CN207623349U

CN207623349U - 一种猪伪狂犬病毒抗体检测试剂盒

Info

Publication number: CN207623349U
Application number: CN201721309228.4U
Authority: CN
Inventors: 钱泓; 吴有强; 查银河; 贾宝琴
Original assignee: Oceanic Rise Bio Tech Ltd Zhejiang
Current assignee: Oceanic Rise Bio Tech Ltd Zhejiang
Priority date: 2017-10-09
Filing date: 2017-10-09
Publication date: 2018-07-17
Anticipated expiration: 2027-10-09

Abstract

本实用新型公开了一种猪伪狂犬病毒抗体检测试剂盒，所述试剂盒有一个盒体，盒体内设有抗原包被反应板存放槽、样品稀释板存放槽、猪伪狂犬病毒gD蛋白抗体阳性对照液孔槽、猪伪狂犬病毒gB蛋白抗体阳性对照液孔槽、猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体阳性对照液孔槽、猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗体阴性对照液孔槽、样品稀释液孔槽、酶结合物孔槽、浓缩洗涤液孔槽、TMB显色液、终止液孔槽和操作说明书存放槽；抗原包被反应板分为检测区I、检测区II和检测区III，检测区I、检测区II和检测区III分别包被猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗原。本试剂盒可用于鉴别诊断和评估亚单位疫苗的免疫效果，具有灵敏度高、特异性好、快速检测大批量样品等优点。

Description

一种猪伪狂犬病毒抗体检测试剂盒

技术领域

本实用新型属于兽用疫病检测技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病毒抗体检测试剂盒。

背景技术

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的猪的急性传染病。该病在猪呈暴发性流行。可引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。

目前该病的预防主要通过疫苗免疫，目前市场上流行的主要是第二代基因工程基因缺失疫苗。该疫苗除了在TK基因引入了一个缺失外，在非编码必需糖蛋白的基因内引入了一个新的缺失，或***一个报告基因，这样得到的突变株就不能产生被缺失的糖蛋白，因而免疫动物就不能产生相应的抗体，因此可以通过血清学方法将免疫接种猪与自然感染野毒的猪相区别。目前，市场上使用最多的是gB抗体检测和gE抗体检测结合来区别弱毒疫苗免疫和野毒感染，这是因为现在的弱毒疫苗一般都是缺少TK基因和gE基因，而含有gB基因。但是，弱毒疫苗是一种活疫苗，在免疫后，会在猪体内增殖，这不利于猪场对PRV的净化。

伪狂犬病毒属于疱疹病毒科(Herpesviridae)、猪疱疹病毒属，病毒粒子为圆形，直径150～180nm，核衣壳直径为105～110nm。病毒粒子的最外层是病毒囊膜，它是由宿主细胞衍生而来的脂质双层结构。囊膜表面有长约8～10nm呈放射状排列的纤突。伪狂犬病毒基因组是线状双链DNA分子，大小约150kb，平均G+C含量高达74％，具有典型的疱疹病毒基因组结构特征，由独特长区段、独特短区段及位于US两侧的末端重复序列(TR)和内部重复序列(IR)组成。目前已发现11种PRV糖蛋白，其中，gB、gC、gD均为刺激机体产生中和抗体的蛋白，所产生的抗体无论是在体内、体外，还是在有无补体存在的情况下都有中和PRV的能力，因此，gB、gC、gD是研制PRV亚单位疫苗的首选糖蛋白。亚单位疫苗的优点：不含有核酸物质因此比较安全；接种后不会产生持续感染或潜伏感染；产生的免疫应答可以与野毒感染相区分，有利于疫病的控制和消灭。鉴于亚单位疫苗的这些优点，本发明人研发了gD蛋白亚单位疫苗，该亚单位疫苗具有良好的免疫原性且生产成本低。具体见本发明人申请的申请号为201710551363.8的中国发明专利申请。

为了区别本发明人的亚单位疫苗免疫和野毒感染以及弱毒疫苗免疫(在没有野毒感染的情况下，可区分是否有弱毒疫苗免疫)，本发明人开发了一种猪伪狂犬病毒抗体检测试剂盒。该试剂盒能够同时检测gD蛋白抗体、gB蛋白抗体和gE蛋白抗体，克服现有技术不能同时检测的不足，也能够减少分开检测所带来的误差。

实用新型内容

本实用新型的目的是为了提供一种快速、有效、同时检测猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗体的间接ELISA检测试剂盒，为实验动物筛选、猪场PRV净化提供新的快捷高效的工具；同时能够区别gD蛋白制备的亚单位疫苗免疫、市场上的弱毒疫苗免疫(在没有野毒感染的情况下，能够区分gD蛋白亚单位疫苗免疫和弱毒疫苗免疫)或野毒感染；还能进一步减少分开检测时带来的误差。

