CN118286140A - 一种银耳多糖发酵物、含其产品、及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种银耳多糖发酵物、含其产品、及其制备方法和应用。银耳多糖发酵物的制备方法包括如下步骤：发酵底物包括银耳多糖和水；将乳酸菌接种到发酵底物中，经发酵培养8~13h，灭菌，即可；其中，乳酸菌包括嗜热链球菌和副干酪乳杆菌，嗜热链球菌和副干酪乳杆菌的活菌数比为1:（0.5~3）。本申请利用特定复合菌种对银耳多糖进行发酵，不仅降低银耳多糖分子量，还提高美容功效，经过本申请发酵的工艺，所制得的银耳多糖发酵物中活性成分含量增加，具有理想的抗衰老、抗氧化、促进细胞代谢和保湿等功效，制备工艺简单，发酵条件温和，不使用任何有机溶剂，实现节能环保。
Description
技术领域
本申请属于发酵技术领域，尤其涉及一种银耳多糖发酵物、含其产品、及其制备方法和应用。
背景技术
银耳是一种食药两用菌，在我国作为营养品被广泛使用。现代科学证明，银耳作为当代补品，具有提高人体免疫力、抗衰老、保湿等润肤功效。
银耳多糖是银耳的精华部分，被认为是一种植物源性类透明质酸物质，分子量高达100~130万，因银耳多糖分子量较大，皮肤无法直接吸收，也就无法充分发挥银耳多糖的功效；而且银耳多糖黏性较大，导致涂抹时肤感粘腻，造成了人们对其认可度不高。
因此，本领域亟需研发一种能够对银耳多糖进行有效分解的方法，提高其生物利用度和美容功效，提高肤感。
发明内容
本申请所要解决的技术问题是克服现有技术中银耳多糖分子量大，无法被皮肤直接吸收，生物利用度低，黏度大，肤感差等缺陷，而提供一种银耳多糖发酵物、含其产品、及其制备方法和应用。本申请利用特定复合菌种对银耳多糖进行发酵，不仅降低银耳多糖分子量，还可提高美容功效，经过本申请发酵的工艺，所制得的银耳多糖发酵物中活性成分含量增加，具有理想的抗衰老、抗氧化、促进细胞代谢和保湿等功效，制备工艺简单，发酵条件温和，且不使用任何有机溶剂，实现节能环保。
本申请采用以下技术方案解决上述技术问题：
本申请提供一种银耳多糖发酵物的制备方法，其包括如下步骤：发酵底物包括银耳多糖和水；将乳酸菌接种到所述发酵底物中，经发酵培养8~13h，灭菌，即可；
其中，所述乳酸菌包括嗜热链球菌和副干酪乳杆菌，所述嗜热链球菌和所述副干酪乳杆菌的活菌数比为1:（0.5~3）。
一些实施例中，所述发酵底物中的所述银耳多糖的平均相对分子质量可为100~125W。“W”为本领域技术人员常规认为地单位“万”。
一些实施例中，所述发酵底物中的所述水和所述银耳多糖的重量份数比可为100：（0.3~1），较佳地为100：（0.5~0.8），例如100：0.6。
一些实施例中，所述发酵底物中还可进一步包括碳源和/或氮源。
其中，所述碳源可包括除银耳多糖外发酵领域常规使用的碳源，较佳地包括糖类碳源，更佳地包括葡萄糖。
其中，所述氮源可包括发酵领域常规使用的氮源，较佳地包括大豆肽。
其中，所述水和所述碳源的重量份数比可为100：（0.4~0.9），较佳地为100：（0.5~0.7），例如100：0.6。
其中，所述水和所述氮源的重量份数比可为100：（0.05~0.25），较佳地为100：（0.1~0.25），例如100：0.2。
一些实施例中，所述水可包括纯净水和/或去离子水。
一些实施例中，所述发酵底物的制备方法包括：将所述发酵底物中各组分混合，直至各组分完全溶解，即可。
其中，所述混合的温度可为60~100℃，较佳地为70~80℃。
其中，所述混合可按照本领域常规在搅拌的条件下进行，所述搅拌的转速可为200~400rpm，较佳地为250~350 rpm，例如300rpm。
一些实施例中，所述发酵底物在使用前还可进一步包括灭菌的操作。
其中，对所述发酵底物进行所述灭菌的方法一般可为高温灭菌法。
当采用所述高温灭菌法对所述发酵底物进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为110℃~135℃，更佳地为115℃~130℃，例如121℃。
当采用所述高温灭菌法对所述发酵底物进行所述灭菌时，所述灭菌的压力可为本领域该类操作常规的压力，较佳地为0.1~0.15MPa，更佳地为0.1~0.13MPa，例如0.12MPa。
当采用所述高温灭菌法对所述发酵底物进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为20~45min，更佳地为25~40min，例如30min。
