CN107881190B - 通过改造林可链霉菌slcg_2919基因提高林可霉素产量的方法 - Google Patents
通过改造林可链霉菌slcg_2919基因提高林可霉素产量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种通过改造林可链霉菌SLCG_2919基因提高林可霉素产量方法，在林可链霉菌中，通过基因工程途径缺失TetR家族转录调节基因SLCG_2919，获得林可霉素高产工程菌株，用所获得的菌株发酵生产林可霉素可以大幅度提高产量，为工业生产提高林可霉素产量提供新的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种通过改造林可链霉菌SLCG_2919基因提高林可霉素产量的方法。
背景技术
链霉菌能产生丰富的次级代谢产物，且这些次级代谢产物及其衍生物用途广泛，诸如抗生素、抗癌药、免疫抑制剂等。目前医疗上使用的抗生素和抗癌药，超过一半以上都是由链霉菌产生的。全基因组测序研究发现链霉菌含有多个生物合成基因簇，且这些基因簇或是沉默的，或是生物合成能力较弱，需要通过筛选才能获得工业生产高产菌株。过去工业生产菌株主要通过物理或化学诱变方法获得。传统的诱变技术不但耗时，且随机性较大，无法对育种提供理论性指导。本发明目的就是通过基因工程途径定向改变基因来获得林可霉素高产菌株，用于林可霉素或中间产物生产。
林可链霉菌NRRL2936是1962年从土壤中分离出的第一株林可霉素产生菌。其次级代谢产物林可霉素A是重要的林可酰胺类抗生素，目前林可霉素系列化学衍生物(盐酸林可霉素、克林霉素等)被广泛用来治疗感染性疾病。随着林可霉素及其衍生物在医疗和商业上需求的日益增长，吸引了许多科学家来研究如何提高其产量。同其它放线菌类似，林可霉素的生物合成基因也成簇的集中在一个DNA片段上。1995年，Peschke等在林可链霉菌78-11中成功克隆了林可霉素的生物合成基因簇，其基因簇大小为35kb，包含27个开放阅读框和至少12个转录单元。到目前为止，关于林可霉素生物合成基因簇内基因，lmrC、lmbH、lmbB2、lmbU和lmbQ等已有研究报道。
2005年，Ramos等以序列相似性、结构和功能为标准将原核生物转录调控子分成LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR和Crp共16个家族。其中TetR家族调控基因在DNA结合结构域上有高度的保守性，广泛参与调控多药抗性、抗生素合成、渗透性应激反应等生物活动。近年来报道了多种参与抗生素产量和链霉菌形态分化的TetR家族转录调控子，比如SACE_3986，SACE_3446，SACE_7301，SCO1712，SAV151，SAV576，JadY，AtrA等，暗示着TetR家族调控基因在链霉菌次级代谢及抗生素生物合成中的重要性。林可链霉菌全基因组中有92个TetR家族基因，然而却没有关于林可链霉菌次级代谢TetR家族调控基因研究，且对于其调节林可霉素产量的精确机制阐明的还未清楚。
发明内容
本发明目的就是通过缺失林可链霉菌中负调控基因SLCG_2919，通过改造林可链霉菌SLCG_2919基因提高林可霉素产量方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种通过改造林可链霉菌SLCG_2919基因提高林可霉素产量方法，其特征在于：通过基因工程途径使林可链霉菌中SLCG_2919基因失活，获得林可链霉菌林可霉素高产工程菌株，用所述的菌株发酵生产林可霉素，即可。
所述的一种通过改造林可链霉菌SLCG_2919基因提高林可霉素产量的方法，其特征在于所述的SLCG_2919基因产物可以负向调控林可霉素生物合成。
SLCG_2919基因在工业菌株中的应用，在工业高产菌株中缺失TetR家族转录基因SLCG_2919基因，获得高产突变株，可用于林可霉素生产。
本发明的优点是：
本发明研究中筛选到了林可霉素生物合成负调控子SLCG_2919，通过基因工程途径缺失林可链霉菌染色体上SLCG_2919基因拷贝，能够获得林可霉素高产菌株，为工业生产提高林可霉素发酵产量提供技术支持。
林可链霉菌LC-G中敲除SLCG_2919基因时林可霉素产量提高了24％，而在ΔSLCG_2919缺失突变株中回补SLCG_2919基因，林可霉素产量得到恢复，表明SLCG_2919是一个参与林可霉素生物合成的负调控因子。利用工业高产菌株LA219作为出发菌株，在其染色体上缺失SLCG_2919基因，使林可霉素产量提高15％，说明缺失SLCG_2919基因提高林可霉素产量的技术在工业高产菌株中同样适用。
附图说明
