CN115073613A - 一种融合蛋白GLuc-p30及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种融合蛋白GLuc‑p30及其制备方法和应用，以非洲猪瘟的p30蛋白为诊断抗原，建立了一种基于荧光素酶免疫沉淀***的非洲猪瘟抗体检测方法，该方法通过DNA转染真核细胞制备荧光素酶与p30的融合抗原，将该抗原分泌到细胞外，融合抗原与血清样本中的非洲猪瘟抗体结合后，被金黄色葡萄球菌A蛋白偶联的磁珠捕获，经荧光素酶试验检测与磁珠特异性结合的融合抗原；本发明使用的真核细胞表达的病毒抗原含有磷酸化等翻译后修饰，与感染情况下表达的病毒蛋白更相近，且无需纯化，简化了抗原的准备过程；与现有的间接ELISA相比，本发明的检测方法具有更好的检测的灵敏性和特异性；本发明检测方法具有简单、敏感、特异、价廉等优点，可以满足大规模检测的要求。

Description

一种融合蛋白GLuc-p30及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种融合蛋白GLuc-p30及其制备方法和应用，属于生物医学和免疫诊断检测技术领域，尤其涉及病毒检测技术领域。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV) 引起的一种急性高传染性猪病，常伴有高热、内脏器官广泛性出血以及呼吸***和神经***功能紊乱等临床症状，并且其病程短，病死率可高达100％。1921年，ASF首次在肯尼亚出现，后逐步流行于欧洲、南美和俄罗斯高加索地区。ASF是世界动物卫生组织(OIE)必须报告的动物疫病，已被我国列为一类动物疫病。迄今，市场上尚无有效的疫苗和特异性抗病毒治疗方法，严格的生物安全措施和精准检测清除是我国当前ASF防控的核心策略。
ASFV是Asfarviridae病毒科的唯一成员，可以感染各种家猪和野猪。它是已知唯一的虫媒DNA病毒，软蜱是其重要的传播宿主和媒介。ASFV基因组为单股双链DNA，长度在170 kb～190kb之间，编码150～170个病毒蛋白。其中p30蛋白是由CP204L基因编码的早期蛋白，感染早期就诱导高水平的抗体反应。基于此，该蛋白被广泛用于检测血清中的ASFV特异性抗体反应。ASFV可以分为24个基因型，我国境内流行的毒株主要为基因II毒株，尽管去年我国也检测到基因I毒株。随着基因II型ASFV在我国的大范围流行，临床上分离到多种自然变异流行株，包括基因缺失株、自然变异株、自然弱毒株等。与传统的流行毒株相比，感染变异株的猪群多呈慢性或隐性感染、潜伏期延长、临床症状轻微、死亡率下降，这些特征使得变异毒株的感染更具隐蔽性、不利于精准检测与清除，给ASF防控带来了新的挑战。
目前，市场上尚无有效的疫苗用于ASF的防控，检测ASF抗原成本高、速度慢，不适合大批量快速检测，且在变异弱毒株的流行背景下，会出现假阴性的情况。而针对ASFV的特异性抗体反应的血清学检测方法可以弥补分子生物学检测的不足。目前，基于p30的ELISA检测方法广泛应用于ASFV的血清学诊断，但是它们存在灵敏度低和检测特异性不高等缺点。因此，急需开发一种灵敏、特异、高效、低成本和易于实施的ASFV血清学检测方法。
荧光素酶免疫沉淀***(Luciferase immunoprecipitation system,LIPS)是一种液相免疫分析法，通过使用荧光素酶融合抗原捕获抗原特异性抗体。它已被广泛用于各种病原的血清学检测，如寄生虫，病毒，以及一些自身免疫性疾病的检测。在基于LIPS的检测方法中，融合抗原通常在真核细胞中表达，它们保持了自身的天然构象。由于生物发光的自然背景较低，真核表达的融合抗原无需纯化、可直接用于LIPS，这极大简化了抗原制备的过程。与ELISA 相比，LIPS的检测灵敏度和特异性更好，可用于ASFV的抗体检测。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的问题提供一种融合蛋白GLuc-p30及其制备方法和应用，其应用的方法能够快速准确检测检测猪血清中的ASFV特异性抗体。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的，一种融合蛋白GLuc-p30，所述融合蛋白GLuc-p30的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；SEQ ID No.1： MGVKVLFALICIAVAEAKPTENNEDFNIVAVASNFATTDLDADRGKLPGKKLPLEVLKEMEA NARKAGCTRGCLICLSHIKCTPKMKKFIPGRCHTYEGDKESAQGGIGEAIVDIPEIPGFKDLE PMEQFIAQVDLCVDCTTGCLKGLANVQCSDLLKKWLPQRCATFASKIQGQVDKIKGAGGD DYKDDDDKGSGDIMDFILNISMKMEVIFKTDLRSSSQVVFHAGSLYNWFSVEIINSGRIVTTAIKTLLSTVKYDIVKSARIYAGQGYTEHQAQEEWNMILHVLFEEETESSASSENIHEKNDNE TNECTSSFETLFEQEPSSEVPKDSKLYMLAQKTVQHIEQYGKAPDFNKVIRAHNFIQTIYGTP LKEEEKEVVRLMVIKLLKKK。