一些实施例中，所述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) 包括保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 28798的嗜热链球菌BSJM23L001和/或郑州和合生物工程技术有限公司生产的菌株号为HH-ST08的嗜热链球菌。
所述嗜热链球菌BSJM23L001的保藏日期为2023年10月27日，保藏编号为CGMCCNO. 28798，分类命名为嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus），保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），地址为：北京市海淀区北四环西路9号17层1701，邮编为100089。
一些实施例中，所述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) 包括保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 28798的嗜热链球菌和/或郑州和合生物工程技术有限公司生产的菌株号为HH-ST08的嗜热链球菌。
一些实施例中，所述副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）包括保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 23145的副干酪乳杆菌SS-01。
所述副干酪乳杆菌SS-01的保藏日期为2021年08月16日，保藏编号为CGMCC No.23145，分类命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），地址为：北京朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。
一些实施例中，所述乳酸菌可按照本领域常规以乳酸菌菌液的形式添加。
其中，所述乳酸菌菌液的制备方法可为本领域常规，一般可包括如下步骤：将所述乳酸菌溶解于无菌去离子水中。
其中，所述嗜热链球菌以嗜热链球菌菌液的形式添加，所述嗜热链球菌菌液中所述嗜热链球菌的活菌浓度可为107~1013CFU/mL，较佳地为108~1011CFU/mL，例如1010CFU/mL。
一些实施例中，所述副干酪乳杆菌以副干酪乳杆菌菌液的形式添加，所述副干酪乳杆菌菌液中所述副干酪乳杆菌的活菌浓度为107~1013CFU/mL，较佳地为108~1011CFU/mL，更佳地为1010CFU/mL。
一些实施例中，以所述发酵底物中所述水为基础，单位质量所述水中接种的所述乳酸菌的数量可为107~1013CFU/g，较佳地为108~1010CFU/g，例如3×108CFU/g。
一些实施例中，所述发酵培养的条件和方法可为本领域常规，一般可为静置发酵。
一些实施例中，所述发酵培养的温度可为38~52℃，较佳地为40~48℃，例如43℃。
一些实施例中，所述发酵培养的时间较佳地为9~11h，例如10h。
一些实施例中，所述灭菌的方法可为本领域常规采用的高温灭菌法。
当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为110℃~135℃，更佳地为115℃~130℃，例如121℃。
当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的压力可为本领域该类操作常规的压力，较佳地为0.1~0.15MPa，更佳地为0.1~0.13MPa，例如0.12MPa。
当采用所述高温灭菌法进行所述灭菌时，所述灭菌的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为20~45min，更佳地为25~40min，例如30min。
一些实施例中，所述灭菌的操作后，还可进一步包括冷却、离心并收集上清液和与防腐剂混合中至少一种的操作。
其中，按照本领域常规，所述冷却可为冷却至室温。
其中，所述离心的转速可为本领域该类操作常规的转速，较佳地为3000~7000rpm，更佳地为3500~6000rpm，例如4800 rpm。
其中，所述离心的时间可为本领域该类操作常规的时间，较佳地为20~45min，更佳地为25~40min，例如30min。
其中，所述与防腐剂混合的过程中，所述混合的温度可为本领域该类操作常规的温度，较佳地为60~80℃，更佳地为65~75℃，例如70℃。
其中，所述与防腐剂混合的过程中，防腐剂可按照本领域常规包括对羟基苯乙酮和/或1,2-己二醇。
