CN111269291B - 寡肽的合成及在抑制柑橘致腐菌指状青霉的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种寡肽Synpep的合成及在抑制柑橘致腐菌指状青霉的药物中的应用，该寡肽为5个氨基酸经线性连接而成，通过固相合成的方法制备而成，经高效液相和质谱检测确认。活性实验结果证实新型合成肽对柑橘采后致腐菌指状青霉（Penicillium digitatum）具有良好的抑制作用，在1 mg/ml的同浓度效果下与市售保鲜剂百可得相当，和结构差别极小的寡肽相比活性更好，没有溶血现象发生，说明该物质对人体没有明显毒副作用，说明经过这项技术制备而成的合成肽Synpep优势明显，是一种潜在的柑橘保鲜剂，可在工农业生产中进行大规模利用。
Description
技术领域
本发明涉及一种新型寡肽的化学合成过程以及它对柑橘主要采后致腐菌指状青霉的抑制活性，具有应用于柑橘保鲜和生物防治的潜力。
背景技术
寡肽是指几个氨基酸脱水缩合连接而成的化合物, 近年来活性寡肽因其结构多样、广谱高效、分子量小、稳定性好、溶解度高且不易引起耐药性，被广泛应用于医药、食品、农业和饲料添加剂等领域。按照生成方式分为天然寡肽和人工合成寡肽两种，由于天然寡肽含量很低且结构未经修饰，故化学合成寡肽在基础和应用研究中占据着十分重要的地位。寡肽的人工合成选择性强，高效且稳定，主要可以用作：①确证天然寡肽或蛋白质的结构；②生产天然的、在生物体内含量极微但有医疗或其他生物效用的寡肽；③改变部分结构，研究其结构与功能的关系，并设计更有效的药物。
柑橘是我国南方农村地区的支柱产业之一，具有重大的经济价值和社会效益。但其储藏期短，在采收后表面分布的霉菌会引起柑橘发生腐败和变质，导致潜在的食品安全危机和巨大的经济损失。传统的化学杀菌剂虽然可以抑制上述霉菌的生长并提高柑橘的储藏期，但由于潜在的安全隐患正逐渐被淘汰，因此筛选到安全高效的生物杀菌剂引起了人们的广泛关注。前期实验中，我们在草酸青霉（Penicillium oxalicum）的培养液中找到一种对柑橘致腐菌具有抑制效果的天然寡肽，但由于其含量微小且提取纯品耗时长，所以利用化学方法设计合成出一条结构类似的人工寡肽，并且对柑橘主要的致腐菌指状青霉具有良好的抑制活性，为深入分析类似结构寡肽的结构和功能，对于开发新型的肽类抗生素和柑橘的生物保鲜等具有重要意义
发明内容
本发明的目的之一是提供一种新型合成肽的制备过程，为了解决天然活性肽提纯繁琐含量微小的问题，采取固相合成的方法制备了一种活性寡肽Synpep。
合成肽，平面结构为5个氨基酸连接的线性寡肽，具体氨基酸组成：Abu-N-Me-Thr-Thr-N-Me-Val-Ser，分子式：C22H41N5O9；分子量：519.61；具体结构式如下：
上述结构中的Abu为2-氨基丁酸，总共含有3个富含羟基的氨基酸。根据氨基酸的结构和抗菌寡肽的预测，利用固相合成方法制备得到的这条多羟基合成肽，极性强，水溶性好，极易溶解于多种溶剂；然后这条寡肽的结构设计完整，制备纯度高，其中作为活性前体的2-氨基丁酸也使这条合成肽对于抑制柑橘致腐菌的靶向性更强。
本发明的技术方案还包括含所述的合成肽的组合物，所述组合物的活性成分为所述的合成肽。所述的组合物中还包括辅药部分，所述的辅药为与所述的合成肽稳定存在的药学上可接受的赋形剂。
本发明的又一技术方案为合成肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）树脂溶涨：将2-氯三酰氯树脂放入反应管中，加入DCM后振荡；
（2）接第一个氨基酸，除掉步骤（1）的溶剂后，加入Fmoc-Ser-OH氨基酸，加入DMF溶剂溶解，再加入DIEA，振荡后密封；其中Fmoc-Ser-OH氨基酸的加入量相对于2-氯三酰氯树脂至少3倍摩尔过量，DIEA加入量相对于2-氯三酰氯树脂至少10倍摩尔过量。
（3）脱保护，除掉步骤（2）中的溶剂DMF，加入哌啶-DMF溶液振荡一段时间后除掉该溶剂后，再加入哌啶-DMF溶液；哌啶-DMF溶液中，哌啶的质量分数为18-25%，优选质量分数为20%。
