CN117942293A - 用于化妆品的铁皮石斛发酵物的制备方法和铁皮石斛发酵物和化妆品 - Google Patents

用于化妆品的铁皮石斛发酵物的制备方法和铁皮石斛发酵物和化妆品 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种用于化妆品的铁皮石斛发酵物的制备方法和铁皮石斛发酵物和化妆品，制备方法包括：将铁皮石斛茎部的粉碎物料与水的混合物灭菌和冷却，以得到浆液；在浆液中加入碳源，后接种发酵菌种，进行发酵，以得到铁皮石斛发酵混合液；将铁皮石斛发酵混合液进行固液分离并高温灭菌，从滤液中得到铁皮石斛发酵物。避免传统方法处理铁皮石斛茎部时活性物质的流失和浪费，是一种高效，天然绿色的制备方法，制得的铁皮石斛发酵物安全、有效，可以用于化妆品。

Description

用于化妆品的铁皮石斛发酵物的制备方法和铁皮石斛发酵物 和化妆品
技术领域
本申请属于化妆品原料提取技术领域，具体涉及一种用于化妆品的铁皮石斛发酵物的制备方法和铁皮石斛发酵物和化妆品。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium officinale)又称黑节草、铁皮石斛、铁皮斗。生于海拔达1600米的山地半阴湿的岩石上，被列为九大仙草之首。铁皮石斛中活性物质具备抗苍老、进步免疫力、活血化瘀、抗肿瘤、补五脏等作用。铁皮石斛的主要功效成分有石斛多糖、黄酮、酚类、萜类和生物碱等。
传统技术中，一般采用水提的方式水提醇沉方式提取铁皮石斛内的多糖等活性物质，但活性物质的提取率低。药用铁皮石斛一般通过传统方法制备成干燥、色深的铁皮枫斗形式，但制备过程经过了长时间烘晒处理，部分活性物质失活、变性、挥发，造成的活性物质浪费。因此，对铁皮石斛有效成分的提取技术仍有待改进。
发明内容
本申请实施例提供一种用于化妆品的铁皮石斛发酵物的制备方法和铁皮石斛发酵物和化妆品，旨在提供一种保留更多有效活性物质的铁皮石斛发酵物的制备方法和铁皮石斛发酵物和化妆品。
第一方面，本申请实施例提供一种用于化妆品的铁皮石斛发酵物的制备方法，包括：
将铁皮石斛茎部的冻干粉碎物料与水的混合物灭菌和冷却，以得到浆液；
在浆液中加入碳源，后接种发酵菌种，进行发酵，以得到铁皮石斛发酵混合液；
将铁皮石斛发酵混合液进行固液分离并高温灭菌，从滤液中得到铁皮石斛发酵物。
根据本申请一个方面的实施例，制备方法还包括：
将铁皮石斛茎部进行冻干并粉碎，以得到铁皮石斛的冻干粉碎物料；将冻干粉碎物料与水以1:50～200的质量比进行混合，以提供所述铁皮石斛茎部的粉碎物料与水的混合物。根据本申请一个方面的实施例，灭菌包括：在温度为115℃～125℃的条件下进行灭菌。
根据本申请一个方面的实施例，发酵菌种选为双歧杆菌乳亚种。
根据本申请一个方面的实施例，发酵菌种的接种体积为浆液总体积的2％～10％。
根据本申请一个方面的实施例，在浆液中加入碳源，后接种发酵菌种，进行发酵，以得到铁皮石斛发酵混合液包括：
在浆液中加入碳源，后接种发酵菌种，在温度为32℃-37℃，发酵液的溶解氧≤1％,PH为6.5～7.0的条件下，同时在搅拌转速为100rpm～300rpm的条件下进行发酵，发酵的时间为24-60h，以得到铁皮石斛发酵混合液。
根据本申请一个方面的实施例，固液分离方式选自陶瓷膜分离、中空纤维膜分离、离心分离、板框压滤或其组合。
根据本申请一个方面的实施例，将铁皮石斛发酵混合液进行固液分离并高温灭菌，从滤液中得到铁皮石斛发酵物包括：
将铁皮石斛发酵混合液在温度为100℃～110℃的条件下进行第一次灭菌，第一次灭菌的时间为10～30min，后进行固液分离，以得到滤液；
