荧光定量PCR扩增病毒保守序列(RdRP基因(特异性靶点)、E蛋白基因、 N蛋白基因以及一个鉴定保守基因S蛋白基因区位点；可以只检测RdRP基因或 者选择RdRP基因和其他多个基因确认)，扩增体系中的荧光蛋白会结合扩增出 的双链DNA序列从而发出荧光，根据检测到的荧光值判断是否有病毒存在并定 量。
目前，新型冠状病毒SARS-CoV-2荧光RT-PCR试剂盒最大的问题可以说并 非产量，而是质量。从一些报道来看，病人要经常要做上三四次核酸检测，甚至 是四五次的实验，才知道是阳性还是阴性。即便如此，可能还有很多人检测出来 是阴性，但已经出现白肺了。或者有些人核酸检测阳转阴了，但其实是假阴性。 这就说明，好些试剂盒在早期研发的时候，并未完成试剂的优化、质控、灵敏度、 特异性测试等等，所以导致灵敏度不够，检测的结果不稳定。目前，我国针对新 型冠状病毒SARS-CoV-2核酸检测仅有荧光定量RT-PCR法体外诊断试剂检测 SARS-CoV-2的ORF1ab和N基因，以及恒温扩增芯片法体外诊断试剂检测 SARS-CoV-2的S基因、N基因，尚未有实时荧光恒温RT-PCR检测ORF1ab和 N基因的恒温荧光检测试剂盒。
现行的新型冠状病毒SARS-CoV-2检测试剂盒都存在一定的问题，影响新型 冠状病毒肺炎病人的确诊，成为影响疫情防控的瓶颈问题。检测病毒抗体和血清 学方法简单快速，但特异性差，灵敏度低，假阳性高，而且短期内很难获得病毒 高质量特异性抗体。病毒基因组测序检测时间长，对检测机构的技术能力和仪器 条件要求比较高，导致病毒基因组测序技术不能推广应用，不能满足疫情实时检 测的需要。PCR技术简单快速，灵敏度高，但工作量大，操作繁琐，通量低； 基因芯片通量高，但也易造成假阳性，费用昂贵；实时荧光定量PCR技术灵敏 度高，可靠性好，为全封闭反应，但是该技术需要价格昂贵的荧光定量PCR仪， 无法在基层检测部门和防疫机构普及，并且要保证高特异性需要荧光标记探针， 检测成本较高。总之，这些核酸检测技术都存在需要依赖昂贵仪器，检测成本较 高，具有实验室限制性等一系列缺点；而且这些分子生物学检测对质量控制、操 作环境和人员的专业能力要求较高，无法实现在基层的普及应用，无法满足疫情 期间病毒快速检测的需要。
对于目前新型冠状病毒SARS-CoV-2检测技术存在的问题主要在于：
一是目前新型冠状病毒SARS-CoV-2检测技术各有优缺点。新型冠状病毒 SARS-CoV-2检测首选的病毒核酸检测方法，全基因组测序可准确鉴定病毒，但 是目前的高通量测序平台测序时间较长，灵敏度相对较低。荧光定量PCR方法 的优点是相较于其他抗原抗体法(如胶体金技术)更为灵敏，检测结果更为准确， 但是检测需要专业的仪器和分子检测实验室以及专业的操作人员，操作不当或者 实验室条件不足可能会因气溶胶污染造成假阳性，且整个流程需要几个小时，相 较于胶体金法时间更长。
病毒分离鉴定：病毒培养是诊断流感病毒感染的传统方法之一，但是传统的 分离鉴定方法需要连续培养多天，敏感性和特异性都会低于核酸检测方法，虽然 在前期确定侵害性病原物起到关键作用，但较为耗时，且不便捷，不能满足大量 疑似患者筛查需求。
免疫胶体金层析技术：虽然免疫胶体金层析技术操作简单，出结果快(一般 为20分钟)，但是此方法敏感性较差，加入样本后的原理靠的是层析，也就是往 外分散，如果材料等质量有误差，会影响检测结果；也会因为病人感染时间较短 或者采样部位导致病毒含量较低，导致出现假阴性。另外，该方法由于依赖抗原 抗体，对于前期开发时选择包被的抗原/抗体最为关键，短时间内开发出的产品 有待确认其特异性和灵敏性。
二是新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸检测试剂盒质量问题。试剂盒反转录效 率低下；扩增的循环数不够；PCR长度/引物设计/引物的特异等都是影响试剂盒 检测质量的重要影响因素。很多试剂盒在早期研发的时候，并未完成试剂的优化、 质控、灵敏度、特异性测试等等，所以导致灵敏度不够，检测的结果不稳定。病 人要经常要做上三四次核酸检测，甚至是四五次的实验，才知道是阳性还是阴性。 即便如此，可能还有很多人检测出来是阴性，但已经出现白肺了。或者有些人核 酸检测阳转阴了，但其实是假阴性。
三是目前新冠病毒SARS-CoV-2核酸检测针对的位点主要是荧光定量 RT-PCR检测新冠病毒基因组中2段保守基因靶标，即：开放读码框1ab(Open reading frame 1ab，ORF1ab)、核壳蛋白(Nucleocapsid protein，N)基因，其中 N基因特异性不强，易产生交叉反应，临床上双结果不易研判，导致临床上需要 反复进行复核操作。目前在用的不同厂家荧光双位点定量PCR试剂盒普遍对于 新冠病毒N蛋白基因的扩增敏感性高于ORF1ab检测，可能导致部分病毒含量 较低的样本检测结果为单通道阳性；此外，由于N基因在新冠病毒的核酸序列 中，其保守程度不及ORF1ab，故可能存在不同冠状病毒间有一定的交叉，导致N基因扩增阳性而ORF1ab阴性。对于临床上样本检测结果为单通道阳性的，需 要谨慎对待，应采用同一检测方法的另一厂家试剂盒或采用目前实验室可进行的 另一检测方法对样本进行复核，如第二次结果为阴性，则报告阴性，并根据相应 文件要求需间隔1天以上再次对同一病人进行取样检测，两次阴性结果可初步排 除感染，但仍需结合临床症状及CT检查结果考虑进一步的核酸检测策略；而第 二次结果仍为单通道阳性的样本，将建议临床重新取该患者样本送检。同时，需 要高度关注核酸提取效率影响病毒核酸检测结果，如出现单通道阳性结果也可以 采用换提取方法重新提取核酸进行重新检测。