（4）检测，除掉哌啶溶液后，取出2-氯三酰氯粒树脂进行茚剂检测，确定脱保护反应是否完成，先用乙醇将树脂洗三次，加入茚三酮试剂检测，在105 ℃-110 ℃下加热5min，变深蓝色为阳性反应，说明脱保护反应已完成。脱保护反应结束后进行润洗，依次用DMF溶剂清洗两次，DCM清洗两次，DMF清洗两次。
（5）缩合，将上述的检测溶液加入第二个保护氨基酸Fmoc-Val-OH、缩合剂O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，经DMF溶解后加入有机碱DIEA进行反应；Fmoc-Val-OH的添加量相对于2-氯三酰氯树脂至少3倍摩尔过量，缩合剂至少3倍摩尔过量，N,N-二异丙基乙胺（DIEA）至少10倍摩尔过量；反应30min；
（6）检测，取出20粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮试剂检测，105℃-110℃加热5min，无色为阴性反应，说明缩合反应已经完成。缩合反应完成后进行润洗，依次用DMF两次，DCM两次，DMF两次进行清洗。
（7）重复脱保护及缩合的步骤，经洗涤、干燥、从树脂上切割寡肽即为合成肽，所述的切割寡肽过程中切割液由92-98%三氟乙酸TFA，0.5-1.5%水，2-3%1,2-二巯基乙烷 EDT，1-3%三异丙基硅烷 TIS组成，优选三氟乙酸TFA 95 %，水1 %，1,2-二巯基乙烷EDT 2 %，三异丙基硅烷TIS 2 %。
经该法所制备的活性五肽，产率达到90%，纯度达到87%。整个制备过程中步骤（2）、（3）和（5）至关重要，其中步骤（2）中加入的保护氨基酸是为了制备过程作为重要组成部分的氨基酸不会发生副反应而选用的，步骤（3）中重复使用哌啶-DMF溶液进行振荡，也是为了脱保护反应的完全进行保证后面缩合反应的成功，还有步骤（5）中加入的反应液都是要求相对于树脂过量是确保反应进行的有效性和完全性，这3个步骤在寡肽合成过程中十分关键，不仅大大减轻了每步反应都要提纯的难度，也能维持合成肽的稳定性，是保证合成肽高产率高纯度的重要环节。本发明的又一技术方案是提供合成肽在制备抑制指状青霉生长的农用抗生素上的应用。
本发明的另一目的是提供一种能防治柑橘致腐菌的寡肽化合物，寡肽（Synpep）作为一种新型农用抗生素，在植物病原真菌中的防治作用。
在一定浓度范围（检测最低限度为：1㎎/ml）下对指状青霉（孢子浓度范围：106 cfu/mL）具有良好的抑制活性，以及和结构差别极小的寡肽（Baba-N-Me-Thr-Thr-N-Me-Val-Ser，其中Baba为3-氨基丁酸）活性比较显示出本发明合成肽的优越性，为开发微生物源抗真菌剂提供了新方向。经过活性实验结果证实新型合成肽对柑橘致腐菌指状青霉具有良好的抑制作用，同浓度效果与市售保鲜剂百可得相当，和结构差别极小的寡肽相比活性更好，这就说明经过这项技术制备而成的合成肽优势明显，是一种潜在的柑橘保鲜剂，可在工农业生产中进行大规模利用。
附图说明
图1为实施例1得到的合成肽的高效液相色谱检测结果。
图2为实施例1得到的合成肽的质谱检测结果。
图3为实施例2中寡肽、百可得、水对指状青霉及柑橘采后致腐的抑制效果。
图4为实施例3中本发明寡肽与对比多肽的活性对比。
图5为实施例4中寡肽的安全性检查效果图。
具体实施方式
实施例1：
新型合成肽的固相合成过程（从C端到N端）：
（1）树脂溶涨，将放入2-氯三酰氯树脂反应管中，DCM(15 ml/g)振荡30 min。
（2）接第一个氨基酸，通过沙芯抽滤掉溶剂，相对于树脂，加入3倍摩尔过量Fmoc-Ser-OH氨基酸，加入DMF溶解，再加入10倍摩尔过量的DIEA，振荡60 min，用甲醇封闭。
（3）脱保护，去掉DMF，加20 %哌啶DMF溶液(15 ml/g)，5 min，去掉再加20 %哌啶DMF溶液(15 ml/g)，反应15 min。
（4）检测，抽掉哌啶溶液，取20粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮试剂检测，105℃-110 ℃加热5 min，变深蓝色为阳性反应，脱保护反应完成。
（5）润洗，依次DMF(10 ml/g)两次，DCM(10 ml/g)两次，DMF(10 ml/g)两次。
