CN111135123B - 一种卷柏发酵提取液的制备方法和应用 - Google Patents

一种卷柏发酵提取液的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种卷柏发酵提取液及其制备方法和在护肤类化妆品中的应用。所述卷柏发酵提取液的原料包括卷柏、葡萄糖、酪蛋白、维生素C、水构成的发酵体系及种子菌液；所述种子菌液包括乙酸钠、大豆蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、蒸馏水及布氏乳杆菌。制备方法为：分别制备种子菌液和发酵体系；将种子菌液稀释后，接入发酵体系静置发酵；将得到的发酵物过滤，将液相部分与固相部分分离，液相部分微滤除去菌体，再加入多元醇，调节pH值，即得卷柏发酵提取液。本发明采用天然植物原料辅以益生菌发酵，充分利用菌体代谢过程对大分子化合物的降解作用制备的提取液，具有补水保湿、修复基底、调节皮肤微生态等功效。

Description

一种卷柏发酵提取液的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种通过发酵提取卷柏中高活性溶胞物的方法，具体涉及一种益生菌发酵卷柏制备提取液的方法，属于生物技术领域。
背景技术
卷柏是土生或石生复苏植物，全草程垫状，海藻糖含量约0.14％，故耐旱能力极强，能在脱水95％以上的生理情况下生存且遇水快速复苏。全株黄酮类物质含量约0.42％，故有止血、收敛、抗炎和皮肤修复的效能。且卷柏干叶含有丰富的多糖、氨基酸、蛋白、黄酮类天然护肤因子，具有强效的保湿、抗氧化功效。
目前绝大多数涉及卷柏的专利中，其主要内容为黄酮类化合物的提取，且提取方法多采用水提法，提取过程中，卷柏原料长时间处于80℃以上的高温状态，破坏卷柏主活性成分的稳定性，同时存在着耗能高、原料提取率低、废水排放量大、提取液气味不佳、颜色稳定性差等一系列问题。通过专利查阅，只有专利CN 106726976A涉及一种去屑止氧发酵药物及其制备方法和应用，该专利仅在十几种草本原料中少量添加卷柏，并且采用酵母发酵，并未涉及益生菌中的乳酸菌发酵制备卷柏发酵提取液。
目前，通过发酵提取卷柏营养物的研究还比较有限，基于天然化妆品原料在市场中的需求日益上升，此类生物发酵植物提取液的研究有极大的拓展空间。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种卷柏营养物及其制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种卷柏发酵提取液，其特征在于，原料包括卷柏、葡萄糖、酪蛋白、维生素C、水构成的发酵体系及种子菌液；所述种子菌液包括乙酸钠、大豆蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、蒸馏水及布氏乳杆菌。
优选地，所述发酵体系中卷柏的质量百分比为0.1-3％，葡萄糖的质量百分比为0.1-2％，酪蛋白的质量百分比为0.001-0.04％，维生素C的的质量百分比为0.001-0.01％，其余为水；所述菌液包括以重量份数计的乙酸钠0.6份、大豆蛋白胨4份、葡萄糖4份、酵母膏1份、磷酸氢二钾0.4份、硫酸镁0.12份、硫酸锰0.05份、蒸馏水200份。
优选地，所述的布氏乳杆菌于2019年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，编号为CGMCC No.19125，分类名：布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)。
优选地，所述种子菌液稀释定量至1×109cfu/mL后再加入到发酵体系中，加入量为发酵体系质量的0.5-3％。
