CN114410560B - 一株高产fk228的工程菌株及其构建与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高产FK228的工程菌株E264Δtdp::R‑tdp‑dep，其是利用Burkholderia thailandensis E264Δtdp为出发菌株，通过位点特异性重组的方法在其基因组上整合了组合生物合成基因簇R‑tdp‑dep获得。本发明还公开了所述工程菌株在发酵制备FK228中的应用。实验证实：本发明的工程菌株E264Δtdp::R‑tdp‑dep产FK228的量达到了350mg/L，是目前FK228生产菌株产量的近18倍。本发明的技术方案极大地提升了FK228的产量且降低了发酵成本，缩短了发酵生产周期，为FK228的规模化制备和开发组蛋白去乙酰化酶抑制剂类药物奠定了基础，具有显著的经济价值和社会效益。

Description

一株高产FK228的工程菌株及其构建与应用
技术领域
本发明涉及一种产组蛋白去乙酰化酶抑制剂的工程菌及其构建与应用，尤其涉及一株高产组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株及其构建与发酵生产FK228的应用，属于生物技术领域。
背景技术
利用遗传操作***对细菌进行改造对发现新型药物具有重大意义。目前，通过Red同源重组技术可以用来精确的修饰细菌的基因组。前期，申请人在伯克氏菌中构建了高效的同源重组***，该***包含三个同源重组操纵子，其中操纵子ETh1h2e_YI23在Burkholderiaglumae PG1中具有非常高的同源重组效率，并且利用该***在其他伯克氏菌中进行了基因组挖掘发现了一系列新的化合物。
Burkholderiathailandensis E264是一株革兰氏阴性菌，其基因组大约为6.7Mbp，含有两个染色体，GC含量为67.6％。antiSMASH软件分析，其含有20个天然产物生物合成基因簇，这些基因簇能够编码表达各种各样的不同类型的化合物，包括非核糖体肽类、聚酮类、萜类等，其中产量最高的是thailandepsin类化合物。
FK228作为一种高效的并具有选择性的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，具有非常好的抗肿瘤活性。由美国Gloucester Pharmaceuticals公司开发的FK228抗肿瘤药物制剂(注射液)Istodax，已于2009年被美国FDA批准用于治疗外周及皮肤T-细胞淋巴瘤。已知能产FK228的野生菌株Chromobacteriumviolaceum No.968产量相对有限(19mg/L)，同时其化学合成也被证明非常困难。
申请人前期提交了申请号为“202111038045.4”的专利申请“一株异源表达组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株及其构建与应用”。该专利通过组合生物合成手段对thailandepsin的生物合成基因簇tdp进行改造得到了能够产FK228的基因簇R-tdp-dep，构建了可以表达FK228的工程菌株E264::R-tdp-dep。但是，该工程菌株E264::R-tdp-dep是利用转座的方法将基因簇R-tdp-dep整合到阻断了thailandepsin表达的菌株BurkholderiathailandensisE264ΔoprABCΔtdpDE5kb的基因组上得到的，其FK228的产量为94mg/L，该产量仍不足以进行工业生产。基于此，申请人进一步检索发现有关利用伯克氏菌高效同源重组***结合反向筛选技术，敲除thailandepsin的完整基因簇，并且在敲除thailandepsin基因簇的位置添加attB位点从而构建底盘菌E264Δtdp；然后通过位点特异性重组将FK228的基因簇R-tdp-dep整合到底盘菌E264Δtdp原本表达thailandepsin的位置，获得能进行工业生产的高产FK228的工程菌株及其应用的专利或文献还未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株高产组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株及其构建与发酵生产FK228的应用。
本发明所述高产组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株，其特征在于：该工程菌株命名为工程菌株E264Δtdp::R-tdp-dep，其基因型为：Burkholderia thailandensisE264Δtdp、阿泊拉霉素抗性基因、tdpR、tdpA、tdpB、tdpC1、tdp-depDE、tdpF、tdpG、tdpH、tdpI和tdpJ，是利用敲除了thailandepsin的完整基因簇并在相应位置添加了attB位点构建的底盘菌Burkholderia thailandensis E264Δtdp为出发菌株，通过位点特异性重组将FK228的基因簇R-tdp-dep整合到底盘菌E264Δtdp原本表达thailandepsin的位置获得。
上述高产组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株的构建方法，步骤是：
(1)利用同源重组***ETh1h2e_YI23对Burkholderia thailandensis E264中thailandepsin的生物合成基因簇进行敲除；
(2)利用PheS反向筛选结合同源重组技术，将attB位点放置在thailandepsin的生物合成基因簇敲除的位置，构建得到底盘菌，命名为Burkholderia thailandensis E264Δtdp；
(3)在构建的质粒p15A-cm-R-tdp-dep中***位点特异性重组元件，构建得到表达质粒，命名为p15A-apra-phiC31-R-tdp-dep；
(4)将表达质粒p15A-apra-phiC31-R-tdp-dep电转至E.coli WM3064中，然后与底盘菌Burkholderia thailandensis E264Δtdp进行结合转移，最终将FK228的基因簇R-tdp-dep整合到宿主染色体上，得到能高产组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株，该工程菌株命名为工程菌株E264Δtdp::R-tdp-dep。
本发明所述高产组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株在发酵制备FK228中的应用。
其中：
所述高产FK228的工程菌株发酵制备FK228的方法是：
一级种子培养：保藏的工程菌株E264Δtdp::R-tdp-dep种子用接种环挑取一环划平板于固体LB培养基上，在37±1℃恒温培养箱中培养12±2h；
二级种子培养：用接种环挑取培养好的一级种子，接入装液量为50mL液体LB培养基的250mL摇瓶中，在37±1℃、180±20r·min-1条件下培养18±2h；
发酵培养：将工程菌株E264Δtdp::R-tdp-dep二级种子按体积比1-5％接种量接入装液量为65mL发酵培养基的250mL摇瓶中，在28±1℃、180±20r·min-1的条件下培养56±2h；得到含FK228的发酵液。
所述含FK228的发酵液的分离方法是：
利用等体积的乙酸乙酯对含FK228的发酵液进行萃取，重复3±1次，合并萃取液，低压浓缩干燥获得FK228粗提物。
HPLC分离纯化：以超纯水为流动相A，以色谱纯乙腈为流动相B，梯度洗脱条件为0–5min 5％B,5–60min 40％B,3mL/min，收集流份，低压浓缩干燥，获得FK228纯品。
本发明公开了一株高产组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株及其构建与发酵生产FK228的应用。其中提供的工程菌株E264Δtdp::R-tdp-dep在现有文献中未见报道，是申请人首次利用伯克氏菌高效同源重组***结合反向筛选技术，敲除thailandepsin的完整基因簇，并且在敲除thailandepsin基因簇的位置添加attB位点而构建了BurkholderiathailandensisE264Δtdp底盘菌，然后将基因簇R-tdp-dep通过位点特异性重组的方法整合到E264Δtdp的基因组上，并在E264Δtdp中实现了FK228的高产。本发明的工程菌株较申请号为“202111038045.4”提供的工程菌株E264::R-tdp-dep突出的优势体现在：利用位点特异性重组技术使基因簇R-tdp-dep整合在底盘菌原本高表达thailandepsin的基因簇的位置，并且本发明的工程菌株未对药物外排泵进行敲除。FK228产量比较实验显示，本发明的工程菌株相比申请号为“202111038045.4”提供的工程菌株E264::R-tdp-dep产FK228的产量提高了3.5倍，产生了意想不到的效果。同时进一步的实验证实：本发明提供的工程菌株E264Δtdp::R-tdp-dep产FK228的量达到了350mg/L，是目前已报道的FK228生产菌株产量的近18倍。本发明技术方案极大地提升了FK228的产量且降低了发酵生产成本，缩短了发酵生产周期，这为FK228的规模化制备和开发组蛋白去乙酰化酶抑制剂类药物奠定了基础，对于开发抗肿瘤药物具有重要的研究和应用价值。