当所述防腐剂包括所述对羟基苯乙酮时，所述对羟基苯乙酮占所述灭菌后制得物料的上清液的质量百分数可为0.1%~0.8%，较佳地为0.1%~0.6%，更佳地为0.5%。
当所述防腐剂包括所述1,2-己二醇时，所述1,2-己二醇占所述灭菌后制得物料的上清液的质量分数为0.3%~1.5%，较佳地为0.5%~1 %，更佳地为0.5%。
一些实施例中，所述室温一般指15~40℃。
本申请还提供一种银耳多糖发酵物，其由如上所述的银耳多糖发酵物的制备方法制得。
本申请还提供一种如上所述的银耳多糖发酵物直接作为产品、作为添加剂或作为基底在制备皮肤外用剂中的应用。
一些实施例中，所述银耳多糖发酵物可作为所述皮肤外用剂中抗氧化活性成分、抗衰老活性成分、保湿锁水活性成分中至少一种。
其中，所述抗氧化活性成分可为具有DPPH自由基清除作用的抗氧化活性成分、具有羟自由基清除作用的抗氧化活性成分和促进还原糖产生的抗氧化活性成分。
其中，所述抗衰老活性成分可为促进细胞代谢的抗衰老活性成分和/或促进细胞内胶原蛋白/透明质酸产生的抗衰老活性成分。
本申请还提供一种皮肤外用剂，其包括如上所述的银耳多糖发酵物。
一些实施例中，所述皮肤外用剂中还可进一步包括本领域常规使用的活性成分，一般可包括保湿活性成分、美白活性成分、抗炎活性成分、抗敏活性成分和抗氧化活性成分中的至少一种。
一些实施例中，所述皮肤外用剂可按照本领域常规包括但不限于面膜、精华或爽肤水。
一些实施例中，所述银耳多糖发酵物占所述皮肤外用剂的质量百分比可为5%~99%，较佳地为60%~99%。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本申请各较佳实例。
本申请所用试剂和原料均市售可得。
本申请的积极进步效果在于：本申请采用特定复合菌种对银耳多糖进行发酵处理，不仅降低银耳多糖分子量，还可提高美容功效，经过本申请发酵的工艺，所制得的银耳多糖发酵物中活性成分含量增加，具有理想的抗衰老、抗氧化、促进细胞代谢和保湿等功效，制备工艺简单，发酵条件温和，且不使用任何有机溶剂，实现节能环保。
附图说明
本申请可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本申请的优选实施例和解释本申请的原理和优点。其中：
图1为实施例1~4或对比例1~5制得产品对羟自由基清除能力对比图；
图2为实施例1~4或对比例1~5制得产品对DPPH自由基清除能力对比图；
图3为实施例1~4或对比例1~5制得产品处理细胞后，细胞内溶酶体活性对比图；
图4为实施例1~4或对比例1~5制得产品处理细胞后，细胞内弹性蛋白含量对比图；
图5为实施例1~4或对比例1~5制得产品处理细胞后，细胞内HA含量对比图；
图6A为实施例1制得产品处理皮肤后，皮肤角质层水分含量随时间变化图；图6B为皮肤角质层水分含量在不同时间点的变化率；
图7A为实施例1制得产品处理皮肤后，经皮水份流失量随时间变化图；图7B为经皮水份流失量在不同时间点的变化率；
图8为实施例1制得产品的分子量分布图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本申请，但并不因此将本申请限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例和对比例中的嗜热链球菌BSJM23L001的保藏日期为2023年10月27日，保藏编号为CGMCC NO. 28798，分类命名为嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus），保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），地址为：北京市海淀区北四环西路9号17层1701，邮编为100089。
下述实施例和对比例中的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) CGMCCNO.28798保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
下述实施例和对比例中的副干酪乳杆菌SS-01保藏日期为2021年08月16日，保藏编号为CGMCC No. 23145，分类命名为：副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编为100101。
下述实施例和对比例中的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)HH-ST08为郑州和合生物工程技术有限公司生产的菌株号为HH-ST08的嗜热链球菌。
