CN111499697A - 一种非洲猪瘟病毒p54重组蛋白的间接ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种非洲猪瘟病毒p54重组蛋白的间接ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111499697A
CN111499697A CN202010270120.9A CN202010270120A CN111499697A CN 111499697 A CN111499697 A CN 111499697A CN 202010270120 A CN202010270120 A CN 202010270120A CN 111499697 A CN111499697 A CN 111499697A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
indirect
swine fever
isa
african swine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010270120.9A
Other languages
English (en)
Inventor
翁长江
步志高
黄丽
张元峰
赵东明
张涛清
刘任强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Original Assignee
Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harbin Veterinary Research Institute of CAAS filed Critical Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority to CN202010270120.9A priority Critical patent/CN111499697A/zh
Publication of CN111499697A publication Critical patent/CN111499697A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/12011—Asfarviridae
    • C12N2710/12022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/12011—Asfarviridae
    • C12N2710/12051—Methods of production or purification of viral material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒p54的原核可溶性表达蛋白的间接ELISA抗体检测盒，该试剂盒用于检测猪血清中的非洲猪瘟病毒p54抗体水平,具有特异性高，重复性好，灵敏性高等优点。为非洲猪瘟的早期诊断提供了一种简便可靠的方法。

Description

一种非洲猪瘟病毒p54重组蛋白的间接ELISA抗体检测试剂盒 及其制备方法
技术领域
本发明涉及病毒检测领域，具体涉及非洲猪瘟病毒抗体检测领域。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、烈性传染病。各种日龄的猪均易感。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫病。其特征是发病过程短，最急性和急性型感染死亡率高达100％，临床表现为发热，心跳加快，呼吸困难，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，心脏、肺叶、胆管、***、肾、胃肠粘膜明显出血，脾脏充血肿大。ASF最早于1909年在非洲首次报道。自2007年传入格鲁吉亚共和国以来，已有19个非洲以外的国家报告了ASF疫情。2018年8月3日，我国首次出现ASF疫情，随后迅速蔓延至全国，给我国养猪业造成了沉重的打击。然而，迄今为止，在世界范围内还未成功研制出有效防控非洲猪瘟的商品化疫苗。因此，检测和扑杀感染动物是控制非洲猪瘟的唯一方法。
抗体的检测是兽医临床检测病毒感染的最常用手段之一，目前常用的抗体检测技术包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光试验(IFA)等。其中ELISA方法是最适用于动物群体进行高通量快速检测的方法。
