CN117886900B - 一种猫杯状病毒vp1蛋白截短体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种猫杯状病毒VP1蛋白截短体及其应用，属于宠物疫病检测领域。所述截短体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述截短体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明根据根据已有的蛋白质三维结构，对猫杯状病毒VP1蛋白的结构进行分析，选择稳定性较好的片段，使用原核大肠杆菌表达***进行表达。其构建方法简单，缩短了试验时间，操作步骤更简单。本发明提供的猫杯状病毒VP1蛋白截短体的ELISA检测试剂盒和试纸条用以检测猫血清中猫杯状病毒的抗体水平，具有重复性好、特异性高的特点，可用于猫杯状病毒血清学调查，适合大规模推广。
Description
技术领域
本发明涉及宠物疫病检测领域，具体涉及一种猫杯状病毒VP1蛋白截短体及其应用。
背景技术
猫杯状病毒（Feline calicivirus virus，FCV）感染，也称猫传染性鼻结膜炎，是猫科动物的一种多发的上呼吸道疾病。病原体猫杯状病毒FCV属于杯状病毒科水疮性病毒属，最早在1957年被发现，之后在全球的猫、狮子、猎豹和虎等猫科动物中均有发现，2009年在腹泻犬的粪便中也被分离到。猫杯状病毒通过病猫的直接接触和分泌物进行传播，具有高度流行性，病猫康复后仍然长期排毒，是主要的传染源。该病毒主要感染1岁以下幼猫，通常导致精神沉郁，浆液性和黏液性鼻漏，口腔溃疡，发热，结膜炎、口腔炎、气管炎和支气管炎等炎症，严重时会导致肺炎甚至死亡，感染率很高，通常死亡率较低，但是有些变异株引发的急性全身***性感染，会导致很高的死亡率，严重威胁宠物猫和猫科野生动物的健康。
猫杯状病毒FCV目前没有特异性、有效的抗病毒药物，主要是对症治疗和支持治疗。该病毒主要依靠疫苗来免疫预防，包括弱毒疫苗和灭活疫苗等。市售的许多猫多联疫苗通常包括猫杯状病毒疫苗，猫疱疹病毒疫苗和猫瘟病毒疫苗等容易混合感染的病毒疫苗。
猫杯状病毒FCV是单股正链RNA病毒，没有囊膜，有正二十面体对称的核衣壳，在室温和干燥环境下能够存活数天甚至数周，阴冷潮湿环境下存活时间更长，容易导致病毒间接传播。该病毒的基因组为7.8kb，包含三个开放阅读框ORF，ORF1主要编码非结构蛋白，包括蛋白酶，RNA依赖的RNA聚合酶RDRP和基因组连接蛋白等，ORF2和3主要编码衣壳蛋白VP1和VP2。目前针对猫杯状病毒FCV已有较多研究，衣壳蛋白VP1具有多种中和抗体和非中和抗体表位，可用于抗体检测。
我国宠物产业在不断地发展，而FCV在我国广泛流行，严重制约着猫宠业的发展。FCV引起的疾病发病率和传染性较高，对FCV的防控工作带来巨大的困难。而抗体水平是评价FCV疫苗效果的最重要参数，抗体水平过低则不能保护需要及时补打疫苗。目前监测FCV的抗体水平常用的方法中和实验，但该方法操作复杂、成本高昂故仅限于专业实验室操作。因此，需要建立一种价格低廉、快速、敏感且能简便检测血清样本的FCV抗体的方法。
因此，制备出猫杯状病毒特异性抗原蛋白，作为检测抗体方法的原料；同时可以制备特异性单克隆抗体，为建立抗原检测的间接或竞争ELISA方法和荧光微球免疫层析法提供优质原料，对于临床准确检测其抗体和抗原水平有着重要意义。
发明内容
为此，本发明目的在于提供一种特异性好、灵敏度高的猫杯状病毒VP1蛋白截短体，并提供该截短体在检测试剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种猫杯状病毒VP1蛋白截短体，其特征在于，所述截短体是由猫杯状病毒VP1蛋白从N端起第336-668位氨基酸残基截断构建而成；
所述截短体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
第二方面，本发明提供一种猫杯状病毒VP1蛋白截短体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
第三方面，本发明提供一种制备上述所述的猫杯状病毒VP1蛋白截短体的方法，其特征在于步骤为：
（1）通过PCR方法扩增出所述的截短体的编码基因后构建到pGEX-6p-1表达载体上；
（2）将步骤（1）中鉴定正确的表达载体转化到BL21(DE3)感受态细胞上，进行培养表达；
（3）将步骤（2）中表达的目的蛋白利用GST亲和层析纯化蛋白后去除标签。