本发明还提供了上述卷柏发酵提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：将乙酸钠、大豆蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、蒸馏水混合均匀，将其pH值调至6.2±0.2，蒸汽灭菌后冷却至室温；
步骤2)：向步骤1)得到的混合液中接入布氏乳杆菌活化培养，制成种子菌液；
步骤3)：将卷柏粉与葡萄糖、酪蛋白、维生素C、水混合均匀，蒸汽灭菌后冷却至室温，制成发酵体系；
步骤4)：将种子菌液稀释后，接入发酵体系静置发酵；
步骤5)：将得到的发酵物过滤，将液相部分与固相部分分离，液相部分微滤除去菌体，再加入多元醇，调节pH值至5.0-6.0，即得卷柏发酵提取液。
优选地，所述步骤1)、步骤3)中蒸汽灭菌的温度为121℃，时间为15min。
优选地，所述步骤2)中活化培养的时间为48h。
优选地，所述步骤3)中的卷柏粉的制备方法为：选择干燥脱水的卷柏整株，除根除泥后挑选卷柏叶清洗、烘干、粉碎至60-100目得到卷柏粉。
优选地，所述步骤4)中发酵温度为37℃，发酵周期为24h至7天。
优选地，所述步骤5)中过滤所采用的滤膜的孔隙为40μm；微滤所采用的滤膜的孔隙0.22μm；液相部分多元醇的加入量为液相部分质量的5.1-5.6％；固相部分采用超声波高速剪切破碎菌体，均质后制成泥膜。
本发明还提供了上述卷柏发酵提取液在护肤类化妆品中的应用，其特征在于，所述卷柏发酵提取液的加入量为所有原料总质量的10-20％。
本发明提供一种卷柏发酵提取液的制备方法，该方法采用天然植物原料辅以益生菌发酵，充分利用菌体代谢过程对大分子化合物的降解作用制备的提取液，具有补水保湿、修复基底、调节皮肤微生态等功效，可广泛应用于护肤类化妆品中。
本发明采用采用的布氏乳杆菌为乳酸菌属，通过与浸提法对照实验，该菌株更能高效的溶出卷柏的活性化合物，黄酮、多糖、氨基酸、蛋白质等含量得到明显提升，同时具有良好的低免疫原性。第二，布氏乳杆菌CGMCC No.19125发酵卷柏，其发酵滤液保留了植物源草本的天然愉悦气息，实现了植物源与益生菌的相互增益。第三，生产的分离与除菌过程均采用常温处理方式，极大地降低了卷柏活性因子的损失与破坏，此外该工艺与浸提法相比也极大地降低了能耗。第四，在本发明提供的布氏乳杆菌CGMCC No.19125发酵卷柏工艺中，一方面发酵除菌滤液可用于高端化妆品的膏霜、保湿水、精华液等的天然原料，强化化妆品保湿、抗炎和抗敏功能，使肌肤更加细腻润泽而富有活力。另一方面，发酵滤渣通过细胞剪切破碎，获得卷柏与乳酸菌的混合溶胞物，进一步制成泥膜，可用于天然面膜原料等。综上，本发明提供的布氏乳杆菌CGMCC No.19125发酵卷柏制备发酵提取液的工艺技术，过程无废水、废渣的排放，同时该生产过程采用严格的厌氧发酵控制，基本无废气的排放，有效实现了该生产技术的绿色与环保。
本发明与已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明利用微生物法提取区别于传统水提法，利用乳酸杆菌的代谢作用促进卷柏高活性化合物溶出，提升提取液保湿、抗炎、修复的功效。采用非高温的除菌工艺极大保留卷柏天然愉悦气息，贴近构建皮肤微生态，实现绿色养肤的概念。
本发明提供了一种有益的乳酸菌对卷柏的活性化合物溶出与增效的工艺，获得的发酵提取液气味愉悦，富含黄酮、多糖、氨基酸、蛋白质等多种高活性因子，且可被皮肤快速吸收利用，可广泛应用于保湿水、护肤霜、精华液中，达到长效保湿、抗炎抗敏、修复基底、平衡表皮菌群的天然护肤效果。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，作详细说明如下。
下列各实施例中所采用的布氏乳杆菌于2019年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，编号为CGMCCNo.19125，分类名：布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)。