附图说明
图1：用于构建底盘菌E264Δtdp的敲除质粒和辅助质粒。
其中：A为质粒pKY23，B为质粒pKP12。
图2：底盘菌E264Δtdp的构建。
其中：A为利用同源重组***结合反向筛选***进行基因敲除以及***attB位点的过程，B为敲除基因簇tdp之后进行菌落PCR结果，C为***attB位点的菌落PCR结果。
图3：质粒p15A-apra-phiC31-R-tdp-dep的构建。
图4：质粒p15A-apra-phiC31-R-tdp-dep的酶切分析。
其中：采用限制性内切酶PstI进行酶切分析。M表示NEB 1kb marker，C表示对照质粒p15A-cm-R-tdp-dep，12个重组子均为正确的重组子。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
一般性说明：
如下实施例所涉及的重组酶表达菌株E.coli GB08-red和重组酶表达菌株E.coliGB05-dir、均购于德国GeneBridges公司；E.coli WM3064和BurkholderiathailandensisE264来源于山东大学-赫姆霍兹生物技术研究所。
pR6K-oriT-phiC31-apra均购于德国Gene Bridges公司。质粒p15A-cm-R-tdp-dep和质粒pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan来源于山东大学-赫姆霍兹生物技术研究所。
LB培养基：Tryptone 10g·L-1，Yeast extract 5g·L-1，NaCl 10g·L-1，固体培养基另添加琼脂12g·L-1；发酵培养基：葡萄糖10g·L-1，胰蛋白胨1.67g·L-1，K2HPO4·3H2O9.17g·L-1，KH2PO4 2g·L-1，柠檬酸钠0.5g·L-1，MgSO4·7H2O 0.1g·L-1，pH 7.0。
Thailandepsins生物合成基因簇tdp和FK228的生物合成基因簇dep基因序列见NCBI中公开的序列。
质粒构建中基因测序由生工生物(上海)股份有限公司完成。其他未提及质粒均为市售常规质粒，电转化转入受体菌中的方法为常规方法。
下述实施例中，其他涉及的试剂和耗材均为国产。实施例中的实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂，均可从商业途径得到。
实施例1：用于构建底盘菌E264Δtdp的敲除质粒和辅助质粒的构建
质粒pKY23和pKP12构建过程见图1。
具体步骤为：以pBBR1-Rha-ETh1h2e_yi23-kan为初始质粒，用Hind III对其进行单酶切，酶切成线性片段的质粒进行胶回收；通过PCR获得阿泊拉霉素抗性基因和反向筛选sacB基因，然后通过串联PCR将两个基因串联在一起；得到的线性载体片段与串联PCR产物共转化到E.coli GB05-dir中进行线线重组，得到的重组子进行酶切验证，测序，从而得到Burkholderiathailandensis E264同源重组敲除质粒，所述系列表达质粒命名为pKY23，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
通过PCR分别获得p15A-cm、PheS反向筛选标签和tetR抗性基因片段，将PCR获得的片段分别进行胶回收处理；得到的线性片段共转化到E.coli GB05-dir中进行线线重组；得到的重组子进行酶切验证，测序，从而得到Burkholderiathailandensis E264同源重组的辅助质粒，命名为pKP12，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2：Burkholderiathailandensis E264中的thailandepsin生物合成基因簇tdp的敲除敲除tdp基因簇的方案见图2A。
具体步骤为：通过antiSMASH分析tdp基因簇在染色体上的位置，确定其位于Burkholderiathailandensis E264中染色体I中(Accession Number：CP000086.1)，敲除区域从BTH_I2355到BTH_I2368，共计38.58kb。
为方便后期在tdp基因簇原位置，表达外源目的生物合成基因簇，设计添加了phCi31位点特异性整合酶的attB位点。
以辅助质粒为模版，以引物pKOtdp-F1和pKOtdp-R1，pKOtdp-F2和pKOtdp-R2，以及pKOtdp-F3和pKOtdp-R3，通过三轮串联PCR获得敲除片段HAUP-tet-PheS-HAUD(～2.8kb)，该敲除片段含有tdp基因簇上下游160bp同源臂以及四环素抗性片段和PheS反向筛选标签。其中，所述引物核苷酸序列是：
pKOtdp-F1：GGTCGGCGCCGGCACGCGGTGATCTTGAGCGGCAATCGATCTGACATTGGCTTGACTATGAGGAAATCACCTCTTATTTCATTATGGTG
pKOtdp-R1：AGATGGTGACGAGGAAACGCGGTTATAGACAATGTGATCGCATATCCGATCGTTGATAAAGAGTTGCACGAGAATCCCTGCTTCGTCCA
pKOtdp-F2：TCACCATGCGCGCTGGGTCGGATTGCCGGCGGCCGTGACGGTCGGCGCCGGCACGCGGT
pKOtdp-R2：TATGGATCGAAAGCAATTTTCAGCAAATTTCCGCAATGGAGATGGTGACGAGGAAACGC
pKOtdp-F3:GAATTGACCGATTCGGTCGTCAGCAGTACCTGCGACCGCAGCCTGCATTTTCACCATGCGCGCTGGGTC
pKOtdp-R3：GATTGACGATCAATTAGATGTTGGTTCTGCGCATGTTTTAAATGAATCGATATGGATCGAAAGCAATTT
用上述三对引物扩增片段HAUP-tet-PheS-HAUD片段的具体做法如下：
PCR反应程序：
胶回收纯化敲除片段HAUP-tet-PheS-HAUD，NanoDrop 3000测定其浓度，将1-2μg敲除片段电转化含有pKY23的Burkholderiathailandensis E264中，通过在Burkholderiathailandensis E264中加入鼠李糖诱导表达-ETh1h2e_yi23重组酶，同源敲除tdp生物合成基因簇。待平板长出单克隆，挑单克隆，以引物ck-KOtdp-F和ck-KOtdp-R菌落PCR验证敲除菌株，1％TBE检测其PCR条带，大约为～3.4kb见图2B。
ck-KOtdp-F：ACGGACATCATCAACCTGAGTCTC
ck-KOtdp-R：CCGGCTCATCCCTCGATCCAATC
用上述检测引物菌落PCR检测敲除菌株的具体做法如下：
PCR反应程序：
以pHAUDtdp-F和pHAUDtdp-R为引物PCR扩增HAUDtdp片段(196bp)；以pHAUPtdp-F和pHAUPtdp-R为引物PCR扩增HAUPtdp片段(196bp)胶回收纯化该片段。以pHAUPtdp-F和pHAUDtdp-R为引物，以上述两个纯化片段为模版，通过串联PCR扩增获得无痕敲除片段fullHAtdp::attB(356bp)。
pHAUDtdp-F：GGGTGCCAGGGCGTGCCTTGGGCTCCCGGGCGCGTATCGTGCAACTCTTTATCAAC
pHAUDtdp-R：GATTGACGATCAATTAGATGTTG
pHAUPtdp-F：GAATTGACCGATTCGGTCGTCAG
pHAUPtdp-R：TACGCGCCCGGGAGCCCAAGGCACGCCCTGGCACCCGGTGATTTCCTCATAGTCAAG
将无痕敲除片段fullHAtdp::attB电转化到含有同源敲除质粒pKY23的已敲除tdp基因簇的E264中，通过在Burkholderiathailandensis E264中加入鼠李糖诱导表达ETh1h2e_yi23重组酶，将Burkholderiathailandensis E264基因组上敲除片段HAUP-tet-PheS-HAUD替换为无痕敲除片段fullHAtdp::attB。
待M9+0.1％cPhe平板长出单克隆，挑单克隆，以引物ck-KOtdp-F和ck-KOtdp-R菌落PCR验证敲除菌株，引物序列同上。1％TBE检测其PCR条带，大约为～1kb见图2C。