p54蛋白是非洲猪瘟病毒的重要结构蛋白，近年来，许多研究以p54蛋白为免疫抗原，构建针对p54蛋白的ELISA抗体检测试剂。如中国专利CN110684085A，公开了ASFV-P54蛋白重组方法及利用其制备的夹心ELISA试剂盒。CN103278627A，公开了一种检测非洲猪瘟病毒抗体的多抗原ELISA试剂盒，其中的抗原之一就是p54蛋白。p54蛋白序列中含有一段跨膜区域，对病毒蛋白经过内质网膜转化成病毒囊膜前体的过程十分重要，是最具免疫原性的蛋白之一。但是在以p54蛋白为抗原开发的各级ASFV抗体检测的试剂中出现了不期望的检测交叉反应，使得检测试剂的阳性检出的准确率下降。
因此，为了进一步提高检出的准确率，需要对p54蛋白抗原进行改造。
发明内容
第一方面，本发明提供一种抗原特异性更高的ASFV p54蛋白，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ.NO.2。p54蛋白是ASFV的重要结构蛋白，蛋白序列中含有一段跨膜区域，为了提高抗原的免疫原性，本发明利用原核表达***表达纯化重组p54蛋白非跨膜区。所得蛋白的免疫原性有显著提高。
进一步，为了降低临床检测中抗原交叉反应发生率，本发明优选提供无标签的可溶性p54蛋白，以该蛋白作为抗原，用于ASFV抗体的检测，不但能使检出率更准确而且能够进一步降低临床检测中的交叉反应。
进一步，为了获得无标签的可溶性p54蛋白，本发明在引物序列中引入特定的凝血酶位点(CTGGTTCCGCGTGGATCC)(SEQ.NO.7)，从而可以方便的将纯化的p54蛋白的His标签切除。
本发明的p54蛋白特异选定在原核***表达，制备步骤如下：
1)扩增E183L基因片段：在引物序列中***凝血酶位点，从非洲猪瘟病毒基因组中扩增E183L基因片段，扩增片段大小为399bp。所用上游引物为F:TTAAGAAGGAGATATACATATGTCTTCAAGAAAG(SEQ.NO 5)；下游引物为R:
CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGGATCCACGCGGAACCAGCAAGGA GTTTTCTAG(SEQ.NO.6)。
2)将步骤1)中所得基因利用同源重组方法克隆到质粒载体中。
3)将上述构建成功的重组表达质粒转化BL21大肠杆菌表达菌株进行诱导表达。利用亲和层析和凝胶层析方法进行纯化，获得p54重组蛋白。
4)将上述纯化得到的重组蛋白利用凝血酶，切除His标签，获得无标签可溶性p54蛋白。
优选ASFV为ASFV Pig/HLJ/2018株。
优选步骤2)中所述质粒载体为pET-21a。
第二方面，本发明提供一种利用ASFV p54无标签可溶性蛋白作为包被抗原制备ASFV间接ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒的制备包括以下步骤：
1)包被抗原：用碳酸盐缓冲液(0.05M，pH值9.6)将纯化的重组p54蛋白稀释加入到96孔酶联反应板中，100μl/孔，置4℃下过夜。甩去孔内液体，加入洗涤液，200μl/孔，洗涤3次，每次静置5分钟，甩去孔内液体，拍干。
2)封闭：加入封闭液，200μl/孔，置37℃下封闭2小时。
3)孵育待检血清：将样品用PBST进行稀释，100μl/孔，置37℃温箱孵育。
4)孵育酶标二抗：用PBST(0.01mol/L，pH值7.4)对辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG进行稀释，100μl/孔，置37℃温箱孵育。
5)加显色液：加入底物溶液100μl/孔，置37℃避光孵育。
6)加终止液：加入终止液2M H2SO4 50μl/孔。
7)读值：轻微震荡混合均匀后，在450nm的波长下读数(应在加入终止液后15分钟内完成读数)，并记录结果。
本发明的有益效果：
本发明首先对原有p54蛋白序列进行精选，获得免疫原性更好的抗原序列，同时在引物序列设计时特异性引入凝血酶位点，从而能够方便的将纯化得到的His-p54原核重组蛋白标签进行切除，极大的避免了实际临床应用中与现有的猪亚单位疫苗产品发生的交叉反应发生率，实现更具有特异性的检测效果。同时采用原核表达***，使得生产简易，纯化简便，易于大量生产。
附图说明
图1所示为本发明中ASFV Pig/HLJ/2018株E183L基因PCR扩增结果图。
(M：DNA Marker；1：E183L扩增片段)
图2所示为本发明中含有重组质粒pET-21a-E183L菌体的阳性克隆菌液PCR鉴定图。
(M：DNA Marker；1-7：pET-21a-E183L阳性克隆菌液PCR结果；8：阳性对照；9：阴性对照)