第四方面，本发明提供下述（a1）-（a4）中任一种生物材料：
（a1）含有上述所述编码基因的表达盒；
（a2）含有上述编码基因的重组载体；
（a3）含有上述所述编码基因的重组菌；
（a4）含有上述所述编码基因的转基因细胞系。
第五方面，本发明提供上述所述的猫杯状病毒VP1蛋白截短体在猫杯状病毒抗体检测试剂盒和检测试纸条中的应用。
优选地，所述试剂盒为夹心ELISA抗原检测试剂盒或竞争ELISA抗体检测试剂盒；
优选地，所述试纸条为胶体金检测试纸条，或荧光微球检测试纸条，或乳胶微球检测试纸条。
本发明实施例具有如下优点：
本发明提供的猫杯状病毒VP1蛋白截短体是根据已有的蛋白质三维结构，对猫杯状病毒VP1蛋白的结构进行分析，从而选择稳定性较好的片段，使用原核大肠杆菌表达***进行表达而成的，缩短了试验时间，操作步骤更简单，同时结构也更加稳定。本发明提供的猫杯状病毒VP1蛋白截短体的ELISA检测试剂盒和试纸条用以检测猫血清中猫杯状病毒的抗体水平，具有重复性好、特异性高的特点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例提供的已发表的猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1三聚体(6GSH)的结构图；
图2为本发明实施例提供的已发表的猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1单体(6GSH)结构图；
图3为本发明实施例提供的猫杯状病毒VP1蛋白截短体表达纯化后电泳结果图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、猫杯状病毒衣壳蛋白VP1的序列比对及结构分析
猫杯状病毒衣壳蛋白VP1的序列参考参考美国生物技术信息中心NCBI的AIS22044氨基酸序列，共668个氨基酸残基，无信号肽和跨膜区，全长对应的核酸序列为KM111171，2007bp。将该蛋白质的氨基酸序列在NCBI Blast功能中与蛋白质结构数据库PDB中的结构数据进行比对。猫杯状病毒衣壳蛋白VP1已有3个结构发表，与该序列相似性均在90%左右，应该是FCV不同毒株的蛋白。其它种属的蛋白结构序列相似度最高仅53%。我们选择序列相似性最高的6GSH结构（2019年发表在Nature期刊）来进行分析。
猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1已发表的结构6GSH如图1所示，3个VP1蛋白分子组成了一个对称的三聚体结构，3个蛋白分子的N端都在上部，C端部分在下部，最下方3个圆球代表结合在C端结构域的钾离子。
猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1已发表的结构6GSH单独的蛋白分子如图2所示，上半部分N端，为类似“盖子”的结构，主要由8个反向平行的β片层和两侧4个较小的α螺旋组成，对应的氨基酸序列为129-335位（N端1-125位氨基酸组成的A区在VP1蛋白成熟过程中被切除，126-128位由于柔性较大，结构中无法显示）。C端结构域（336-668位氨基酸）大部分为无规则卷曲，穿插有几个较短的α螺旋和β片层。经由分析预测后表明，C端结构域能够独立稳定存在，且含有多个抗原表位，故而将VP1蛋白的C端结构域（336-668位氨基酸）截短体来进行表达、纯化和验证。
猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1全长氨基酸序列（SEQ ID No.1）：
MCSTCANVLKYYDWDPHIRLVIDPNRFLSVSFCDKPLLCCYPDLLPEFGTVWDCNQSPLEIYLESILGDDEWSSTFEAIDPVVPPMHWDEAGKIFQPHPGVLMHHLINQVAKAWDPNLPLFRLEADDGSITSPEQGTMVGGVIAEPSAQMSTAADMATGKSVDSEWEAFFSFHTSVNWSTSETQGKILFKQSLGPLLNPYLEHLAKLYVAWSGSVDVRFSISGSGVFGGKLAAIVVPPGVNPVQSTSMLQYPHVLFDARQVEPVIFSIPDLRSTLYHLMSDTDTTSLVIMVYNDLINPYASDSNSSGCIVTVETKPGPDFKFHLLKPPGSMLTHGSVPSDLIPKSSSLWIGNRHWTDITDFVIRPFVFQANRHFDFNQETAGWSTPRFRPITITISEKDGSKLGIGVAMDSIVPGIPDGWPDTTIPEKLVPAGDYAIANGTGNDITTAKDYDSATVIQNNTNFKGMYICGSLQRAWGDKKISNTAFITTATRRDNTITPSNVIDPTKIAVYQDTHVGAEVQTSDDTLAILGYTGIGEEAIGADRDRVVRISVLPETGARGGNHPIFYKNSIKLGYVIRSIDVFNSQILHTSRQLSLNNYLLPPDSFAVYRITDSNGSWFDIGIDSDGFSFVGASNVGKLEFPLTASYMGIQLAKIRLASNIRSSMTKL。
猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1全长核苷酸序列（SEQ ID No.2）：
ATGTGCTCAACCTGCGCTAACGTGCTTAAATACTACGATTGGGACCCCCACATTAGGTTAGTGATTGACCCCAATAGGTTTCTTTCTGTTAGTTTCTGTGATAAGCCACTTCTTTGTTGCTACCCAGACCTACTCCCAGAATTTGGAACCGTGTGGGATTGCAACCAATCTCCACTGGAAATTTACCTTGAATCTATACTTGGTGACGACGAGTGGTCATCGACGTTCGAAGCCATTGACCCAGTCGTTCCACCAATGCACTGGGACGAGGCTGGGAAGATTTTCCAGCCCCATCCTGGGGTCCTCATGCATCACCTTATCAACCAGGTTGCAAAAGCTTGGGACCCTAATCTGCCTCTATTTCGACTTGAGGCTGATGATGGGTCTATCACGTCACCTGAGCAGGGAACCATGGTTGGTGGTGTGATTGCAGAGCCTAGTGCCCAAATGTCAACTGCAGCTGATATGGCCACAGGAAAGAGTGTCGACTCTGAATGGGAGGCATTCTTCTCATTCCATACCAGTGTCAATTGGAGTACATCTGAAACACAAGGCAAGATTCTTTTCAAGCAATCTTTAGGACCACTACTTAACCCATACCTTGAGCACCTAGCAAAACTCTATGTTGCTTGGTCGGGATCTGTTGATGTTAGATTTTCTATTTCTGGATCTGGTGTCTTTGGAGGTAAGTTGGCTGCCATTGTTGTGCCTCCAGGGGTCAACCCTGTACAAAGCACATCAATGCTCCAATACCCCCACGTTCTCTTTGATGCTCGTCAAGTGGAACCTGTTATCTTCTCAATTCCTGATCTAAGGAGCACTCTGTACCACCTTATGTCTGACACTGATACCACATCCCTCGTAATCATGGTGTACAATGATCTTATCAATCCGTATGCTAGTGATTCTAATTCTTCTGGATGTATTGTCACTGTTGAAACTAAGCCTGGACCAGATTTCAAGTTCCATCTACTAAAACCCCCCGGTTCCATGCTAACTCACGGCTCCGTGCCGTCTGATTTGATCCCAAAGTCCTCTTCCCTCTGGATTGGCAATCGGCACTGGACCGATATAACTGACTTTGTAATTCGGCCATTTGTATTCCAAGCCAACCGTCACTTCGACTTTAATCAGGAGACGGCTGGTTGGAGCACGCCAAGATTCCGACCAATCACAATAACAATTAGTGAGAAGGATGGATCCAAATTGGGAATTGGGGTTGCAATGGACTCTATCGTTCCTGGAATACCGGATGGATGGCCAGATACTACCATACCTGAGAAGTTAGTCCCTGCTGGCGACTATGCAATCGCCAATGGGACTGGAAATGACATTACTACAGCCAAAGATTATGATTCGGCCACTGTAATTCAAAACAATACCAACTTCAAAGGTATGTATATCTGTGGATCTTTACAGAGAGCCTGGGGTGATAAGAAAATATCAAACACCGCATTTATTACTACTGCAACCAGGAGGGACAACACAATTACACCATCCAATGTGATAGACCCCACCAAGATTGCTGTGTACCAGGACACCCATGTGGGCGCGGAAGTGCAAACATCTGACGACACTTTGGCCATCCTTGGTTACACAGGAATTGGAGAGGAAGCGATTGGAGCTGACAGGGACAGGGTCGTGCGCATCAGTGTGCTGCCAGAAACTGGGGCTCGCGGTGGCAACCATCCCATCTTTTACAAGAACTCTATTAAACTAGGTTATGTGATTAGATCTATAGATGTGTTCAACTCTCAAATCCTGCACACATCTCGACAACTATCCCTCAATAACTATCTTCTCCCACCTGATTCTTTCGCTGTGTACCGGATAACTGATTCTAATGGTTCATGGTTTGACATAGGAATTGATAGTGATGGCTTCTCTTTTGTCGGTGCCTCCAACGTTGGTAAATTGGAGTTTCCTCTTACTGCCTCCTACATGGGAATTCAATTGGCAAAGATTCGGCTTGCCTCAAACATTAGGAGTTCAATGACTAAATTATGA。
猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1 336-668aa截短体氨基酸序列（SEQ ID No.3）：
SVPSDLIPKSSSLWIGNRHWTDITDFVIRPFVFQANRHFDFNQETAGWSTPRFRPITITISEKDGSKLGIGVAMDSIVPGIPDGWPDTTIPEKLVPAGDYAIANGTGNDITTAKDYDSATVIQNNTNFKGMYICGSLQRAWGDKKISNTAFITTATRRDNTITPSNVIDPTKIAVYQDTHVGAEVQTSDDTLAILGYTGIGEEAIGADRDRVVRISVLPETGARGGNHPIFYKNSIKLGYVIRSIDVFNSQILHTSRQLSLNNYLLPPDSFAVYRITDSNGSWFDIGIDSDGFSFVGASNVGKLEFPLTASYMGIQLAKIRLASNIRSSMTKL。
猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1 336-668aa截短体对应核苷酸序列（SEQ ID No.4）：
TCCGTGCCGTCTGATTTGATCCCAAAGTCCTCTTCCCTCTGGATTGGCAATCGGCACTGGACCGATATAACTGACTTTGTAATTCGGCCATTTGTATTCCAAGCCAACCGTCACTTCGACTTTAATCAGGAGACGGCTGGTTGGAGCACGCCAAGATTCCGACCAATCACAATAACAATTAGTGAGAAGGATGGATCCAAATTGGGAATTGGGGTTGCAATGGACTCTATCGTTCCTGGAATACCGGATGGATGGCCAGATACTACCATACCTGAGAAGTTAGTCCCTGCTGGCGACTATGCAATCGCCAATGGGACTGGAAATGACATTACTACAGCCAAAGATTATGATTCGGCCACTGTAATTCAAAACAATACCAACTTCAAAGGTATGTATATCTGTGGATCTTTACAGAGAGCCTGGGGTGATAAGAAAATATCAAACACCGCATTTATTACTACTGCAACCAGGAGGGACAACACAATTACACCATCCAATGTGATAGACCCCACCAAGATTGCTGTGTACCAGGACACCCATGTGGGCGCGGAAGTGCAAACATCTGACGACACTTTGGCCATCCTTGGTTACACAGGAATTGGAGAGGAAGCGATTGGAGCTGACAGGGACAGGGTCGTGCGCATCAGTGTGCTGCCAGAAACTGGGGCTCGCGGTGGCAACCATCCCATCTTTTACAAGAACTCTATTAAACTAGGTTATGTGATTAGATCTATAGATGTGTTCAACTCTCAAATCCTGCACACATCTCGACAACTATCCCTCAATAACTATCTTCTCCCACCTGATTCTTTCGCTGTGTACCGGATAACTGATTCTAATGGTTCATGGTTTGACATAGGAATTGATAGTGATGGCTTCTCTTTTGTCGGTGCCTCCAACGTTGGTAAATTGGAGTTTCCTCTTACTGCCTCCTACATGGGAATTCAATTGGCAAAGATTCGGCTTGCCTCAAACATTAGGAGTTCAATGACTAAATTATGA。