将滤液在温度为115℃～125℃的条件下进行第二次灭菌，第二次灭菌的时间为15～30min，以得到铁皮石斛发酵物。
第二方面，本申请提供了一种用于化妆品的铁皮石斛发酵物，由第一方面的制备方法得到。
根据本申请一个方面的实施例，铁皮石斛发酵物还包含防腐剂。
第三方面，本申请提供了一种化妆品，包含第一方面制备方法制得的铁皮石斛发酵物或第二方面的铁皮石斛发酵物。
与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
本申请提供的制备方法，利用发酵菌对铁皮石斛茎部的冻干粉碎物料的浆液进行发酵，使得铁皮石斛中包含的活性物质能够充分被发酵菌酵解、释放出来，最后通过高温灭菌去除发酵菌和灭除杂菌，利用固液分离技术将活性物质进行分离，避免传统方法处理铁皮石斛茎部时活性物质的流失和浪费，是一种高效，天然绿色的制备方法，制得的铁皮石斛发酵物安全、有效，可以用于化妆品。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了本申请中不同接种量发酵产物对DPPH自由基清除率；
图2示出了本申请实施例和对比例中铁皮石斛发酵物对DPPH自由基清除率；
图3示出了本申请实施例和对比例中铁皮石斛发酵物功效成分含量；
图4示出了本申请实施例和对比例细胞毒性结果。
具体实施方式
下面将详细描述本申请的各个方面的特征和示例性实施例，为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施例，对本申请进行进一步详细描述。应理解，此处所描述的具体实施例仅意在解释本申请，而不是限定本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以在不需要这些具体细节中的一些细节的情况下实施。下面对实施例的描述仅仅是为了通过示出本申请的示例来提供对本申请更好的理解。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
近年来，关于植物药材作的研究越来越多，实现了植物药材的广泛应用。
为了推动植物药材的多场景应用，发明人进行了大量研究，发现植物药材可以作为菌株的发酵基质，通过微生物发酵作用，可以对植物药材中的糖种类进行调节，减少单糖成分或降低多糖分子量，从而提高多糖分子的有效吸收。
传统技术中，提取主要通过有机溶剂萃取的方法，而这种方法的提取效率低，不适用于工业生产，同时发酵物中可能残留的有机溶剂也会影响发酵物的进一步利用。
发明人经研究发现，通过部分微生物作用，石斛中的蛋白质、氨基酸、脂肪酸以及多酚含量均会发生变化，发酵后铁皮石斛在抗衰老，维持皮肤微生态平衡及保湿方面的护肤作用可以得到较好的改善。
经进一步研究发现，发现使用部分发酵菌种的发酵液的抗氧化性能显著高于其他常用的发酵微生物，例如双歧杆菌；其可能的原因是双歧菌能够利用铁皮石斛溶出的活性成分，如类黄酮、多糖、皂苷等，作为双歧杆菌的益生元，一方面促进菌株的生长和代谢，一方面在代谢过程产生的各种酶类，会使铁皮石斛原有的活性成分发生转化，得到新的活性成分，或是被降解为更多低极性和小分子量的代谢产物，从而提高铁皮石斛的抗氧化性能。
铁皮石斛发酵物的制备方法
第一方面，本申请实施例提供一种用于化妆品的铁皮石斛发酵物的制备方法，包括：
(a)将铁皮石斛茎部的粉碎物料与水的混合物灭菌和冷却，以得到浆液；
(b)在浆液中加入碳源，后接种发酵菌种，进行发酵，以得到铁皮石斛发酵混合液；
(c)将铁皮石斛发酵混合液进行固液分离并高温灭菌，从滤液中得到铁皮石斛发酵物。