图3所示为本发明中37℃，0.5mM IPTG诱导条件下His-p54重组蛋白的表达分析图。
(M：蛋白Marker；1：未诱导细菌裂解产物；2：0.5mM IPTG诱导细菌裂解产物；3：重组菌裂解产物上清；4：重组菌裂解产物沉淀)
图4所示为本发明中镍柱亲和层析方法纯化His-p54重组蛋白的洗脱峰图。
图5所示为本发明中镍柱亲和层析方法纯化的His-p54重组蛋白SDS-PAGE鉴定结果。
(M：蛋白Marker；)
图6所示为本发明中凝胶亲和层析方法纯化His-p54重组蛋白的洗脱峰图。
图7所示为本发明中凝胶亲和层析方法纯化的His-p54重组蛋白SDS-PAGE鉴定结果。
(M：蛋白Marker；2-6：Superdex 200分子筛纯化的His-p54重组蛋白)
图8所示为本发明中凝血酶切除His标签后的p54蛋白鉴定结果。
(M：蛋白Marker；1：未切除的His-p54蛋白；2：切除标签后的p54蛋白)
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施方案对本发明做进一步说明。
实施例1：非洲猪瘟病毒p54重组可溶性蛋白的制备
1)扩增E183L基因：根据中国农业科学院哈尔滨兽医研究所测定的ASFV Pig/HLJ/2018株的E183L基因序列(GeneBank登录号：MK333180.1)利用Oligo7软件设计扩增E183L基因全长的特异性引物，所用上游引物为F:TTAAGAAGGAGATATACATATGTCTTCAAGAAAG(SEQ.NO1)；下游引物为R:TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGGATCCACGCGGAACCAGCAAGGAGTTTTCTAG(SEQ.NO 2)。提取ASFV基因组DNA，利用PCR方法扩增E183L基因片段(见图1)。PCR扩增体系如下：5×HF buffer，10μL；上游引物(10μmol/L)，2.5μL；下游引物(10μmol/L)，2.5μL；100％DMSO，1.5μL；2.5mmol/L dNTP，4μL；Phusion高保真DNA 聚合酶(2000U/mL)，1μl；重组质粒模板，1μL；ddH2O，27.5μL；总体系，50μL。E183L基因PCR扩增反应程序为预变性98℃，30s；变性98℃，10s；退火57℃，30s；延伸72℃，1min，变性至延伸过程设置35个循环数；终延伸，72℃，10min。
2)构建E183L原核表达质粒：基因扩增产物进行核酸凝胶电泳分析，按照胶回收试剂盒说明书回收E183L基因片段。将回收得到的E183L基因片段与载体pET-21a分别用XhoⅠ、NdeⅠ进行酶切，将酶切后的E183L基因片段与酶切后的载体pET-21a进行连接，构建pET-21a-E183L原核表达质粒，测序正确后转化E.coli BL21菌株(见图2)，进行蛋白表达纯化。
3)重组蛋白p54的表达：随机挑取单个菌落，接种于含有100ug/ml氨苄的LB液体培养基中，37℃恒温摇床内以180rpm/min的转速摇菌过夜。次日，分别以1％的比例接种于3管LB液体培养基中，37℃振荡培养。当菌液OD600约为0.6～0.8时，向其中两管中加入终浓度为0.5mM的IPTG作为诱导组。另外一组不做处理，为对照组。其中一组诱导组37℃诱导5h，另外一组16℃诱导过夜。将诱导组和对照组各取1mL菌液12000rpm高速离心2min后弃掉上清，加入80μL的PBS缓冲液重悬菌体，加入20μL 5×SDS样品缓冲液，100℃煮样10min。进行SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝染色，根据结果分析温度和诱导时间对重组蛋白His-P54的表达的影响(见图3)。
4)重组蛋白His-p54的纯化：挑取含重组质粒pET-21a-E183L的单个菌落，接种于含有100μg/ml氨苄的LB液体培养基中，37℃恒温摇床内摇菌过夜。次日，以1％的比例接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养。当菌液OD600约为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG，37℃诱导5h。收集菌液，6000rpm，15min离心，弃上清，用缓冲液A(150mM NaCl，20mMTris-HCL(pH 8.0))重悬菌体，超声破碎，13,000rpm，4℃，离心30min。上清液用0.22μm或0.45μm的滤膜过滤后挂Ni-柱(见图4)。然后在AKTA层析仪上(见图6)，利用缓冲液A和B(150mM NaCl，20mM Tris-HCL(pH 8.0)，1M咪唑)进行洗脱，***流速为2mL/min，设置2％、5％、10％、20％、30％、50％、100％的缓冲液B洗脱蛋白并收集。进行SDS-PAGE电泳分析目的蛋白出现的梯度，结果表明His-p54蛋白的洗脱梯度为20％、30％、50％。将收集好的目的蛋白4℃透析过夜(见图5和图7)。次日，将透析后的His-p54蛋白离心后，取上清过分子筛superdex200，收集目的蛋白His-p54。
