CN115873079B - 犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白抗原、截短体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白抗原、截短体及其应用。如下M1）所示的蛋白质：M1）犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白自N端起第118‑481位氨基酸；所述犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明实施例根据已有和预测的蛋白质三维结构，对犬传染性肝炎病毒蛋白的结构进行了分析，选择稳定性较好的片段，使用原核表达***进行表达，经过免疫学实验验证，该抗原蛋白可以很好地结合犬传染性肝炎病毒蛋白抗体，利用该抗原制备的抗体检测试剂盒效果好、成本更低、特异性和稳定性强。

Description

犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白抗原、截短体及其应用

技术领域

本发明实施例涉及生物技术领域，具体涉及一种犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白抗原、截短体及其应用。

背景技术

腺病毒（adenovirus）最初在1953年由人体中分离发现，是一种双链DNA病毒。腺病毒科的病毒通常无包膜，病毒颗粒呈现正二十面体结构，直径70～90纳米。根据其感染对象的不同，腺病毒科分为两个属：哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属。前者感染人类和猿猴、牛、羊、猪、狗、鼠等哺乳类动物，对于鼠等啮齿类动物可诱发肿瘤。其中狗的腺病毒具有明显的病原性，可引起狗的传染性肝炎和气管支气管炎。犬传染性肝炎病毒（Infectious caninehepatitis virus，ICHV），也称犬腺病毒I型（CAV I），是犬传染性肝炎（Infectious caninehepatitis）的病原体。犬传染性肝炎属于二类传染病，临床上分为肝炎型和呼吸型两类，主要发生在1岁以内的幼犬身上，发病率和病死率均较高。病犬和带毒犬是主要传染源，病犬的分泌物、***物均含有病毒。该病主要经消化道感染，胎盘、呼吸道和体外寄生虫也可传播。

犬传染性肝炎病毒在养狗场中传播较为广泛，宠物犬也会感染，因此该病毒对犬类存在一定威胁。该病毒的主要防治手段是疫苗接种，常用疫苗有犬传染性肝炎弱毒疫苗，还有犬传染性肝炎与犬细小病毒性肠炎二联苗和犬五联苗等。检测蛋白抗体的诊断方法能确定动物对病毒株的抵抗力。同时日常监测疫苗产生抗体是对群体的日常监测选择疫苗、评估免疫程序合理性、掌握健康状态的重要手段，同时也可从侧面反映管理是否合理，也是适时注射疫苗的主要依据。

关于犬传染性肝炎病毒的诊断方法，主要针对其六邻体蛋白Hexon。六邻体蛋白是犬传染性肝炎病毒ICHV正二十面体衣壳的主要成分，包含有中和抗原决定簇，可引发中和反应。基因和结构研究证实，ICHV六邻体蛋白包含P1和P2组成的基底区域和4个环状结构Loop1-4组成的塔形区域，其中Loop1（127-310aa）和Loop2（383-538aa）区域包含超变区和主要抗原决定簇。

临床血清学检测的几种方法中，血清中和试验反应快，特异性强，但敏感性低，试验结果会受到不同病毒滴度的影响，同时对样本有较高的要求，不适用于临床大规模检测。酶联免疫吸附试验具有快速、简便、廉价、可自动批量检测的优点，但也存在特异性不强、高灵敏性易出现假阳性结果，需要酶标仪测定结果，且不适合做单个样本的检测的缺点。免疫荧光染色技术具有简单方便、具有针对性、准确度高、诊断快速等优点，多用于犬传染性肝炎的诊断，但同时该方法特异***叉，不宜进行大批量检测。乳胶凝集试验与酶联免疫吸附试验相似，多用于早期感染检测，敏感性高特异性强，可进现地应用，快速血清筛选检测。琼脂免疫扩散试验操作简单，性价比高，适用范围更广泛。但检测的敏感性与提取抗原的方法及阳性血清的可靠性有关，给检测带来不便。

