CN106520866B - 通过改造糖多孢红霉菌sace_3980基因提高红霉素产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量方法,在糖多孢红霉菌中,通过基因工程途径缺失TetR家族转录调节基因SACE_3980,获得红霉素高产工程菌株,用所获得的菌株发酵生产红霉素可以大幅度提高产量,为工业生产提高红霉素产量提供新的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,具体涉及一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量的方法。
背景技术
红霉素是由糖多孢红霉菌次级代谢产生,属于典型的聚酮类抗生素,其组分包括红霉素A(Er-A)、红霉素B(Er-B)、红霉素C(Er-C)、红霉素D(Er-D)、红霉素E(Er-E)和红霉素F(Er-F)等。该类抗生素有广谱抗菌作用,其抗菌谱与青霉素相似,对革兰阳性菌有较强的抑制作用。红霉素各组分中临床上广泛应用的是红霉素A,它的抑菌活性最高,而红霉素系列化学衍生物(克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素等)也被广泛用来治疗感染性疾病,红霉素及其衍生物每年的销售额达数百亿美元。
红霉素在医药领域具有重要作用,但其产率仍有待提高。传统优化发酵条件提高红霉素A产量的方法耗时且不经济,不适合广泛应用。而通过基因工程的方法,在糖多孢红霉菌染色体中增加合成基因的拷贝数,或通过基因敲除的方法改造调控基因来获得红霉素高产菌株,有着很好的前景。
2003年Rodriguez等报道红霉素高产主要是由于其调控基因,而不是合成基因,更使我们将研究重点转向调节基因。2005年,Ramos等以序列相似性、结构和功能为标准将原核生物转录调控子分成LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Cold shock、GntR和Crp共16个家族。其中TetR家族调控基因在DNA结合结构域上有高度的保守性,广泛参与调控多药抗性、抗生素合成、渗透性应激反应等生物活动。近年来报道了多种参与抗生素或链霉菌形态分化的TetR家族转录调控子,比如SCO1712,SAV151,SAV576,jadY,atrA等,暗示着TetR家族调控基因在链霉菌次级代谢及抗生素生物合成中的重要性。糖多孢红霉菌全基因组中有101个TetR家族基因,然而关于糖多孢红霉菌次级代谢TetR家族调控基因研究依然很少,报道的仅有参与调控糖多孢红霉菌形态分化的调控基因SACE_7040、SACE_0012和调控红霉素合成代谢基因SACE_5599、SACE_3986,SACE_3446,SACE_7301等,且对于其调节红霉素产量的精确机制阐明的还未清楚。
发明内容
本发明目的就是通过缺失糖多孢红霉菌中负调控基因SACE_3980,通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量方法。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量方法,其特征在于:通过基因工程途径使糖多孢红霉菌中SACE_3980基因失活,获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株,用所述的菌株发酵生产红霉素。
所述的一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量方法,其特征在于所述的SACE_3980基因产物可以负向调控红霉素生物合成。
SACE_3980基因在工业菌株中的应用,其特征在于:在工业高产菌株中缺失TetR家族转录基因SACE_3980,获得高产突变株,可用于红霉素生产。
本发明的优点是:
本发明研究中筛选到了红霉素生物合成负调控子SACE_3980,通过基因工程途径缺失糖多孢红霉菌染色体上SACE_3980基因拷贝,能够获得红霉素高产菌株,为工业生产提高红霉素发酵产量提供技术支持。
糖多孢红霉菌A226中敲除SACE_3980基因时红霉素产量提高了29.3%,而在ΔSACE_3980缺失突变株中回补SACE_3980基因,红霉素产量得到恢复,表明SACE_3980是一个参与红霉素生物合成的负调控因子。利用工业高产菌株WB作为出发菌株,在其染色体上缺失SACE_3980基因,使红霉素产量提高15.8%,说明缺失SACE_3980基因提高红霉素产量的技术在工业高产菌株中同样适用。
附图说明
图1:SACE_3980基因及周边邻近基因在染色体上的位置信息;
图2:本发明的染色体片段同源重组技术示意图及缺失突变株的PCR鉴定,
(A)ΔSACE_3980突变体构建示意图,
(B)ΔSACE_3980突变体的PCR鉴定:SACE_3980基因(639bp)被tsr抗性基因(1360bp)替换后长度变为1727bp;M,5000bp DNA Marker;
图3:出发菌株A226及缺失突变株ΔSACE_3980的抑菌分析及红霉素A每日产量分析,
(A)A226出发菌株和ΔSACE_3980突变株发酵液的抑菌分析,
(B)出发菌株A226和缺失突变株ΔSACE_3980六天红霉素A产物的HPLC分析;
图4:SACE_3980基因回复、过表达菌株的构建及红霉素A产量分析,