本实用新型提供了一种猪伪狂犬病毒抗体检测试剂盒，所述试剂盒有一个盒体(1)，盒体(1)内设有抗原包被反应板存放槽(2)、样品稀释板存放槽(3)、猪伪狂犬病毒gD蛋白抗体阳性对照液孔槽(4)、猪伪狂犬病毒gB蛋白抗体阳性对照液孔槽(5)、猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体阳性对照液孔槽(6)、猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗体阴性对照液孔槽(7)、样品稀释液孔槽(8)、酶结合物孔槽(9)、浓缩洗涤液孔槽(10)、TMB显色液(11)、终止液孔槽(12)和操作说明书存放槽(13)；抗原包被反应板存放槽(2)内放置抗原包被反应板，样品稀释板存放槽(3)内放置样品稀释板，各孔槽中(4-12)放置装有相应溶液的试剂瓶，操作说明书存放槽(13)内放置操作说明书；所述的抗原包被反应板分为检测区I、检测区II和检测区III，检测区I、检测区II和检测区III分别包被猪伪狂犬病毒gD蛋白抗原、猪伪狂犬病毒gB蛋白抗原和猪伪狂犬病毒gE蛋白抗原。

本实用新型的技术方案中，优选地，所述的抗原包被反应板的规格为96孔，每个试剂盒共有5块包被板，每块包被板从左至右平均分为检测区I、检测区II和检测区III。

本实用新型的技术方案中，优选地，所述的样品稀释板的规格为96孔，每个试剂盒共有5块样品稀释板。

本实用新型的技术方案中，优选地，所述的抗原包被反应板和样品稀释板都是可以拆卸的96孔板，每块板都可以拆卸为12排，每排8孔。

本实用新型的技术方案中，优选地，所述的猪伪狂犬病毒gD蛋白抗体阳性对照液、猪伪狂犬病毒gB蛋白抗体阳性对照液和猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体阳性对照液分别为用样品稀释液100倍稀释的猪伪狂犬病毒gD蛋白、猪伪狂犬病毒gB蛋白和猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的猪阳性血清，分别按2ml/瓶分装。

本实用新型的技术方案中，优选地，所述的猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗体阴性对照液为用样品稀释液100倍稀释的不含有猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗体的猪阴性血清，按4ml/瓶分装。

本实用新型的技术方案中，优选地，所述的样品稀释液为1％BSA溶液，按照250ml/瓶分装。

本实用新型的技术方案中，优选地，所述的酶结合物为用样品稀释液5,000倍稀释的商品化羊抗猪IgG酶标二抗，按60ml/瓶分装。

本实用新型的技术方案中，优选地，所述的浓缩洗涤液为25×PBST溶液，按照150ml/瓶分装。

本实用新型的技术方案中，优选地，所述的TMB显色液为商品化的显示液，按60mL/瓶分装，所述的终止液为2M H₂SO₄溶液，按60ml/瓶分装。

本实用新型采用酶联免疫间接法，将猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗原分别包被在抗原包被板的三个检测区内，可分别与待检样品中的特异性抗体反应，形成抗原抗体复合物，再加入羊抗猪IgG二抗的酶结合物，形成“抗原-抗体-二抗-酶”复合物，最后通过加入TMB显示液进行显色，并读取光吸收值(OD450)。

实验有效性判定：只有当满足以下条件时检测才能有效：阳性对照OD450值-阴性对照OD450值＞0.5；阴性对照OD450值＜0.15。

结果计算与判定：临界值＝阴性对照孔OD450平均值+0.2；样品OD450平均值＞临界值判为阳性；样品OD450平均值≤临界值判定为阴性。

本实用新型的检测试剂盒具有如下优点：(1)本实用新型使用基因表达的重组蛋白为检测抗原，安全性好、无杂蛋白污染，且具有特异性好、灵敏度高、可大批量检测等优点。(2)本实用新型的试剂盒可以在同一块板子上同时检测猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗体，在检测gD蛋白制备的亚单位疫苗免疫产生的抗体同时可进一步区别是否有野毒感染或弱毒疫苗免疫(在没有野毒感染的情况下，可区分gD蛋白亚单位疫苗免疫和弱毒疫苗免疫)，因此本试剂盒可应用于PRV野毒感染及亚单位疫苗免疫的鉴别诊断或者应用于弱毒疫苗免疫和亚单位疫苗免疫的鉴别诊断(在没有野毒感染的情况下，可区分gD蛋白亚单位疫苗免疫和弱毒疫苗免疫)、评估PRV-gD蛋白亚单位疫苗的免疫效果以及指导猪场进行PRV的净化。(3)本试剂盒的抗原包被板是可以拆卸的，当样品较少时，可以将暂时不用的包被板拆下，以便后续使用，可以进一步降低使用成本和方便终端用户的使用。(4)本试剂盒可以根据免疫所用疫苗情况(弱毒疫苗或亚单位疫苗等)选择需要检测的抗体，如检测前知道样本免疫的是弱毒疫苗，则可以选择检测gB蛋白抗体和gE蛋白抗体或者选择检测gD蛋白抗体和gE蛋白抗体；如果检测前知道免疫的是亚单位疫苗，而不清楚在这之前是否免疫过弱毒疫苗，则可以选择检测三种蛋白抗体，如果gE蛋白抗体检测为阴性，则说明没有野毒感染，则可以判定是否有弱毒疫苗免疫(gB蛋白抗体阳性即说明免疫过弱毒疫苗)。(5)本试剂盒提供了样品稀释板，可以在96孔板上直接稀释样品，这样在加样时可以使用多道移液器直接将稀释好的样品加到酶标板相应的孔中，这样可以节约加样时的时间，尽量保证检测时孵育的时间一致，进一步减少加样和孵育引起的误差。