综上所述，从目前来看，不同检测方法均存在着各自的优势和弊端，只有综 合运用各种检测工具，才能实现快速高效的检测。
发明内容
本发明为解决综上所述的问题，创新性设计新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因恒温扩增RT-PCR检测的内外环引物组，建立成熟稳定、测试 成本低的实时荧光恒温RT-PCR检测新方法及试剂盒。密切分析国际上公布的新 型冠状病毒SARS-CoV-2全基因组序列，针对ORF1ab和N基因分别开展种内 保守性比对、种外同源性比对以及差异位点分析，在分别设计的6套引物组合基 础上，真对每个基因分别筛选确定了特异性好、敏感度强的一套内外环引物组合： 2条内引物、2条外引物及2条环引物为核心技术，增强了实时荧光恒温RT-PCR 检测技术的特异性和灵敏度保证。解决目前针对新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸检测仅有实时荧光定量RT-PCR试剂盒检测ORF1ab及N基因，恒温扩增芯片试 剂盒检测S基因、N基因，而没有实时荧光恒温RT-PCR试剂盒检测ORF1ab及 N基因的问题。
本发明的技术构思如下：
一是创新性设计新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因恒温扩增的内 外环引物组，保证检测的特异性。
本发明根据全球流感序列数据库(GISAID)公布的SARS-CoV-2核酸序列， 选择ORF1ab和N基因两个基因作为检测靶标，对其保守区进行检测，采用Primer Premier 5.0软件自行设计恒温扩增引物，每个基因各自设计了6组实时荧光恒温 扩增引物，每组引物包括1对内引物、1对外引物及1对环引物，并使用Primer blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行评估。另外，在 GISAID(https：//www.GISAID.org)上独立发布的其他序列也对比对进行了补 充，确认了所选引物与所有序列的良好匹配。
二是创新性建立新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因实时荧光恒温 RT-PCR检测试剂盒，选择简便快速灵敏度高的恒温RT-PCR扩增技术解决上述 检测试剂盒的瓶颈问题。
恒温扩增是一种新型核酸扩增技术，利用一种具有链置换活性的DNA聚合 酶(BstDNA聚合酶)，在恒温条件下进行特异、敏感和高效的核酸扩增。恒温扩 增反应需要特别设计2条内引物、2条外引物和2条环引物，增强特异性靶 DNA在60℃～65℃恒温条件下(如水浴箱内)保温约60min，即可完成恒温核 酸扩增反应。恒温扩增最终产物是由大量菜花样结构组成的茎环状DNA混合 物，由于恒温扩增产生了巨大数量的DNA产物，故可通过反应管内副产物的 浊度或荧光来对产物进行检测。通过逆转录酶，恒温扩增可进行RNA高效扩增。恒温扩增具有不需要特殊仪器设备的特点，使用恒温检测仪、荧光定量PCR仪 均可以适用，特别适用于现场或者基层单位，这些地方无法做到严格的实验分区 或者严格的操作流程。恒温扩增可以不用严格的实验分区，反应区和加样区可以 合二为一。恒温扩增技术的引物设计是关键核心技术，但对检测人员的实际操作 要求并不高，操作简便、省时高效，且不需要特殊的试剂和仪器设备，该设备已 国产化，价格在3-10万元之间不等，均能满足要求。逆转录恒温扩增法对2009 年H1N1大流行病毒的敏感性为97.8％，特异性为100％。基于恒温扩增的检测 方法也被用于检测高致病性的H5N1和H7N9禽流感病毒，其敏感性比基于荧光定量RT-PCR的方法具有可比性或更高的灵敏度。因此，恒温扩增技术是解决目 前核酸快速检测基层应用难题的突破口，在生物安全快速检测领域具有广阔应用 前景。
本发明开展新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因恒温扩增RT-PCR 检测，创新性设计新型冠状病毒ORF1ab和N基因恒温扩增RT-PCR检测的内外 环引物组，建立成熟稳定、测试成本低的实时荧光恒温RT-PCR检测试剂盒。针 对世界公布的新型冠状病毒2019-nCoV毒株全基因组序列测定和变异分析结果， 针对ORF1ab和N基因，自主设计恒温扩增RT-PCR特异性引物，体外转录RNA 进行验证实验，研发特性、灵敏的新型冠状病毒SARS-CoV-2ORF1ab和N基因 恒温扩增RT-PCR检测试剂盒。30-45min即可完成对新型冠状病毒ORF1ab和N 基因的快速检测，性能指标优于国内外同类方法水平。所研发的试剂盒可以在线 实现样品的预处理及测试的全过程，使核酸现场快速检验设想成为可能。