图1：SLCG_2919基因及周边邻近基因在染色体上的位置信息
图2：ΔSLCG_2919突变体构建示意图及缺失突变株的PCR鉴定
(A)ΔSLCG_2919突变体构建示意图，
(B)ΔSLCG_2919突变体的PCR鉴定：SLCG_2919基因(420bp)被tsr抗性基因(1360bp)替换；M,5000bp DNA Marker；
图3：出发菌株LC-G及缺失突变株ΔSLCG_2919的林可霉素产量分析
图4：SLCG_2919基因回复、过表达菌株的构建及林可霉素的产量分析
(A)ΔSLCG_2919/pKC1139-2919回补、LC-G/pKC1139-2919过表达菌株的PCR鉴定:PCR产物为apr抗性基因(776bp)；M,5000bp DNA Marker，1，ΔSLCG_2919/pKC1139，2，ΔSLCG_2919/pKC1139-2919，3，LC-G/pKC1139，4，LC-G/pKC1139-2919。
(B)出发菌株LC-G、缺失突变株ΔSLCG_2919、缺失回补菌株及回补空载对照菌株、过表达菌及过表达空载对照菌株林可霉素的HPLC分析；
图5：SLCG_2919基因对菌株形态分化的影响及ΔSLCG_2919突变株生物量的测定
(A)ΔSLCG_2919突变株和出发菌株LC-G菌株菌丝体的生物量测定；
(B)ΔSLCG_2919突变株和出发菌株LC-G菌株的孢子生长情况，其中左：LC-G菌株，右：ΔSLCG_2919突变株。
图6：林可霉素工业高产菌株ΔSLA2192919缺失突变株的构建及林可霉素产量分析，
(A)ΔSLA2192919突变体的PCR鉴定：SLCG_2919基因(420bp)被tsr抗性基因(1360bp)替换；M,5000bp DNA Marker 1,2，ΔSLA2192919；
(B)高产菌株LA219及缺失突变株ΔSLA2192919林可霉素产量的HPLC分析。
具体实施方式
实施例1
1.1菌株、质粒与生长条件
试验中使用到的菌株和质粒见表1。大肠杆菌在37℃的液体LB培养基或在添加1.25％琼脂的固体LB平板上培养。林可霉素产生菌林可链霉菌及其工程菌株在30℃胰蛋白胨大豆肉汤(TSBY)培养基或在含有2.2％琼脂的MGM平板上培养。
1.2材料、DNA操作与测序
PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋氨基酸、硫链丝菌肽、安普霉素从Sigma公司购买。TSB、酵母提取物、蛋白胨购买于Oxoid公司。甘氨酸、琼脂粉、氯化钠和其它生物学试剂都购于试剂公司。大肠杆菌和林可链霉菌的一般操作技术按照标准操作。引物的合成和DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
表1研究中所用的菌种和质粒
1.3 SLCG_2919基因缺失突变体的构建
试验中合成的引物序列见表2。pUCTSR质粒是在pUC18的BamH I和Sma I酶切位点之间***1360bp的硫链丝菌肽抗性基因(tsr)。为了敲除林可链霉菌中的SLCG_2919基因，分别用2919-P1/2919-P2和2919-P3/2919-P4为引物、林可链霉菌LC-G基因组为模板，PCR扩增SLCG_2919基因的上、下游各约1.7kb的同源片段。
分别将上述两个2919-U和2919-D上下游片段分别连接到pUCTSR的tsr抗性基因序列两侧，完成构建质粒pUCTSRΔ2919；用HindIII和EcoRI酶切下2919U-tsr-D大片段，然后连接到pKC1139载体上，完成质粒pKC1139Δ2919的构建。利用原生质体转化技术，将pKC1139Δ2919质粒转化到林可链霉菌原生质体中，根据硫链丝菌肽抗性筛选阳性突变株，获得SLCG_2919基因被tsr替换的基因工程菌株。以2919-P5和2919-P6作为鉴定引物，以质粒pKC1139Δ2919为阳性模板，LC-G基因组为阴性模板进行PCR鉴定，阳性缺失突变体命名为ΔSLCG_2919。
1.4SLCG_2919基因回复菌株的构建
利用设计的引物2919-P7和2919-P8扩增出SLCG_2919基因，并电泳回收，使用NdeI和HindIII内切酶分别对回收到的SLCG_2919基因片段与pKC1139进行双酶切并回收，通过T4 DNA连接酶将SLCG_2919基因片段连接到pKC1139上，成功获得质粒pKC1139-2919。然后通过PEG介导的原生质体转化方法将pKC1139-2919导入ΔSLCG_2919原生质体中。通过安普霉素初步筛选，以安普霉素抗性基因(apr)为对象进行PCR鉴定，获得的回复菌株命名为ΔSLCG_2919/pKC1139-2919。