5)测定纯化后的重组His-p54蛋白浓度，每毫克蛋白加入3～5μl凝血酶，置4℃搅拌过夜后以12000r/min于4℃离心20分钟，收集上清样品。通过AKTA蛋白层析纯化仪上样与Ni-NTA树脂结合，使未被切除标签的His-p54蛋白和切除下来的His标签蛋白结合上Ni-NTA树脂。用1～2个柱体积的PBS对Ni-NTA树脂洗脱，***流速为2mL/min，收集洗脱液，即为切除标签后的p54蛋白(见图8)。
实施例2：最佳工艺参数的确定
1、抗原抗体的最佳工作浓度确定
将纯化的p54重组蛋白用包被液稀释成0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml浓度，从左到右加入酶标板中，100μl/孔，4℃孵育过夜；次日，用PBST洗涤3次，每次5min；用5％脱脂乳200μl/孔37度封闭2h。将标准阴阳性血清作1:50、1:100、1:200、1:400梯度稀释，100μl/孔，自上而下加入酶标板，37℃作用30min，洗涤3次，每次5min；加入1：30000的酶标二抗，37℃孵育45min，洗涤3次，每次5min，拍干；每孔加入100μl TMB显色液，37℃避光作用15min；加入100μl终止液终止反应，立即使用酶标仪测定OD450值。根据OD450值和P/N值确定抗原抗体的最佳工作浓度。结果显示，当抗原包被浓度为2.5μg/ml，抗体稀释度为1：200时，阳性血清的OD450值接近于1.0，并且P/N值最大。因此，确定ELISA抗原的最佳包被浓度为2.5μg/ml，血清最佳稀释度为1：200。
2、酶标二抗最佳稀释度的确定
以最佳浓度的抗原包被酶标板，将阴阳性血清按最佳稀释度稀释，将酶标二抗作1：5000、1：10000、1：15000、1：30000稀释，每个稀释度做三个重复，通过OD450值和P/N值来确定酶标二抗的最佳工作浓度。结果显示，当酶标二抗浓度为1：30000时，P/N值最大。
3、最佳包被时间的确定
以最佳浓度的抗原包被酶标板，设置三种包被条件：37℃孵育1h，4℃包被过夜；37℃孵育3h，4℃包被过夜；4℃包被过夜，每种包被条件设4个重复。以最佳稀释度稀释阴、阳性血清和酶标二抗，通过OD450值和P/N值来确定抗原的最佳包被时间。结果显示，最佳包被条件为4℃包被过夜。
4、最佳封闭液的选择
以最佳浓度的抗原包被酶标板，4℃包被过夜，洗涤后，分别以5％脱脂奶粉、5％脱脂奶粉+酶标板稳定剂、3％明胶、3％明胶+酶标板稳定剂、1％BSA、1％BSA+酶标板稳定剂、酶标板稳定剂，每个孔做三个重复，以最佳稀释度稀释阴、阳性血清和酶标二抗，通过OD450值和P/N值来确定最佳封闭液。结果显示，当用5％脱脂奶粉+酶标板稳定剂封闭时，P/N值最大，因此选择5％脱脂奶粉+酶标板稳定剂为最佳封闭液。
5、封闭时间的确定
以最佳浓度的抗原包被酶标板，4℃包被过夜，洗涤后，以5％脱脂奶粉分别封闭30min、60min、90min、120min，每个条件设置3个重复。通过OD450值和P/N值来确定最佳封闭液。结果显示，最佳封闭时间为120min。
6、血清及酶标二抗最佳反应时间的确定
以最佳稀释度稀释阴、阳性血清和酶标二抗，分别孵育30min、45min、60min、90min，每个梯度设置3个重复，进行最佳血清和酶标二抗孵育时间的摸索。通过OD450值和P/N值来确定血清及酶标二抗最佳反应时间。结果显示，最佳血清孵育时间为30min，最佳二抗孵育时间为45min。
7、显色时间的确定
加入显色液，于37℃分别避光孵育3min、5min、10min、15min、20min，每个显色时间阴阳性血清各设置3个重复。通过OD450值和P/N值来确定最佳显色时间。结果显示，当反应时间为15min时，P/N值最大，因此底物最佳显色时间为15min。
实施例3检测非洲猪瘟病毒p54抗体的间接ELISA试剂盒
通过以下步骤制备本发明的检测非洲猪瘟病毒p54抗体的间接ELISA试剂盒，其步骤如下：
(1)包被：用重组ASFV p54蛋白包被酶标板，p54的最佳包被浓度为2.5μg/ml，100μl/孔，4℃孵育过夜，次日用PBST缓冲液洗涤3次，每次5min，拍干；