测序验证菌落PCR，将Burkholderiathailandensis E264中的thailandepsin生物合成基因簇tdp无痕敲除的菌株命名为Burkholderiathailandensis E264Δtdp。
用上述检测引物菌落PCR检测敲除菌株的具体做法如下：
PCR反应程序：
实施例3：表达质粒p15A-oriT-phiC31-kan-R-tdp-dep的构建
表达质粒p15A-oriT-phiC31-kan-R-tdp-dep的构建过程见图3。
首先以pR6K-oriT-phiC31-kan为模板，以oriT-phiC31-kan-1以及oriT-phiC31-kan-2为引物扩增片段oriT-phiC31-kan，其上带有p15A-cm-R-tdp-dep质粒上氯霉素基因序列两端的同源臂，将扩增的片段经胶回收纯化。
将经纯化的片段oriT-phiC31-apra电转至含质粒p15A-cm-R-tdp-dep并经10％L-***糖诱导的E.coli GB08-red中，细胞复苏1h之后，均匀涂布到20μg/ml阿泊拉霉素的LB平板上，置于37℃的恒温培养箱中，过夜培养。挑取单菌落，用限制性内切酶PstI进行酶切(酶切电泳分析见图4)，筛选正确的重组质粒p15A-apra-phiC31-R-tdp-dep。将限制性内切酶分析正确的重组质粒分别用引物R1-3out-seq和kan-3out-seq进行测序，对同源臂区域的序列进行测序所用的引物序列如下：
oriT-phiC31-kan-1:ACTAGTGCTTGGATTCTC
oriT-phiC31-kan-2:gacgtcgatatctggcgaaaatgagacgtTGATCATATGCGGATTAG(小写字母为同源臂)。
用引物oriT-phiC31-kan-1和oriT-phiC31-kan-2PCR扩增片段oriT-phiC31-kan的具体做法如下：
PCR扩增体系：
PCR反应程序：
对同源臂区域的序列进行测序所用的引物序列如下：
R1-3out-seq:GGCAAGAGATTCTCCAGCGC
kan-3out-seq:CGTCGGGCTCTTCGTAGAC。
实施例4：本发明所述工程菌株E264Δtdp::R-tdp-dep的构建
将表达质粒p15A-apra-phiC31-R-tdp-dep电转至E.coli WM3064中，然后与Burkholderiathailandensis E264Δtdp进行结合转移，最终将组合生物合成基因簇R-tdp-dep整合到宿主染色体，得到了能高产FK228的工程菌株，命名为工程菌株E264Δtdp::R-tdp-dep。
其中接合转移步骤是：首先将质粒p15A-apra-phiC31-R-tdp-dep电转至E.coliWM3064中，挑取单克隆进行酶切鉴定筛选正确克隆；含质粒p15A-apra-phiC31-R-tdp-dep的E.coli WM3064在20μg/ml阿泊拉霉素和1mM DAP的LB平板上划线，37℃，倒置培养过夜；Burkholderiathailandensis E264Δtdp在LB平板上划线，37℃，倒置培养过夜；挑取过夜培养的Burkholderiathailandensis E264Δtdp在含有1mM DAP的LB平板上一区划线，在其上划线过夜培养的含质粒p15A-apra-phiC31-R-tdp-dep的E.coli WM3064；培养6h后，用LB洗出菌苔，吸取100ul，在含20μg/ml阿泊拉霉素的LB平板上划线。挑取单克隆，进行菌落PCR，鉴定正确的克隆即为高产FK228的工程菌株E264Δtdp::R-tdp-dep。
实施例5：以高产FK228的工程菌株发酵制备FK228
一级种子培养：将保藏的高产FK228的工程菌株E264Δtdp::R-tdp-dep种子用接种环挑取一环划平板于固体LB培养基上，在37±1℃恒温培养箱中培养12±2h；
二级种子培养：用接种环挑取培养好的一级种子，接入装液量为50mL液体LB培养基的250mL摇瓶中，在37±1℃、180±20r·min-1条件下培养18±2h；
发酵培养：将二级种子按体积比1％接种量接入装液量为65mL发酵培养基的250mL摇瓶中，在28±1℃、180±20r·min-1的条件下培养56±2h；得到含FK228的发酵液。
实施例6：FK228的分离纯化
利用等体积的乙酸乙酯对含FK228的发酵液进行萃取，重复3±1次，合并萃取液，低压浓缩干燥获得FK228的粗提物；HPLC分离纯化：以超纯水为流动相A，以色谱纯乙腈为流动相B，梯度洗脱条件为0–5min 5％B,5–60min 40％B,3mL/min，收集流份，低压浓缩干燥，获得FK228纯品。
序 列 表
<110> 山东大学
<120> 一株高产FK228的工程菌株及其构建与应用
<141> 2022-01-27
<160> 2
<210> 1
<211> 12047
<212> DNA
<213>人工序列
<221> pKY23的核苷酸序列
<222>（1）…（12047）
<400> 1
ctaccggcgc ggcagcgtga cccgtgtcgg cggctccaac ggctcgccat cgtccagaaa 60
acacggctca tcgggcatcg gcaggcgctg ctgcccgcgc cgttcccatt cctccgtttc 120
ggtcaaggct ggcaggtctg gttccatgcc cggaatgccg ggctggctgg gcggctcctc 180
gccggggccg gtcggtagtt gctgctcgcc cggatacagg gtcgggatgc ggcgcaggtc 240
gccatgcccc aacagcgatt cgtcctggtc gtcgtgatca accaccacgg cggcactgaa 300
caccgacagg cgcaactggt cgcggggctg gccccacgcc acgcggtcat tgaccacgta 360
ggccgacacg gtgccggggc cgttgagctt cacgacggag atccagcgct cggccaccaa 420
gtccttgact gcgtattgga ccgtccgcaa agaacgtccg atgagcttgg aaagtgtctt 480
ctggctgacc accacggcgt tctggtggcc catctgcgcc acgaggtgat gcagcagcat 540
tgccgccgtg ggtttcctcg caataagccc ggcccacgcc tcatgcgctt tgcgttccgt 600
ttgcacccag tgaccgggct tgttcttggc ttgaatgccg atttctctgg actgcgtggc 660
catgcttatc tccatgcggt agggtgccgc acggttgcgg caccatgcgc aatcagctgc 720
aacttttcgg cagcgcgaca acaattatgc gttgcgtaaa agtggcagtc aattacagat 780
tttctttaac ctacgcaatg agctattgcg gggggtgccg caatgagctg ttgcgtaccc 840
ccctttttta agttgttgat ttttaagtct ttcgcatttc gccctatatc tagttctttg 900
gtgcccaaag aagggcaccc ctgcggggtt cccccacgcc ttcggcgcgg ctccccctcc 960
ggcaaaaagt ggcccctccg gggcttgttg atcgactgcg cggccttcgg ccttgcccaa 1020
ggtggcgctg cccccttgga acccccgcac tcgccgccgt gaggctcggg gggcaggcgg 1080
gcgggcttcg ccttcgactg cccccactcg cataggcttg ggtcgttcca ggcgcgtcaa 1140
ggccaagccg ctgcgcggtc gctgcgcgag ccttgacccg ccttccactt ggtgtccaac 1200
cggcaagcga agcgcgcagg ccgcaggccg gaggcttttc cccagagaaa attaaaaaaa 1260
ttgatggggc aaggccgcag gccgcgcagt tggagccggt gggtatgtgg tcgaaggctg 1320
ggtagccggt gggcaatccc tgtggtcaag ctcgtgggca ggcgcagcct gtccatcagc 1380
ttgtccagca gggttgtcca cgggccgagc gaagcgagcc agccggtggc cgctcgcggc 1440
catcgtccac atatccacgg gctggcaagg gagcgcagcg accgcgcagg gcgaagcccg 1500