下述对比例中的弯曲乳杆菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 23317的弯曲乳杆菌。
下述实施例和对比例中的银耳多糖购自山东福瑞达生物股份有限公司，平均相对分子质量为1.25x106。
下述实施例和对比例中的大豆肽和葡萄糖均为市售可得。
实施例1
称取0.6g银耳多糖、0.2g大豆肽、0.6g葡萄糖和100g纯净水，在温度为80℃，且搅拌的条件下将各组分混合，直至各组分完全溶解，搅拌的转速为300rpm；然后，在温度为121℃、压力为0.12MPa的条件下灭菌30min，灭菌后静置至室温，得到发酵底物。
嗜热链球菌（CGMCC NO.28798）菌液的制备方法包括：将嗜热链球菌CGMCCNO.28798溶解于无菌去离子水中，制备嗜热链球菌（CGMCC NO.28798）菌液；嗜热链球菌（CGMCC NO. 28798）菌液中嗜热链球菌CGMCC NO. 28798的活菌浓度为1010CFU/mL。
副干酪乳杆菌（CGMCC No.23145）菌液的制备方法包括：将副干酪乳杆菌CGMCCNo.23145溶解于无菌去离子水中，制备副干酪乳杆菌（CGMCC No.23145）菌液；副干酪乳杆菌（CGMCC No.23145）菌液中副干酪乳杆菌CGMCC No.23145的活菌浓度为1010CFU/mL。
在上述制得的发酵底物中先接种1.5mL的嗜热链球菌（CGMCC NO. 28798）菌液，然后再接种1.5mL的副干酪乳杆菌（CGMCC No.23145）菌液。在温度为43℃的环境下静置发酵培养10h。发酵结束后，在温度为121℃、压力为0.12MPa的条件下灭菌30min，灭菌后静置至室温，再于转速为4800rpm的条件下离心30min，取上清液，在70℃条件下向上清液中添加对羟基苯乙酮和1,2-己二醇，其中，对羟基苯乙酮占上清液的质量百分数为0.5%，1,2-己二醇占上清液的质量百分数为0.5%，即得银耳多糖发酵物。
实施例2
与实施例1相比，不同之处仅在于发酵培养的时间为13h，其他条件参数同实施例1。
实施例3
与实施例1相比，不同之处仅在于接种的嗜热链球菌（CGMCC NO.28798）和副干酪乳杆菌（CGMCC No.23145）的活菌数比为1:2，具体接种1mL嗜热链球菌（CGMCC NO. 28798）菌液和2mL的副干酪乳杆菌（CGMCC No.23145）菌液，其他条件参数同实施例1。
实施例4
与实施例1相比，不同之处在于将接种的嗜热链球菌（CGMCC NO. 28798）替换为等量的嗜热链球菌（HH-ST08），其他条件参数同实施例1。
对比例1
与实施例1相比，不同之处仅在于发酵培养的时间为18h，其他条件参数同实施例1。
对比例2
与实施例1相比，不同之处仅在于只接种嗜热链球菌（CGMCC NO.28798）菌液，接种量为3.0mL，其他条件参数同实施例1。
对比例3
与实施例1相比，不同之处仅在于只接种副干酪乳杆菌（CGMCC No.23145）菌液，接种量为3.0mL，其他条件参数同实施例1。
对比例4
与实施例1相比，不同之处仅在于将副干酪乳杆菌（CGMCC No.23145）替换为等量的弯曲乳杆菌（CGMCC NO. 23317），其他条件参数同实施例1。
对比例5
与实施例1相比，不同之处仅在于不进行发酵，具体操作为：
称取0.6g银耳多糖、0.2g大豆肽、0.6g葡萄糖和100g纯净水，在温度为80℃，且搅拌的条件下混合，直至各组分完全溶解，搅拌的转速为300rpm；然后，在温度为121℃、压力为0.12MPa的条件下灭菌30min，灭菌后静置至室温，再于转速为4800rpm的条件下离心30min，取上清液，在70℃条件下向上清液中添加对羟基苯乙酮和1,2-己二醇，其中，对羟基苯乙酮占上清液的质量百分数为0.5%，1,2-己二醇占上清液的质量百分数为0.5%，即可。
效果实施例1 羟自由基清除率
利用Fenton反应产生羟自由基（·OH），向反应体系中加入水杨酸，·OH与水杨酸反应，生成的有色化合物2，3-二羟基苯甲酸在510 nm处有特征吸收。采用固定反应时间法，在510nm处测定含被测物反应液的吸光度，并与空白液比较，测定被测物对·OH的清除作用。
待测液为上述实施例和对比例制得的产品；
按表1往试管中添加试剂，依次加入9mmol/L FeSO4、9mmol/L水杨酸乙醇溶液、待测液、适量去离子水和8.8mmol/L H2O2溶液。摇匀，37℃水浴加热15min后取出，测定空白对照的吸光度A0、样品组吸光度Ax和不加H2O2的溶液本底组吸光度Ax0。测定A0时，参比溶液为不加双氧水体系；每组做三个平行实验，测试吸光度值并取平均值，结果请见表2，按照下述公式计算各组羟自由基清除率，结果见表2和图1。