(2)封闭：加入含5％脱脂奶粉，100μl/孔，37℃封闭1.5h，洗涤3次，每次5min，拍干；加入酶标板稳定剂，100μl/孔，37℃封闭1h，洗涤3次，每次5min。(3)血清孵育：加入1：200稀释的待检血清，37℃孵育30min，洗涤3次，每次5min，拍干；
(4)二抗孵育：加入1：30000的酶标二抗，37℃孵育45min，洗涤3次，每次5min，拍干；
(5)显色：加入TMB显色液100μl/孔，37℃避光显色15min；
(6)终止：加入终止液2M H2SO4，50ul/孔；
(7)读数：用酶标仪读取OD450值。
实施例4：非洲猪瘟病毒p54抗体的间接ELISA试剂盒的效果验证
将经西班牙INGENASA公司ASFV抗原检测试剂盒检测为阴性的100份临床猪血清样品，用建立的间接ELISA试剂盒进行检测，计算出阴性血清样品OD450值的平均值(x)为0.159，标准差(SD)为0.097。按照公式x+3SD确定间接ELISA方法的阴阳性临界值为0.35，即当待检样品的OD450≥0.45时为阳性，OD450<0.45时为阴性。
1、间接ELISA的特异性和重复性实验
用建立的间接ELISA方法分别检测已知的猪瘟病毒(CSFV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪流行性胃肠炎病毒(TGEV)等病原的阳性血清，同时设立ASFV阳性血清和阴性血清对照，并以西班牙INGENASA公司的ASFV抗原检测ELISA试剂盒作为对照，确定是否有交叉反应，分析此间接ELISA试剂盒的特异性。结果表明，OD450值均小于0.45，判定为阴性，表明ASFV p54重组蛋白与上述病毒的阳性血清无交叉方法，该间接ELISA试剂盒特异性良好。
用5块不同批次纯化的p54重组蛋白包被的酶标板同时检测3份阳性血清和2份阴性血清，每份血清样本重复4个孔。根据公式CV＝SD/X计算变异系数，3份阳性血清的变异系数分别为3.2％、3.9％、4.5％，变异系数均小于10％，表明本发明的间接ELISA方法重复性好。
2、间接ELISA的符合率测定
本发明的的间接ELISA试剂盒检测184份临床血清样品，与西班牙INGENASA公司的ASFV抗原检测ELISA试剂盒相对比，分析该试剂盒的敏感性、特异性和符合率。
相对敏感性(％)＝阳性数/(阳性数+假阴性数)×100％
相对特异性(％)＝阴性数/(阴性数+假阳性数)×100％
总符合率(％)＝(阳性数+阴性数)/检测总数×100％
结果表明：本发明的间接ELISA试剂盒检测184份临床血清样品，其中148份检测结果为阴性，36份检测结果为阳性，用西班牙INGENASA公司的ASFV抗原检测ELISA试剂盒检测结果为152份阴性，32份阳性。由此可知本发明的的间接ELISA方法的相对敏感性为100.00％，相对特异性为97.37％，总符合率为97.83％。
因此可见，本发明中的间接ELISA试剂盒的敏感性和特异性较高，与已有的商品化试剂盒相比具有更高的符合率。
序 列 表
<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）
<120>一种非洲猪瘟病毒p54重组蛋白的间接ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法
<130>
<160> 7
<170> PatentIn Version 3.3
<210> 1
<211> 555
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ATGGATTCTGAATTTTTTCAACCGGTTTATCCGCGGCATTATGGTGAGTGTTTGTCACCAGTCACTACACCAAGCTTCTTTCAAGAAAGAAAAAAGCTGCTGCTATTGAGGAGGAAGATATACAGTTTATAAATCCTTATCAAGATCAGCAGTGGGTAGAAGTCACTCCACAACCAGGTACCTCTAAACCAGCTGGAGCGACTACAGCAAGTGTAGGCAAGCCAGTCACGGGCAGACCGGCAACAAACAGACCAGCAACAAACAAACCAGTTACGGACAACCCAGTTACGGACAGACTAGTCATGGCAACTGGCGGGCCGGCGGCCGCACCTGCGGCCGCGAGTGCTCCTGCTCATCCGGCTGAGCCTTACACGACAGTCACTACTCAGAACACTGCTTCACAAACAATGTCGGCTATTGAAAATTTACGACAAAGAAACACCTATACGCATAAAGACCTAGAAAACTCCTTGTAATCTCCACACATATGTATACTATTCTCATTGCTATCGTGGTCTTAGTCATCATTATCATCGTTCTAATCTATCTATTCTC