实施例1
一种卷柏发酵提取液的制备方法：
1)发酵菌种的活化
称取乙酸钠0.6g、大豆蛋白胨4g、葡萄糖4g、酵母膏1g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.12g、硫酸锰0.05g、蒸馏水200ml，将pH值调至6.2±0.2，高压蒸汽灭菌15min后冷却至室温，接入保藏菌种布氏乳杆菌CGMCC No.19125活化培养48h，制得活化后的种子培养基。
2)发酵培养基的制备
取干燥脱水后的卷柏整株，清洗、烘干后收集卷柏干叶粉碎得到60目卷柏粉末。在该发酵体系中加入0.1wt％卷柏粉末、0.1wt％葡萄糖、0.001wt％酪蛋白、0.001wt％维生素C，其余用水补足，充分摇匀后121℃、15min灭菌。
3)发酵过程
将种子培养基活化后稀释定量为1×109cfu/mL的种子菌液。向发酵培养基中加入质量为发酵体系质量的0.5wt％的种子菌液，37℃发酵24h。
4)发酵后处理
发酵结束后，上清液采用孔径为40μm滤膜除植物残渣后用孔径为0.22μm滤膜除去菌体，将pH值调至5.0-6.0制成卷柏发酵提取液；固相部分超声破碎1h、均质1.5h后制成泥膜。
实施例2
一种卷柏发酵提取液的制备方法：
1)发酵菌种的活化
称取乙酸钠0.6g、大豆蛋白胨4g、葡萄糖4g、酵母膏1g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.12g、硫酸锰0.05g、蒸馏水200ml，将pH值调至6.2±0.2，高压蒸汽灭菌15min后冷却至室温，接入保藏菌种布氏乳杆菌CGMCC No.19125活化培养48h，制得活化后的种子培养基。
2)发酵培养基的制备
取干燥脱水后的卷柏整株，清洗、烘干后收集卷柏干叶粉碎得到80目卷柏粉末。在该发酵体系中加入1wt％卷柏粉末、1wt％葡萄糖、0.02wt％酪蛋白、0.005wt％维生素C，其余用水补足，充分摇匀后121℃、15min灭菌。
3)发酵过程
将种子培养基活化后稀释定量为1×109cfu/mL的种子菌液。向发酵培养基中加入质量为发酵体系质量的2wt％的种子菌液，37℃发酵3天。
4)发酵后处理
发酵结束后，上清液采用孔径为40μm滤膜除植物残渣后用孔径为0.22μm滤膜除去菌体，将pH值调至5.0-6.0制成卷柏发酵提取液；固相部分超声破碎1h、均质1.5h后制成泥膜。
实施例3
一种卷柏发酵提取液的制备方法：
1)发酵菌种的活化
称取乙酸钠0.6g、大豆蛋白胨4g、葡萄糖4g、酵母膏1g、磷酸氢二钾0.4g、硫酸镁0.12g、硫酸锰0.05g、蒸馏水200ml，将pH值调至6.2±0.2，高压蒸汽灭菌15min后冷却至室温，接入保藏菌种布氏乳杆菌CGMCC No.19125活化培养48h，制得活化后的种子培养基。
2)发酵培养基的制备
取干燥脱水后的卷柏整株，清洗、烘干后收集卷柏干叶粉碎得到100目卷柏粉末。在该发酵体系中加入3wt％卷柏粉末、2wt％葡萄糖、0.04wt％酪蛋白、0.01wt％维生素C，其余用水补足，充分摇匀后121℃、15min灭菌。
3)发酵过程
将种子培养基活化后稀释定量为1×109cfu/mL的种子菌液。向发酵培养基中加入质量为发酵体系质量的3wt％的种子菌液，37℃培养箱发酵7天。
4)发酵后处理
发酵结束后，上清液采用孔径为40μm滤膜除植物残渣后用孔径为0.22μm滤膜除去菌体，将pH值调至5.0-6.0制成卷柏发酵提取液；固相部分超声破碎1h、均质1.5h后制成泥膜。
对比例1
取干燥脱水后的卷柏整株，清洗、烘干后收集卷柏干叶粉碎得到100目卷柏粉末。称取水提体系质量的3wt％卷柏粉末，其余用水补足，100℃回流3h。提取结束后，上清液采用孔径为0.22μm滤膜除去植物残渣，将pH值调至5.0-6.0制成卷柏提取液。
将实施例1-3和对比例1制备的发酵提取液进行相关测试。
检测方法如下：