其中，SEQ ID No.1由392个氨基酸组成，SEQ ID No.1的第199～392位氨基酸为ASFV p30抗原的氨基酸序列，SEQ ID No.1的第1～185位氨基酸为所述荧光素酶GLuc的氨基酸序列，SEQ ID No.1的186～198位氨基酸为连接肽的氨基酸序列。
所述融合蛋白GLuc-p30的编码基因序列如SEQ ID No.2所示，SEQ ID No.2： ATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATCGCTGTGGCCGAGGCCAAGCCCAC CGAGAACAACGAAGACTTCAACATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGAT CTCGATGCTGACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGCTCAAAG AGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCC CACATCAAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGCCACACCTACG AAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGA GATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTCATCGCACAGGTCGATCTGT GTGTGGACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCT GCTCAAGAAGTGGCTGCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAG GTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGACGATTACAAGGATGACGACGATAAGGGGA GTGGCGATATCATGGACTTCATCCTGAACATCAGCATGAAAATGGAAGTGATTTTCAAGA CAGATCTGAGAAGCTCTTCTCAGGTGGTGTTCCACGCCGGATCTCTGTACAACTGGTTC AGCGTGGAAATCATCAACAGCGGCAGAATCGTGACCACCGCCATCAAGACACTGCTGA GCACCGTGAAGTACGACATCGTGAAAAGCGCTAGAATCTACGCCGGCCAGGGCTACAC CGAGCACCAGGCCCAGGAGGAATGGAATATGATCCTGCACGTGCTGTTCGAGGAAGAG ACAGAGAGCTCCGCCAGCTCCGAGAACATCCACGAGAAGAACGACAATGAAACCAAC GAGTGCACCAGCTCCTTCGAAACCCTGTTTGAGCAGGAGCCAAGCTCTGAGGTCCCCA AGGACAGCAAGCTGTACATGCTGGCTCAAAAGACAGTGCAGCATATCGAGCAGTACGGCAAGGCCCCTGATTTTAACAAGGTGATCCGGGCCCACAACTTCATCCAGACCATCTATGG CACCCCTCTGAAGGAAGAAGAGAAAGAGGTTGTGCGGCTGATGGTGATTAAGCTGCTC AAGAAAAAGTGA。
其中，SEQ ID No.2由1179个核苷酸组成，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。 SEQ ID No.2的第595～1179位核苷酸编码SEQ ID No.1中的非洲猪瘟病毒p30抗原；SEQ ID No.2的1～555位核苷酸编码SEQ ID No.1中的GLuc；SEQ ID No.2的556～594位核苷酸编码 SEQ ID No.1中的连接肽。
一种重组质粒pCAGGS-GLuc-p30，所述重组质粒如SEQ ID No.2所示的基因，载体为真核表达载体pCAGGS。
重组质粒pCAGGS-GLuc-p30的制备方法如下：将GLuc基因融合与密码子优化后的非洲猪瘟病毒p30蛋白核苷酸序列克隆到真核表达载体pCAGGS中；以密码子优化的非洲猪瘟病毒p30蛋白的核苷酸序列为模板，分别用XhoⅠ和EcoRⅤ双酶切位点进行连接以构建pCAGGS-GLuc-p30表达质粒。
一种制备融合蛋白GLuc-p30的方法，步骤如下：
S1：构建重组质粒pCAGGS-GLuc-p30；
S2-1：将HEK-293T细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞密度约80％时进行DNA转染实验；
S2-2：运用Lipofectamine 2000转染试剂(ThermoFisher Scientific)转染HEK-293T细胞；依照试剂盒说明书，每孔转染1μg pCAGGS-GLuc-p30质粒；