（6）缩合，保护氨基酸Fmoc-Val-OH相对于树脂3倍摩尔过量，HBTU 3倍摩尔过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入DIEA相对于树脂10倍摩尔过量，反应30 min。
（7）检测，取20粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮试剂检测，105 ℃-110 ℃加热5min，无色为阴性反应，缩合反应完成。
（8）润洗，依次DMF(10 ml/g)两次，DCM(10 ml/g)两次，DMF(10 ml/g)两次。
（9）重复（3）至（6）步操作，从右到左依次连接设计序列中的氨基酸。
（10）按照下列方法洗树脂：DMF(10 ml/g)两次，甲醇(10 ml/g)两次，DMF(10 ml/g)两次，DCM(10 ml/g)两次，再抽干10 min。
（11）从树脂上切割寡肽，配制切割液（10/g）: TFA 95 %；水1 %；EDT 2 %；TIS 2%，切割时间：120min。
（12）吹干洗涤，将裂解液用氮气尽量吹干，用***洗六次，然后常温挥干。
（13）分析提纯，用高效液相色谱将粗品提纯，根据附图1液相分析图中可得提纯后合成肽的纯度为87%。
（14）冻干，收集目标寡肽溶液放入冻干机中进行浓缩，冻干成白色粉末，在-20℃保存。
（15）将寡肽送到质检部（高效液相和质谱）进行确认。
高效液相色谱分析条件液相柱型号：Kromasil 100-5C18, 4.6 mm×250 mm, 5micron；检测波长：220 nm；进样体积：10 µl；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃；流动相A：0.1%三氟乙酸-乙腈溶液；流动相B：0.1%三氟乙酸-水溶液；分析时间：20 min；分析梯度设置：流动相A 10%→50%；流动相B 90%→50%. 质谱分析方法为电喷雾电离（ESI）阳离子扫描模式；毛细管电压（KV）：±2500~3000；样品锥孔电压：30~50V；脱溶剂气温度（Desolvation Temp）：450 ℃，流速：800 L/hr；分析时间：1 min。
附图1和附图2为检测结果报告图，附图1的液相报告分析说明所得到的的实际产物纯度高为87%。附图2质谱分析报告显示合成得到的实际产物和最开始设计的目标产物分子量相同均为519.61，说明本次合成过程顺利得到目标合成肽。
实施例2：
牛津杯法测量合成肽的抑菌活性：
准备无菌水和洁净的试管（经过121 ℃，20 min高压灭菌），在试管中加入10 ml无菌水，挑取平板上生长状态良好的指示菌菌块（即指状青霉）放入无菌水中，充分摇晃，用无菌棉花过滤掉菌丝体备用，在显微镜下计算孢子数量，用蒸馏水将菌悬液配制成浓度为106 cfu/mL，配置好备用。
将PDA 固体培养基（水1000 ml，土豆块200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g；经过121℃，20 min高压灭菌后冷却备用）加热融化，制作平板，待平板充分凝固，平皿表面水汽吹干后，在平板表面加入400 µl备用的指状青霉孢子悬液，用干净涂布棒均匀涂抹在平板表面，然后将无菌牛津杯竖直立于培养基中心表面，每个牛津杯中滴入200 µl合成肽溶液，观察抑菌作用。
在实验结果中，使用的合成肽有效最低浓度限度为1㎎/ml，在大于这个作用浓度时，能保证合成肽抑制指状青霉的有效性，并且对于指状青霉孢子的抑制范围为106 cfu/mL，已经达到投入田间实验的要求。另外根据附图3的抑菌圈说明，合成的寡肽（实验组）对指状青霉有良好的抑菌作用，可以达到同浓度的正对照组（市售化学保鲜剂百可得）相同抑制效果，负对照组为水浸泡处理。
实施例3：
本发明提供的合成肽结构为：Abu-N-Me-Thr-Thr-N-Me-Val-Ser，其中Abu为2-氨基丁酸；对比寡肽结构为：Baba-N-Me-Thr-Thr-N-Me-Val-Ser，其中Baba为3-氨基丁酸，两条寡肽的结构类似，唯一差别仅在左边第一个氨基酸中氨基的连接位置上面，但是两条寡肽的活性存在明显的不同。