<210> 2
<211>184
<212> 氨基酸
<213> 人工序列
<400> 2
MDSEFFQPVYPRHYGECLSPVTTPSFFSTHMYTILIAIVVLVIIIIVLIYLFSSRKKKAAAIEEEDIQFINPYQDQQWVEVTPQPGTSKPAGATTASVGKPVTGRPATNRPATNKPVTDNPVTDRLVMATGGPAAAPAAASAPAHPAEPYTTVTTQNTASQTMSAIENLRQRNTYTHKDLENSL
<210> 3
<211> 399
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
TCTTCAAGAAAGAAAAAAGCTGCTGCTATTGAGGAGGAAGATATACAGTTTATAAATCCTTATCAAGATCAGCAGTGGGTAGAAGTCACTCCACAACCAGGTACCTCTAAACCAGCTGGAGCGACTACAGCAAGTGTAGGCAAGCCAGTCACGGGCAGACCGGCAACAAACAGACCAGCAACAAACAAACCAGTTACGGACAACCCAGTTACGGACAGACTAGTCATGGCAACTGGCGGGCCGGCGGCCGCACCTGCGGCCGCGAGTGCTCCTGCTCATCCGGCTGAGCCTTACACGACAGTCACTACTCAGAACACTGCTTCACAAACAATGTCGGCTATTGAAAATTTACGACAAAGAAACACCTATACGCATAAAGACCTAGAAAACTCCTTGTAA
<210> 4
<211> 132
<212> 氨基酸
<213> 人工序列
<400> 4
SSRKKKAAAIEEEDIQFINPYQDQQWVEVTPQPGTSKPAGATTASVGKPVTGRPATNRPATNKPVTDNPVTDRLVMATGGPAAAPAAASAPAHPAEPYTTVTTQNTASQTMSAIENLRQRNTYTHKDLENSL
<210> 5
<211>34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>5
TTAAGAAGGAGATATACATATGTCTTCAAGAAAG
<210> 6
<211>60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>6
TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGGATCCACGCGGAACCAGCAAGGAGTTTTCTAG
<210> 7
<211>18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400>7
CTGGTTCCGCGTGGATCC

Claims (6)

1.一种非洲猪瘟病毒p54蛋白，其特征在于，所述蛋白的序列如SEQ.NO.2。
2.如权利要求1所述的p54蛋白，所述蛋白不含有标签。
3.如权利要求1-2所述的p54蛋白，所述蛋白在原核表达***表达纯化。
4.一种利用权利要求1-3任一项所述p54蛋白制备的非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测试剂盒。
5.一种权利要求1-3任一项所述p54蛋白的制备方法，其包括如下步骤1)扩增E183L基因片段：所用上游引物为SEQ.NO 5；下游引物为SEQ.NO.6。
6.如权利要求5所述的制备方法，其中所用质粒载体为pET-21a。
CN202010270120.9A 2020-04-08 2020-04-08 一种非洲猪瘟病毒p54重组蛋白的间接ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法 Pending CN111499697A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010270120.9A CN111499697A (zh) 2020-04-08 2020-04-08 一种非洲猪瘟病毒p54重组蛋白的间接ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010270120.9A CN111499697A (zh) 2020-04-08 2020-04-08 一种非洲猪瘟病毒p54重组蛋白的间接ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111499697A true CN111499697A (zh) 2020-08-07