(A)A226/pIB139-3980回补、过表达菌株的PCR鉴定:PCR产物为apr抗性基因(776bp);M,5000bp DNA Marker,
(B)出发菌株A226、缺失突变株ΔSACE_3980、缺失回补菌株及回补空载对照菌株、过表达菌A226/pIB139-3980及过表达空载对照菌株红霉素A的HPLC分析;
图5:SACE_3980基因对菌株形态分化的影响及ΔSACE_3980突变株生物量的测定,
(A)ΔSACE_3980突变株和野生型A226菌株的孢子生长情况,其中1:A226菌株,2:ΔSACE_3980突变株,3:回复菌株ΔSACE_3980/pIB139-3980,4:过表达菌株A226/pIB139-3980,
(B)ΔSACE_3980突变株和野生型A226菌株菌丝体的生物量测定。
图6:红霉素工业高产菌株WB/SACE_3980缺失突变株的构建及红霉素A产量分析,
(A)WB/ΔSACE_3980突变体的PCR鉴定:SACE_3980基因(639bp)被tsr抗性基因(1360bp)替换后长度变为1727bp;M,5000bp DNA Marker,
(B)高产菌株WB及缺失突变株WB/ΔSACE_3980红霉素A产量的HPLC分析。
具体实施方式
实施例1
1.1菌株、质粒与生长条件
试验中使用到的菌株和质粒见表1。大肠杆菌在37℃的液体LB培养基或在添加1.25%琼脂的固体LB平板上培养。红霉素产生菌糖多孢红霉菌及其工程菌株在30℃胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基或在含有2.2%琼脂的R3M平板上培养。
1.2材料、DNA操作与测序
PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋氨基酸、硫链丝菌肽、安普霉素从Sigma公司购买。TSB、酵母提取物、蛋白胨购买于Oxoid公司。甘氨酸、琼脂粉、氯化钠和其它生物学试剂都购于试剂公司。大肠杆菌和糖多孢红霉菌的一般操作技术按照标准操作。引物的合成和DNA测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
表1研究中所用的菌种和质粒
表2本发明构建合成的引物
1.3 SACE_3980基因缺失突变体的构建
试验中合成的引物序列见表2。pUCTSR质粒是在pUC18的BamH I和Sma I酶切位点之间***1360bp的硫链丝菌肽抗性基因(tsr)。为了敲除糖多孢红霉菌中的SACE_3980基因,分别用3980-P1/3980-P2和3980-P3/3980-P4为引物、糖多孢红霉菌A226基因组为模板,PCR扩增SACE_3980基因的上、下游各约1.5kb的同源片段。
分别将上述两个3980-U和3980-D上下游片段分别连接到pUCTSR的tsr抗性基因序列两侧,完成构建质粒pUCTSRΔ3980;以3980-P1和3980-P4为引物、pUCTSRΔ3980质粒为模板,PCR扩增3980U-tsr-D大片段,利用染色体片段同源重组技术将3980U-tsr-D大片段转化糖多孢红霉菌原生质体中,根据硫链丝菌肽抗性筛选阳性突变株,获得SACE_3980基因被tsr替换的基因工程菌株。以3980-P5和3980-P6作为鉴定引物,以质粒pUCTSRΔ3980为阳性模板,A226基因组为阴性模板进行PCR鉴定,阳性缺失突变体命名为ΔSACE_3980(见图3A)。
1.4 SACE_3980基因回复菌株的构建
利用设计的引物3980-P7和3980-P8扩增出SACE_3980基因,并电泳回收,使用NdeI和Xba I内切酶分别对回收到的SACE_3980基因片段与pIB139进行双酶切并回收,通过T4DNA连接酶将SACE_3980基因片段连接到pIB139上,成功获得整合型质粒pIB139-3980。然后通过PEG介导的原生质体转化方法将pIB139-3980导入ΔSACE_3980原生质体中。通过安普霉素初步筛选,以安普霉素抗性基因(apr)为对象进行PCR鉴定,获得的回复菌株命名为ΔSACE_3980/pIB139-3980。
1.5出发菌株A226中过表达SACE_3980基因
pIB139-3980通过PEG介导的原生质体转化技术导入糖多孢红霉菌A226原生质体中,以安普霉素抗性基因(apr)为对象进行PCR鉴定,获得阳性菌株命名为A226/pIB139-3980。
1.6糖多孢红霉菌发酵产物HPLC检测
接种糖多孢红霉菌于TSB培养基,在30℃振荡培养48小时后,转接至R5液体培养基,30℃振荡培养144小时,然后利用有机溶剂对发酵液进行萃取,使用水浴锅蒸干后,加入1mL甲醇溶解并使用0.22μm有机滤膜处理,后上机检测样品中的红霉素A含量。
1.7糖多孢红霉菌菌丝体生物量检测
以相同的接种量分别将ΔSACE_3980突变株与A226接种于30mL的液体TSB中,30℃摇床培养48小时后,转接到R5培养基中30℃转速220rpm摇床培养144小时,期间设置不同时间段取样,用无水乙醇清洗后烘干称量菌体干重,每次重复取样两次,并取得平均值,测量结束后根据实验数据绘制菌体生物量曲线。
1.8红霉素工业高产菌株WB/ΔSACE_3980菌株的构建及HPLC检测