在本申请实施例中，铁皮石斛的主要功效成分有石斛多糖、黄酮、酚类、萜类和生物碱等。石斛发酵物在化妆品领域具有抗氧化、抗衰、抗菌、保湿、美白等多种功效。利用发酵菌种的发酵作用，将铁皮石斛中的大分子活性成分分解为小分子活性成分，例如，大分子多糖降解为易于皮肤吸收的小分子单糖或寡糖；从而更易被肌肤吸收，同时配合发酵菌种产生的代谢产物，大大增加了铁皮石斛功效成分的利用率及其抗氧化能力，进一步提高了铁皮石斛发酵物中的有效活性物质，提高了铁皮石斛发酵物在化妆品中的使用是的抗氧化性和去除自由基的性能。可以将石斛发酵物作为化妆品直接使用或添加到化妆品基础配方中使用，具有较好的抗氧化、抗衰老、滋养肌肤的效果。
根据本申请实施例，上述制备方法利用发酵菌种的发酵作用，促进铁皮石斛中活性成分(如多糖、皂苷)溶出，或者铁皮石斛原有的活性成分发生转化，得到新的活性成分，或是被降解为更多低极性和小分子量的代谢产物，上述制备方法简单，提取效率高，生产周期短且具有良好的安全性。
在本申请实施例中，步骤(a)中，水可选为去离子水。可以避免在铁皮石斛发酵物中引入新杂质。
在一些实施例中，步骤(a)中，制备方法还包括：
将铁皮石斛茎部进行冻干并粉碎，以得到铁皮石斛的冻干粉碎物料；将冻干粉碎物料与水以1:50～200的质量比进行混合，以提供所述铁皮石斛茎部的粉碎物料与水的混合物。
根据本申请实施例，控制铁皮石斛茎部冻干粉碎物料与水以1:50～200的质量比进行混合，可以在兼顾充分溶解铁皮石斛茎部，为后续发酵提供适宜的环境基础上，可以在不进行浓缩的基础上，提供有效活性物质在溶液中的浓度。
在一些实施例中，步骤(a)中，铁皮石斛茎部可以经冷冻干燥后进行粉碎，制得铁皮石斛茎部的粉碎物料，冷冻干燥可以有效保护铁皮石斛中的有效活性组分。
在一些实施例中，步骤(a)中，灭菌包括：在温度为115℃～125℃的条件下进行灭菌。通过对铁皮石斛茎部的粉碎物进行灭菌，可以避免杂菌在后续发酵中影响发酵菌种发酵，同时净化了铁皮石斛发酵物，避免了很多杂菌在发酵液中产生有害物质，可以使其用于化妆品。
在一些实施例中，步骤(b)中，碳源选自葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖或其组合。根据本申请实施例，发酵菌种对发酵条件较为敏感，碳源的含量过低，无法满足发酵菌种前期生长繁殖的要求，含量过高，会影响发酵效果。发明人根据大量实验确定，碳源在浆液中的初始浓度可以为2g/L～10g/L，以便为后续发酵菌种提供充足的碳源，促进其充分发酵。
在一些实施例中，步骤(b)中，发酵菌种双歧杆菌乳亚种。上述发酵菌种可以使铁皮石斛中的有效活性组分溶出，同时可以将大分子物质分解为小分子物质，提高铁皮石斛发酵物使用时的抗氧化性。
需要说明的是，实施例中使用的双歧杆菌购于中国普通微生物保藏管理中心，编号为CGMCC 1.2226。
在一些实施例中，步骤(b)中，发酵菌种子液中活菌浓度为106～108CFU/mL。通过控制发酵菌种子液中活菌浓度，有利于保证发酵液中初始菌种的浓度，保证发酵的顺利进行，同时提高发酵的效率。
在一些实施例中，步骤(b)中，发酵菌种的接种体积为浆液总体积的2％～10％。通过控制发酵菌种的接种体积，有利于保证发酵液中初始菌种的浓度，保证发酵的顺利进行，同时提高发酵的效率。
发酵菌种接种量以及活菌数对最终得到发酵液具有一定的影响，发明人通过实验确定了上述活菌浓度和接种体积。
在一些实施例中，步骤(b)中，在浆液中加入碳源，后接种发酵菌种，进行发酵，以得到铁皮石斛发酵混合液包括：
在浆液中加入碳源，后接种发酵菌种，在温度为32℃-37℃，发酵液的溶解氧≤1％,PH为6.5～7.0的条件下，同时在搅拌转速为100rpm～300rpm的条件下进行发酵，发酵的时间为24-60h，以得到铁皮石斛发酵混合液。