Family

ID=71867272

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010270120.9A Pending CN111499697A (zh) 2020-04-08 2020-04-08 一种非洲猪瘟病毒p54重组蛋白的间接ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111499697A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112920268A (zh) * 2021-03-19 2021-06-08 河南农业大学 ASFV-p54蛋白特异性的纳米抗体-HRP融合蛋白及制备方法、应用
CN114081941A (zh) * 2021-11-19 2022-02-25 上海奢旭企业管理中心(有限合伙) B7-h4蛋白的制备方法及其制备抗过度免疫反应或抗细胞因子风暴的药品中的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102236019A (zh) * 2010-04-23 2011-11-09 陈文刚 一种用于检测非洲猪瘟病毒的间接elisa试剂盒
CN102967703A (zh) * 2012-09-06 2013-03-13 中国动物卫生与流行病学中心 一种用于elisa诊断的生物安全性非洲猪瘟抗原多因子血清
CN110093356A (zh) * 2019-05-14 2019-08-06 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 编码非洲猪瘟病毒抗原的dna序列、由其编码的抗原的组合物及其在免疫学检测中的应用
CN110423761A (zh) * 2019-07-08 2019-11-08 郑州大学 一种非洲猪瘟病毒抗体检测试纸
CN110684085A (zh) * 2019-11-07 2020-01-14 青岛立见诊断技术发展中心 Asfv-p54蛋白重组方法及利用其制备的夹心elisa试剂盒
WO2020102370A1 (en) * 2018-11-15 2020-05-22 Kansas State University Research Foundation Immunogenic compositions for african swine fever virus
US20200306360A1 (en) * 2019-03-27 2020-10-01 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Immunogenic compositions and vaccines comprising african swine fever virus peptides and proteins and uses thereof

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102236019A (zh) * 2010-04-23 2011-11-09 陈文刚 一种用于检测非洲猪瘟病毒的间接elisa试剂盒
CN102967703A (zh) * 2012-09-06 2013-03-13 中国动物卫生与流行病学中心 一种用于elisa诊断的生物安全性非洲猪瘟抗原多因子血清
WO2020102370A1 (en) * 2018-11-15 2020-05-22 Kansas State University Research Foundation Immunogenic compositions for african swine fever virus
US20200306360A1 (en) * 2019-03-27 2020-10-01 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Immunogenic compositions and vaccines comprising african swine fever virus peptides and proteins and uses thereof
CN110093356A (zh) * 2019-05-14 2019-08-06 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 编码非洲猪瘟病毒抗原的dna序列、由其编码的抗原的组合物及其在免疫学检测中的应用