附图说明

图1为本试剂盒的横切面剖视图：其中1是盒体，2是抗原包被反应板存放槽、3是样品稀释板存放槽、4是猪伪狂犬病毒gD蛋白抗体阳性对照液孔槽、5是猪伪狂犬病毒gB蛋白抗体阳性对照液孔槽、6是猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体阳性对照液孔槽、7是猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗体阴性对照液孔槽、8是样品稀释液孔槽、9是酶结合物孔槽、10是浓缩洗涤液孔槽、11是TMB显色液、12是终止液孔槽、13是操作说明书存放槽。

图2为本试剂盒抗原包被反应板的结构示意图；其中，I区包被猪伪狂犬病毒gD蛋白抗原，II区包被猪伪狂犬病毒gB蛋白抗原，III区包被猪伪狂犬病毒gE蛋白抗原。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本实用新型做进一步说明，本实用新型的实施例仅用于说明本实用新型的技术方案，并非限定本实用新型。

本实用新型使用的试剂和耗材均为市售产品，其中：

酶标板和样品稀释板均购自NUNC公司；

购自sigma公司；

酶结合物购自美国Earthox公司；

TMB显示液购自北京索莱宝科技有限公司。

实施例1：试剂盒组成

一种猪伪狂犬病毒抗体检测试剂盒，所述试剂盒有一个盒体(1)，盒体(1)内设有抗原包被反应板存放槽(2)、样品稀释板存放槽(3)、猪伪狂犬病毒gD蛋白抗体阳性对照液孔槽(4)、猪伪狂犬病毒gB蛋白抗体阳性对照液孔槽(5)、猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体阳性对照液孔槽(6)、猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗体阴性对照液孔槽(7)、样品稀释液孔槽(8)、酶结合物孔槽(9)、浓缩洗涤液孔槽(10)、TMB显色液(11)、终止液孔槽(12)和操作说明书存放槽(13)；抗原包被反应板存放槽(2)内放置抗原包被反应板，样品稀释板存放槽(3)内放置样品稀释板，各孔槽中(4-12)放置装有相应溶液的试剂瓶，操作说明书存放槽(13)内放置操作说明书；所述的抗原包被反应板分为检测区I、检测区II和检测区III，检测区I、检测区II和检测区III分别包被猪伪狂犬病毒gD蛋白抗原、猪伪狂犬病毒gB蛋白抗原和猪伪狂犬病毒gE蛋白抗原。

其中，抗原包被反应板的规格为96孔，每个试剂盒共有5块包被板，每块包被板从左至右平均分为检测区I、检测区II和检测区III，具体如图2所示。样品稀释板的规格为96孔，每个试剂盒共有5块样品稀释板。抗原包被反应板和样品稀释板都是可以拆卸的96孔板，每块板都可以拆卸为12排，每排8孔。

实施例2：试剂盒制备

1.抗原包被反应板制备：检测区I、检测区II和检测区III在酶标板孔中均匀包被猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗原，包被量为0.02-0.1μg/孔，包被缓冲液为0.05mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液(即1L碳酸盐缓冲液中含1.59g Na₂CO₃和2.93gNaHCO₃)，2～8℃过夜后，使用PBST洗板3次；洗板后加入封闭液，封闭液为质量浓度为1-5％的BSA或脱脂牛奶的任一种或其组合，200μl/孔，37℃封闭2h，干燥后密封保存。

2.样品稀释液：使用1×PBS作为溶剂，配制1％BSA溶液，再加入使用终浓度(v∶v)为0.1％，按照250ml/瓶分装。

3.酶结合物：用样品稀释液将商品化羊抗猪IgG酶标二抗按照1∶5,000稀释而成，按60ml/瓶分装。

4.浓缩洗涤液：为25×PBST溶液，其中Tween-20的浓度为1.25％(v/v)，再加入使用终浓度(v∶v)为0.1％，按照150ml/瓶分装。

5.TMB显色液：为商品化的TMB显示液，按60ml/瓶分装。

6.终止液：为2M H₂SO₄溶液，配制时在178.26ml的超纯水中加入21.76ml的浓硫酸，混匀即得，按60ml/瓶分装。

7.阳性对照液：分别为用样品稀释液100倍稀释的猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗体的猪阳性血清，分别按2ml/瓶分装。