羟自由基清除率=（A0-（Ax-Ax0））/A0×100%。
表1
表2
| 编号 | 羟自由基清除率 |
| 实施例1 | 53.30% |
| 实施例2 | 51.62% |
| 实施例3 | 39.50% |
| 实施例4 | 44.27% |
| 对比例1 | 31.35% |
| 对比例2 | 29.81% |
| 对比例3 | 28.93% |
| 对比例4 | 19.90% |
| 对比例5 | 14.90% |
由结果可知，实施例1~4制得产品的羟自由基清除率均远高于对比例1~5制得产品的羟自由基清除率。可见，本申请实施例制得产品具有理想的抗氧化功效，而且发酵培养的温度和菌种对终产品的抗氧化性能均具有较大影响。
效果实施例2DPPH自由基清除率
DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。
待测液：上述实施例或对比例制得的产品。
DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：
（1）取等体积（1mL）的待测液与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀（A1管）；
（2）取等体积（1mL）的无水乙醇与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀（A2管）；
（3）取等体积（1mL）的无水乙醇与待测液混匀（A3管）；
（4）避光反应30min后，在517nm下测A1管、A2管、A3管吸光度值；
DPPH自由基清除率计算公式为：DPPH自由基清除率=[(A2+A3)-A1]/A2×100%，计算结果见表3和图2。
表3
| 编号 | DPPH自由基清除率 |
| 实施例1 | 53.50% |
| 实施例2 | 47.50% |
| 实施例3 | 56.36% |
| 实施例4 | 48.79% |
| 对比例1 | 35.14% |
| 对比例2 | 34.79% |
| 对比例3 | 44.29% |
| 对比例4 | 31.36% |
| 对比例5 | 27.86% |
结果表明，实施例1~4制得产品的DPPH自由基清除率均远高于对比例1~5制得产品的DPPH自由基清除率。可见，本申请实施例制得产品具有理想的抗氧化功效，而且发酵培养的温度和菌种对终产品的抗氧化性能均具有较大影响。
效果实施例3 对溶酶体活性的影响
待测液：上述实施例或对比例制得的产品。
收集对数生长期状态良好的HaCat细胞，经胰蛋白酶消化，完全培养基终止消化，计数；将细胞悬浮液调整浓度为1.0×104cells/mL，接种至96孔培养板，每孔加入100μL细胞悬浮液。分为空白组、样品组，每组设置3个平行。置37℃，5%CO2培养箱培养过夜。然后弃去培养基，空白组加入无血清培养基，样品组加入上述待测液，孵育24h后加入10μL中性红染色剂染色，反应后加入0.1mL细胞裂解液震荡摇匀，采用酶标仪测试波长为540nm处的吸光度值，并采用下述公式计算溶酶体活性，结果见表4和图3。
溶酶体活性＝样品组/空白组×100％。
表4
| 编号 | 溶酶体活性 |
| 空白对照组 | 100% |
| 实施例1 | 127.19% |
| 实施例2 | 117.05% |
| 实施例3 | 122.58% |
| 实施例4 | 121.20% |
| 对比例1 | 105.07% |
| 对比例2 | 104.15% |
| 对比例3 | 105.53% |
| 对比例4 | 108.76% |
| 对比例5 | 102.76% |
溶酶体中含有多种水解酶，可降解大分子物质，溶酶体活性及数量可间接地反映出细胞的代谢更新能力，溶酶体活性越高代表细胞代谢能力越强，有助于保持细胞活力。上述结果表明，与空白对照组相比，本申请实施例1~4制得的产品处理细胞后，细胞溶酶体的活性显著增高，而且增高程度显著高于对比例1~5。由此可知，实施例1~4制得的产品促进细胞代谢能力更强。
效果实施例4 弹性蛋白含量测试
绘制弹性蛋白标准曲线为：y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D；A=2.8868，B=-1.43806，C=85.3045，D=0.06246；R2=0.99631。
BCA总蛋白标准曲线为：y = 1.0855x + 0.0126；R² = 0.9975。待测样：上述实施例或对比例制得的产品；