gagagcaagc ccgtagggcg ccgcagccgc cgtaggcggt cacgactttg cgaagcaaag 1560
tctagtgagt atactcaagc attgagtggc ccgccggagg caccgccttg cgctgccccc 1620
gtcgagccgg ttggacacca aaagggaggg gcaggcatgg cggcatacgc gatcatgcga 1680
tgcaagaagc tggcgaaaat gggcaacgtg gcggccagtc tcaagcacgc ctaccgcgag 1740
cgcgagacgc ccaacgctga cgccagcagg acgccagaga acgagcactg ggcggccagc 1800
agcaccgatg aagcgatggg ccgactgcgc gagttgctgc cagagaagcg gcgcaaggac 1860
gctgtgttgg cggtcgagta cgtcatgacg gccagcccgg aatggtggaa gtcggccagc 1920
caagaacagc aggcggcgtt cttcgagaag gcgcacaagt ggctggcgga caagtacggg 1980
gcggatcgca tcgtgacggc cagcatccac cgtgacgaaa ccagcccgca catgaccgcg 2040
ttcgtggtgc cgctgacgca ggacggcagg ctgtcggcca aggagttcat cggcaacaaa 2100
gcgcagatga cccgcgacca gaccacgttt gcggccgctg tggccgatct agggctgcaa 2160
cggggcatcg agggcagcaa ggcacgtcac acgcgcattc aggcgttcta cgaggccctg 2220
gagcggccac cagtgggcca cgtcaccatc agcccgcaag cggtcgagcc acgcgcctat 2280
gcaccgcagg gattggccga aaagctggga atctcaaagc gcgttgagac gccggaagcc 2340
gtggccgacc ggctgacaaa agcggttcgg caggggtatg agcctgccct acaggccgcc 2400
gcaggagcgc gtgagatgcg caagaaggcc gatcaagccc aagagacggc ccgagacctt 2460
cgggagcgcc tgaagcccgt tctggacgcc ctggggccgt tgaatcggga tatgcaggcc 2520
aaggccgccg cgatcatcaa ggccgtgggc gaaaagctgc tgacggaaca gcgggaagtc 2580
cagcgccaga aacaggccca gcgccagcag gaacgcgggc gcgcacattt ccccgaaaag 2640
tgccacctgg gatgaatgtc agctactggg ctatctggac aagggaaaac gcaagcgcaa 2700
agagaaagca ggtagcttgc agtgggctta catggcgata gctagactgg gcggttttat 2760
ggacagcaag cgaaccggaa ttgccagctg gggcgccctc tggtaaggtt gggaagccct 2820
gcaaagtaaa ctggatggct ttcttgccgc caaggatctg atggcgcagg ggatcaagat 2880
ctgatcaaga gacaggatga ggatcgtttc gcatgattga acaagatgga ttgcacgcag 2940
gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg 3000
gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca 3060
agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac tgcaggacga ggcagcgcgg ctatcgtggc 3120
tggccacgac gggcgttcct tgcgcagctg tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg 3180
actggctgct attgggcgaa gtgccggggc aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg 3240
ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta 3300
cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag 3360
ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac 3420
tgttcgccag gctcaaggcg cgcatgcccg acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg 3480
atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa atggccgctt ttctggattc atcgactgtg 3540
gccggctggg tgtggcggac cgctatcagg acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg 3600
aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg 3660
attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc ttgacgagtt cttctgagcg ggactctggg 3720
gttcgaaatg accgaccaag cgacgcccaa cctgccatca cgagatttcg attccaccgc 3780
cgccttctat gaaaggttgg gcttcggaat cgttttccgg gacgccggct ggatgatcct 3840
ccagcgcggg gatctcatgc tggagttctt cgcccacccc catgggcaaa tattatacgc 3900
aaggcgacaa ggtgctgatg ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtt tgtgatggct 3960
tccatgtcgg cagaatgctt aatgaattac aacagttttt atgcattaat ctttctgcga 4020
attgagatga cgccactggc tgggcgtcat cccggtttcc cgggtaaaca ccaccgaaaa 4080
atagttacta tcttcaaagc cacattcggt cgaaatatca ctgattaaca ggcggctatg 4140
ctggagaaga tattgcgcat gacacactct gacctgtcgc agatattgat tgatggtcat 4200
tccagtctgc tggcgaaatt gctgacgcaa aacgcgctca ctgcacgatg cctcatcaca 4260
aaatttatcc agcgcaaagg gacttttcag gctagccgcc agccgggtaa tcagcttatc 4320
cagcaacgtt tcgctggatg ttggcggcaa cgaatcactg gtgtaacgat ggcgattcag 4380
caacatcacc aactgcccga acagcaactc agccatttcg ttagcaaacg gcacatgctg 4440
actactttca tgctcaagct gaccgataac ctgccgcgcc tgcgccatcc ccatgctacc 4500
taagcgccag tgtggttgcc ctgcgctggc gttaaatccc ggaatcgccc cctgccagtc 4560
aagattcagc ttcagacgct ccgggcaata aataatattc tgcaaaacca gatcgttaac 4620