现有技术中，针对该病病原体及其抗体水平的诊断试剂参差不齐，建立一种快速灵敏、特异性强、操作简单、经济实用的诊断方法势在必行。本发明关注的重点主要还是在六邻体抗原蛋白及其应用。

发明内容

为此，本发明实施例提供犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白抗原、截短体及其应用。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

本发明提供如下M1）所示的蛋白质：

M1）犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白自N端起第118-481位氨基酸残基；

所述犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供一种蛋白质或截短体，所述截短体为如下（1）-（4）中任一所示：

（1）氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；

（2）在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

（3）将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

（4）与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有95%以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。

上述所述的蛋白质或所述蛋白质或其截短体的编码基因。

本发明的一个实施例中，M1）所述蛋白质或所述截短体的编码基因为如下1）-3）任一所示：

1）SEQ ID No.3所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码上述M1）所述蛋白质或上述所述截短体的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA分子具有95%以上的同一性且编码上述M1）所述蛋白质或上述所述截短体的DNA分子。

下述（a1）-（a4）中任一种生物材料：（a1）含有上述所述编码基因的表达盒；（a2）含有上述所述编码基因的重组载体；（a3）含有上述所述编码基因的重组菌；（a4）含有上述所述编码基因的转基因细胞系，也属于本发明的保护范围。

本发明另一方面还提供所述的蛋白质和/或所述的蛋白质或其截短体和/或所述编码基因和/或所述的生物材料在制备免疫原和/或抗原中的应用，或，所述免疫原或抗原是针对犬传染性肝炎病毒或犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白的。

所述的蛋白质和/或所述的蛋白质或其截短体和/或所述编码基因和/或所述的生物材料作为抗原在制备针对犬传染性肝炎病毒抗体中的应用；

或，所述的蛋白质和/或所述的蛋白质或其截短体和/或所述编码基因和/或所述的生物材料在制备预防和/或治疗犬传染性肝炎病毒引起的疾病的产品中的应用；

或，所述的蛋白质和/或所述的蛋白质或其截短体和/或所述编码基因和/或所述的生物材料在预防和/或治疗犬传染性肝炎病毒引起的疾病中的应用，属于本发明的保护范围。

上述所述的蛋白质和/或所述的蛋白质或其截短体和/或所述编码基因和/或所述的生物材料在如下（a1）-（a6）任一种中的应用：（a1）抑制病毒感染；（a2）抑制病毒感染的产品；（a3）抑制病毒入侵；（a4）抑制病毒入侵的产品；（a5）检测病毒抗体；（a6）检测病毒抗体的产品；所述病毒为犬传染性肝炎病毒。

本发明还提供一种产品，其活性成分为所述的蛋白质或所述的蛋白质或其截短体；所述产品的功能为如下（b1）-（b3），（b1）抑制病毒感染的药物或疫苗；（b2）抑制病毒入侵的药物或疫苗；（b3）检测病毒抗体的试剂；所述病毒为为犬传染性肝炎病毒。

本发明还提供一种多抗，是以所述的蛋白质或所述的蛋白质或其截短体为免疫原制备得到的。

本发明实施例具有如下优点：

本发明实施例根据已有和预测的蛋白质三维结构，对犬传染性肝炎病毒蛋白的结构进行了分析，选择稳定性较好的片段，使用原核表达***进行表达，经过免疫学实验验证，该抗原蛋白可以很好地结合犬传染性肝炎病毒蛋白抗体，利用该抗原制备的抗体检测试剂盒效果好、成本更低，而且特异性好和稳定性高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。

图1为本发明实施例提供的犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白hexon的蛋白序列比对结果；

图2为本发明实施例提供的已发表的人腺病毒41六邻体6YBA中A链结构示意图；

图3为本发明实施例提供的AlphaFold预测的犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白结构；

图4为本发明实施例提供的人腺病毒41六邻体6YBA（绿色）与犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白（蓝色）对比图；