可以解决目前新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因核酸检测仅局限 于应用实时荧光定量RT-PCR试剂盒，而没有使用廉价、特异的恒温扩增RT-PCR 试剂盒的问题。
本发明的技术方案如下：
新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab基因恒温扩增引物组，包括如下引物： (1)外引物A：
5′-CCACTAGAGGAGCTACTGTAG-3′
5′-CGGACATACTTATCGGCAAT-3′
(2)内引物A：
5′-AACGGTGTGACAAGCTACAACAAATGTGATAGAGCCATGCC-3′
5′-TGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGAATGTGGCATCTCCTGATGA-3′
(3)环引物A：
5′-GCGAGCAAGAACAAGTGAG-3′
5′-TGTGGCGGTTCACTATATGTTAA-3′。
新型冠状病毒SARS-CoV-2N基因恒温扩增引物组，包括如下引物：
(1)外引物B：
5′-GTCTTGGTTCACCGCTC-3′
5′-ATTGCCAGCCATTCTAGC-3′
(2)内引物B：
5′-ACCGTCACCACCACGAATTCAGGACAAGGCGTTCCA-3′
5′-ATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGTGCGACTACGTGATGAG-3′
(3)环引物B：
5′-GTCATCTGGACTGCTATTGGT-3′
5′-CAGTCAAGCCTCTTCTCGTT-3′。
本发明同时请求保护根据上述引物组含有上述引物组合进行新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab基因和N基因恒温扩增RT-PCR检测试剂盒。
进一步的，所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab基因和/或N基因的恒 温扩增RT-PCR检测试剂盒，包括以下组分：反应液S-1(A)，反应液S-1(B)， Bst聚合酶B-1，逆转录酶R-1，密封液C-1，阳性对照PG-1，阴性对照NG-1；
所述的反应液S-1(A)包括1.4μM内引物A，0.2μM外引物A，0.6μM 环引物A；
所述的反应液S-1(B)包括1.6μM内引物B，0.2μM外引物B，0.6μM 环引物B。
本发明的有益效果如下：目前，核酸检测试剂盒质量参差不齐，核酸检测稳 定性可靠性尚存疑；核酸检出率低，许多病历需要重复2-3次检测；很多病人咽 拭子阴性但肺细胞罐洗液里有病毒；目前等待核酸检测人数大大超过检测能力， 仓促上阵得出的检测结果可靠性不高。目前针对新型冠状病毒SARS-CoV-2核酸 检测仅有荧光定量RT-PCR检测ORF1ab及N基因试剂盒，而尚没有实时荧光 恒温扩增RT-PCR检测ORF1ab及N基因试剂盒。最新报道，多家单位成功分离 新型冠状病毒SARS-CoV-2毒株的全基因组序列测定和变异分析，与新型冠状病 毒SARS-CoV-2参考基因组NC 045512.2相比，很多毒株基因组orf1a/b基因发 生了重要的两个位点突变，提示现有的检测方法、检测靶标需要根据病毒变异情 况进行进一步更新和优化。有必要开展新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab及N 基因恒温扩增RT-PCR检测试剂盒研究，研发适用于现场的快速筛查试剂盒，适 用于现场检测、便捷高效的技术手段。
本发明密切分析国际上公布的新型冠状病毒SARS-CoV-2全基因组序列，开 展新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab及N基因种内保守性比对、种外同源性比 对以及差异位点分析，针对每个基因分别设计并筛选确定了2条内引物、2条 外引物及2条环引物为核心技术，增强了恒温扩增检测试剂盒的特异性和灵敏 度保证。成果与国内外同类技术相比，具有明显的成本、效益优势。所研发的新 型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab及N基因实时荧光恒温RT-PCR检测试剂盒， 性能指标与实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒具有同等水平，检测时间可在30 分钟-45分钟完成，操作简便、快捷。
