CN118126910A - 一种改善***感染的益生菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种改善***感染的益生菌剂及其制备方法和应用，所述益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.24110的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株和保藏编号为CCTCC NO:M 2022572的嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA18菌株，本发明所述益生菌剂可以有效改善***感染，且干酪乳杆菌LC16菌株和嗜酸乳杆菌LA18菌株在上述效果上具有潜在的协同作用。

Description

一种改善***感染的益生菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种改善***感染的益生菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

目前女性外阴***感染非常普遍，该疾病是***生态***失衡的结果，由不同的外源性或内源性因素引起，这些因素会影响***中微生物群并减少有保护性的乳酸杆菌。乳酸菌是数量最多的优势微生物，在健康的绝经前妇***道液中占10⁷~10⁸ CFU，它们具有维持***健康环境的功能，通过产生酸、过氧化氢、细菌素和调节局部免疫反应来限制病原微生物的生长。最常见的***感染是由致病菌引起的，典型的是***加德纳菌导致细菌性***病（BV），或者是真菌，如念珠菌导致外阴***念珠菌病（VVC）。根据治疗指导方针，BV的常规治疗是口服或***内用甲硝唑或克林霉素，而VVC通常使用制霉菌素对局部和全身进行治疗。常规疗法可能产生副作用、出现耐药菌株和症状复发。为了尽量减少这些不良影响，尝试开发不同的替代治疗方法非常重要。所以，使用含有乳酸菌的特定益生菌产品是恢复***生态***生理平衡的首选。

益生菌被定义为活的微生物，如果给予足够的量，就会对宿主产生有益的生理影响。历史研究中报道了乳酸菌菌株对BV和VVC的有益作用，迄今为止，益生菌制剂已经进行了口服和局部测试，然而***内给药途径迄今为止似乎是益生菌管理的首选。它的一些优点是：减轻了胃肠道酶和酸作用的严重程度，克服了其他肠外途径造成的疼痛和组织损伤。这些优势主要表现为让患者使用较低的剂量，较不频繁的给药使得益生菌具有高吸收率、不受胃肠道影响。将益生菌定植在***环境并保持相对活力的剂型研究是一项新挑战。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种改善***感染的益生菌剂及其制备方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种改善***感染的益生菌剂，所述益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.24110的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株和保藏编号为CCTCC NO:M 2022572的嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA18菌株。

本发明创造性地发现所涉及的干酪乳杆菌LC16菌株与嗜酸乳杆菌LA18菌株的组合能够显著改善外***感染，效果大于单菌株应用效果。具体表现在：（1）有效抑制病原菌生长；（2）小鼠外***炎症反应缓解；（3）降低BV小鼠血清炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6水平。

优选地，所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株和嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA18菌株的活菌数之比为(3-9):1。

其中(3-9)中的具体点值均可选择3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株和嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA18菌株的活菌数独立地不低于1×10⁹ CFU/mL，例如1×10⁹CFU/mL、2×10⁹ CFU/mL、3×10⁹ CFU/mL、4×10⁹ CFU/mL、5×10⁹ CFU/mL、6×10⁹ CFU/mL、7×10⁹ CFU/mL、8×10⁹ CFU/mL、9×10⁹ CFU/mL、1×10¹⁰ CFU/mL、2×10¹⁰ CFU/mL、5×10¹⁰CFU/mL、8×10¹⁰ CFU/mL、1×10¹¹ CFU/mL、1×10¹² CFU/mL、1×10¹³ CFU/mL等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述益生菌剂的剂型包括片剂。

优选地，所述益生菌剂还包括保护剂、快速释放成分和缓速释放成分。

优选地，所述保护剂包括乙酸、牛血清白蛋白、丙二醇、乳酸或海藻酸盐中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述益生菌剂以质量百分含量计包括乙酸0.1-1%、牛血清白蛋白0.1-0.5%、丙二醇0.1-0.4%、乳酸0.1-1%。

所述乙酸的质量百分含量可以选择0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%等，所述牛血清白蛋白的质量百分含量可以选择0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%等，所述丙二醇的质量百分含量可以选择0.1%、0.2%、0.3%、0.4%等，所述乳酸的质量百分含量可以选择0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。

优选地，所述缓速释放成分包括硬脂酸、羧甲基纤维素钠、抗坏血酸、乳糖、滑石粉、硬脂酸镁、壳聚糖或卡波姆中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述快速释放成分包括乳糖、己二酸、碳酸氢钠或玉米淀粉中的任意一种或至少两种的组合。

第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的改善***感染的益生菌剂的制备方法，所述制备方法包括：