将1×106个成纤维细胞/孔接种到6孔板中培养24 h，吸弃原培养基，分别加入无血清DMEM处理24 h。吸弃原培养基，加入1 mL PBS，模型组和实验组细胞暴露于UVA 7J/cm2下处理40min；空白对照组不做处理；处理后实验组分别加入含实施例1~4、对比例1~5的DMEM（125µL待测样；875µL的DMEM），模型组和空白组加入1mL的DMEM，均继续处理培养过夜后，收集上清液，检测上清液。
采用ELN ELISA kit试剂盒(北京拜尔迪生物技术有限公司)检测上述上清液在波长为450nm下的吸光度值，代入弹性蛋白标准曲线，计算上清液中弹性蛋白含量A。
采用BCA试剂盒（北京百瑞极生物技术有限公司）检测上述上清液在波长为562nm下的吸光度值，代入BCA总蛋白标准曲线，计算上清液中BCA总蛋白含量C。
计算弹性蛋白相对含量=A/C，结果见表5和图4。
表5
结果表明：与对比例1~5制得的产品相比，采用实施例1~4制得产品处理受损细胞后，细胞内弹性蛋白含量显著增加，比空白对照组弹性蛋白表达量还高，尤其实施例1。由此可见实施例1~4制得的产品可促进弹性蛋白的析出，对受损细胞进行有效修复。（图4中，*p＜0.05，表示与模型组相比有统计学差异；**p＜0.01，表示与模型组相比有显著性统计学差异；***p＜0.001，表示与模型组相比有极其显著性统计学差异；###p＜0.001，表示与空白对照组相比有极其显著性统计学差异。）
效果实施例5 HA含量测试
待测液：上述实施例或对比例制得的产品；
绘制HA标准曲线为：y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D；A=0.16901，B=1.73485，C=0.49356，D=0.06135；R2=0.99981。
BCA总蛋白标准曲线为：y = 0.8812x + 0.0057；R² = 0.9982。取对数生长期状态良好的人皮肤成纤维细胞（HSF）计数并接种于6孔板中，每孔接种3×105个细胞。在37℃，5%CO2环境下培养至细胞密度达到80%时，弃培养基，模型组和实验组采用UVA照射仪照射 5J/cm2，照射40min；随后样品组加入2mL待测液，模型组加入2mL无血清DMEM培养液培养24h；空白组不进行照射处理，加入2mL无血清DMEM培养液培养24h，上述各组均做三个平行，培养结束后，收集上清液。
采用 HA ELISA kit试剂盒(北京拜尔迪生物技术有限公司)检测上述上清液在波长为450nm下的吸光度值，代入HA标准曲线，计算上清液中HA含量A。
采用BCA试剂盒（北京百瑞极生物技术有限公司）检测上述上清液在波长为562nm下的吸光度值，代入BCA总蛋白标准曲线，计算上清液中BCA总蛋白含量C。
计算HA相对含量=A/C，结果见表6和图5。
表6
结果表明：与模型组相比，实施例1~4制得产品处理受损细胞后，细胞中HA含量显著增加；对比例1~5制得的产品处理受损细胞后，细胞内HA含量与模型组相比也有增加，但增加量有限，明显差于实施例1~4。（图5中，*p＜0.05，表示与模型组相比有统计学差异；**p＜0.01，表示与模型组相比有显著性统计学差异；***p＜0.001，表示与模型组相比有极其显著性统计学差异，极显著降低，###p＜0.001，表示与模型组相比有极其显著性统计学差异）。）
效果实施例6
筛选14名健康成年人，按要求使用样品（实施例1制得的产品），测试手前臂内侧测试区域水分含量和经表皮水分流失率，对比使用样品前（T0），使用样品后5min、20min、1h改善皮肤屏障的效果。
比较使用样品前后，不同时间点测试区域水分含量、经表皮水分流失率变化情况；
1）志愿者测试前两天及当天不能在手臂涂任何产品，到访前1~3h，测量部位不能清洗或接触水，来到实验室后在恒温恒湿室静坐20min，测试期间不能喝水和饮料。
2)对于手臂使用皮肤记号笔在左右手臂内侧共标记测试区域，区域面积为3×3cm2，测试区域之间间隔至少1cm。样品涂抹区和空白对照区应随机分布于测试区域，确保所有样品和空白区域位置在统计学上达到平衡。
3)志愿者休息20min后，分别对手臂内侧各个测试区域进行经表皮水分流失率基础值（T0）数据采集，每个区域测试一次；用干面纸巾分别对各个测试区域进行清洁并进行皮肤角质层含水量基础值（T0）数据采集，每个区域平行测试3次，取平均值。
4)按要求在相应测试区域涂抹样品，5min后分别对各测试区域进行经表皮水分流失率、皮肤含水量值数据采集，并做好相关记录（T5min）；
5)20min后分别对各测试区域进行经表皮水分流失率、皮肤含水量值数据采集，并做好相关记录（T20min）；
5)1h后分别对各测试区域进行经表皮水分流失率值、皮肤含水量值数据采集，并做好相关记录（T1h）