ggaagcgtag gagtgtttat cgtcagcatg aatgtaaaag agatcgccac gggtaatgcg 4680
ataagggcga tcgttgagta catgcaggcc attaccgcgc cagacaatca ccagctcaca 4740
aaaatcatgt gtatgttcag caaagacatc ttgcggataa cggtcagcca cagcgactgc 4800
ctgctggtcg ctggcaaaaa aatcatcttt gagaagtttt aactgatgcg ccaccgtggc 4860
tacctcggcc agagaacgaa gttgattatt cgcaatatgg cgtacaaata cgttgagaag 4920
attcgcgtta ttgcagaaag ccatcccgtc cctggcgaat atcacgcggt gaccagttaa 4980
actctcggcg aaaaagcgtc gaaaagtggt tactgtcgct gaatccacag cgataggcga 5040
tgtcagtaac gctggcctcg ctgtggcgta gcagatgtcg ggctttcatc agtcgcaggc 5100
ggttcaggta tcgctgaggc gtcagtcccg tttgctgctt aagctgccga tgtagcgtac 5160
gcagtgaaag agaaaattga tccgccacgg catcccaatt cacctcatcg gcaaaatggt 5220
cctccagcca ggccagaagc aagttgagac gtgatgcgct gttttccagg ttctcctgca 5280
aactgctttt acgcagcaag agcagtaatt gcataaacaa gatctcgcga ctggcggtcg 5340
agggtaaatc attttcccct tcctgctgtt ccatctgtgc aaccagctgt cgcacctgct 5400
gcaatacgct gtggttaacg cgccagtgag acggatactg cccatccagc tcttgtggca 5460
gcaactgatt cagcccggcg agaaactgaa atcgatccgg cgagcgatac agcacattgg 5520
tcagacacag attatcggta tgttcataca gatgccgatc atgatcgcgt acgaaacaga 5580
ccgtgccacc ggtgatggta tagggctgcc cattaaacac atgaataccc gtgccatgtt 5640
cgacaatcac aatttcatga aaatcatgat gatgttcagg aaaatccgcc tgcgggagcc 5700
ggggttctat cgccacggac gcgttaccag acggaaaaaa atccacacta tgtaatacgg 5760
tcatactggc ctcctgatgt cgtcaacacg gcgaaatagt aatcacgagg tcaggttctt 5820
accttaaatt ttcgacggaa aaccacgtaa aaaacgtcga tttttcaaga tacagcgtga 5880
attttcagga aatgcggtga gcatcacatc accacaattc agcaaattgt gaacatcatc 5940
acgttcatct ttccctggtt gccaatggcc cattttcctg tcagtaacga gaaggtcgcg 6000
aattcaggcg ctttttagac tggtcgtaat gaacaattct taagaaggag gatatcctat 6060
ggtgcatggg ctcgacatcg aggcttatca cgcgatggag ccggtcagca aatccgggct 6120
cgactcgatc gacctgtcgc cgttcatctt ctggtcgcgc catcgcgatc cgcgcaggcc 6180
ggcgccgcgc gagaagcaag ggcaactcga aggcgcgctg gctcactgcg ctgtgctgga 6240
gccgaaggag ttcgagaagc gatacatcgt cggcaaggcg attcaccgcg gcaccaagga 6300
atggaaggaa ttcgttgcgg cgcatcccga gcacacggcc atccagccgg atcagtacga 6360
ggccgcgacg cgccaagcgg tatccgttcg agcactccct gagattggag aagtgctcga 6420
acaaggcgct gccgaggtgt ccgcgttttg ggttgatgaa gagacgggca tggaatgtcg 6480
gtgcaggccg gacttcgtgc atgacgtcga tgcagattcg gtgattttgc tggatctgaa 6540
aaccttctct gatccgagcc cgaacgaatt ctcgcggcaa tgcgctcgaa aggcctatgc 6600
gaaacaggct tccttctata ccgacggata cgagaaagcg agcggcaaga ctgttcgagc 6660
gttcatcttc atagccgtcg gcaatgaatg gccctatgcc gcctcagcaa tgatgctcga 6720
cgaagaaagt cttgaagccg gccgacgcca ttacaaacgc aacctcagaa catacgctga 6780
gtgcatgcgt agcggggaat ggccagggtt ctcgaacgga atcacgctca ttcgtctgcc 6840
gatgtgggcg atggaacgcg ctgaggagga gtgaaggagg cagctatatg gcacaaacca 6900
ccagcattgc aaacctgaaa cagacgtcga agatggtcgc gcgcgacgcg ggcatcggca 6960
gcgtgaagac gttcttcgag tcgcagaaag cgacgctcgc cgcggtgctg ccgaagcatg 7020
tcagcccaga ccgcatgctc aagatcgcgc tcggcgcgct gcgcacgacg ccgaagctga 7080
tggaatgcac ggtcgaatcg ctgatgggtg cggtcgtgca gtgctcgcag cttggcctgg 7140
agccgaatac gccgctcggg cacgcgtacc tgatcccgtt cgagaagaag aaaaagcagg 7200
gcggccagtg ggtgacggac aaggtcgaga ctcaaattgt gatcggctac aaaggcctga 7260
tcgatcttgc tcgccgctcg ggacaagtcg tgagcatcgc agcgcacgcg gtgcacgagc 7320
gcgacgcgtt cgactattcc tacggcctcg acgagaagct cgaacataaa ccggccatga 7380
cgaatcgcgg gcacgtgatc gcgttctatg cggtcgcgaa gctggtcggc ggcggtcatg 7440
cgttcgaggt gatgagcgcc gagcaggtca acgagatccg cgacgcgagc cagaacttca 7500
agttcgcgcg cgacaaggaa aagacagtct ggggccagca ctacgaagag atgggccgca 7560
agacggtgct gcgccggctt ttcaagtact tgccagtcag catcgagctg gcaacggcta 7620
cggcgatcga tgacgtcggc gcgcgcaacg gatcgcaggc gctcgacacg gtgctcgacg 7680
gcgactacat cacgccgagc gacgacaacg acgacggcga cgtgatcgac caagccaccg 7740
gcgagatcac cgaccagcgc gcgcagcagc aggacatgac cgtcgactac aacgaccttc 7800
tgagccagat ggggaaggcg aaggacgttg aaacgctcgc gatggtgctc gacagcggcc 7860
gttctttgcc ggaagaccag tttgtgaagc tctcggcaga gtacgaagac cgtcgtgaaa 7920
