CN117904162A - 通过改造糖多孢红霉菌sace_5680基因提高红霉素产量的方法及应用 - Google Patents
通过改造糖多孢红霉菌sace_5680基因提高红霉素产量的方法及应用 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域,提供了一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_5680基因提高红霉素产量的方法,通过基因工程方法使糖多孢红霉菌中GntR家族SACE_5680基因缺失,继而获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株,利用所得的糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株发酵生产红霉素;其中,所述SACE_5680基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种上述方法的应用。本发明研究中筛选到了红霉素生物合成负调控子SACE_5680,通过基因工程途径缺失糖多孢红霉菌染色体上SACE_5680基因拷贝,能够获得红霉素高产菌株,为工业生产提高红霉素发酵产量提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,尤其涉及一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_5680基因提高红霉素产量的方法及应用。
背景技术
红霉素是由糖多孢红霉菌次级代谢产生,属于典型的聚酮类抗生素,其组分包括红霉素A(Er-A)、红霉素B(Er-B)、红霉素C(Er-C)、红霉素D(Er-D)、红霉素E(Er-E)和红霉素F(Er-F)等。该类抗生素有广谱抗菌作用,其抗菌谱与青霉素相似,对革兰阳性菌有较强的抑制作用。红霉素各组分中临床上广泛应用的是红霉素A,它的抑菌活性最高,而红霉素系列化学衍生物(克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素等)也被广泛用来治疗感染性疾病,红霉素及其衍生物每年的销售额达数百亿美元。
红霉素在医药领域具有重要作用,但其产率仍有待提高。传统优化发酵条件提高红霉素A产量的方法耗时且不经济,不适合广泛应用。而通过基因工程的方法,在糖多孢红霉菌染色体中增加合成基因的拷贝数,或通过基因敲除的方法改造调控基因来获得红霉素高产菌株,有着很好的前景。
Ramos等以序列相似性、结构和功能为标准将原核生物转录调控子分成LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Coldshock、GntR和Crp共16个家族。GntR家族转录调控因子是细菌中分布最为广泛的一类螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix,HTH)转录调控因子,此家族转录调控因子包含两个功能域,分别是N端的DNA结合结构域和C端的效应物结合结构域/寡聚化作用结构域。DNA结构域的氨基酸序列在GntR家族成员中是非常保守的,但效应物结合结构域/寡聚化作用结构域的氨基酸序列存在很大的差异性。目前许多GntR家族的转录调控因子已经被鉴定,这些转录因子调控细菌许多不同的细胞过程,如运动性、葡萄糖代谢、细菌的耐药性、病原细菌的致病力等。然而目很少有关于糖多孢红霉菌次级代谢GntR家族调控基因的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_5680基因提高红霉素产量的方法及应用。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题:
一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_5680基因提高红霉素产量的方法,通过基因工程方法使糖多孢红霉菌中GntR家族SACE_5680基因缺失,继而获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株,利用所得的糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株发酵生产红霉素;其中,所述SACE_5680基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
作为本发明的优选方式之一,所述SACE_5680基因编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
作为本发明的优选方式之一,所述SACE_5680基因产物负向调控红霉素生物合成。
一种上述通过改造糖多孢红霉菌SACE_5680基因提高红霉素产量的方法的应用,在工业高产菌株中敲除SACE_5680基因,获得高产突变株,用于红霉素生产。
作为本发明的优选方式之一,所述工业高产菌株具体选择糖多孢红霉菌工业菌株WB,对应地,所述高产突变株为WB-△SACE_5680菌株。
本发明相比现有技术的优点在于:
本发明研究中筛选到了红霉素生物合成负调控子SACE_5680,通过基因工程途径缺失糖多孢红霉菌染色体上SACE_5680基因拷贝,能够获得红霉素高产菌株,为工业生产提高红霉素发酵产量提供技术支持。其中,在糖多孢红霉菌A226中敲除SACE_5680基因时红霉素产量提高了22%,而在ΔSACE_5680缺失突变株中回补SACE_5680基因,红霉素产量得到恢复,表明SACE_5680是一个参与红霉素生物合成的负调控因子。此外,利用工业高产菌株WB作为出发菌株,在其染色体上缺失SACE_5680基因,红霉素产量提高53%,说明缺失SACE_5680基因提高红霉素产量的技术在工业高产菌株中同样适用。