根据本申请实施例，发酵菌种对发酵条件较为敏感，发酵体系中的水分活度以及氧气浓度等参数，会导致发酵过程以及产物存在区别。发酵温度，发酵时间对发酵产物的影响较大，时间太短，铁皮石斛的活性成分溶出不充分且发酵菌种的代谢产物较少，时间太长，可能导致微生物利用活性成分过多，导致发酵液中有效成分降低。发明人通过大量实验确定双歧杆菌可以在温度为32℃-37℃，发酵液的溶解氧≤1％,PH为6.5～7.0的条件下生长，并利用发酵液中的成分，实现对铁皮石斛有效活性物质的溶出，提高有效活性物质的组分；使大分子物质分解为小分子物质，提高铁皮石斛发酵物使用时的抗氧化性。
在一些实施例中，步骤(c)中，固液分离方式选自陶瓷膜分离、中空纤维膜分离、离心分离、板框压滤或其组合。上述固液分离的方式可以有效分离发酵混合物中的固体渣和发酵液，实现有效分离。例如，中空纤维膜分离中的膜呈毛细管状，微孔位于管壁上，能有效实现发酵混合物中各组分的分离，以各组分能否通过这些微孔来实现分离。
在一些实施例中，步骤(c)中，将铁皮石斛发酵混合液进行固液分离并高温灭菌，从滤液中得到铁皮石斛发酵物包括：
将铁皮石斛发酵混合液在温度为100℃～110℃的条件下进行第一次灭菌，第一次灭菌的时间为10～30min，后进行固液分离，以得到滤液；
将滤液在温度为115℃～125℃的条件下进行第二次灭菌，第二次灭菌的时间为15～30min，以得到铁皮石斛发酵物。
根据本申请实施例，在温度为100℃～110℃的条件下进行第一次灭菌，是为了及时杀灭发酵菌种，终止菌种生长代谢，实现定向灭菌，避免在后续提取操作过程中，活菌继续生长，对功效成分过度利用，甚至进入微生物的衰退期。当发酵菌种在上述条件下发酵24-60h后，根据菌种繁殖的周期，发酵菌种处于衰退期，会分泌溶酶体，导致细胞自溶，所释放的胞内酶可能会对功效物质进行酶解、破坏、改变pH环境，最终造成有效物质的损失，甚至直接产生有害物质，如内毒素。
基于本申请的铁皮石斛发酵物用于化妆品，而有害物质在后续过程中不易去除，且在后续去除过程中，可能会降低有效活性物质的含量或使其失活，避免铁皮石斛活性物质的流失和浪费。因此，在此时温度为100℃～110℃的条件下进行时十分有必要和关键的。
根据本申请实施例，将滤液在温度为115℃～125℃的条件下进行第二次灭菌，10～30min，是基于进行了固液分离，可能引入了部分杂菌，由于本申请的铁皮石斛发酵物用于化妆品，在115℃～125℃的条件下进行灭菌，15～30min，去除杂菌，使铁皮石斛发酵物进行无菌保藏。
第二方面，本申请提供了一种用于化妆品的铁皮石斛发酵物，由第一方面的制备方法得到。
在一些实施例中，铁皮石斛发酵物还包含防腐剂。
在一些实施例中，防腐剂选自对羟基苯乙酮、1,2-己二醇或其组合。
制备含防腐剂的铁皮石斛发酵物时，向铁皮石斛发酵物添加防腐剂在温度为60℃～80℃时，使两者充分混合，以得到含防腐剂的铁皮石斛发酵物。
在本申请实施例中，防腐剂的添加有助于延长铁皮石斛发酵物的使用寿命，防止细菌污染等积极效果。
在一些实施例中，对羟基苯乙酮添加于含防腐剂的铁皮石斛发酵物中的体积百分数为0.5％～2％。在一些实施例中，1,2-己二醇添加于含防腐剂的铁皮石斛发酵物中的体积百分数为0.5％～2％。添加上述体积分数的防腐剂，在不影响铁皮石斛发酵物的功效基础上，可以延长使用期限。
第三方面，本申请提供了一种化妆品，包含第一方面制备方法制得的铁皮石斛发酵物或第二方面的铁皮石斛发酵物。
根据本申请实施例，铁皮石斛发酵物可以添加到化妆品基础配方中使用，具体的，铁皮石斛发酵物占皮肤外用化妆品的质量百分比为1％～99％；可选的，铁皮石斛发酵物占皮肤外用化妆品的质量百分比为10％～80％
实施例
下述实施例更具体地描述了本申请公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本申请公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。