图5为本发明实施例提供的犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白不同结构域示意图；

图6为本发明实施例提供的CAV I 118-481aa蛋白电泳结果图。

实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中，腺病毒正二十面体的衣壳是由122个壳粒组成，其中110个壳粒是六邻体蛋白，12个壳粒是五联体蛋白。其六邻体蛋白为腺病毒的主要抗原表位，且保守区域具有很强的抗原性和暴露性，可诱导高效价的抗腺病毒特异性抗体，可用于不同型别、不同组别特异性抗原表位的腺病毒的常规免疫学诊断。经过在美国生物技术信息中心NCBI的查找犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白序列，最终确定为编号ALY06351的905位氨基酸为犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白序列，对应的核苷酸序列编号为KP840545，共有2718 bp。犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白的氨基酸序列（SEQ ID No.1）为：

MATPSMLPQWSYMHIAGQDAAEYLSPALVQFAQATSSYFKLDNKFRNPTVAPTHDVTTERSQRLQLRFVPVMQEDGQYTYKTRFQLAVGDNRVLDMASTYFDIRGTLDRGPSFKPYSGTAYNALAPRAGANNCLFNGSGANINTLAQVPFAGAITVNGQAAVTDNTYQPEPQLGPESWVDGTLADLGDASGRALKASTPRMPCYGSYAPPTNENGGQATGAVERRFYKVTTNNNNEADALLYTEDVNLQTPDTHLVHQVSDDQVTGVQGLGQQAAPNRPNYIGFRDNFIGLMYYNSNGNLGVLAGQSSQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDALTDRSRYFSMWNQAVDSYDQDVRIIDNHGVEDDMPNYCFPLSGMGPLTNMTAMKVNSQNFQTDNTNVGPIQKIGFGNVEAMEINLNANLFKGFLYSNVALYLPDAYKYTPDNIVAPANANTYAYMNVRLPAANLIDTFVNIGARWSPDVMDSVNPFNHHRNAGLRYRSQLLGNGRYCSFHIQVPQKFFAIKNLLLLPGTYTYEWSFRKDVNMILQSSLGNDLRVDGASINIQSINLYASFFPMAHNTASTLEAMLRNDVNDQSFADYLSAANMLYPIPANTTNLPISIPARNWAGFRGWSFTRIKQRETPALGSPYDPYFTYSGSIPYLDSTFYLSHTFRRVSIMFDSSVSWPGNDRLLTPNEFEIKRYVDGEGYNVAQSNMTKDWFLVQMLAHYNIGYQGYHLPESYKDRMYSFLRNFEPMCRQLVDVTNYATYQSVTVGHQHNNSGYASALSTFNPREGHPYPANWPYPLIGVNAVPTVTQKKFLCDRTLWRIPFSSNFMSMGTLTDLGQNLLYSNSAHALDMTFEVDAMNEPTLLYVLFEVFDVARVHQPHRGVIEVVYLRTPFSAGNATT。