agctgatggg agcctgagga tccatatgag gaggtctaga tatgatgctt accgcagatc 7980
gcgttcgtga actcctcgac tacgcgcctg acaccggaat attcacatgg cgaaagactt 8040
ctcgccgtgc agtcgcaggc gctgtagcgg gttcggacaa cggtgagggg tacctgcaga 8100
tatcggtcga tggtcggcgc tacgccgcgc atcgcttggc atggctgcat gtccatggcg 8160
aatggccgga gacggagctt gatcatatcg acggcacgcg ctcccacaac gcgcttgcca 8220
atctgcgcct ggcggatcgg tttctgaata accggaacgt tcatggcgcg agacacaaca 8280
gcaaaaccgg tcttctcggc gcatcgccaa aaggcaatcg gttcgtcgcc caaattacag 8340
caaacggaat taaccactat ctcggccgct tcgatacggc cgaggaagca catgcggctt 8400
atatcgccgc aaagagaatc catcattcaa ccgaggagtg actcgagtgt acaggaggtc 8460
tagatatgat ccagaaacgc gacacccgcc cgcgcatcga acgaatccgc gcggcgctcg 8520
aaaagctcgg cccctcgaca gtctttgcca tcgcgaacga gacgggcatc gacgagcgcg 8580
ccatcggcga gatcatccgc accgcccgca agaaggattt ccccggcacg cggttccgca 8640
aggcaggcaa gacgcgcgag ggctgcgtga atcgaagctg gctttacgag gtaagcgacg 8700
aacctgacgt gattgtcgcg ccggcgcgat atcagccgag ccgcgagaag gccgtcaagc 8760
atcccggcat gacgcgcgaa gaagtcgccg acatgaagcg ccgggcagag cttctgcgtc 8820
aaatgaagcc gtttcgccac tggcaagacg tggcgctctt tggagccgca gcatgactcg 8880
agcatatgag gaggcctagg tatgcgcgtc ctcgtgatcg aaatcaacgg cggaaactca 8940
ttcacgttgc acgagggcga tcgttaccac gacgagctgt gctgggatga actgctcggc 9000
atggttgccg aaatgacgca tccccgtctc ggtgacggcc gctatgggtt gcgcactcgc 9060
gaagagtgga cggcgtggcg ccggtccatg cgtcctacgc agcaccctgt ttataccgaa 9120
ccgccccttc tcaccttcac cccggagaaa tgacctaggt gtacaggatc ccccagcccg 9180
cctaatgagc gggctttttt ttgaacaact cgagttggca gcatcaccca taattgtggt 9240
ttcaaaatcg gctccgtcga tactatgtta tacgccaact ttgaaaacaa ctttgaaaaa 9300
gctgttttct ggtatttaag gttttagaat gcaaggaaca gtgaattgga gttcgtcttg 9360
ttataattag cttcttgggg tatctttaaa tactgtagaa aagaggaagg aaataataag 9420
tgcaatacga atggcgaaaa gccgagctca tcggtcagct tctcaacctt ggggttaccc 9480
ccggcggtgt gctgctggtc cacagctcct tccgtagcgt ccggcccctc gaagatgggc 9540
cacttggact gatcgaggcc ctgcgtgctg cgctgggtcc gggagggacg ctcgtcatgc 9600
cctcgtggtc aggtctggac gacgagccgt tcgatcctgc cacgtcgccc gttacaccgg 9660
accttggagt tgtctctgac acattctggc gcctgccaaa tgtaaagcgc agcgcccatc 9720
catttgcctt tgcggcagcg gggccacagg cagagcagat catctctgat ccattgcccc 9780
tgccacctca ctcgcctgca agcccggtcg cccgtgtcca tgaactcgat gggcaggtac 9840
ttctcctcgg cgtgggacac gatgccaaca cgacgctgca tcttgccgag ttgatggcaa 9900
aggttcccta tggggtgccg agacactgca ccattcttca ggatggcaag ttggtacgcg 9960
tcgattatct cgagaatgac cactgctgtg agcgctttgc cttggcggac aggtggctca 10020
aggagaagag ccttcagaag gaaggtccag tcggtcatgc ctttgctcgg ttgatccgct 10080
cccgcgacat tgtggcgaca gccctgggtc aactgggccg agatccgttg atcttcctgc 10140
atccgccaga ggcgggatgc gaagaatgcg atgccgctcg ccagtcgatt ggctgactag 10200
aggatcgcta gtcacttctt gaatttgtca aaacccgtcc atataattag cactcgctgc 10260
acaggaggaa acgatgacgt actccaaaca agccgtttcc cgtagacaca aacgtttggc 10320
cctgagcgcc gccgcgctca ccgcagccgc ttgcatgtcg gcgcacgcgc agagcgacgg 10380
cgcaactcaa gcgtttgcga aagaaacgaa ccaaaagcca tataaggaaa catacggcat 10440
ttcccatatt acacgccatg atatgctgca aatccctgaa cagcaaaaaa atgaaaaata 10500
tcaagtttct gaatttgatt cgtccacaat taaaaatatc tcttctgcaa aaggcctgga 10560
cgtttgggac agctggccat tacaaaacgc tgacggcact gtcgcaaact atcacggcta 10620
ccacatcgtc tttgcattag ccggagatcc taaaaatgcg gatgacacat cgatttacat 10680
gttctatcaa aaagtcggcg aaacttctat tgacagctgg aaaaacgctg gccgcgtctt 10740
taaagacagc gacaaattcg atgcaaatga ttctatccta aaagaccaaa cacaagaatg 10800
gtcaggttca gccacattta catctgacgg aaaaatccgt ttattctaca ctgatttctc 10860
cggtaaacat tacggcaaac aaacactgac aactgcacaa gttaacgtat cagcatcaga 10920
cagctctttg aacatcaacg gtgtagagga ttataaatca atctttgacg gtgacggaaa 10980
aacgtatcaa aatgtacagc agttcatcga tgaaggcaac tacagctcag gcgacaacca 11040
tacgctgaga gatcctcact acgtagaaga taaaggccac aaatacttag tatttgaagc 11100
aaacactgga actgaagatg gctaccaagg cgaagaatct ttatttaaca aagcatacta 11160
tggcaaaagc acatcattct tccgtcaaga aagtcaaaaa cttctgcaaa gcgataaaaa 11220