实施例1
本申请实施例提供一种用于化妆品的铁皮石斛发酵物的制备方法，包括：
将铁皮石斛茎部的粉碎物料与水的混合物灭菌和冷却，以得到浆液；具体包括：取铁皮石斛茎段的冻干粉40g，加入去离子水1L进行匀浆，并在5L发酵罐中加水定容至4L，匀浆液经过121℃灭菌20min。
在浆液中加入碳源，后接种发酵菌种，双歧杆菌，进行发酵，以得到铁皮石斛发酵混合液；具体包括：用泵补入5g/L提前灭菌的葡萄糖，以形成初始发酵体系。随后通入氮气排除发酵罐内的溶解氧(DO)，控制DO≤1％，接入提前培养至活菌量为106～108CFU/mL的双歧杆菌种子液320ml(发酵液体积的8％)，随后在35℃环境、搅拌转速100rpm～300rpm、PH6.5±0.5的条件下发酵培养48小时。
将铁皮石斛发酵混合液进行固液分离并高温灭菌，从滤液中得到铁皮石斛发酵物。具体包括：将发酵液升温105℃，灭活10分钟，冷却后，用板框进行压滤，获得透清液体为发酵滤液3600ml，随后将滤液于120℃灭菌20min,降温至80℃时，开始加入对羟基苯乙酮20g,1,2-己二醇18g，并混匀溶解，随后继续冷却至室温。
实施例2-6
制备方法同实施例1，不同之处在于双歧杆菌接种量分别按2％，4％，6％，8％，10％进行接种，其他条件参数同实施例1。最终对发酵产物滤液的抗氧化性能进行DPPH自由基清除率的比较，结果如表1，作图如图1。从数据可知，在50％样品浓度下，双歧杆菌种子液8％接种量进行发酵时，其发酵产物滤液的DPPH自由基清除率最高，间接反映了发酵产物的相对较优的抗氧化性能。
表1不同接种量发酵产物对DPPH自由基清除率的比较
项目 接种量
实施例2 2％
实施例3 4％
实施例4 6％
实施例5 8％
实施例6 10％
实施例7
制备方法如实施例1，不同之处在于发酵周期为60h。在最长60h内还是得到了可靠的安全的产品。
对比例1
制备方法同实施例1，不同之处在于：不接种菌株，直接发酵。
对比例2
制备方法同实施例1，不同之处在于：
在发酵培养后，直接进行固液分离，以得到滤液；
将滤液在温度为115℃～125℃的条件下进行灭菌，灭菌的时间为15～30min，以得到铁皮石斛发酵物。
测试部分
DPPH自由基清除率
DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其褪色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。
DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：
(1)取等体积(1mL)的待测液与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A1管)；
(2)取等体积(1mL)的无水乙醇(待测物溶剂)与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A2管)；
(3)取等体积(1mL)的无水乙醇与待测液混匀(A3管)；
(4)避光反应30min后，在517nm下测A1管、A2管、A3管吸光度值；清除率计算公式为：清除率＝[(A2+A3)-A1]/A2×100％。
本实验对实施例1～4和对比例1～2的样品进行DPPH自由基清除实验的测试，测试结果如表2、图1所示。
表2.DPPH自由基清除率。
项目 DPPH自由基清除率
实施例2 60.8％
实施例3 64.4％
实施例4 65.0％
实施例5 74.8％
实施例6 70.8％