S2-3：于37℃、5％CO2的条件下培养48小时收集转染的上清液，即得到含有GLuc-p30 抗原的溶液，通过测定溶液中的荧光素酶活性确定蛋白表达量。
一种所述的融合蛋白GLuc-p30在非洲猪瘟抗体检测中的非诊断目的的应用。
所述应用的方法如下：将按1:50-1:3200稀释的猪血清样和荧光素酶活性梯度为108-105光子数的融合蛋白GLuc-p30加入磷酸缓冲液中，于4℃过夜孵育；向每个反应中加入5μL 的Protein A Magbeads，常温孵育1小时后，通过磁力分离架收集磁珠；PBST洗涤磁珠去除非特异性结合的荧光素酶后，加入GLuc底物孵育检测荧光素酶活性。
检测ASFV感染的***，包括利用荧光素酶免疫共沉淀技术检测是否感染ASFV的试剂和仪器。具体来说，检测ASFV感染的***可由GLuc-p30融合蛋白、Protein A MagBeads、荧光素酶底物以及利用荧光素酶免疫共沉淀技术检测是否感染ASF所需的其他试剂和仪器组成。所述Protein A MagBeads可为GenScript公司产品，货号为L00273。所述荧光素酶底物可为懋康生物公司产品Coelenterazine h，货号为MX4608。所述化学发光检测仪可为上海闪谱公司的SuPerMax 3000FL。
所述检测ASFV的***还包括记载下述内容的载体：以已知阳性猪血清和阴性猪血清进行LIPS实验，得出S/N的临界值。如待检血清的S/N大于或等于所述临界值，待测血清为非洲猪瘟阳性；如待检血清的S/N小于所述临界值，待测血清为非洲猪瘟阴性血清。
上述检测非洲猪瘟病毒感染的***中，所述真核细胞可为293T细胞。
上述检测非洲猪瘟病毒感染的***中，所述培养进行48小时。
进一步，血清稀释倍数为1:50-1:3200，更优选血清稀释倍数为1:100。
进一步，融合蛋白GLuc-p30的荧光素酶活性梯度为108-105光子数，更优选融合蛋白 GLuc-p30荧光素酶活性为107光子数。
一种非洲猪瘟抗体检测的试剂盒，包括如下组成：107荧光素酶活性的GLuc-p30蛋白、 PBS缓冲液、PBST、Protein A Magbeads、GLuc底物。
本发明具有以下有益效果：1.本发明将ASFV p30与GLuc荧光素酶融合表达，借由GLuc的分泌信号将GLuc-p30被分泌到细胞外，细胞培养上清可直接用于LIPS检测。融合蛋白GLuc-p30经转染真核细胞表达，含有真核生物的磷酸化等翻译后修饰，与病毒感染情况下表达的蛋白构象一致。与使用纯化抗原的ELISA等血清学检测方法相比，由于LIPS检测中生物发光的背景低，无需纯化抗原，降低了检测成本，提高了检测灵敏度。
2.本方法操作简单，无需经过专业培训即可在较短时间内掌握。猪血清样和融合抗原在 200μL体积的八连管中孵育即可，所需的血清样品的量少，操作方便，减少了交叉污染的可能性，且耗材成本低廉。加入磁珠孵育过后，通过磁力分离器和排枪即可快速完成磁珠的洗涤和收集。
3.基于不同类型ELISA的ASFV血清学检测方法存在假阳性较高的缺点，与之相比，本发明的ASFV血清学检测方法的特异性和灵敏度均为100％。
附图说明
图1为表达质粒pCAGGS-GLuc-p30的图谱。
图2为非洲猪瘟抗体检测LIPS法的检测特异性与灵敏性。
图3为非洲猪瘟抗体检测LIPS法的交叉反应性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中非洲猪瘟阳性猪血清为PCR检测阳性，非洲猪瘟阴性猪血清均为无非洲猪瘟感染猪血清。
实施例1：融合蛋白GLuc-p30的制备
1、重组质粒的构建
将密码子优化后的非洲猪瘟病毒p30蛋白核苷酸序列与GLuc基因融合、克隆到真核表达载体pCAGGS中；以密码子优化的非洲猪瘟病毒p30蛋白的核苷酸序列为模板，分别用XhoⅠ和EcoRⅤ双酶切位点进行连接以构建pCAGGS-GLuc-p30表达质粒。
2、DNA转染HEK-293T细胞表达融合蛋白
1)将293T细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞密度约80％时进行DNA转染实验；
2)运用Lipofectamine 2000转染试剂(ThermoFisher Scientific)转染HEK-293T细胞。依照试剂盒说明书，每孔转染1μg pCAGGS-GLuc-p30质粒；
3)于37℃、5％CO2的条件下培养48小时收集转染的上清液，即得到含有GLuc-p30抗原的溶液，通过测定溶液中的荧光素酶活性确定蛋白表达量(如下表1)。
表1
编号 检测体积(uL) 荧光强度值
1 20 303415666.7
2 20 224510000
3 20 185869666.7
实施例2：ASFV抗体检测LIPS的建立与优化
1、LIPS检测融合蛋白GLuc-p30加入量的优化
将108、107、106、105荧光素酶活性(光子计数)的融合抗原分别与ASFV阳性(P)和阴性血清(N)进行LIPS，P/N最大时的融合抗原使用量为最佳加入量。结果显示融合抗原的荧光素酶活性在107时P/N值最大，因此将融合抗原的最佳加入量为107酶活性/反应，如表2所示。
表2融合蛋白GLuc-p30使用量的优化结果