本发明研发的新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因恒温扩增RT-PCR检测的内外环引物组，以及研发的实时荧光恒温RT-PCR检测试剂盒， 解决仅有实时荧光定量RT-PCR检测ORF1ab和N基因，而没有使用廉价、便捷 的实时荧光恒温RT-PCR检测ORF1ab和N基因试剂盒的问题，是对新型冠状病 毒SARS-CoV-2检测ORF1ab和N基因试剂盒的有力补充。新型冠状病毒 SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因实时荧光恒温RT-PCR检测试剂盒具有技术成熟稳定、测试成本低，更适合于基层推广的优势，既可以使用廉价的恒温检测仪， 又可以使用荧光定量PCR仪，更适合于社区化验室、企业化验室、县区卫生所 等基层实验室的快速检测，成果具有很好的市场竞争力，有良好的产业化前景。
附图说明
图1 ORF1ab基因引物组筛选结果
图2 ORF1ab基因特异性测试扩增曲线
图3 N基因引物组筛选结果
图4 N基因特异性测试扩增曲线
图5 ORF1ab基因灵敏度测试扩增曲线
其中：1、1×10^8copies/μL，2、1×10^7copies/μL，3、1×10^6copies/μL， 4、1×10^5copies/μL，5、1×10^4copies/μL，6、1×10^3copies/μL，7、1×10^2 copies/μL；
图6 N基因灵敏度测试扩增曲线
其中：1、1×10^8copies/μL，2、1×10^7copies/μL，3、1×10^6copies/μL， 4、1×10^5copies/μL，5、1×10^4copies/μL，6、1×10^3copies/μL，7、1×10^2 copies/μL；
图7检测试剂盒使用说明流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的说明和解释。本发明AMV反转录酶购自 宝生物(大连)工程技术有限公司，Bst聚合酶、恒温扩增反应液RM-SCI购自 广州双螺旋基因技术有限公司。GENIE等温扩增仪购自英国optiGene公司。 ABI 7500实时荧光定量PCR仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司。
实施例1 ORF1ab和N基因实时荧光恒温RT-PCR检测的引物组特异性验 证
1.1恒温扩增引物组的特异性测试
1.1.1阳性对照品的制备
根据新型冠状病毒国家科技资源服务***(http://nmdc.cn/#/nCoV)公布的SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因核酸序列，分别人工合成制备ORF1ab基因和N 基因质粒体外转录RNA阳性对照样本，分装并于-20℃保存备用。
1.1.2特异性扩增试验
使用与新型冠状肺炎感染部位相同或感染症状相似的其它病原体，用于验证 特异***叉反应，由于无法在疫情爆发期间获得这些病原体样本，所以是人工合 成基因片段，它们是：冠状病毒229E型、冠状病毒OC43型、冠状病毒HKU1 型、冠状病毒NL63型、MERS冠状病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞 病毒、鼻病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、肺炎链球菌。甲型流感病毒RNA、 乙型流感病毒RNA、肺炎克雷伯菌核酸、军团菌核酸、金黄色葡萄球菌核酸样 本由广州双螺旋基因技术有限公司提供。本发明使用的所有合成RNA都经过超微量可见紫外分光光度计进行定量。验证本案所设计的6套新型冠状病毒 ORF1ab和N基因恒温扩增RT-PCR检测的内外环引物组的扩增特异性，以便筛 选出最佳的一套引物组。
1.1.3 ORF1ab基因引物组的特异性扩增测试结果
使用10pg/μL(10^6copies/μL)新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab基因基 因体外转录RNA阳性对照进行引物筛选，分析所设计6套引物组的扩增反应结 果及特异性。
引物筛选试验结果表明，第二套引物出峰时间最早，未出现假阳性，且重复 性最佳(图1)。由此可见，第二套引物扩增测试时，阳性模板有正常扩增曲线， 其它病原体核酸均无扩增，表明本发明所设计的新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab基因恒温扩增第二套内外环引物组具有较好的特异性(图2)。因此，确 定第二套新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab基因恒温扩增内外环引物组进行后 续实验。
ORF1ab基因第二套内外环引物组碱基序列如下(方向为5'to 3')
(1)外引物A：
5′-CCACTAGAGGAGCTACTGTAG-3′
5′-CGGACATACTTATCGGCAAT-3′
(2)内引物A：
5′-AACGGTGTGACAAGCTACAACAAATGTGATAGAGCCATGCC-3′