采用德国CK Corneometer CM825皮肤水份测试仪皮肤水分含量测试结果，并计算皮肤水分含量变化率，结果分别见图6A和图6B。
采用德国CK皮肤水份流失(TEWL)测试仪TM300测试皮肤经皮水分流失量和皮肤水分流失量变化率，测试结果分别见图7 A和图7B。
根据图6A结果可知，使用实施例1制得的产品处理皮肤后，皮肤角质层水分含量均高于本底值，其中使用后 5min 皮肤角质层水分含量最高。如图6B 所示，使用实施例1制得产品后，皮肤角质层水分变化率均为正值。实施例1制得的产品具有理想的保湿效果。
根据如图7A结果可知，使用实施例1制得的产品处理皮肤20min后，皮肤经皮水分流失量低于本底值。如图7B结果可知，使用实施例1制得的产品后20min、60min变化率降为负值。实验结果表明：实施例1制得的产品具有理想的修护效果。
效果实施例7
委托上海微谱检测科技集团股份有限公司测试实施例1制得产品的分子量分布，结果见表7和图8。
表7
根据结果可知，与原料相比，实施例1中银耳多糖经发酵培养后，分子量降低。可见，银耳多糖经特定菌种发酵后，制得的产品更有利于皮肤吸收。
最后，还需要说明的是，在本申请中术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管上面已经通过本申请的具体实施例的描述对本申请进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本申请的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本申请所要求保护的范围内。
Claims (10)
1.一种银耳多糖发酵物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：发酵底物包括银耳多糖和水；将乳酸菌接种到所述发酵底物中，经发酵培养8~13h，灭菌，即可；
其中，所述乳酸菌包括嗜热链球菌和副干酪乳杆菌，所述嗜热链球菌和所述副干酪乳杆菌的活菌数比为1:（0.5~3）；所述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) 包括保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 28798的嗜热链球菌BSJM23L001和/或郑州和合生物工程技术有限公司生产的菌株号为HH-ST08的嗜热链球菌；所述副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）包括保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 23145的副干酪乳杆菌SS-01。
2.如权利要求1所述的银耳多糖发酵物的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中至少一种：
所述发酵底物中的所述银耳多糖的平均相对分子质量为100~125W；
所述发酵底物中的所述水和所述银耳多糖的重量份数比为100：（0.3~1），较佳地为100：（0.5~0.8）；
所述发酵底物中还进一步包括碳源和/或氮源；较佳地，所述碳源包括糖类碳源，更佳地包括葡萄糖；较佳地，所述氮源包括大豆肽；较佳地，所述水和所述碳源的重量份数比为100：（0.4~0.9），更较佳地为100：（0.5~0.7）；较佳地，所述水和所述氮源的重量份数比为100：（0.05~0.25），更佳地为100：（0.1~0.25）；
所述水包括纯净水和/或去离子水；
所述发酵底物在使用前还进一步包括灭菌的操作。
3.如权利要求1所述的银耳多糖发酵物的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中至少一种：
所述嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus) 包括保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 28798的嗜热链球菌和/或郑州和合生物工程技术有限公司生产的菌株号为HH-ST08的嗜热链球菌；
所述副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）包括保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 23145的副干酪乳杆菌SS-01；