Figure BDA0003717430020000061
2、LIPS检测血清稀释度的优化
将一份临床确诊的ASFV阳性血清和一份ASFV阴性血清分别以1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200进行梯度稀释，使用含有107荧光素酶活性的融合蛋白GLuc-p30 进行LIPS检测，以此来进行血清稀释倍数确定试验。通过向收集的磁珠中加入荧光素酶底物，通过化学发光检测仪进行荧光强度值的读取，通过P/N值的变化判断血清最终稀释倍数。结果显示稀释度在1:100时P/N值最大，因此将血清稀释度确定为1:100。如表3所示。
表3 LIPS检测血清稀释度的确定
Figure BDA0003717430020000062
3、优化后的ASFV抗体检测LIPS检测程序
(1)将10uL 1:100稀释的猪血清与10uL含有107荧光素酶活性的融合蛋白GLuc-p30 加入130uL的PBS中，形成150uL的终体系，在200uL体积的八连管中于4℃中震荡孵育过夜；
(2)用PBST洗涤Protein A Magbeads三次后，向步骤(1)的体系中加入5uL的磁珠；使用LIPS Buffer洗涤3次，置于室温下震荡孵育1小时；
(3)孵育结束后，用磁力分离器沉淀磁珠，去除上清，加入150mL的PBS进行洗涤，再通过磁力分离器沉淀磁珠后将洗涤液去除，共洗涤3次后，再使用PBS洗涤1次，除去上清液体,得到磁珠沉淀；
(4)用20uL的PBS将磁珠从八联排管中转移到96孔微孔板中；
(5)向步骤(4)中转移到96孔微孔板的磁珠沉淀中加入50u1的荧光素酶底物(懋康生物，Coelenterazine h，MX4608)，放入化学发光检测仪，设置整合时间为1秒，延迟时间为1秒，测试方式选用光子计数。得到LIPS方法检测血清样品的荧光强度值，并记录数据。
实施例3：ASFV抗体检测LIPS的灵敏性与特异性
本试验用到的37份ASFV阳性猪血清和81份ASFV阴性猪血清均经商用非洲猪瘟间接 ELISA复核。将样品按1:100的稀释度进行稀释后与含有107的荧光素酶活性的融合蛋白GLuc-p30进行孵育，采用实施例2中优化后的LIPS检测程序。计算所有样品的S/N值，通过接受者操作特征曲线(ROC曲线)确定检测临界值，并计算LIPS的检测灵敏性与特异性，如图1。
当S/N≥30.59，血清样本被判定为被ASFV阳性；当S/N<30.59时，血清样本被判定为 ASFV阴性。从这37份临床确诊的ASFV感染阳性猪血清样品中检测出37份ASFV感染的阳性猪血清，检测灵敏性为100％；利用LIPS从这81份临床确诊的ASFV感染阴性猪血清样品中检测出81份ASFV感染的临床阴性猪血清，检测特异性为100％(图2)。
实施例4：ASFV抗体检测LIPS的交叉反应性验证
为了验证本发明的ASFV抗体检测方法对其他病原的交叉反应性。我们选择了17份特定病原阳性的猪血清，包括2份猪流行性腹泻病毒阳性血清、3份猪德尔塔冠状病毒阳性血清、 5份猪塞内卡病毒阳性血清、2份猪瘟病毒阳性血清、5份猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清。 LIPS的检测结果均为阴性(图3A)。同时将这17份特定病原阳性的猪血清用基于p30抗原的商品化非洲猪瘟间接ELISA抗体检测试剂盒(北京亿森宝，货号为FZE024)进行检测，其中一份猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清的检测结果为假阳性(图3B)，说明相比之下，本发明的检测方法具有更好的特异性。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种融合蛋白GLuc-p30及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu
1 5 10 15
Ala Lys Pro Thr Glu Asn Asn Glu Asp Phe Asn Ile Val Ala Val Ala
20 25 30
Ser Asn Phe Ala Thr Thr Asp Leu Asp Ala Asp Arg Gly Lys Leu Pro
35 40 45
Gly Lys Lys Leu Pro Leu Glu Val Leu Lys Glu Met Glu Ala Asn Ala
50 55 60
Arg Lys Ala Gly Cys Thr Arg Gly Cys Leu Ile Cys Leu Ser His Ile
65 70 75 80
Lys Cys Thr Pro Lys Met Lys Lys Phe Ile Pro Gly Arg Cys His Thr
85 90 95
Tyr Glu Gly Asp Lys Glu Ser Ala Gln Gly Gly Ile Gly Glu Ala Ile
100 105 110
Val Asp Ile Pro Glu Ile Pro Gly Phe Lys Asp Leu Glu Pro Met Glu
115 120 125