5′-TGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGAATGTGGCATCTCCTGATGA-3′
(3)环引物A：
5′-GCGAGCAAGAACAAGTGAG-3′
5′-TGTGGCGGTTCACTATATGTTAA-3′。
1.1.4 N基因引物组的特异性扩增测试结果
使用10pg/μL(10^6copies/μL)新型冠状病毒SARS-CoV-2N基因基因体外 转录RNA阳性对照进行引物筛选，分析所设计6套引物组的扩增反应结果及特 异性。
引物筛选试验结果表明，第三套引物出峰时间最早，未出现假阳性，且重复 性最佳(图3)。由此可见，第三套引物扩增测试时，阳性模板有正常扩增曲线， 其它病原体核酸均无扩增，表明本发明所设计的新型冠状病毒SARS-CoV-2N基 因恒温扩增第二套内外环引物组具有较好的特异性(图4)。因此，确定第三套 新型冠状病毒SARS-CoV-2N基因恒温扩增内外环引物组进行后续实验。
N基因第三套内外环引物组碱基序列如下(方向为5'to 3')
(1)外引物B：
5′-GTCTTGGTTCACCGCTC-3′
5′-ATTGCCAGCCATTCTAGC-3′
(2)内引物B：
5′-ACCGTCACCACCACGAATTCAGGACAAGGCGTTCCA-3′
5′-ATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGTGCGACTACGTGATGAG-3′
(3)环引物B：
5′-GTCATCTGGACTGCTATTGGT-3′
5′-CAGTCAAGCCTCTTCTCGTT-3′。
实施例2 ORF1ab和N基因实时荧光恒温RT-PCR检测体系的优化
2.1实时荧光恒温RT-PCR反应体系的建立
25μL反应体系包括2.0μL of RNA模板，12.5μL of反应液RM-SCI(中国 广州双螺旋基因科技有限公司，包含2.8mM dNTPs，40mM Tris-HCl，20mM KCl，16mM MgSO4，20mM(NH4)2SO4，1.6M甜菜碱)，0.5μL of 1000×SYBR Green I(Thermo Scientific)，0.8μL of8U/μL Bst聚合酶(NEB)，0.2μL of 5U/μL AMV 酶(TAKARA，中国，大连)，8μL of超纯水，1.0μL of内引物、外引物和环引 物。最后加1滴(约20μL)of石蜡封管。
采用自行设计并确认新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因检测最特 异的引物组(内引物、外引物和环引物)，分别配制成新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因实时荧光恒温RT-PCR检测反应体系，混匀后置于GENIE恒 温扩增仪或实时荧光定量PCR仪进行荧光恒温RT-PCR扩增。
反应条件为：(可根据不同的仪器设置相应的反应条件)
恒温扩增仪：63℃条件下反应45min。
实时荧光定量PCR仪：荧光基团选择FAM或SYBR，淬灭基团选择None， 将63℃15s，63℃45s作为一个循环，于63℃45s处收集荧光信号，45个循环。
2.2实时荧光恒温RT-PCR检测体系的建立及优化结果
分别使用10pg/μL(10^6copies/μL)ORF1ab和N基因体外转录RNA作为检 测样本，分别使用ORF1ab和N基因引物组进行实时荧光恒温RT-PCR检测体系 的建立及优化测试。确定具有明显S形扩增曲线，且曲线光滑，Ct值较为合适 的检测体系，如表1所示。
表1实时荧光恒温RT-PCR检测体系
Figure BDA0002428778550000111
Figure BDA0002428778550000121
实施例3 ORF1ab和N基因实时荧光恒温RT-PCR检测灵敏度验证
3.1灵敏度测试方法
分别将ORF1ab和N基因体外转录RNA质粒阳性对照样本以10倍差进行 稀释，梯度浓度分别为1×10^6copies/μL、1×10^5copies/μL、1×10^4copies/μL、 1×10^3copies/μL、1×10^2copies/μL、10copies/μL，经优化好的荧光恒温RT-PCR 反应体系进行检测，验证本案所设计的新型冠状病毒SARS-CoV-2 ORF1ab和N 基因恒温扩增RT-PCR检测的内外环引物组所建立的实时荧光恒温RT-PCR检测 方法的灵敏度。
3.2灵敏度测试结果
按照3.1的方法进行灵敏度测试，结果显示，ORF1ab和N基因分别都在 1fg/μL(10^2copies/μL)浓度三个平行样本均检出，均存在明显扩增曲线，且曲 线形态良好。采用1×10^2copies/μL RNA样本作为模板进一步进行20个重复测 试，确定本发明所设计的新冠病毒ORF1ab和N基因恒温扩增RT-PCR检测的内 外环引物组和反应体系的检测灵敏度为1fg/μL(10^2copies/μL)。结果如图5、6。