（1）将菌株活化、发酵后与保护剂混合，冷冻干燥，得到复合益生菌颗粒；

（2）将复合益生菌颗粒与缓速释放成分混合造粒，再与快速释放成分混合，压片，即得。

第三方面，本发明提供一种根据第一方面所述的改善***感染的益生菌剂在制备改善***感染的产品中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明创造性地发现所涉及的干酪乳杆菌LC16菌株与嗜酸乳杆菌LA18菌株的组合能够显著改善外***感染，效果大于单菌株应用效果。具体表现在：（1）有效抑制病原菌生长；（2）小鼠外***炎症反应缓解；（3）降低BV小鼠血清炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6水平。

附图说明

图1是24h内益生菌片剂溶胀指数。

图2是不同环境细菌活力测试结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述内容中涉及的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株，分类命名为干酪乳杆菌Lactobacillus casei，保藏编号为CGMCC No.24110，保藏日期为2021年12月15日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

下述内容中涉及的嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA18菌株，分类命名为Lactobacillus acidophilus LA18，保藏编号为CCTCC NO: M 2022572，保藏日期为2022年05月09日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

海藻酸盐、玉米淀粉、抗坏血酸、硬脂酸、羧甲基纤维素钠、抗坏血酸、乳糖、滑石粉、硬脂酸镁、壳聚糖、己二酸、碳酸氢钠均购自铭之鑫化工厂。

乙酸、和牛血清白蛋白、丙二醇、乳酸均购自Sigma。

实施例1

本实施例提供一种复合益生菌发酵液，发酵液中干酪乳杆菌LC16菌株和嗜酸乳杆菌LA18菌株，二者的活菌数之比为4:1，总活菌数为1×10⁹ CFU/mL。

其制备方法为：

将干酪乳杆菌LC16菌株和嗜酸乳杆菌LA18菌株分别接种于MRS培养基中，37℃培养24 h，采用无菌生理盐水调整活菌数后混合，即得。

实施例2

本实施例提供一种复合益生菌发酵液，发酵液中干酪乳杆菌LC16菌株和嗜酸乳杆菌LA18菌株，二者的活菌数之比为1:1，总活菌数为1×10⁹ CFU/mL。

制备方法参考实施例1。

实施例3

本实施例提供一种复合益生菌发酵液，发酵液中干酪乳杆菌LC16菌株和嗜酸乳杆菌LA18菌株，二者的活菌数之比为10:1，总活菌数为1×10⁹ CFU/mL。

制备方法参考实施例1。

对比例1

本对比例提供一种复合益生菌发酵液，其与实施例1的区别仅在于，将干酪乳杆菌LC16菌株替换为干酪乳杆菌ATCC393菌株，干酪乳杆菌与嗜酸乳杆菌的活菌数之比及总活菌数保持不变。

制备方法参考实施例1。

对比例2

本对比例提供一种复合益生菌发酵液，其与实施例1的区别仅在于，将嗜酸乳杆菌LA18菌株替换为嗜酸乳杆菌ATCC4356菌株，干酪乳杆菌与嗜酸乳杆菌的活菌数之比及总活菌数保持不变。

制备方法参考实施例1。

对比例3

本对比制备例提供一种益生菌发酵液，发酵液中干酪乳杆菌LC16菌株的活菌数为1×10⁹ CFU/mL。

制备方法参考实施例1。

对比例4

本对比制备例提供一种益生菌发酵液，发酵液中嗜酸乳杆菌LA18菌株的活菌数为1×10⁹ CFU/mL。

制备方法参考实施例1。

测试例1

体外益生菌菌液对大肠杆菌的影响

将大肠杆菌标准株(ATCC25922)接种于LB液体培养基中，经过37℃，18小时的培养，离心(3000 rpm，5min)收集细菌，用PBS稀释10倍，制备所需的细菌悬浮液。大肠杆菌密度为10⁴ CFU/mL。

24孔微滴板上每孔加入1mL 2×TPY液体培养基，先接种上述制得的500 μL大肠杆菌悬液。然后分别加入500 μL实施例1-3和对比例1-4所述发酵液作为实验组，500 μL生理盐水作为生长对照。另设含有1mL 2×TPY液体培养基和1mL无菌生理盐水作为空白对照。所有实验均为三份，以确保重复性。37℃厌氧培养48小时后，采用平板计数法测定大肠杆菌活菌数，结果如表1所示。

表1

体外实验结果显示干酪乳杆菌LC16和嗜酸乳杆菌LA18发酵液对大肠杆菌生长有不同程度的抑制作用，且LC16和LA18在上述效果上可以相互配合，二者联合使用的效果优于两种菌株的单独使用。