编码犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白的核苷酸序列（SEQ ID No.4）为：

atggcaactccgtcgatgctgccacaatggtcttacatgcacattgctggccaggacgccgccgaatacttgtctcccgccctggttcagtttgcccaagcaaccagttcttactttaagttggacaacaagttcagaaaccccactgtggcccccactcacgatgtaaccactgaaaggtctcagcgcttgcagttgcgctttgtgccagttatgcaagaagatggccagtacacttacaaaacccggttccaattggcagtgggagataacagggttctggacatggccagtacctactttgacattaggggcaccctagacagaggcccctccttcaagccctacagtgggacggcttacaatgctctcgctcccagagctggggctaataactgcctatttaatggatcaggtgccaacattaacactttagcccaagtgccatttgcgggcgccattaccgttaatggtcaagccgcagtcacagacaacacctaccagccagagccccagctgggccctgaaagttgggtggatggcaccttggcagacctaggagatgcgtctggccgcgccctgaaagcatcgaccccacgcatgccttgctacggttcttatgctccccccaccaatgaaaacggaggtcaagcaactggggccgtggaacgaagattctataaagtgaccaccaacaataataatgaagctgatgccctactatatacagaagatgtgaacctccaaaccccagacacccacttggtgcatcaggtgtcagacgatcaggttacaggtgtacagggactggggcaacaagctgccccaaacaggccaaattacattggctttagagataactttataggtttaatgtattacaatagtaatggaaacctaggggtgctggcgggtcaatcgtctcaactaaatgccgtggtggacttgcaagacagaaacacagagctttcttatcagctgttgctagatgcccttacagataggtctcgctacttttccatgtggaaccaggcagtagatagctatgaccaggatgtcaggattattgacaatcacggcgtggaagacgacatgccaaactattgcttcccactgagcggcatgggaccattaactaacatgacagctatgaaggtcaatagtcaaaactttcaaacggacaacactaacgtgggtcccattcaaaagattggtttcggaaatgttgaggccatggagataaatctcaatgctaacctctttaaaggttttctctactccaatgtggccctatacctacctgatgcctataaatacacacctgataacattgtagctcctgctaatgcaaatacctatgcttacatgaatgtgagattgcccgctgctaaccttatagacacatttgtaaatattggcgccagatggtcacctgatgtaatggactctgttaatccttttaaccaccacagaaatgcaggactccgctaccgatcacagctgcttggcaatggccgctattgctcgttccatattcaggtccctcaaaaattttttgcaatcaaaaatcttctccttctaccgggtacgtacacgtacgagtggtctttcaggaaggatgtaaacatgatccttcagagcagcttgggcaatgacctccgagtggatggagcctctatcaacattcaaagcatcaacctatatgccagctttttccccatggcacacaacacagcctccactttggaagccatgctgcgcaatgatgtaaatgaccagtcctttgcagactacctgtctgccgccaacatgctttatccgatccctgccaacactacaaacctaccaatctccattcctgccagaaattgggccggattcagagggtggagctttaccagaattaagcagcgggaaactccagccctgggctcaccttacgacccctactttacttactcgggtagcattccctacctggattcaactttctatcttagccacaccttcagaagagtctccatcatgtttgactcttctgtatcttggccgggtaatgacaggctcctcactccaaatgagtttgagattaaaaggtatgtggacggtgaaggctacaacgtggcccagtccaacatgacaaaagattggtttctggttcaaatgctggctcattacaacattggctatcaaggctaccacttgcccgagagctacaaagacagaatgtactcattcctcagaaattttgagcccatgtgcagacaactggtagatgtaactaactatgctacctaccagtcagtcaccgtaggtcaccagcataacaattctggatatgctagcgccctttcaacctttaacccaagggagggtcacccctatccggcaaactggccttatcccctaatcggggtcaatgctgtgcctactgttacccaaaaaaagttcctttgtgacagaaccctatggcgcatccccttctcttccaactttatgtctatgggcaccctcactgaccttggtcaaaacctgctgtactccaactccgctcacgcccttgacatgactttcgaggttgatgccatgaatgagcccactctgttgtacgttttgtttgaagtgttcgacgtggcacgtgttcatcaaccccaccgaggggtgattgaagtagtgtacctcagaactcccttctccgccggcaacgccacgacctaa。

将该蛋白序列在NCBI Blast功能中与蛋白结构数据库PDB中数据进行对比，如图1所示，目前犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白hexon的蛋白质三维结构仍未解析，但是与已有结构具有较高的序列相似性，相似最高的是人腺病毒41六邻体的结构（PDB编号6YBA的A链），序列同源性为71.26%，覆盖了全长905个氨基酸。

已发表的人腺病毒41六邻体6YBA中A链的结构如图2所示，最左边的几个α螺旋是整个蛋白的N端，中部α螺旋、β片层和无规则卷曲比较密集的结构域是C端结构域，最右边延伸出来的以β片层和无规则卷曲为主的两部分属于全长序列的中部。该结构是通过直接解析病毒颗粒整体结构获得的，病毒颗粒是从真核细胞直接培养获得的，成本相对较高。