实施例4新型冠状病毒ORF1ab和N基因实时荧光恒温RT-PCR检测试 剂盒使用方法
4.1产品内容
表2试剂盒产品内容
Figure BDA0002428778550000122
Figure BDA0002428778550000131
4.2检验原理
恒温扩增技术原理：基于靶基因3'和5'端的6个区域设计3对特异性引物， 包括1对内引物(2条)、1对外引物(2条)及1对环引物(2条)，3对特异 性引物组依靠链置换BstDNA聚合酶，使得链置换DNA合成不停地自我循环， 从而实现快速扩增。通过逆转录酶，恒温扩增则进行RNA高效扩增。反应1h 后可根据扩增副产物焦磷酸镁沉淀形成的浊度或者荧光染料进行判断扩增情况。 此反应先形成哑铃状模板，进入循环扩增阶段，再进行伸长、循环扩增，共3 个阶段。
恒温扩增产物荧光信号技术原理：SYBR Green是一种结合于所有双链DNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green发出 微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green 的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存 在的双链DNA数量。
4.3所需要的器材
保温设备：恒温检测仪或实时荧光定量PCR仪；移液器(量程0.1-200uL)； 样品架、浮子(仅用于水浴锅)；乳胶或一次性手套若干
4.4样本要求
适用样本类型：咽拭子、鼻咽拭子、肛拭子、血浆等样本；标本应当避免反 复冻融。
4.5操作流程示意图
示意图如图7。
4.6操作步骤
4.6.1样本RNA提取(可以按照其他提取试剂盒操作进行)
转移20μL蛋白酶K至1.5mL离心管中。转移200μL样本(如咽拭子、鼻 咽拭子、肛拭子、血浆等样本)的保存液至装有蛋白酶K的离心管中，震荡混 匀5s。转移200μL BufferVGB、蛋白酶K、Carrier RNA至样品中，涡旋混匀15s。 56℃水浴10min。加入裂解液。向裂解液中加无水乙醇溶液转移至Spin Column 中。弃去滤液。将Spin Column移至1.5mL RNasefree离心管上。用RNase free dH2O清洗，把样本RNA用于检测实验或保存于-80℃。
4.6.2实时荧光恒温RT-PCR检测步骤
(1)取出试剂盒，将试剂完全解冻，各组分离心30s，B-I及R-I为液体， 取出后应放置于冰盒上。
(2)试剂配制
分别检测ORF1ab基因和N基因，则若有N个待检样本，则分别参照下表， 分别按照N+3个数量计算各组分用量(N个待检样本+1个阴性对照+1个阳性对 照+1份备用)，将反应液置于0.6mL或者1.5mL离心管中，涡旋混匀，离心30s， 分装于0.2mL PCR管中，并向每管加入1滴C-I(约20μL)。
Figure BDA0002428778550000141
(3)添加待检样本模板
向步骤1中已含有反应液的PCR管中分别加入2μL模板，最后滴加一滴C-1 (约20μL)，离心30s，应立即进行扩增反应。
(4)扩增反应(可根据不同的仪器设置相应的反应条件)
恒温扩增仪：63℃条件下反应45min。
实时荧光定量PCR仪：荧光基团选择FAM或SYBR，淬灭基团选择None， 将63℃15s，63℃45s作为一个循环，于63℃45s处收集荧光信号，45个循环。
其他仪器请参照仪器说明书进行设置。
(5)检测结果判定
空白对照、阴性对照和阳性对照全部满足下述条件，表明检测体系有效：空 白对照、阴性对照无“S”型扩增曲线(无核酸扩增)，阳性对照有“S”扩增(有核酸扩 增)。
样本检测结果判定：若有“S”型扩增曲线，则判断为阳性(有核酸扩增)，若 无“S”型扩增曲线，则判断为阴性(无核酸扩增)。
(6)注意事项
该试剂的反应体系、扩增管以及阳性对照品在-20℃条件下保存。
在试剂使用过程中，每一步用吸管滴加或吸取液体后必须更换新的吸管，不 同样品之间滴入或吸出液体也必须更换新的吸管，以防止交叉污染。
操作过程中要佩戴一次性或乳胶手套，若检测的样品量大，要提高更换手套 的频率，以防止交叉污染。
尽量在空气流通的地方向扩增管中加入样品和阳标，防止检测结果出现假阳 性。每一次检测都要设置阳性对照和阴性对照以保证被测样品检测结果的可靠性。
实施例5新型冠状病毒肺炎临床样本检测结果
根据每个参与伙伴的医疗道德规则，为了优化诊断工作流程，同意样本的内 部使用。新型冠状病毒肺炎患者的鼻咽拭子52份临床样本，由具备新型冠状病 毒检测资质的实验室按照实施例4中的新型冠状病毒ORF1ab和N基因实时荧 光恒温RT-PCR检测试剂盒和操作流程进行检测，结果显示，确诊为新型冠状病 毒肺炎患者核酸阳性的临床样本，分别检出ORF1ab和N基因明显扩增曲线， 且曲线形态良好，经本试剂盒检测验证为ORF1ab和N基因阳性。
上述实施例只是用于对本发明的举例和说明，而非意在将本发明限制于所描 述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明不局限于上述实 施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落 在本发明所要求保护的范围内。