1.5出发菌株LC-G中过表达SLCG_2919基因
pKC1139-2919通过PEG介导的原生质体转化技术导入林可链霉菌LC-G原生质体中，以安普霉素抗性基因(apr)为对象进行PCR鉴定，获得阳性菌株命名为LC-G/pKC1139-2919。
1.6林可链霉菌发酵产物HPLC检测
林可链霉菌在斜面培养基上培养7d后，挖1cm2接种于种子培养基，在30℃振荡培养48小时后，转接至发酵培养基，30℃振荡培养7d，然后取2ml菌液12000rpm离心10min；再取200ul上清加800ul甲醇混匀，12000rpm离心10分钟；最后将上清通过有机滤膜注入检测瓶中进行产量检测。
1.7林可链霉菌菌丝体生物量检测
以相同的接种量分别将ΔSLCG_2919突变株与LC-G接种于30mL的液体TSBY中，30℃摇床培养48小时后，转接到YMG培养基中30℃转速240rpm摇床培养7d，期间设置不同时间段取样，用无水乙醇清洗后烘干称量菌体干重，每次重复取样两次，并取得平均值，测量结束后根据实验数据绘制菌体生物量曲线。
1.8林可霉素工业高产菌株ΔSLA2192919菌株的构建及HPLC检测
在林可霉素工业高产菌株LA219中缺失SLCG_2919，验证正确菌株命名为ΔSLA2192919。并将LA219高产菌株与缺失突变株ΔSLA2192919的发酵产物进行HPLC检测。突变株构建过程和HPLC检测参考上述1.3和1.6方法。
结果分析：
2.1缺失突变株ΔSLCG_2919较出发菌株LC-G林可霉素产量提高。
SLCG_2919与临近基因在林可链霉菌染色体上的位置见图1。SLCG_2919基因缺失突变株ΔSLCG_2919构建过程见图2A。SLCG_2919基因缺失突变体在含有30μg ml-1硫链丝菌肽的R5平板上筛选并通过PCR证实(见图2B)。ΔSLCG_2919在发酵培养基中发酵7d后，经HPLC检测林可霉素产量，发现ΔSLCG_29198较出发菌株LC-G的产量提高了24％(见图3)，HPLC结果表明SLCG_2919是参与林可霉素生物合成的负向调控子。
2.2 SLCG_2919基因回复与过表达。
为了验证突变体ΔSLCG_2919中林可霉素产量的提高是因为SLCG_2919基因缺失引起的，将SLCG_2919基因表达载体pKC1139-2919和pKC1139载体(作为对照)，分别导入ΔSLCG_2919突变株和出发菌株LC-G的原生质体中，获得回复菌株及空载ΔSLCG_2919/pKC1139-2919、ΔSLCG_2919/pKC1139，过表达菌株及空载LC-G/pKC1139-2919、LC-G/pKC1139，PCR鉴定证实(见图4A)。后将LC-G及ΔSLCG_2919系列突变株进行摇瓶发酵，HPLC检测结果显示：
ΔSLCG_2919的林可霉素产量较LC-G升高24％；回复菌株ΔSLCG_2919/pKC1139-2919的林可霉素产量较LC-G基本恢复；LC-G/pKC1139-2919的林可霉素产量相比于LC-G降低约15％(见图4B)；HPLC检测结果进一步表明SLCG_2919基因能够负调林可霉素的生物合成。
2.3缺失SLCG_2919基因对菌体生长及孢子形态分化的影响。
测定发酵7d的ΔSLCG_2919突变株与LC-G菌株的菌体干重，绘制相应变化曲线，结果显示ΔSLCG_2919较LC-G的生物量差异不大(见图5A)，暗示着SLCG_2919基因的缺失并未影响菌体的初级代谢。
为了确定SLCG_2919基因是否调控菌体的孢子形成，将突变株ΔSLCG_2919和对照菌株LC-G同时涂于斜面培养基平板上，30℃培养48h和72h，观察菌株孢子生长情况。结果显示相比于LC-G，ΔSLCG_2919突变体的孢子形态无明显差异(图5B)，说明SLCG_2919基因的缺失不影响孢子的形成。
2.4改造的工业高产菌株ΔSA2192919使林可霉素产量提高。
首先进行ΔSA2192919突变株的构建，构建过程参照图2A，PCR鉴定见图6A。后将ΔSA2192919突变株及工业高产菌株LA219涂板活化，然后分别接入工业种子培养基的摇瓶中，30℃转速240rpm下培养2d后，转接发酵培养基中，继续培养7d。发酵结束后萃取浓缩经HPLC分析，相比较出发菌株LA219，ΔSA2192919的林可霉素产量分别提高了15％(见图6B)。这说明高产菌株LA219中SLCG_2919基因同样参与调节林可霉素的产量。
序列表
<110> 安徽大学
<120> 通过改造林可链霉菌SLCG_2919基因提高林可霉素产量的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 630
<212> DNA