本发明利用加利福尼亚大学旧金山分校UCSF开发的免费结构展示软件ChimeraX提供的AlphaFold结构预测功能，输入犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白hexon的905位氨基酸序列，使用AlphaFold软件计算和预测该蛋白三维结构，预测结构如图3所示，该结构与同源结构6YBA在序列空间位置上分布较为相似，最左边的两个α螺旋和无规则卷曲是整个蛋白的N端，最右边延伸出来的α螺旋、β片层和无规则卷曲部分属于全长序列的中部，结构中部α螺旋、长β片层和无规则卷曲比较密集的结构域是C端结构域。通过具体结构的比对，如图4所示，在蛋白质结构的细节方面二者相差很大，使用芬兰赫尔辛基大学提供的Dali服务器计算二者结构比对的均方根偏差r.m.s.d.为3.4 Å，具有较大的差别。

根据空间结构对犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白结构进行划分，如图5所示，N端1-56 aa构成的N端结构域显示为金黄色，分布在其他两个较大结构域之外。中部深蓝色的结构域包括57-117aa，280-349aa，482-766aa和810-905aa，该结构域包括结构主体和C末端氨基酸。右边浅蓝色的结构域包括118-279aa，350-481aa和767-809aa三部分，相对中部结构域氨基酸较少。根据此空间分布，预测57-905aa，118-481aa和482-905aa三个截短体片段可能相对全长更加稳定，且预测具有抗原活性。

本发明根据犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白结构预测的结果，将全长犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白CAV I 1-905aa和三个截短体片段CAV I 57-905aa、CAV I 118-481aa和CAV I 482-905aa的进行表达纯化。在基因公司合成全长蛋白的基因序列，然后通过设计引物对3个截短体片段，进行PCR扩增。

然后通过分子克隆的手段分别将编码全长犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白CAV I1-905aa、截短体片段CAV I 57-905aa、截短体片段CAV I 118-481aa和截短体片段CAV I482-905aa，总共4个片段连接入原核表达载体pGEX-6p-1，在大肠杆菌中进行4个片段的原核蛋白质表达。

结果表明，编码CAV I 1-905aa和CAV I 57-905aa两个较长的片段的核苷酸片段未表达出可溶性表达的蛋白，目的蛋白处于包涵体沉淀状态。编码CAV I 118-481aa和CAVI 482-905aa核苷酸序列表达，并获得了目的蛋白。其中，CAV I 118-481aa片段蛋白的电泳结果如图6所示，目的蛋白大小正确，纯度较高，同时含有部分杂质片段。

将纯化获得犬传染性肝炎病毒（CAV I）的CAV I 118-481aa和CAV I 482-905aa蛋白用ELISA验证抗原活性。分别包被纯化的CAV I 118-481aa和CAV I 482-905aa蛋白浓度为0.1 μg/mL，100 μL/孔，0.1%明胶37℃ 2 h，250 μL/孔的 PBST洗液（0.1%）洗板3次，稀释后的CAV I病毒单克隆抗体100 μL/孔，37℃1 h（阳性对照组为CAV I病毒颗粒，阴性对照组为PBS缓冲液，每组做三次重复），250 μL/孔的PBST洗液（0.1%）洗板3次，拍干后加入HRP酶标兔抗鼠二抗（以PBS按照1:10000稀释）100 μL/孔，37℃反应30 min，再次洗板3次，拍干后加入TMB显色液（商品化）100 μL/孔，室温显色10 min，最后加入0.5M硫酸，50 μL/孔，终止反应，用酶标仪测定OD_450nm值。

纯化表达的CAV I 118-481aa蛋白和CAV I 482-905aa蛋白抗原活性验证结果如表1所示，CAV I 118-481aa蛋白与阳性对照接近，具有较好的抗原活性，CAV I 482-905aa蛋白与阴性对照接近，不具备抗原活性。因此，可利用、CAV I 118-481aa按照上述体系制备得到ELISA检测抗体试剂盒。