对上述发酵产物滤液的抗氧化性能进行DPPH自由基清除率的比较，结果如表1，作图如图1。从数据可知，双歧杆菌种子液8％接种量进行发酵时，其发酵产物滤液的DPPH自由基清除率最高，反映了发酵产物的相对较优的抗氧化性能。
根据上述DPPH自由基清除率测定方法，对实施例1和对比例1中的石斛发酵物进行测定，记录结果，如表3所示和图2所示。
从数据可知，总皂苷提高了35％。并在抗氧化性能方面，接种发酵后，其DPPH自由基清除率达到了86.3％，比不接菌发酵前提高了30.6％，表明本申请方案对石斛发酵物在化妆品的抗氧性方面具有显著的优势。
有效活性组分的测定
实施例中所描述的功效成分：总蛋白、总多酚、总糖、总黄酮、总皂苷的含量检测方法参考描述如下：
总蛋白含量检测采用北京百瑞极生物科技有限公司生产的货号为BN27109的BCA蛋白定量检测试剂盒进行测定。
总多酚含量检测按照GB/T8313-2018《茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》进行测定。
总糖含量检测按照GB/T 15672-2009《食用菌中总糖含量的测定》，稍作调整，将试样水解操作过程调整为“取发酵液5ml,加10％盐酸25ml，于100℃水浴30min，冷却后加水定容至50ml”其余不变。
总皂苷的测定方法按照T-AHFIA 004-2018《食品中总皂苷含量的测定-分光光度法》进行测定。
总黄酮的测定方法按照DB43T 476-2009《植物源性食品中总黄酮的测定》进行测定。
根据上述方法对实施例1和对比例1中的石斛发酵物进行含量检测。结果如表4所示和图3所示。
表4实施例1和对比例1-2中有效活性组分的含量。
由上表可知，实施例1相比对比例1中的有效活性组分，总皂苷、总多酚、总糖含量更高。
细胞(HaTAC)急性毒性的测试
试剂：
0.25％(含EDTA)胰蛋白酶，生产厂家为美国GIBCO公司；
DMEM培养基，生产厂家为美国GIBCO公司；
双抗，生产厂家为美国Corning公司；
CCK-8，生产厂家为北京拜尔迪生物技术有限公司；
胎牛血清，生产厂家为美国GIBCO公司；
磷酸盐缓冲液，生产厂家为北京百瑞极生物科技有限公司。
设备：
WJ-80A-Ⅱ型CO2恒温培养箱，生产厂家为上海圣科仪器设备有限公司；
Sunrise酶标仪，生产厂家为帝肯贸易有限公司；
TL80-2型医用离心机，生产厂家为江苏天力医疗器械有限公司；
NUNC 96孔细胞培养板，生产厂家为赛默飞世尔科技公司
具体步骤：分别将上述实施例1～6和对比例1～2制得的产品用无血清的DMEM培养基配置成体积百分数为5％的实验组待测液。人永生化角质形成细胞养于含10％胎牛血清以及1％双抗(1×105U/L的青霉素、100mg/L的链霉素)的DMEM培养基中。细胞生长于37℃、5％ CO2饱和湿度的培养箱中，当细胞融合达到85％以上时，以0.05％胰酶消化对数生长期细胞，用含血清的DMEM终止消化反应。用细胞计数板计数，将细胞悬液浓度调整到7×104个/mL，将细胞悬液按照每孔100μL的比例接种到96孔板上，37℃、5％ CO2条件下孵育12h。去除旧培养液，用磷酸盐缓冲液清洗细胞两遍。实验组中每孔加入100μL上述配置的已过滤除菌的不同浓度的实验组待测液，每个待测液做6个复孔；对照组含有细胞，加入无血清的DMEM培养基；空白对照组无细胞，加入100μL的PBS。再于37℃、5％ CO2条件下孵育24h。然后每孔加入10μL的CCK-8溶液，再孵育3h，在450nm波长下测定吸光度值，计算各组细胞存活率，细胞存活率的计算公式如下：
细胞存活率(％)＝(A实验组-A空白对照组)/(A对照组-A空白对照组)×100％。
测试结果见下表5，将测试结果制成数据图4以进行对比。
表5铁皮石斛发酵液急性毒性的测试结果。