测试例2

BV模型小鼠模型的建立及动物分组和治疗

将88只雌性ICR小鼠称重后随机分为11组(n=8组)，即正常组、***组、模型组、抗生素对照组(每天给予卡那霉素7 mg/kg，连用6天)、益生菌组（每日***灌注1mL实施例1-3和对比例1-4所述发酵液治疗6天）。除正常组，其余小鼠在***内接种细菌前3天在下腹皮下注射***（苯甲酸***）(0.1 mg/只)，然后每天在模型组、抗生素对照组和益生菌组小鼠***内注射30 μL (10⁸ CFU/mL)大肠杆菌悬液，连续5 D建立BV模型。

对小鼠***充血、水肿、出血3项临床指标分别进行评分：无充血、水肿、出血、浸润0分；稍有影响的0.1分；有影响0.2分；严重0.3分；极度严重0.4分。然后对炎症的严重程度和治疗效果进行定量分析。

表2

缓解BV的临床症状结果如表1所示，正常组小鼠各项临床指标均在正常范围内。模型组小鼠***红肿、黏膜充血、分泌物浑浊等BV临床症状较其他组更为明显，临床指标评分较其他组升高。***组小鼠***开口处出现长期轻度红肿。治疗3 d后，抗生素组与益生菌组***红肿、分泌物浑浊明显改善。表明干酪乳杆菌LC16和嗜酸乳杆菌LA18发酵液对***红肿、分泌物浑浊有一定的改善作用，且两种菌株在上述效果上可以相互配合。

测试例3

将测试例2中所述小鼠在治疗结束后处死并采集血样。离心后采集血清，按照ELISA试剂盒说明采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测。通过检测炎症因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表达水平，评价抗生素和益生菌菌悬液的治疗效果，B组为模型建立对照组不做对比，结果如表3所示。

表3

大肠杆菌引起的***炎症对BV小鼠血清炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达有抑制作用，显示实施例1组治疗效果优于抗生素组以及其他组。证明干酪乳杆菌LC16和嗜酸乳杆菌LA18发酵液联合应用时能减轻BV小鼠的炎症反应，且两种菌株在上述效果上可以相互配合。

测试例4

冻干益生菌颗粒：将实施例1所得发酵液与0.5%乙酸、0.3%牛血清白蛋白、0.2%丙二醇、0.5%乳酸混合形成颗粒物，再与1%海藻酸盐混合乳化，冷冻干燥，即得。

粒状基质：将2%玉米淀粉制备成10%的糊状物，用于湿润颗粒混合物，加入2%碳酸氢钠、10%的己二酸、10%玉米淀粉和余量乳糖。通过40目筛网，在37℃的烘箱中干燥，直到重量恒定，颗粒干燥后，通过20目筛网使结块消失。

再将冻干益生菌颗粒、粒状基质以表4中的配比制成片剂。

表4

其制备方法为：

将冻干益生菌颗粒与抗坏血酸、乳糖、羧甲基纤维素钠、卡波姆、壳聚糖、滑石粉、硬脂酸镁、碳酸氢钠混合，造粒；

将步骤（2）所得产物与粒状基质混合，干燥，压片，即得。

1、片剂溶胀指数研究

制备模拟***液，其配方为：3.5 g/L NaCl、1.4 g/L KOH、0.2 g/L Ca(OH)₂、2.0g/L乳酸、1.0 g/L醋酸、0.2 g/L甘油、0.4 g/L尿素、5.0 g/L葡萄糖、0.02 g/L牛血清白蛋白（均购自生工生物工程上海有限公司），将混合物调至pH 5.5。

将片剂称重(G1)，放入预称重的200目孔径不锈钢筐中。将含有药片的网片在37℃的玻璃烧杯中浸入25 mL模拟***液中，使药片膨胀。从烧杯中取出不锈钢筐，用滤纸除去多余的水后，在预定的时间重新称重(G2)。实验分三次进行，溶胀指数(%)的最终数据计算如下：

结果如图1所示，由于制剂中存在可膨胀的生物黏附聚合物，因此有必要进行水合作用研究，以了解片剂的溶胀能力，而溶胀能力直接涉及黏附机理，溶胀能力越强说明片剂黏附力越好。溶胀指数研究证实了两种不同的释放曲线，一种是泡腾层的快速细菌释放，另一种是缓释基质层的延长释放，直到24h结束，说明改善***感染的益生菌片剂中，通过羧甲基纤维素钠适度调配比例，更改后A配方片剂中卡波姆和壳聚糖添加量少导致缓释层片剂溶胀降低，B配方片剂中卡波姆和壳聚糖添加量相对较多时缓释层片剂溶胀较高。