实施例2、猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1 336-668aa截短体表达、纯化和抗原活性验证
根据结构分析和抗原表位预测的结果，选择猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1的C末端结构域336-668aa截短体进行表达纯化。在基因公司合成VP1蛋白全长核苷酸序列，通过PCR方法扩增出336-668aa截短体片段基因，使用分子克隆的方法，构建到pGEX-6p-1表达载体上，鉴定正确后转化BL21(DE3)感受态细胞，进行截短体的原核表达尝试，得到可溶性表达的目标蛋白质。在利用GST亲和层析纯化蛋白后，使用PreScission Protease蛋白酶切去GST标签，最终获得的猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1 336-668aa截短体。该截短体电泳结果如图3所示，蛋白量很大导致条带整体偏下，以条带上部的位置为准，在大约36.4kD大小处有目的条带，纯度和表达量都很高。
将纯化获得的猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1 336-668aa截短体使用ELISA方法验证抗原活性。包被纯化的猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1 336-668aa截短体0.8μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜，0.1%BSA 37℃封闭2h，250μl/孔的PBST洗液（0.1%）洗板3次，加入稀释后的临床阳性血清100μl/孔，37℃孵育30min（阳性对照组为猫杯状病毒阳性血清，阴性对照组为猫杯状病毒阴性血清，每组做三次重复），250μl/孔的PBST洗液（0.1%）洗板3次，拍干后加入HRP标记的兔抗猫二抗（以PBS按照1:15000稀释）100μl/孔，37℃反应30min，再次洗板3次，拍干后加入TMB显色液（商品化）100μl/孔，37℃显色10min，最后加入0.5M硫酸，50μl/孔，终止反应，用酶标仪测定OD450nm值。结果如表1所示，猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1 336-668aa截短体与临床阳性血清发生反应，与阳性对照结果接近，具有较好的抗原活性。
表1抗原活性验证结果
实施例3、基于猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1 336-668aa截短体作为抗原的ELISA抗体检测试剂盒
利用猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1 336-668aa截短体作为抗原所制备的ELISA抗体检测试剂盒是一种检测猫血清中猫杯状病毒抗体水平的酶联免疫的试剂盒，其工作步骤是：
（1）从试剂盒中取出抗原包被板，在血清稀释板上用样品稀释液100倍稀释待检测的血清（198μl样品稀释液和2μl待检血清混合），取100μl混合液加入酶标板中，同时阳性血清和阴性血清各加2孔，每孔100μl。
（2）轻轻振荡混匀各孔中样品，用封板膜覆盖包被板，置37℃孵育30分钟。
（3）弃去板孔中的溶液，每孔加入250μl工作洗涤液，重复3次。最后一次洗板后将液体彻底拍干。
（4）每孔加入100μl酶标抗体，用封板膜覆盖包被板，置37℃孵育30分钟。
（5）弃去板孔中的溶液，每孔加入250μl工作洗涤液，重复3次。最后一次洗板后将液体彻底拍干。
（6）每孔加入100μl底物溶液，用封板膜覆盖包被板，置37℃孵育10分钟。
（7）每孔加入50μl终止液终止反应。
（8）测定样品和对照于450nm波长的吸光值（OD450nm）。阳性对照OD450nm值≥0.5，阴性对照OD450nm值≤0.2，试验成立。判读标准：S/P=（待检样品OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）/（阳性对照OD450nm均值-阴性对照OD450nm均值）。S/P≥0.3为阳性，待检样品血清抗体达到保护水平；S/P＜0.3为阴性，待检样品血清抗体未达到保护水平。
该应用实验结果如下：
1、特异性试验