8.阴性对照液：用样品稀释液100倍稀释的不含有猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗体的猪阴性血清，按4ml/瓶分装。

9.组装：按每一个试剂盒配抗原包被反应板5块、样品稀释板5块、猪伪狂犬病毒gD蛋白抗体阳性对照液1瓶、猪伪狂犬病毒gB蛋白抗体阳性对照液1瓶、猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体阳性对照液1瓶、猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗体阴性对照液1瓶、样品稀释液1瓶、酶结合物1瓶、浓缩洗涤液1瓶、TMB显色液1瓶、终止液1瓶和操作说明书1份进行装盒。

实施例3：试剂盒检测方法

1.将待检样品用样品稀释液在样品稀释板中稀释100倍(如取396μl样品稀释液再加入4μl待检样品)，将其分别加入抗原包被反应板中检测区I、检测区II和检测区III，每孔加100μl，同时设置阳性对照组、阴性对照组，其中，阳性对照组加入相应的100μl阳性对照液，阴性对照组加入100μl阴性对照液，每个样品和对照平行加样2个孔；

2.加样完成后，将抗原包被反应板置37℃孵育1h后，洗涤液(提前将25×浓缩洗涤液稀释成1×，即为洗涤液，稀释时取10ml 25×浓缩洗涤液加到240ml超纯水中，混匀即得)洗板3-5次，甩干；

3.每孔再加入100μl酶结合物，37℃孵育0.5h，洗涤液洗板3-5次，甩干；

4.每孔加入100μl TMB显色液，室温避光显色10-15min，每孔加入100μl终止液；

5.将抗原包被反应板置于酶标仪中，在450nm测定其光吸收值OD450；

6.结果分析：

本实用新型通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本实用新型并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本实用新型。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本实用新型精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本实用新型只受到本实用新型权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本实用新型精神和范围内的备选方案和等同方案。

Claims

1.一种猪伪狂犬病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒有一个盒体(1)，盒体(1)内设有抗原包被反应板存放槽(2)、样品稀释板存放槽(3)、猪伪狂犬病毒gD蛋白抗体阳性对照液孔槽(4)、猪伪狂犬病毒gB蛋白抗体阳性对照液孔槽(5)、猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体阳性对照液孔槽(6)、猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗体阴性对照液孔槽(7)、样品稀释液孔槽(8)、酶结合物孔槽(9)、浓缩洗涤液孔槽(10)、TMB显色液(11)、终止液孔槽(12)和操作说明书存放槽(13)；抗原包被反应板存放槽(2)内放置抗原包被反应板，样品稀释板存放槽(3)内放置样品稀释板，各孔槽中(4-12)放置装有相应溶液的试剂瓶，操作说明书存放槽(13)内放置操作说明书；所述的抗原包被反应板分为检测区I、检测区II和检测区III，检测区I、检测区II和检测区III分别包被猪伪狂犬病毒gD蛋白抗原、猪伪狂犬病毒gB蛋白抗原和猪伪狂犬病毒gE蛋白抗原。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的抗原包被反应板的规格为96孔，每个试剂盒共有5块包被板，每块包被板从左至右平均分为检测区I、检测区II和检测区III。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的样品稀释板的规格为96孔，每个试剂盒共有5块样品稀释板。

4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述的抗原包被反应板和样品稀释板都是可以拆卸的96孔板，每块板都可以拆卸为12排，每排8孔。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的猪伪狂犬病毒gD蛋白抗体阳性对照液、猪伪狂犬病毒gB蛋白抗体阳性对照液和猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体阳性对照液分别为用样品稀释液100倍稀释的猪伪狂犬病毒gD蛋白、猪伪狂犬病毒gB蛋白和猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的猪阳性血清，分别按2ml/瓶分装。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗体阴性对照液为用样品稀释液100倍稀释的不含有猪伪狂犬病毒gD蛋白、gB蛋白和gE蛋白抗体的猪阴性血清，按4ml/瓶分装。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的样品稀释液为1％BSA溶液，按照250ml/瓶分装。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的酶结合物为用样品稀释液5,000倍稀释的商品化羊抗猪IgG酶标二抗，按60ml/瓶分装。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的浓缩洗涤液为25×PBST溶液，按照150ml/瓶分装。

10.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的TMB显色液为商品化的显示液，按60ml/瓶分装，所述的终止液为2M H₂SO₄溶液，按60ml/瓶分装。