Gln Phe Ile Ala Gln Val Asp Leu Cys Val Asp Cys Thr Thr Gly Cys
130 135 140
Leu Lys Gly Leu Ala Asn Val Gln Cys Ser Asp Leu Leu Lys Lys Trp
145 150 155 160
Leu Pro Gln Arg Cys Ala Thr Phe Ala Ser Lys Ile Gln Gly Gln Val
165 170 175
Asp Lys Ile Lys Gly Ala Gly Gly Asp Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
180 185 190
Lys Gly Ser Gly Asp Ile Met Asp Phe Ile Leu Asn Ile Ser Met Lys
195 200 205
Met Glu Val Ile Phe Lys Thr Asp Leu Arg Ser Ser Ser Gln Val Val
210 215 220
Phe His Ala Gly Ser Leu Tyr Asn Trp Phe Ser Val Glu Ile Ile Asn
225 230 235 240
Ser Gly Arg Ile Val Thr Thr Ala Ile Lys Thr Leu Leu Ser Thr Val
245 250 255
Lys Tyr Asp Ile Val Lys Ser Ala Arg Ile Tyr Ala Gly Gln Gly Tyr
260 265 270
Thr Glu His Gln Ala Gln Glu Glu Trp Asn Met Ile Leu His Val Leu
275 280 285
Phe Glu Glu Glu Thr Glu Ser Ser Ala Ser Ser Glu Asn Ile His Glu
290 295 300
Lys Asn Asp Asn Glu Thr Asn Glu Cys Thr Ser Ser Phe Glu Thr Leu
305 310 315 320
Phe Glu Gln Glu Pro Ser Ser Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys Leu Tyr
325 330 335
Met Leu Ala Gln Lys Thr Val Gln His Ile Glu Gln Tyr Gly Lys Ala
340 345 350
Pro Asp Phe Asn Lys Val Ile Arg Ala His Asn Phe Ile Gln Thr Ile
355 360 365
Tyr Gly Thr Pro Leu Lys Glu Glu Glu Lys Glu Val Val Arg Leu Met
370 375 380
Val Ile Lys Leu Leu Lys Lys Lys
385 390
<210> 2
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60
gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120
gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagatg 180
gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240
aagtgcacgc ccaagatgaa gaagttcatc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300
aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360
ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420
acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480
ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540
ggggccggtg gtgacgatta caaggatgac gacgataagg ggagtggcga tatcatggac 600
ttcatcctga acatcagcat gaaaatggaa gtgattttca agacagatct gagaagctct 660
tctcaggtgg tgttccacgc cggatctctg tacaactggt tcagcgtgga aatcatcaac 720
agcggcagaa tcgtgaccac cgccatcaag acactgctga gcaccgtgaa gtacgacatc 780
gtgaaaagcg ctagaatcta cgccggccag ggctacaccg agcaccaggc ccaggaggaa 840