<213> 林可链霉菌(Streptomyces lincolnensis)
<400> 1
atggctgaga tcgggctgcg tgagcgcaag aagcagcgga tgtacgaggt cgtgtcggag 60
atcgcgatcg ggttgttcct ggagaagggc ttcgacgcgg tgtccgtggc cgaggtggcg 120
gccgcggcgg agatctcgaa gccgacgttg ttccggtact tcccgtccaa ggaggacctc 180
gtgctgtacc ggttcgccga tcacgaggac gaggcagcgc gggtcgtcag gggctcggac 240
gaggcgccgt tgcgggcgtt gcggcggcgg tttctggagg ggctggcgca gggggatccc 300
gtcactgggc tgaatggtca ccccggggtc ctcgcctttc attcgctgct gtacggcact 360
ccggcgctgg tggcgcggct gtacggctat ctggagcggt cggaggccgc gttggcagag 420
gcgctcggtg gtgggctgga cgcgcggctg gccgccgggc agatcatcgc cgtacagcgg 480
attctcgcgg aggagaactg gcggcggatc gcggacgggg agcgggtgga ggaggtgcgg 540
gcggacgcgg aggcggccgc gcggcgggcc ttcgggctgt tggaggcggg gctgccgtat 600
ctcggtggga cggagagcgt taccgagtaa 630
Claims (2)
1.一种通过改造林可链霉菌SLCG_2919基因提高林可霉素产量的方法，其特征在于：通过基因工程途径使林可链霉菌中TetR家族转录基因SLCG_2919基因失活，获得林可链霉菌林可霉素高产工程菌株，用所述的菌株发酵生产林可霉素；
所述的SLCG_2919基因的核苷酸序列如下：
ATGGCTGAGATCGGGCTGCGTGAGCGCAAGAAGCAGCGGATGTACGAGGTCGTGTCGGAGATCGCGATCGGGTTGTTCCTGGAGAAGGGCTTCGACGCGGTGTCCGTGGCCGAGGTGGCGGCCGCGGCGGAGATCTCGAAGCCGACGTTGTTCCGGTACTTCCCGTCCAAGGAGGACCTCGTGCTGTACCGGTTCGCCGATCACGAGGACGAGGCAGCGCGGGTCGTCAGGGGCTCGGACGAGGCGCCGTTGCGGGCGTTGCGGCGGCGGTTTCTGGAGGGGCTGGCGCAGGGGGATCCC
GTCACTGGGCTGAATGGTCACCCCGGGGTCCTCGCCTTTCATTCGCTGCTGTACGGCACTCCGGCGCTGGTGGCGCGGCTGTACGGCTATCTGGAGCGGTCGGAGGCCGCGTTGGCAGAGGCGCTCGGTGGTGGGCTGGACGCGCGGCTGGCCGCCGGGCAGATCATCGCCGTACAGCGGATTCTCGCGGAGGAGAACTGGCGGCGGATCGCGGACGGGGAGCGGGTGGAGGAGGTGCGGGCGGACGCGGAGGCGGCCGCGCGGCGGGCCTTCGGGCTGTTGGAGGCGGGGCTGCCGTAT
CTCGGTGGGACGGAGAGCGTTACCGAGTAA
其编码的氨基酸序列如下：
MAEIGLRERKKQRMYEVVSEIAIGLFLEKGFDAVSVAEVAAAAEISKPTLFRYFPSKEDLVLYRFADHEDEAARVVRGSDEAPLRALRRRFLEGLAQGDPVTGLNGHPGVLAFHSLLYGTPALVARLYGYLERSEAALAEALGGGLDARLAAGQIIAVQRILAEENWRRIADGERVEEVRADAEAAARRAFGLLEAGLPYLGGTESVTE。
2.根据权利要求1所述的一种通过改造林可链霉菌SLCG_2919基因提高林可霉素产量的方法，其特征在于：所述的SLCG_2919基因产物可以负向调控林可霉素生物合成。
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| GR01 | Patent grant | ||
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