附图说明
图1是SACE_5680基因及周边邻近基因在染色体上的位置信息图;
图2是△SACE_5680突变株的构建示意图;
图3是△SACE_5680突变株的PCR鉴定图(图中,SACE_5680基因未敲除,666bp;SACE_5680基因敲除后,360bp;M,5000bp DNA Marker);
图4是ΔSACE_5680/pIB139-5680回补菌株的PCR鉴定图(图中,PCR产物为安普霉素抗性基因,776bp;M,5000bp DNAMarker);
图5是出发菌株A226及缺失突变株ΔSACE_5680的红霉素A产量分析(图中,“***”表示存在显著差异,p<0.001);
图6是出发菌株A226、缺失突变株ΔSACE_5680、缺失回补菌株ΔSACE_5680/pIB139-5680及回补空载对照菌株ΔSACE_5680/pIB139红霉素A的HPLC分析(图中,“***”表示存在显著差异,p<0.001)。
图7是ΔSACE_5680突变株和野生型A226菌株菌丝体的生物量测定结果图;
图8是ΔSACE_5680中红霉素合成基因簇相关基因转录水平(图中,“**”表示p<0.01,“***”表示p<0.001);
图9是高产菌株WB及缺失突变株WB/ΔSACE_5680红霉素A产量的HPLC分析(图中,“**”表示存在显著差异,p<0.01)。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明,本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下述实施例中使用到的菌株和质粒见表1,合成的引物序列见表2。其中,出发菌株为糖多孢红霉菌A226(CGMCC 8279),为可直接购买获得的菌株。
同时,下述实施例中使用到的大肠杆菌在37℃的液体LB培养基或在添加1.25%琼脂的固体LB平板上培养。红霉素产生菌糖多孢红霉菌及其工程菌株在30℃胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基或在含有2.2%琼脂的R3M平板上培养。
下述实施例使用的材料中PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋氨基酸、硫链丝菌肽、安普霉素从Sigma公司购买。TSB、酵母提取物、蛋白胨购买于Oxoid公司。甘氨酸、琼脂粉、氯化钠和其它生物学试剂都购于试剂公司。大肠杆菌和糖多孢红霉菌的一般操作技术按照标准操作。引物的合成和DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
表1本发明涉及的菌种、质粒及其主要性质
表2本发明涉及引物
实施例1
SACE_5680基因的分析:
SACE_5680与临近基因在糖多孢红霉菌染色体上的位置见图1。
SACE_5680基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,基因长度为666bp,编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示,蛋白单体大小为24.4KDa。
实施例2
SACE_5680基因缺失突变菌株的构建(参见图2):
以糖多孢红霉菌A226的基因组DNA为模板,分别利用引物5680UF/5680UR和5680DF/5680DR PCR扩增出1.5kb上下游同源臂,并用Hind III、Xba I和EcoR I、Xba I酶切上下游同源臂后回收;同时用Hind III和EcoR I酶切敲除载体pKC1139并回收;将回收后的上下游同源臂和pKC1139质粒连接转化后转入DH5α中,通过PCR和酶切鉴定,获得pKC1139-Δ5680。
将构建好的质粒pKC1139-Δ5680转入到制备好的糖多孢红霉菌A226原生质体中,然后涂布于无抗R3M固体平板上(倒板吹干后放置37℃烘箱48h左右),放入30℃恒温培养箱中培养大约20h后加入安普霉素(Apr)的无菌水覆盖(终浓度为50μg/mL安普霉素),继续30℃培养4~5d会有单克隆长出。将长出的单克隆转接至含50μg/mL安普霉素的R3M固体平板上富集,30℃培养4~5d会有孢子长出。取少量孢子于无抗的R3M固体平板中划板,然后置于37℃恒温培养箱中培养2~3d完成质粒的松弛与丢失。当平板中有单克隆长出时,挑单孢一半于无抗R3M固体平板中,一半于含50μg/mL安普霉素的R3M固体平板中,30℃培养4~5d。将在安普霉素的R3M固体平板中不长,在无抗R3M固体平板中生长的菌株刮取少量孢子进行菌液PCR,鉴定引物为5680JDF、5680JDR,阳性对照的模板为pKC1139-Δ5680质粒,阴性对照的模板为A226基因组,根据PCR产物的大小(参见图3),获得了ΔSACE_5680缺失突变株。
实施例3
SACE_5680基因回补和过表达菌株的构建:
利用设计的引物5680-P1和5680-P2扩增出SACE_5680基因,并电泳回收,使用NdeI和Xba I内切酶分别对回收到的SACE_5680基因片段与pIB139进行双酶切并回收,通过T4DNA连接酶将SACE_5680基因片段连接到pIB139上,成功获得整合型质粒pIB139-5680。然后通过PEG介导的原生质体转化方法将pIB139-5680导入ΔSACE_5680原生质体中。通过安普霉素初步筛选,以安普霉素抗性基因为对象进行PCR鉴定,如图4所示,获得的回复菌株命名为ΔSACE_5680/pIB139-5680。
实施例4
糖多孢红霉菌发酵产物HPLC检测:
接种糖多孢红霉菌于TSB培养基,在30℃振荡培养48h后,转接至R5液体培养基,30℃振荡培养168h,然后利用有机溶剂对发酵液进行萃取,使用水浴锅蒸干后,加入1mL甲醇溶解并使用0.22μm有机滤膜处理,后上机检测样品中的红霉素A含量。
实施例5
糖多孢红霉菌菌丝体生物量检测:
以相同的接种量分别将ΔSACE_5680突变株与A226接种于30mL的液体TSB中,30℃摇床培养48h后,转接到R5培养基中30℃转速220rpm摇床培养168h,期间设置不同时间段取样,用无水乙醇清洗后烘干称量菌体干重,测量结束后根据实验数据绘制菌体生物量曲线。
实施例6
ΔSACE_5680中红霉素生物合成基因簇内基因的转录分析:
为了探究ΔSACE_5680菌株中红霉素合成基因簇相关基因转录水平,进行了RT-qRCR实验(相关引物见表2)。将ΔSACE_5680和A226在R5培养基中进行发酵,发酵24h后,各取1mL发酵液于匀浆管中,在4℃,12000rpm下离心15min,去上清后,加入1mL Transzol试剂匀浆震荡破碎,然后使用RNA提取试剂盒提取总RNA并进行Nanodrop定量,选取OD260/280在1.9~2.2之间的RNA进行后续实验操作。消化RNA中基因组DNA后及时将其反转录成cDNA,最后以反转录的cDNA为模板,使用RT-qPCR试剂盒配制反应体系,在qPCR仪上进行上机检测红霉素合成基因簇相关基因转录水平。
实施例7
红霉素工业高产菌株WB/ΔSACE_5680菌株的构建及HPLC检测:
在红霉素工业高产菌株WB中缺失SACE_5680,验证正确菌株命名为WB/ΔSACE_5680。并将WB高产菌株与缺失突变株WB/ΔSACE_5680的发酵产物进行HPLC检测。突变株构建过程和HPLC检测参考上述实施例。
实施例8
上述实施例的具体实验结果:
1、缺失突变株ΔSACE_5680较出发菌株A226红霉素产量提高。
ΔSACE_5680在发酵培养基中发酵7d后,经HPLC检测红霉素A产量,发现ΔSACE_5680较出发菌株A226的产量提高了22%(见图5),HPLC结果表明SACE_5680是参与红霉素生物合成的负向调控子。
2、SACE_5680基因回复与过表达。
为了验证突变体ΔSACE_5680中红霉素产量的提高是因为SACE_5680基因缺失引起的,将SACE_5680基因表达载体pIB139-5680和pIB139载体(作为对照),导入ΔSACE_5680突变株的原生质体中,获得回复菌株及空载ΔSACE_5680/pIB139-5680、ΔSACE_5680/pIB139。PCR鉴定证实后,将A226及ΔSACE_5680系列突变株进行摇瓶发酵,HPLC检测结果显示:ΔSACE_5680的红霉素A产量较A226升高22%;回复菌株ΔSACE_5680/pIB139-5680的红霉素A产量较A226基本恢复(见图6);HPLC检测结果进一步表明SACE_5680基因能够负调红霉素A的生物合成。
3、缺失SACE_5680基因对菌体生长的影响。
测定发酵7天的ΔSACE_5680突变株与A226菌株的菌体干重,绘制相应变化曲线,结果显示ΔSACE_5680较A226的生物量差异不大(见图7),暗示着SACE_5680基因的缺失并未影响菌体的初级代谢。
4、ΔSACE_5680突变株中红霉素生物合成基因簇内基因的转录量增加。
与出发菌株A226相比,ΔSACE_5680突变株中ermE、eryAI、eryCI、eryK、eryBI、eryBIII、eryBIV和eryBVI的转录水平都显著上升。说明SACE_5680对红霉素生物合成基因簇内基因的的转录具有直接的调控作用(见图8)。
5、改造的工业高产菌株WB/ΔSACE_5680使红霉素产量提高。
构建WB/ΔSACE_5680突变株后,将WB/ΔSACE_5680突变株及工业高产菌株WB涂板活化,然后分别接入工业种子培养基的摇瓶中,30℃转速220rpm下培养2天后,转接工业发酵培养基中,继续培养7天。发酵结束后萃取浓缩经HPLC分析,相比较出发菌株WB,WB/ΔSACE_5680的红霉素产量提高了53%(见图9)。这说明高产菌株WB中SACE_5680基因同样参与调节红霉素的产量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_5680基因提高红霉素产量的方法,其特征在于,通过基因工程方法使糖多孢红霉菌中GntR家族SACE_5680基因缺失,继而获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株,利用所得的糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株发酵生产红霉素;其中,所述SACE_5680基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的通过改造糖多孢红霉菌SACE_5680基因提高红霉素产量的方法,其特征在于,所述SACE_5680基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的通过改造糖多孢红霉菌SACE_5680基因提高红霉素产量的方法,其特征在于,所述SACE_5680基因产物负向调控红霉素生物合成。
4.一种如权利要求1~3任一所述的通过改造糖多孢红霉菌SACE_5680基因提高红霉素产量的方法的应用,其特征在于,在工业高产菌株中敲除SACE_5680基因,获得高产突变株,用于红霉素生产。
5.根据权利要求4所述的通过改造糖多孢红霉菌SACE_5680基因提高红霉素产量的方法的应用,其特征在于,所述工业高产菌株具体选择糖多孢红霉菌工业菌株WB,对应地,所述高产突变株为WB-△SACE_5680菌株。
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