表1抗原活性验证结果

本发明中，CAV I 118-481aa蛋白的氨基酸序列为（SEQ ID NO.2）：

GTAYNALAPRAGANNCLFNGSGANINTLAQVPFAGAITVNGQAAVTDNTYQPEPQLGPESWVDGTLADLGDASGRALKASTPRMPCYGSYAPPTNENGGQATGAVERRFYKVTTNNNNEADALLYTEDVNLQTPDTHLVHQVSDDQVTGVQGLGQQAAPNRPNYIGFRDNFIGLMYYNSNGNLGVLAGQSSQLNAVVDLQDRNTELSYQLLLDALTDRSRYFSMWNQAVDSYDQDVRIIDNHGVEDDMPNYCFPLSGMGPLTNMTAMKVNSQNFQTDNTNVGPIQKIGFGNVEAMEINLNANLFKGFLYSNVALYLPDAYKYTPDNIVAPANANTYAYMNVRLPAANLIDTFVNIGARWSPDVM。

编码CAV I 118-481aa蛋白对应的核苷酸分子352-1443bp序列（SEQ ID NO.3）：

gggacggcttacaatgctctcgctcccagagctggggctaataactgcctatttaatggatcaggtgccaacattaacactttagcccaagtgccatttgcgggcgccattaccgttaatggtcaagccgcagtcacagacaacacctaccagccagagccccagctgggccctgaaagttgggtggatggcaccttggcagacctaggagatgcgtctggccgcgccctgaaagcatcgaccccacgcatgccttgctacggttcttatgctccccccaccaatgaaaacggaggtcaagcaactggggccgtggaacgaagattctataaagtgaccaccaacaataataatgaagctgatgccctactatatacagaagatgtgaacctccaaaccccagacacccacttggtgcatcaggtgtcagacgatcaggttacaggtgtacagggactggggcaacaagctgccccaaacaggccaaattacattggctttagagataactttataggtttaatgtattacaatagtaatggaaacctaggggtgctggcgggtcaatcgtctcaactaaatgccgtggtggacttgcaagacagaaacacagagctttcttatcagctgttgctagatgcccttacagataggtctcgctacttttccatgtggaaccaggcagtagatagctatgaccaggatgtcaggattattgacaatcacggcgtggaagacgacatgccaaactattgcttcccactgagcggcatgggaccattaactaacatgacagctatgaaggtcaatagtcaaaactttcaaacggacaacactaacgtgggtcccattcaaaagattggtttcggaaatgttgaggccatggagataaatctcaatgctaacctctttaaaggttttctctactccaatgtggccctatacctacctgatgcctataaatacacacctgataacattgtagctcctgctaatgcaaatacctatgcttacatgaatgtgagattgcccgctgctaaccttatagacacatttgtaaatattggcgccagatggtcacctgatgtaatg。

1、ELISA检测抗体试剂盒检测过程

本实施例利用实施例2制备的CAV I 118-481aa蛋白作为抗原制备ELISA检测抗体试剂盒检测过程，检测抗体的过程包括：

步骤一、从ELISA检测试剂盒中取出CAV I 118-481aa蛋白抗原包被板，在血清稀释板上用样品稀释液2倍稀释待检测的血清（60 μL样品稀释液和60 μL待检血清混合），取100 μL混合液加入到酶标板中，同时，阳性血清和阴性血清各加2孔，每孔100 μL。

步骤二、轻轻振荡均匀各孔中样品，用封板膜覆盖包被板，置37℃孵育30分钟。

步骤三、弃去包备板孔中的溶液，每孔加入250 μL工作洗涤液，重复3次。最后一次洗板后将液体彻底拍干。

步骤四、每孔加入100 μL酶标抗体，用封板膜覆盖包被板，置37℃孵育30分钟。

步骤五、弃去包备板孔中的溶液，每孔加入250 μL工作洗涤液，重复3次。最后一次洗板后将液体彻底拍干。

步骤六、每孔加入100 μL底物溶液，用封板膜覆盖包被板，室温孵育10分钟。

步骤七、每孔加入50 μL终止液终止反应。测定样品和对照于450 nm波长的吸光值（OD_450nm）。判读标准：S/P=（待检样品OD_450nm均值-阴性对照OD_450nm均值）/（阳性对照OD_450nm均值-阴性对照OD_450nm均值）。S/P≥0.3为阳性，待检样品血清抗体达到保护水平；S/P＜0.3为阴性，待检样品血清抗体未达到保护水平。