Figure IDA0002428778600000011
Figure IDA0002428778600000021

Claims (4)

1.新型冠状病毒SARS-CoV-2ORF1ab基因恒温扩增引物组，其特征在于，包括如下引物：
(1)外引物A：
5′-CCACTAGAGGAGCTACTGTAG-3′
5′-CGGACATACTTATCGGCAAT-3′
(2)内引物A：
5′-AACGGTGTGACAAGCTACAACAAATGTGATAGAGCCATGCC-3′
5′-TGAGTGTGCTCAAGTATTGAGTGAATGTGGCATCTCCTGATGA-3′
(3)环引物A：
5′-GCGAGCAAGAACAAGTGAG-3′
5′-TGTGGCGGTTCACTATATGTTAA-3′。
2.新型冠状病毒SARS-CoV-2N基因恒温扩增引物组，其特征在于，包括如下引物：
(1)外引物B：
5′-GTCTTGGTTCACCGCTC-3′
5′-ATTGCCAGCCATTCTAGC-3′
(2)内引物B：
5′-ACCGTCACCACCACGAATTCAGGACAAGGCGTTCCA-3′
5′-ATCGTGCTACAACTTCCTCAAGGTGCGACTACGTGATGAG-3′
(3)环引物B：
5′-GTCATCTGGACTGCTATTGGT-3′
5′-CAGTCAAGCCTCTTCTCGTT-3′。
3.一种进行新型冠状病毒实时荧光恒温RT-PCR检测的恒温扩增试剂盒，其特征在于，包括新型冠状病毒SARS-CoV-2ORF1ab基因恒温扩增引物组和新型冠状病毒SARS-CoV-2N基因恒温扩增引物组。
4.如权利要求3所述的恒温扩增试剂盒，其特征在于，包括以下组分：反应液S-1(A)，反应液S-1(B)，Bst聚合酶B-1，逆转录酶R-1，密封液C-1，阳性对照PG-1，阴性对照NG-1；
所述的反应液S-1(A)包括1.4μM内引物A，0.2μM外引物A，0.6μM环引物A；
所述的反应液S-1(B)包括1.6μM内引物B，0.2μM外引物B，0.6μM环引物B。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112899402A (zh) * 2021-03-15 2021-06-04 东南大学 快速检测新型冠状病毒的等温扩增引物组及其检测试剂盒
CN113186259A (zh) * 2021-05-14 2021-07-30 上海市公共卫生临床中心 一种用于检测茎环核酸的荧光等温扩增方法、扩增体系与应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004092208A2 (en) * 2003-04-15 2004-10-28 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Health Sars-related proteins
US20050095618A1 (en) * 2003-07-29 2005-05-05 The Chinese University Of Hong Kong Compositions and methods for diagnosing and treating severe acute respiratory syndrome (SARS)
WO2006022459A1 (en) * 2004-08-23 2006-03-02 Mogam Biotechnology Institute Primer and probe for detection of sars coronavirus, kit comprising the primer and/or the probe, and detection method thereof
CN1829736A (zh) * 2003-04-10 2006-09-06 希龙公司 严重急性呼吸道综合征冠状病毒
CN1938420A (zh) * 2003-12-02 2007-03-28 巴斯德研究所 由sars相关联冠状病毒新病毒株的基因组编码的蛋白质和肽的用途
CN103484565A (zh) * 2013-09-02 2014-01-01 湖北朗德医疗科技有限公司 一种实时荧光rt-pcr检测冠状病毒的试剂盒及其应用
CN103993101A (zh) * 2014-03-07 2014-08-20 崔淑娟 一种同时检测人的冠状病毒229e、oc43、nl63的方法及试剂盒
CN104072592A (zh) * 2013-03-26 2014-10-01 复旦大学 对新型冠状病毒HCoV-EMC 2012感染具有抑制作用的多肽及其应用