在红霉素工业高产菌株WB中缺失SACE_3980,验证正确菌株命名为WB/ΔSACE_3980。并将WB高产菌株与缺失突变株WB/ΔSACE_3980的发酵产物进行HPLC检测。突变株构建过程和HPLC检测参考上述1.3和1.6方法。
结果分析:
2.1缺失突变株ΔSACE_3980较出发菌株A226红霉素产量提高。
SACE_3980与临近基因在糖多孢红霉菌染色体上的位置见图1。SACE_3980基因缺失突变株A226/ΔSACE_3980构建过程见图2A。SACE_3980基因缺失突变体在含有30μg ml-1硫链丝菌肽的R3M平板上筛选并通过PCR证实(见图2B)。
ΔSACE_3980在R5液体培养基中发酵6天(144h),离心收集发酵上清液;点样于含枯草芽孢杆菌菌液的LB平板表面,37℃培养12小时后观察平板上抑菌圈大小,结果显示:ΔSACE_3980的发酵液抑菌圈较A226明显偏大(见图3A),初步推断SACE_3980基因可能是负调节于红霉素的产量。
将发酵液萃取后,经HPLC检测每日红霉素A产量,发现第六天ΔSACE_3980较出发菌株A226的产量提高了28.3%(见图3B),HPLC结果再次表明SACE_3980是参与红霉素生物合成的负向调控子。
2.2 SACE_3980基因回复与过表达。
为了验证突变体ΔSACE_3980中红霉素产量的提高是因为SACE_3980基因缺失引起的,将SACE_3980基因表达载体pIB139-3980和pIB139载体(作为对照),分别导入ΔSACE_3980突变株和出发菌株A226的原生质体中,获得回复菌株及空载ΔSACE_3980/pIB139-3980、ΔSACE_3980/pIB139,过表达菌株及空载A226/pIB139-3980、A226/pIB139,PCR鉴定证实(见图4A)。后将A226及ΔSACE_3980系列突变株进行摇瓶发酵,HPLC检测结果显示:ΔSACE_3980的红霉素A产量较A226升高29.3%;回复菌株ΔSACE_3980/pIB139-3980的红霉素A产量较A226基本恢复;A226/pIB139-3980的红霉素A产量相比于A226降低约20%(见图4B);HPLC检测结果进一步表明SACE_3980基因能够负调红霉素A的生物合成。
2.3缺失SACE_3980基因对菌体生长及孢子形态分化的影响。
测定发酵6天的ΔSACE_3980突变株与A226菌株的菌体干重,绘制相应变化曲线,结果显示ΔSACE_3980较A226的生物量差异不大(见图5A),暗示着SACE_3980基因的缺失并未影响菌体的初级代谢。
为了确定SACE_3980基因是否调控菌体的孢子形成,将突变株ΔSACE_3980、回复菌株ΔSACE_3980/pIB139-3980、过表达菌株A226/pIB139-3980以及野生型对照菌株A226同时涂于R3M平板上,30℃培养72小时,观察菌株孢子生长情况。结果显示相比于A226,ΔSACE_3980突变体的孢子形态无明显差异(图5B),说明SACE_3980基因的缺失不影响孢子的形成。
2.4改造的工业高产菌株WB/ΔSACE_3980使红霉素产量提高。
首先进行WB/ΔSACE_3980突变株的构建,构建过程参照图2A,PCR鉴定见图6A。后将WB/ΔSACE_3980突变株及工业高产菌株WB涂板活化,然后分别接入工业种子培养基的摇瓶中,30℃转速220rpm下培养2天后,转接工业发酵培养基中,继续培养6天。发酵结束后萃取浓缩经HPLC分析,相比较出发菌株WB,WB/ΔSACE_3980的红霉素产量分别提高了15.8%(见图6B)。这说明高产菌株WB中SACE_3980基因同样参与调节红霉素的产量。
CCCAAGCTTGCGGTGTTCATCAGCGCGAT
GCTCTAGAGCTCGACGAACAGCCGGATG
CGGGGTACCAGATCACCACCGTCCTGCG
CCGGAATTCAGCCTCAACGTGCGGTTCA
GCATGCCACAAAGGCTAACTCGGT
AAGTCAGCACAGGCGTCCTCAGT
GGAATTCCATATGATGGCGGTCATGAGCGAGCC
GCTCTAGATCAGCCGCAGCAGGCGGCC
GGAGTGCATATGGTGCAATACGAATGGCGAAAAG
CTCAAAGCTTCAGCCAATCGACTGGCGAGCG
Claims (3)
1.一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量的方法,其特征在于:通过基因工程途径使糖多孢红霉菌中SACE_3980基因失活,获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株,用所述的菌株发酵生产红霉素。
2.根据权利要求1所述的一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量的方法,其特征在于所述的SACE_3980基因产物可以负向调控红霉素生物合成。
3.根据权利要求1所述的一种通过改造糖多孢红霉菌SACE_3980基因提高红霉素产量的方法,其特征在于:在工业高产菌株中缺失TetR家族转录基因SACE_3980,获得高产突变株,可用于红霉素生产。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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