2、片剂黏附力研究

安乐处死体重大于2.5kg的新西兰雌性白兔，切开暴露2cm×2cm的***组织，用磷酸盐缓冲液(PBS, pH 6.8)清洗，保持粘膜的完整性。选择上述实验中的B配方片剂，片剂上滴加2滴氰基丙烯酸酯胶，将药片附着在测力计支架上。待使用***组织用PBS溶液洗涤保持湿润，然后用模拟***液湿润药片的游离侧，指尖用力使其基质层与***组织粘膜表面接触20s。2分钟后片剂与组织形成粘连。使用测力计测量片剂的黏附强度(片剂从兔***粘膜脱离所需的力)。测力计测量了***片的生物黏附强度，单位为克(g)。

黏附力(N)=生物粘附强度(g)×0.0098

4个配方片剂黏附力试验为3次，每次随机抽取3片供研究。

黏附力与黏附时间结果如表5所示。

表5

片剂的黏附力非常重要，主要作用让益生菌长时间附着在给药的地方，防止未达到作用效果排出。如表5结果显示，黏附强度和黏附力的结果表示为每次完成试验的三次药片测量结果的平均值(*表示p<0.05)。为了检验所达到的黏附力是否保证了药片在***内的持久性，直到益生菌负荷完全释放，从表5中可以看出，所研究的各片剂的黏附力测试结果相似。配方C片剂黏附力最低，这可能与使用的***粘膜状态有关，因为这种情况下，它的表面更均匀光滑，配方B片剂黏附力最大，为0.0983 N。选择配方B片剂进行后续研究。

此试验还研究了黏附时间，对4种不同配方的片剂进行分析，结果用每种配方测试的黏附小时数的测量的时间平均值表示。黏附时间平均值为12.75±0.42 h。结果表明，改善***感染的益生菌片剂可每日给药2次。

3、片剂益生菌贮存及活力测试研究

将B组益生菌配方片剂，每组10片，分别保存在室温环境下和密闭干燥器中60天。密闭干燥器中使用硅胶作为干燥剂，对片剂进行防潮。在这段时间内，每隔30天对片剂中微生物进行培养评估细菌的活力。具体操作为将片剂溶解在9mL无菌纯净水中，吸取1mL于MRS固体培养基上37℃，48h培养进行平板计数。

结果如图2所示，在室温条件和干燥箱中保存60天并进行细菌活力测定。n=10，所有点均以mean ± SD表示，稳定性研究表明，在干燥器和室温下，配方B片剂细菌活力在60天内整体上保持不变。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种改善***感染的益生菌剂及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种改善***感染的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂中的菌株包括保藏编号为CGMCC No.24110的干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株和保藏编号为CCTCC NO:M 2022572的嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA18菌株。

2.根据权利要求1所述的改善***感染的益生菌剂，其特征在于，所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株和嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA18菌株的活菌数之比为(3-9):1。

3.根据权利要求1所述的改善***感染的益生菌剂，其特征在于，所述干酪乳杆菌Lactobacillus casei LC16菌株和嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus LA18菌株的活菌数独立地不低于1×10⁹ CFU/mL。

4.根据权利要求1所述的改善***感染的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂的剂型包括片剂。

5.根据权利要求1所述的改善***感染的益生菌剂，其特征在于，所述益生菌剂还包括保护剂、快速释放成分和缓速释放成分。

6.根据权利要求5所述的改善***感染的益生菌剂，其特征在于，所述保护剂包括乙酸、牛血清白蛋白、丙二醇、乳酸或海藻酸盐中的任意一种或至少两种的组合。

7.根据权利要求5所述的改善***感染的益生菌剂，其特征在于，所述缓速释放成分包括硬脂酸、羧甲基纤维素钠、抗坏血酸、乳糖、滑石粉、硬脂酸镁、壳聚糖或卡波姆中的任意一种或至少两种的组合。

8.根据权利要求5所述的改善***感染的益生菌剂，其特征在于，所述快速释放成分包括乳糖、己二酸、碳酸氢钠或玉米淀粉中的任意一种或至少两种的组合。

9.一种根据权利要求1-8中任一项所述的改善***感染的益生菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

（1）将菌株活化、发酵后与保护剂混合，冷冻干燥，得到复合益生菌颗粒；

（2）将复合益生菌颗粒与缓速释放成分混合造粒，再与快速释放成分混合，压片，即得。

10.一种根据权利要求1-8中任一项所述的改善***感染的益生菌剂在制备改善***感染的产品中的应用。