2、ELISA检测抗体试剂盒的特异性试验

用犬传染性肝炎病毒抗体水平检测试剂盒检测犬细小病毒CPV，犬瘟热病毒CDV和狂犬病毒RABV等标准抗体阳性血清和犬传染性肝炎病毒CAV I抗体阳性血清。

检测结果如表2所示，除CAV I标准抗体阳性血清的S/P值显著大于0.3外，其余血清S/P值小于0.3，符合阴性血清的判定标准，表明本发明的实施例2制备的ELISA检测抗体试剂盒特异性良好。

表2特异性血清检测结果

3、ELISA检测抗体试剂盒敏感性试验

将CAV I标准抗体阳性血清分别稀释2、4、8、16、32、64倍，使用本发明的实施例2制备的ELISA检测抗体试剂盒及外购犬传染性肝炎病毒ELISA抗体检测试剂盒同时进行检测。检测结果见下表3所示，本发明的ELISA试剂盒可检测至32倍稀释的CAV I标准抗体阳性血清，外购试剂盒可检测至16倍稀释的CAV I标准抗体阳性血清，说明本发明的犬传染性肝炎病毒Elisa抗体检测试剂盒具有良好的敏感性。

表3本发明的ELISA试剂盒敏感性检测结果

4、 ELISA检测试剂盒符合率比较

使用本发明的ELISA试剂盒及外购犬传染性肝炎病毒Elisa抗体检测试剂盒同时检测25份血清样本，结果进行对比，本发明的ELISA试剂盒与外购试剂盒整体样本检测的符合率为96%，说明与外购对照试剂盒有良好的适应性，具体结果见下表4所示。

表4本发明的ELISA试剂盒及外购试剂盒样本符合率比较

本发明制备的CAV I 118-481aa蛋白抗原与抗体的亲和力强，用于建立高敏感性的检测诊断方法。该CAV I 118-481aa蛋白抗原稳定性更好、表达量更高、成本更低，检测抗体水平的特异性和灵敏度都更好，可用于建立更准确、更快速的检测试剂盒。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.如下M1）所示的蛋白质：

M1）犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白自N端起第118-481位氨基酸残基；所述犬传染性肝炎病毒六邻体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种蛋白质截短体，所述截短体为如下（1）或（2）中所示：

（1）氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；

（2）在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质。

3.权利要求1所示的蛋白质或权利要求2所述蛋白质截短体的编码基因。

4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于，

权利要求1中M1）所述蛋白质或权利要求2所述蛋白质截短体的编码基因为如下1）或2）所示：

1）SEQ ID No.3所示的DNA分子；

2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1中M1）所述蛋白质或权利要求2所述蛋白质截短体的DNA分子。

5.下述（a1）-（a4）中任一种生物材料：

（a1）含有权利要求3或4所述编码基因的表达盒；

（a2）含有权利要求3或4所述编码基因的重组载体；

（a3）含有权利要求3或4所述编码基因的重组菌；

（a4）含有权利要求3或4所述编码基因的转基因细胞系。

6.权利要求1所述的蛋白质和/或权利要求2所述的蛋白质截短体和/或权利要求3或4所述编码基因和/或权利要求5所述的生物材料作为抗原在制备针对犬传染性肝炎病毒抗体中的应用。

7.一种产品，其活性成分为权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的蛋白质截短体；

所述产品的功能为检测病毒抗体的试剂；

所述病毒为犬传染性肝炎病毒。