tggaatatga tcctgcacgt gctgttcgag gaagagacag agagctccgc cagctccgag 900
aacatccacg agaagaacga caatgaaacc aacgagtgca ccagctcctt cgaaaccctg 960
tttgagcagg agccaagctc tgaggtcccc aaggacagca agctgtacat gctggctcaa 1020
aagacagtgc agcatatcga gcagtacggc aaggcccctg attttaacaa ggtgatccgg 1080
gcccacaact tcatccagac catctatggc acccctctga aggaagaaga gaaagaggtt 1140
gtgcggctga tggtgattaa gctgctcaag aaaaagtga 1179

Claims (10)

1.一种融合蛋白GLuc-p30，其特征在于：所述融合蛋白GLuc-p30的氨基酸序列如SEQID No.1所示；融合蛋白GLuc-p30通过GLuc的强分泌信号肽分泌，其中超过95％分泌到细胞外。
2.根据权利要求1所述的一种融合蛋白GLuc-p30，其特征在于：所述融合蛋白GLuc-p30的编码基因序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种重组质粒pCAGGS-GLuc-p30，其特征在于：所述重组质粒包含如SEQ ID No.2所示的基因，载体为真核表达载体pCAGGS。
4.权利要求3所述重组质粒pCAGGS-GLuc-p30的制备方法，其特征在于，所述方法如下：将GLuc基因融合与密码子优化后的非洲猪瘟病毒p30蛋白核苷酸序列克隆到真核表达载体pCAGGS中；以密码子优化的非洲猪瘟病毒p30蛋白的核苷酸序列为模板，分别用XhoⅠ和EcoRⅤ双酶切位点进行连接以构建pCAGGS-GLuc-p30表达质粒。
5.一种制备融合蛋白GLuc-p30的方法，其特征在于：所述方法的步骤如下：
S1：构建如权利要求3所述的重组质粒pCAGGS-GLuc-p30；
S2：将重组质粒转染真核细胞，培养细胞后使编码基因表达，得到所述融合蛋白GLuc-p30。
6.根据权利要求5所述的制备融合蛋白GLuc-p30的方法，其特征在于：所述S2的具体步骤如下：
S2-1：将HEK-293T细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞密度约80％时进行DNA转染实验；
S2-2：运用Lipofectamine 2000转染试剂转染HEK-293T细胞；依照试剂盒说明书，每孔转染1μg pCAGGS-GLuc-p30质粒；
S2-3：于37℃、5％CO2的条件下培养48小时收集转染的上清液，即得到含有GLuc-p30抗原的溶液，通过测定溶液中的荧光素酶活性确定蛋白表达量。
7.权利要求1或2所述的融合蛋白GLuc-p30在非洲猪瘟抗体检测中的非诊断目的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用的方法如下：将按1:50-1:3200稀释的猪血清样和荧光素酶活性梯度为108-105光子数的融合蛋白加入磷酸缓冲液中，于4℃过夜孵育；向每个反应中加入5μL的Protein A Magbeads，常温孵育1小时后，通过磁力分离架收集磁珠；PBST洗涤磁珠去除非特异性结合的荧光素酶后，加入GLuc底物孵育检测荧光素酶活性。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述猪血清样的稀释度为1:100，所述融合蛋白为含有107荧光素酶活性的融合蛋白。
10.一种非洲猪瘟抗体检测的试剂盒，其特征在于：包括如下组成：107荧光素酶活性的GLuc-p30蛋白、PBS缓冲液、PBST、Protein A Magbeads、GLuc底物。
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CN116063563A (zh) * 2022-09-29 2023-05-05 扬州大学 一种融合抗原GLuc-p30及其制备方法、试剂盒和检测方法
CN116643050A (zh) * 2023-04-17 2023-08-25 新希望六和股份有限公司 一种抗猪A群轮状病毒的IgA抗体ELISA检测试剂盒以及检测方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116063563A (zh) * 2022-09-29 2023-05-05 扬州大学 一种融合抗原GLuc-p30及其制备方法、试剂盒和检测方法
CN116643050A (zh) * 2023-04-17 2023-08-25 新希望六和股份有限公司 一种抗猪A群轮状病毒的IgA抗体ELISA检测试剂盒以及检测方法
CN116643050B (zh) * 2023-04-17 2024-05-24 新希望六和股份有限公司 一种抗猪A群轮状病毒的IgA抗体ELISA检测试剂盒以及检测方法

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