准备无菌水和洁净的试管，在试管中加入10 ml无菌水，挑取平板上生长状态良好的指示菌菌块（即指状青霉）放入无菌水中，充分摇晃，用无菌棉花过滤掉菌丝体备用，在显微镜下计算孢子数量，用蒸馏水将菌悬液配制成浓度为：106 cfu/mL，配置好备用。将PDA固体培养基，经过121 ℃，20 min高压灭菌后冷却备用。加热融化PDA培养基后，制作平板，待平板充分凝固，平皿表面水汽吹干后，在平板表面加入400 µl备用的指状青霉孢子悬液，用干净涂布棒均匀涂抹在平板表面，然后将无菌牛津杯竖直立于培养基中心表面，每个牛津杯中滴入200 µl不同的寡肽溶液（作用浓度均为：1㎎/ml），记录抑菌圈大小进行比较。
在附图4中的结果显示，本发明中提供的合成肽（柱形图2）的抑菌圈的平均直径为15 mm，并且标准偏差趋势线表示3组平行实验中，抑菌圈的数值稳定无较大的起伏；但是作为对比寡肽（柱形图1）的平均抑菌圈直径仅有11 mm，并且活性测定实验中起伏较大。综上可得，本发明所提供的的合成肽活性稳定，结构优势突出，是一种具备很强潜力的抗真菌剂。
实施例4：
合成寡肽的安全性检测：
取新鲜大鼠血液5 ml，经低温离心机5000 r/min离心5 min后，去除上清液，取底层红细胞用PBS溶液清洗3遍。将最后一遍清洗得到的红细胞用PBS溶液分散，使体积分数约为5 %。取0.5 ml红细胞溶液加入不同浓度的五肽溶液（1000，500,250,100,50 μg/ml），1%Triton溶液处理为阳性对照组，PBS溶液处理为阴性对照组，其他操作均相同，将混液放在37℃恒温培养箱中孵育1h。孵育结束后，将混液经低温离心机5000 r/min离心5 min后，分别取上清液100 μL，加入96孔板内，用酶标仪检测570 nm处OD值，并计算溶血率；另分别取沉淀10 μL，在光学显微镜下观察并记录红细胞形态。
结果表明，实验组的溶血率均在15 %以下，说明寡肽溶液（使用浓度: 50~1000 μg/mL）与血液相容性良好（附图5上）。并且在显微镜（40×）下观察细胞形态（附图5下），发现实验组（1000μg/ml）和正常生长组的细胞均形态完整，而在阳性组（1%Triton溶液）中未发现完整细胞存在，也进一步证实了寡肽溶液对血液中的细胞并无副作用影响，表明该物质可以作为潜在的农用抗生素和柑橘保鲜剂进行安全使用。
Claims (3)
1.一种安全防治柑橘致腐菌指状青霉的寡肽化合物的固相合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)树脂溶涨：将2-氯三酰氯树脂放入反应管中，加入二氯甲烷后振荡、溶涨；
(2)接第一个氨基酸：抽掉步骤(1)的溶剂后，加入Fmoc-Ser-OH氨基酸，加入DMF溶剂溶解，再加入DIEA，振荡后密封，Fmoc-Ser-OH氨基酸的加入量相对于2-氯三酰氯树脂至少3倍摩尔过量，DIEA的加入量相对于2-氯三酰氯树脂至少10倍摩尔过量；
(3)脱保护：抽掉步骤(2)中的溶剂DMF，加入哌啶-DMF溶液振荡一段时间后除掉该溶剂，再加入哌啶-DMF溶液，经茚三酮试剂检测为阳性反应后即完成脱保护剂反应；
(4)缩合，将上述脱保护后的反应溶液加入第二个保护氨基酸Fmoc-Val-OH、缩合剂HBTU，经DMF溶解后加入有机碱DIEA进行反应，茚三酮试剂检测为阴性反应后即完成缩合反应，保护氨基酸Fmoc-Val-OH、HBTU的加入量相对于2-氯三酰氯树脂至少3倍摩尔过量；DIEA的加入量相对于2-氯三酰氯树脂至少10倍摩尔过量；
(5)重复脱保护、缩合步骤从右到左依次连接寡肽序列中的氨基酸，经洗涤、干燥、从树脂上切割寡肽即为寡肽化合物，切割寡肽过程中采用切割液进行切割，所述的切割液由95％三氟乙酸，1％水，2％1,2-二巯基乙烷，2％三异丙基硅烷组成；所述的寡肽化合物为平面结构为5个氨基酸连接的线性寡肽，具体氨基酸组成：Abu-N-Me-Thr-Thr-N-Me-Val-Ser，分子式：C22H41N5O9；分子量：519.61；具体结构式如下
2.根据权利要求1所述的寡肽化合物的固相合成方法，其特征在于，步骤(3)哌啶-DMF溶液中，哌啶的质量分数为18-25％。
3.根据权利要求1或2所述固相合成方法合成得到的寡肽化合物在安全防治柑橘致腐菌指状青霉上的应用。
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