1、黄酮浓度
1)标准溶液配制
精密称取芦丁对照品0.06g，加60％甲醇适量,置水浴中加热溶解，放冷，以60％甲醇定容于100mL容量瓶中，摇匀备用，配成芦丁含量为0.6g/L的标准液，备用。
2)标准曲线的制作
加2.5mL不同稀释倍数的标准液，加400uL 5wt％NaNO2，静置5min，加400uL10wt％Al(NO3)3，静置6min，加600uL 10wt％NaOH，静置6min，30％乙醇定容至10mL，静止10min，510nm处测吸光度。
3)待测样的检测
将2)中标准液改为待测液即可。
2、氨基酸含量
参考QB/T 2409-1998
3、多糖含量
参考SN/T 4260-2015
4、蛋白质含量
参照GB/T 6432-2018
上述测试的具体数据如表1所示。
表1
Figure BDA0002375613030000061
Figure BDA0002375613030000071
实施例4
一种抗蓝光抗过敏护肤水，包括以下质量百分比计的组分：
成分 含量
水 80wt％
卷柏发酵提取液 10wt％
甘油 3％
丁二醇 2％
对羟基苯乙酮 0.5％
戊二醇 0.5％
柠檬酸钠 0.3％
透明质酸 0.1％
乙基己基甘油 0.1％
制备方法：将水、甘油、丁二醇、对羟基苯乙酮、戊二醇、柠檬酸钠、透明质酸加入水相锅中，加热至80℃，保温搅拌溶解均匀；降温至40℃，加入卷柏发酵提取液搅拌均匀，即可得到抗蓝光抗过敏护肤水。
实施例5
一种抗氧化保湿护肤水，包括以下质量百分比计的组分：
Figure BDA0002375613030000072
Figure BDA0002375613030000081
制备方法：将水、甘油、丁二醇、水溶性维生素E、白藜芦醇、柠檬酸钠、透明质酸加入水相锅中，加热至80℃，保温搅拌溶解均匀；降温至40℃，加入卷柏发酵提取液搅拌均匀，即可得到抗蓝光抗过敏护肤水。
实施例6
一种抗氧化保湿护肤霜，包括以下质量百分比计的组分：
成分 含量
单甘脂 2wt％
鲸蜡硬脂酸 2wt％
植物角鲨烷 2.4％
橄榄油 3％
乳木果油 2.8％
植物甾醇 1％
卷柏发酵提取液 16.8％
苯氧乙醇 0.5％
水 70％
制备方法：将单甘脂、鲸蜡硬脂醇、植物角鲨烷、橄榄油、乳木果油、植物甾醇等加入油相锅加热到80-85℃，将水、卷柏发酵提取液等保湿剂加入水相锅加热到80-85℃，并保持恒温30min后，同时将油相锅和水相锅中原料抽入主乳化锅进行乳化，25rpm搅拌，3600转均质5-8min，后冷却水冷却至40±5℃，搅拌均匀混合，低于30℃出料。
对比例2
一种植物保湿护肤水，包括以下质量百分比计的组分：
Figure BDA0002375613030000082
Figure BDA0002375613030000091
制备方法：将水、甘油、丁二醇、水溶性维生素E、白藜芦醇、柠檬酸钠、透明质酸加入水相锅中，加热至80℃，保温搅拌溶解均匀。降温至40℃，加入卷柏发酵提取液搅拌均匀，即可得到植物保湿护肤水。
将实施例4-6和对比例2制备的护肤水进行相关测试。
检测方法如下：
1、透明质酸酶抑制率：
Figure BDA0002375613030000092
Figure BDA0002375613030000101
试剂配制：
乙酰丙酮试剂配制方法：称取26.5g Na2C03加水定容至500mL，加入4.9mL乙酰丙酮，45mL水，用HCI调节pH至9.8。
苯甲醛试剂配制方法：称取1.6g对二甲氨基苯甲醛溶于60mL无水乙醇与60mL浓盐酸混合液中。
Figure BDA0002375613030000102
2、脂肪氧化酶检测方法：
Figure BDA0002375613030000103
试剂配制：
LOX酶：1体积5-LOX酶加50体积蒸馏水。
底物：将吐温20以0.5ml/l浓度分散于0.2mol/L硼酸缓冲液中，再以0.54mL/L浓度加入亚油酸(亚油酸纯度>99％)，混匀后用1moL/L氢氧化钠调节缓冲液pH为9.0。