acgcacggct gagttagcaa acggcgctct cggtatgatt gagctaaacg atgattacac 11280
actgaaaaaa gtgatgaaac cgctgattgc atctaacaca gtaacagatg aaattgaacg 11340
cgcgaacgtc tttaaaatga acggcaaatg gtacctgttc actgactccc gcggatcaaa 11400
aatgacgatt gacggcatta cgtctaacga tatttacatg cttggttatg tttctaattc 11460
tttaactggc ccatacaagc cgctgaacaa aactggcctt gtgttaaaaa tggatcttga 11520
tcctaacgat gtaaccttta cttactcaca cttcgctgta cctcaagcga aaggaaacaa 11580
tgtcgtgatt acaagctata tgacaaacag aggattctac gcagacaaac aatcaacgtt 11640
tgcgccgagc ttcctgctga acatcaaagg caagaaaaca tctgttgtca aagacagcat 11700
ccttgaacaa ggacaattaa cagttaacaa ataatagtag agcttaccgg tttattgact 11760
accggaagca gtgtgaccgt gtgcttctca aatgcctgag gccagtttgc tcaggctctc 11820
cccgtggagg taataattga cgatatgatc atttattctg cctcccagag cctgataaaa 11880
acggtgaatc cgttagcgag gtgccgccgg cttccattca ggtcgaggtg gcccggctcc 11940
atgcaccgcg acgcaacgcg gggaggcaga caaggtatag ggcggcgagg cggctacagc 12000
cgatagtctg gaacagcgca cttacgggtt gctgcgcaac ccaagtg 12047
<210> 2
<211> 4325
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> pKY12的核苷酸序列
<222>（1）…（4325）
<400> 2
agatccgaaa accccaagtt acggatctta aggatctcca ggcatcaaat aaaacgaaag 60
gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctctac 120
tagagtcaca ctggctcacc ttcgggtggg cctttctgcg tttataccta gggatatatt 180
ccgcttcctc gctcactgac tcgctacgct cggtcgttcg actgcggcga gcggaaatgg 240
cttacgaacg gggcggagat ttcctggaag atgccaggaa gatacttaac agggaagtga 300
gagggccgcg gcaaagccgt ttttccatag gctccgcccc cctgacaagc atcacgaaat 360
ctgacgctca aatcagtggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 420
ccctggcggc tccctcgtgc gctctcctgt tcctgccttt cggtttaccg gtgtcattcc 480
gctgttatgg ccgcgtttgt ctcattccac gcctgacact cagttccggg taggcagttc 540
gctccaagct ggactgtatg cacgaacccc ccgttcagtc cgaccgctgc gccttatccg 600
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggaaa gacatgcaaa agcaccactg gcagcagcca 660
ctggtaattg atttagagga gttagtcttg aagtcatgcg ccggttaagg ctaaactgaa 720
aggacaagtt ttggtgactg cgctcctcca agccagttac ctcggttcaa agagttggta 780
gctcagagaa ccttcgaaaa accgccctgc aaggcggttt tttcgttttc agagcaagag 840
attacgcgca gaccaaaacg atctcaagaa gatcatctta ttaatcagat aaaatatttc 900
tagatttcag tgcaatttat ctcttcaaat gtagcacctg aagtcagccc catacgatat 960
aagttgttac tagtgcttgg attctcacca ataaaaaacg cccggcggca accgagcgtt 1020
ctgaacaaat ccagatggag ttctgaggtc attactggat ctatcaacag gagtccaagc 1080
gagctcgata tcaaattacg ccccgccctg ccactcatcg cagtactgtt gtaattcatt 1140
aagcattctg ccgacatgga agccatcaca aacggcatga tgaacctgaa tcgccagcgg 1200
catcagcacc ttgtcgcctt gcgtataata tttgcccatg gtgaaaacgg gggcgaagaa 1260
gttgtccata ttggccacgt ttaaatcaaa actggtgaaa ctcacccagg gattggctga 1320
gacgaaaaac atattctcaa taaacccttt agggaaatag gccaggtttt caccgtaaca 1380
cgccacatct tgcgaatata tgtgtagaaa ctgccggaaa tcgtcgtggt attcactcca 1440
gagcgatgaa aacgtttcag tttgctcatg gaaaacggtg taacaagggt gaacactatc 1500
ccatatcacc agctcaccgt ctttcattgc catacgaaat tccggatgag cattcatcag 1560
gcgggcaaga atgtgaataa aggccggata aaacttgtgc ttatttttct ttacggtctt 1620
taaaaaggcc gtaatatcca gctgaacggt ctggttatag gtacattgag caactgactg 1680
aaatgcctca aaatgttctt tacgatgcca ttgggatata tcaacggtgg tatatccagt 1740
gatttttttc tccattttag cttccttagc tcctgaaaat ctcgataact caaaaaatac 1800
gcccggtagt gatcttattt cattatggtg aaagttggaa cctcttacgt gccgatcaac 1860
gtctcatttt cgccagaagc tgttgactcg cttgggattt tcggaatatc atgccgggtc 1920
tgacaatcgg atcgagcttc gaaaggacaa gcatatggac ctcgatcaga tcgtggcgga 1980
tgcccagcag agctttgagg gcgcggccga cattacgacc ttggaaaatg aaaaggcccg 2040
cttcctgggc aagagcggtg ccctcacgga actcttgaag gggctgggta agctggaccc 2100
ggaaacccgg aagaccgagg gtgcccggat taacgtggcc aagcagcagg tggaggcggc 2160
cttgaatgcc cggcggcagg ccttggcgga tgcccttctc aatcagcgcc tggcggctga 2220
agccattgat gtgaccctcc ccggtcgcgg ggcgggcgcc ggctcgctgc accccgtcat 2280
gcgaacctgg gaacgtgtgg agcagatttt ccgtagcatt ggcttcgatg tcgcggatgg 2340