项目 细胞存活率(％)
样品体积分数 5％
实施例1 92.54±0.2
实施例2 84.58±0.89
实施例3 89.43±1.00
实施例4 90.43±0.45
实施例5 89.65±0.65
实施例6 84.97±0.88
对比例1 82.12±1.43
对比例2 81.53±1.20
从表5数据来看，不同样品，HaCAT细胞存活率均大于81％，表明本申请方法所制备的铁皮石斛发酵滤液对人体角质形成细胞具有良好的安全性，人体角质形成细胞可正常生长，间接地表明本方案制备的石斛发酵滤液在化妆品中的应用是安全可靠的。
以上所述，仅为本申请的具体实施方式，所属领域的技术人员可以清楚地了解到，为了描述的方便和简洁，上述描述的***、模块和单元的具体工作过程，可以参考前述方法实施例中的对应过程，在此不再赘述。应理解，本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于化妆品的铁皮石斛发酵物的制备方法，包括：
将铁皮石斛茎部的冻干粉碎物料与水的混合物灭菌和冷却，以得到浆液；
在所述浆液中加入碳源，后接种发酵菌种，进行发酵，以得到铁皮石斛发酵混合液；
将所述铁皮石斛发酵混合液进行固液分离并高温灭菌，从滤液中得到铁皮石斛发酵物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：
将铁皮石斛茎部进行冻干并粉碎，以得到铁皮石斛的冻干粉碎物料；将冻干粉碎物料与水以1:50～200的质量比进行混合，以提供所述铁皮石斛茎部的粉碎物料与水的混合物。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述灭菌包括：在温度为115℃～125℃的条件下进行灭菌。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述发酵菌种双歧杆菌乳亚种；和/或，所述发酵菌种的接种体积为所述浆液总体积的2％～10％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述浆液中加入碳源，后接种发酵菌种，进行发酵，以得到铁皮石斛发酵混合液包括：
在所述浆液中加入碳源，后接种发酵菌种，在温度为32℃-37℃，发酵液的溶解氧≤1％,PH为6.5～7.0的条件下，同时在搅拌转速为100rpm～300rpm的条件下进行发酵，发酵的时间为24-60h，以得到铁皮石斛发酵混合液。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述固液分离方式选自陶瓷膜分离、中空纤维膜分离、离心分离、板框压滤或其组合。
7.根据权利要求1-5中任意一项所述的制备方法，其特征在于，
将所述铁皮石斛发酵混合液进行固液分离并高温灭菌，从滤液中得到铁皮石斛发酵物包括：
将所述铁皮石斛发酵混合液在温度为100℃～110℃的条件下进行第一次灭菌，第一次灭菌的时间为10～30min，后进行固液分离，以得到滤液；
将所述滤液在温度为115℃～125℃的条件下进行第二次灭菌，第二次灭菌的时间为15～30min，以得到铁皮石斛发酵物。
8.一种用于化妆品的铁皮石斛发酵物，由如权利要求1-7任一项所述的制备方法得到。
9.根据权利要求8所述的铁皮石斛发酵物，其特征在于，所述铁皮石斛发酵物还包含防腐剂。
10.一种化妆品，包含权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的铁皮石斛发酵物或权利要求8或9所述的铁皮石斛发酵物。
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