CN105039598A (zh) * 2015-08-14 2015-11-11 黑龙江博腾生物科技有限公司 一种中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因检测试剂盒
CN105861744A (zh) * 2016-03-24 2016-08-17 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 用于快速等温检测猪德尔塔冠状病毒的引物组和方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1829736A (zh) * 2003-04-10 2006-09-06 希龙公司 严重急性呼吸道综合征冠状病毒
WO2004092208A2 (en) * 2003-04-15 2004-10-28 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Health Sars-related proteins
US20050095618A1 (en) * 2003-07-29 2005-05-05 The Chinese University Of Hong Kong Compositions and methods for diagnosing and treating severe acute respiratory syndrome (SARS)
CN1938420A (zh) * 2003-12-02 2007-03-28 巴斯德研究所 由sars相关联冠状病毒新病毒株的基因组编码的蛋白质和肽的用途
WO2006022459A1 (en) * 2004-08-23 2006-03-02 Mogam Biotechnology Institute Primer and probe for detection of sars coronavirus, kit comprising the primer and/or the probe, and detection method thereof
CN104072592A (zh) * 2013-03-26 2014-10-01 复旦大学 对新型冠状病毒HCoV-EMC 2012感染具有抑制作用的多肽及其应用
CN103484565A (zh) * 2013-09-02 2014-01-01 湖北朗德医疗科技有限公司 一种实时荧光rt-pcr检测冠状病毒的试剂盒及其应用
CN103993101A (zh) * 2014-03-07 2014-08-20 崔淑娟 一种同时检测人的冠状病毒229e、oc43、nl63的方法及试剂盒
CN105039598A (zh) * 2015-08-14 2015-11-11 黑龙江博腾生物科技有限公司 一种中东呼吸综合征冠状病毒ORF1a2基因检测试剂盒
CN105861744A (zh) * 2016-03-24 2016-08-17 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 用于快速等温检测猪德尔塔冠状病毒的引物组和方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANIEL K W CHU等: "Molecular Diagnosis of a Novel Coronavirus (2019-nCoV) Causing an Outbreak of Pneumonia", CLINICAL CHEMISTRY, vol. 66, pages 549 - 555, XP055796083, DOI: 10.1093/clinchem/hvaa029 *
MOHAMED EL-THOLOTH等: "A Single and Two-Stage, Closed-Tube, Molecular Test for the 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) at Home, Clinic, and Points of Entry", CHEMRXIV, pages 1 - 25 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112899402A (zh) * 2021-03-15 2021-06-04 东南大学 快速检测新型冠状病毒的等温扩增引物组及其检测试剂盒
CN112899402B (zh) * 2021-03-15 2022-03-18 东南大学 快速检测新型冠状病毒的等温扩增引物组及其检测试剂盒
CN113186259A (zh) * 2021-05-14 2021-07-30 上海市公共卫生临床中心 一种用于检测茎环核酸的荧光等温扩增方法、扩增体系与应用
CN113186259B (zh) * 2021-05-14 2023-08-29 上海市公共卫生临床中心 一种用于检测茎环核酸的荧光等温扩增方法、扩增体系与应用

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