accggaaatt gagacggatt ggtataattt cacggcgctc aactcgcccg aaaaccaccc 2400
cgcacggtcc atgcaggaca ccttctatgt ggatggtaag gacgccgatg ggcggcccct 2460
cctcctccgg acccatacct cgcccatgca ggtgcggtac gcccgcatga atcgaccccc 2520
gattaaggtg attgctcccg gtcggaccta tcgggtcgat tcggacgcca cccatagccc 2580
catgtttaat caggtggagg ggctctggat tgatgaaaac gtgtcgtttg ccgatctcaa 2640
gggtgcctac accgactttc tcaagaaatt tttcgaacga gatgacatct tggtccgttt 2700
ccgcccgagc tacttcccct tcacggaacc cagcgcggaa attgatatga tgtttgaaca 2760
tgggaagaat gctggtaagt ggttggaaat cagcggcagc ggtcaggtcc accccacggt 2820
cattcggaat atgggcctcg acccggagcg ttacattggc ttcggcttcg gttccgggtt 2880
ggaacgcctt accatgctcc ggtatggtgt ccaggacctc cggctctttt tcgaaaatga 2940
cctccggttc ctccgccagt tcgcctaatc tcatgtttga cagcttatca tcgataagct 3000
ttaatgcggt agtttatcac agttaaattg ctaacgcagt caggcaccgt gtatgaaatc 3060
taacaatgcg ctcatcgtca tcctcggcac catcaccctg gatgctgtag gcataggctt 3120
ggttatgccg gtactgccgg gcctcttgcg ggatatcgtc cattccgaca gcatcgccag 3180
tcactatggc gtgctgctag cgctatatgc gttgatgcaa tttctatgcg cacccgttct 3240
cggagcactg tccgaccgct ttggccgccg cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc 3300
cactatcgac tacgcgatca tggcgaccac acccgtcctg tggatcctct acgccggacg 3360
catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat 3420
caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg 3480
tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt 3540
ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa cctactactg ggctgcttcc taatgcagga 3600
gtcgcataag ggagagcgtc gaccgatgcc cttgagagcc ttcaacccag tcagctcctt 3660
ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc cgcacttatg actgtcttct ttatcatgca 3720
actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg ggtcattttc ggcgaggacc gctttcgctg 3780
gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc ggtattcgga atcttgcacg ccctcgctca 3840
agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg tttcggcgag aagcaggcca ttatcgccgg 3900
catggcggcc gacgcgctgg gctacgtctt gctggcgttc gcgacgcgag gctggatggc 3960
cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg cggcatcggg atgcccgcgt tgcaggccat 4020
gctgtccagg caggtagatg acgaccatca gggacagctt caaggatcgc tcgcggctct 4080
taccagccta acttcgatca ttggaccgct gatcgtcacg gcgatttatg ccgcctcggc 4140
gagcacatgg aacgggttgg catggattgt aggcgccgcc ctataccttg tctgcctccc 4200
cgcgttgcgt cgcggtgcat ggagccgggc cacctcgacc tgaatggaag ccggcggcac 4260
ctcgctaacg gattcaccac tccaagatgc ataatgtgcc tgtcaaatgg acgaagcagg 4320
gattc 4325

Claims (4)

1.一株高产组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株，其特征在于：该工程菌株命名为工程菌株E264Δtdp::R-tdp-dep，其基因型为：Burkholderia thailandensis E264Δtdp、阿泊拉霉素抗性基因、tdpR、tdpA、tdpB、tdpC1、tdp-depDE、tdpF、tdpG、tdpH、tdpI和tdpJ，是利用敲除了thailandepsin的生物合成基因簇并在相应位置添加了attB位点构建的底盘菌Burkholderia thailandensis E264Δtdp为出发菌株，通过位点特异性重组将FK228的基因簇R-tdp-dep整合到底盘菌Burkholderia thailandensis E264Δtdp原本thailandepsin的生物合成基因簇的位置获得。
2.权利要求1所述高产组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株的构建方法，步骤是：
(1)利用同源重组***ETh1h2e_YI23对Burkholderia thailandensis E264中thailandepsin的生物合成基因簇进行敲除；
(2)利用PheS反向筛选结合同源重组技术，将attB位点放置在thailandepsin的生物合成基因簇敲除的位置，构建得到底盘菌，命名为Burkholderia thailandensis E264Δtdp；
(3)在构建的质粒p15A-cm-R-tdp-dep中***位点特异性重组元件，构建得到表达质粒，命名为p15A-apra-phiC31-R-tdp-dep；
(4)将表达质粒p15A-apra-phiC31-R-tdp-dep电转至E.coli WM3064中，然后与底盘菌Burkholderia thailandensis E264Δtdp进行结合转移，最终将FK228的基因簇R-tdp-dep整合到宿主染色体上，得到能高产组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株，该工程菌株命名为工程菌株E264Δtdp::R-tdp-dep。
3.权利要求1所述高产组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的工程菌株在发酵制备FK228中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：
发酵制备FK228的方法是：将工程菌株E264Δtdp::R-tdp-dep二级种子按体积比1-5％接种量接入装液量为65mL发酵培养基的250mL摇瓶中，在28±1℃、180±20r·min-1的条件下培养56±2h；得到含FK228的发酵液；
所述含FK228的发酵液的分离方法是：利用等体积的乙酸乙酯对含FK228的发酵液进行萃取，重复3±1次，合并萃取液，低压浓缩干燥获得FK228粗提物。
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