用猫杯状病毒抗体水平检测试剂盒检测猫瘟病毒FPV，猫疱疹病毒FHV和狂犬病毒RABV等标准抗体阳性血清，以及猫杯状病毒FCV抗体阳性血清。结果见下表，除猫杯状病毒标准抗体阳性血清的S/P值显著大于0.3外，其余血清S/P值小于0.3，符合阴性血清的判定标准，表明这种方法的特异性良好。
表2特异性血清检测结果
2、敏感性试验
将猫杯状病毒FCV标准抗体阳性血清分别稀释2、4、8、16、32、64和128倍，使用本发明制备的ELISA抗体检测试剂盒及商品化猫杯状病毒ELISA抗体检测试剂盒同时进行检测。结果见下表3，本研究建立的方法可检测至32倍稀释的FCV标准抗体阳性血清，外购试剂盒也可检测至32倍稀释的FCV标准抗体阳性血清，说明本研究建立的猫杯状病毒ELISA抗体检测方法具有良好的敏感性。
表3敏感性血清检测结果
3、符合率比较
使用本发明制备的ELISA抗体检测试剂盒及商品化猫杯状病毒ELISA抗体检测试剂盒同时检测30份血清样本，结果进行对比，本研究建立的方法与外购试剂盒整体样本检测的符合率为100%，说明与对照试剂有良好的对应性，具体结果见表4和表5。
表4样本符合率比较
表5符合率结果分析
实施例4、基于猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1 336-668aa截短体作为抗原的抗体荧光检测试纸条
利用猫杯状病毒FCV衣壳蛋白VP1 336-668aa截短体作为抗原所制备的抗体荧光检测试剂盒是一种检测猫杯状病毒抗体水平的荧光试剂盒，其工作步骤是：
（1）将试纸条和样本稀释液恢复至室温，用移液器吸取20μl血清样本加入到样本稀释液中，充分混匀后，用移液器吸取80μl待测液，垂直逐滴加入试纸条加样孔中。
（2）加样后室温反应5min，将卡***荧光免疫分析仪检测孔内，按下“快速测试”自动读值。
（3）测定T线和C线的荧光值，样品和对照使用365nm波长的激发光，检测615nm发射光的荧光强度。判读标准：T/C=T线荧光值均值/C线荧光值均值。T/C≥0.3为阳性，待检样品血清抗体达到保护水平；T/C＜0.3为阴性，待检样品血清抗体未达到保护水平。
该应用中实验结果如下：
1、特异性试验
用猫杯状病毒抗体水平检测试纸卡检测猫瘟病毒FPV，猫疱疹病毒FHV和狂犬病毒RABV等标准抗体阳性血清，以及猫杯状病毒FCV抗体阳性血清。结果见下表，除猫杯状病毒标准抗体阳性血清的S/P值显著大于0.3外，其余血清S/P值小于0.3，符合阴性血清的判定标准，表明这种方法的特异性良好。
表6特异性血清检测结果
2、敏感性试验
将猫杯状病毒标准抗体阳性血清分别稀释2、4、8、16、32、64、128倍，使用本发明制备的抗体检测试纸卡及商品化的猫杯状病毒抗体荧光检测试纸卡同时进行检测。结果见下表，本研究建立的方法可检测至32倍稀释的猫杯状标准抗体阳性血清，外购试剂盒也可检测至32倍稀释的猫杯状病毒标准抗体阳性血清，说明本研究建立的猫杯状病毒抗体荧光检测方法具有良好的敏感性。
表7敏感性血清检测结果
3、符合率比较
使用本发明制备的抗体检测试纸卡及商品化的猫杯状病毒抗体荧光检测试纸卡同时检测30份血清样本，结果进行对比，本研究建立的方法与外购试剂盒整体样本检测的符合率为100%，说明与对照试剂有良好的对应性，具体结果见表8和表9。
表8样本符合率比较
表9试纸条符合率结果分析
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.一种猫杯状病毒VP1蛋白截短体，其特征在于，所述截短体是由猫杯状病毒VP1蛋白从N端起第336-668位氨基酸残基截断构建而成；
所述截短体的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的猫杯状病毒VP1蛋白截短体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
3.下述（a1）-（a4）中任一种生物材料：
（a1）含有权利要求2所述编码基因的表达盒；
（a2）含有权利要求2所述编码基因的重组载体；
（a3）含有权利要求2所述编码基因的重组菌；
（a4）含有权利要求2所述编码基因的转基因细胞系。
4.一种猫杯状病毒ELISA抗体检测试剂盒，特征在于，抗原活性成分为权利要求1所述的猫杯状病毒VP1蛋白截短体。
5.一种猫杯状病毒抗体的检测试纸卡，特征在于，抗原活性成分为权利要求1所述的猫杯状病毒VP1蛋白截短体。
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