Figure BDA0002375613030000111
上述测试的具体数据如表2所示。
表2
Figure BDA0002375613030000112

Claims (10)

1.一种卷柏发酵提取液，其特征在于，原料包括卷柏、葡萄糖、酪蛋白、维生素C、水构成的发酵体系及种子菌液；所述种子菌液包括乙酸钠、大豆蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、蒸馏水及布氏乳杆菌；所述的布氏乳杆菌于2019年12月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，编号为CGMCC No.19125，分类名：布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)。
2.如权利要求1所述的卷柏发酵提取液，其特征在于，所述发酵体系中卷柏的质量百分比为0.1-3％，葡萄糖的质量百分比为0.1-2％，酪蛋白的质量百分比为0.001-0.04％，维生素C的质量百分比为0.001-0.01％，其余为水；所述菌液包括以重量份数计的乙酸钠0.6份、大豆蛋白胨4份、葡萄糖4份、酵母膏1份、磷酸氢二钾0.4份、硫酸镁0.12份、硫酸锰0.05份、蒸馏水200份。
3.如权利要求1所述的卷柏发酵提取液，其特征在于，所述种子菌液稀释定量至1×109cfu/mL后再加入到发酵体系中，加入量为发酵体系质量的0.5-3％。
4.权利要求1-3任意一项所述的卷柏发酵提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：将乙酸钠、大豆蛋白胨、葡萄糖、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、蒸馏水混合均匀，将其pH值调至6.2±0.2，蒸汽灭菌后冷却至室温；
步骤2)：向步骤1)得到的混合液中接入布氏乳杆菌活化培养，制成种子菌液；
步骤3)：将卷柏粉与葡萄糖、酪蛋白、维生素C、水混合均匀，蒸汽灭菌后冷却至室温，制成发酵体系；
步骤4)：将种子菌液稀释后，接入发酵体系静置发酵；
步骤5)：将得到的发酵物过滤，将液相部分与固相部分分离，液相部分微滤除去菌体，再加入多元醇，调节pH值至5.0-6.0，即得卷柏发酵提取液。
5.如权利要求4所述的卷柏发酵提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤1)、步骤3)中蒸汽灭菌的温度为121℃，时间为15min。
6.如权利要求4所述的卷柏发酵提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中活化培养的时间为48h。
7.如权利要求4所述的卷柏发酵提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中的卷柏粉的制备方法为：选择干燥脱水的卷柏整株，除根除泥后挑选卷柏叶清洗、烘干、粉碎至60-100目得到卷柏粉。
8.如权利要求4所述的卷柏发酵提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中发酵温度为37℃，发酵周期为24h至7天。
9.如权利要求4所述的卷柏发酵提取液的制备方法，其特征在于，所述步骤5)中过滤所采用的滤膜的孔隙为40μm；微滤所采用的滤膜的孔隙0.22μm；液相部分多元醇的加入量为液相部分质量的5.1-5.6％；固相部分采用超声波高速剪切破碎菌体，均质后制成泥膜。
10.权利要求1-3任意一项所述的卷柏发酵提取液在护肤类化妆品中的应用，其特征在于，所述卷柏发酵提取液的加入量为所有原料总质量的10-20％。
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