所述嗜热链球菌以嗜热链球菌菌液的形式添加，所述嗜热链球菌菌液中所述嗜热链球菌的活菌浓度为107~1013CFU/mL，较佳地为108~1011CFU/mL；
所述副干酪乳杆菌以副干酪乳杆菌菌液的形式添加，所述副干酪乳杆菌菌液中所述副干酪乳杆菌的活菌浓度为107~1013CFU/mL，较佳地为108~1011CFU/mL；
以所述发酵底物中所述水为基础，单位质量所述水中接种的所述乳酸菌的数量为107~1013CFU/g，较佳地为108~1010CFU/g。
4.如权利要求1所述的银耳多糖发酵物的制备方法，其特征在于，所述制备方法满足下述条件中至少一种：
所述发酵培养的方法为静置发酵；
所述发酵培养的温度为38~52℃，较佳地为40~48℃；
所述发酵培养的时间为9~11h；
所述灭菌的方法为高温灭菌法。
5.如权利要求1~4中任意一项所述的银耳多糖发酵物的制备方法，其特征在于，所述灭菌的操作后，还包括冷却、离心并收集上清液和与防腐剂混合中至少一种的操作；
较佳地，所述冷却为冷却至室温；
较佳地，所述离心的转速为3000~7000 rpm，更佳地为3500~6000rpm；
较佳地，所述离心的时间为20~45min，更佳地为25~40min；
较佳地，所述与防腐剂混合的过程中，所述混合的温度为60~80℃，更佳地为65~75℃；
较佳地，所述与防腐剂混合的过程中，防腐剂包括对羟基苯乙酮和/或1,2-己二醇；更佳地，所述对羟基苯乙酮占所述灭菌后制得物料的上清液的质量百分数为0.1%~0.8%，进一步更佳地为0.1%~0.6%；更佳地，所述1,2-己二醇占所述灭菌后制得物料的上清液的质量分数为0.3%~1.5%，进一步更佳地为0.5%~1%。
6.一种银耳多糖发酵物，其特征在于，由如权利要求1~5中任意一项所述的银耳多糖发酵物的制备方法制得。
7.一种如权利要求6所述的银耳多糖发酵物直接作为产品、作为添加剂或作为基底在制备皮肤外用剂中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述银耳多糖发酵物作为所述皮肤外用剂中抗氧化活性成分、抗衰老活性成分、保湿锁水活性成分中至少一种；
较佳地，所述抗氧化活性成分为具有DPPH自由基清除作用的抗氧化活性成分、具有羟自由基清除作用的抗氧化活性成分的抗氧化活性成分；
较佳地，所述抗衰老活性成分为促进细胞代谢的抗衰老活性成分和/或促进细胞内胶原蛋白/透明质酸产生的抗衰老活性成分。
9.一种皮肤外用剂，其特征在于，包括如权利要求6所述的银耳多糖发酵物。
10.如权利要求9所述的皮肤外用剂，其特征在于，所述皮肤外用剂满足下述条件中至少一种：
所述皮肤外用剂中还包括保湿活性成分、美白活性成分、抗炎活性成分、抗敏活性成分和抗氧化活性成分中的至少一种；
所述皮肤外用剂包括面膜、精华或爽肤水；
所述银耳多糖发酵物占所述皮肤外用剂的质量百分比为5%~99%，较佳地为60%~99%。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410352697.2A CN118286140A (zh) | 2024-03-26 | 2024-03-26 | 一种银耳多糖发酵物、含其产品、及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410352697.2A CN118286140A (zh) | 2024-03-26 | 2024-03-26 | 一种银耳多糖发酵物、含其产品、及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118286140A true CN118286140A (zh) | 2024-07-05 |
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202410352697.2A Pending CN118286140A (zh) | 2024-03-26 | 2024-03-26 | 一种银耳多糖发酵物、含其产品、及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
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| CN (1) | CN118286140A (zh) |
-
2024
- 2024-03-26 CN CN202410352697.2A patent/CN118286140A/zh active Pending
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