CN110423761A (zh) * 2019-07-08 2019-11-08 郑州大学 一种非洲猪瘟病毒抗体检测试纸
CN110684085A (zh) * 2019-11-07 2020-01-14 青岛立见诊断技术发展中心 Asfv-p54蛋白重组方法及利用其制备的夹心elisa试剂盒

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KENICHI SAKAMOTO等: "Detection of African Swine Fever Virus-Specific Antibodies Using the Recombinant Viral Proteins p32 and p54 Expressed in Insect Cells", 《JAPAN AGRICULTURAL RESEARCH QUARTERLY》 *
VINCENT,M.等: "E183L [African swine fever virus]", 《GENBANK》 *
张晓凯: "非洲猪瘟病毒无标签重组p54、B602L抗原的制备与应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》 *
张鑫宇等: "非洲猪瘟病毒E183L、B602L、K205R和A104R基因表达及诊断抗原筛选", 《中国兽医杂志》 *
王永琦: "具有免疫原性ASFV膜蛋白的筛选与鉴定", 《万方数据》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112920268A (zh) * 2021-03-19 2021-06-08 河南农业大学 ASFV-p54蛋白特异性的纳米抗体-HRP融合蛋白及制备方法、应用
CN112920268B (zh) * 2021-03-19 2021-09-24 河南农业大学 ASFV-p54蛋白特异性的纳米抗体-HRP融合蛋白及制备方法、应用
CN114081941A (zh) * 2021-11-19 2022-02-25 上海奢旭企业管理中心(有限合伙) B7-h4蛋白的制备方法及其制备抗过度免疫反应或抗细胞因子风暴的药品中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110105436B (zh) 猪圆环病毒3型抗体的elisa检测试剂盒及其制备方法与应用
CN112877348B (zh) 一种非洲猪瘟病毒CD2v胞外域重组蛋白及其应用
CN107759674B (zh) 一种牛支原体免疫相关性蛋白、含有该蛋白的检测试剂盒及其在牛支原体抗体检测中的用途
CN111499697A (zh) 一种非洲猪瘟病毒p54重组蛋白的间接ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法
CN115160411A (zh) 一种非洲猪瘟病毒优势抗原的筛选、制备及应用
CN113637056A (zh) 一种用于鉴别牛种布鲁氏菌与其它种布鲁氏菌的试剂盒
CN113588946A (zh) 一种猪肺炎支原体抗体间接elisa检测用的重组蛋白和方法
CN111621506B (zh) 牛支原体分泌蛋白MbovP0145及其应用
CN112980802A (zh) 一种分泌鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗的杂交瘤细胞、单抗及应用
CN110376388B (zh) 一种副猪嗜血杆菌抗体检测方法及其试剂盒
CN111848749A (zh) 猪细小病毒VLPs抗体检测试剂盒及其制备方法、应用
CN108982847B (zh) 一种导致鸭脾脏坏死的鸭呼肠孤病毒的间接elisa检测方法
CN111393510B (zh) 一种非洲猪瘟病毒重组抗原及其应用
CN114778852A (zh) 一种检测prrsv plp2抗体的间接elisa方法
CN111208302B (zh) 利用多表位串联蛋白检测猪***o型抗体的化学发光检测试剂盒
CN114047332A (zh) 一种犬瘟热病毒抗体检测试剂盒和编码犬瘟热病毒核蛋白的基因及其应用
CN110554187B (zh) 一种用于检测牛病毒性腹泻病毒抗体的表达蛋白、elisa试剂盒及其制备方法和应用
CN114113634A (zh) 一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒以及protein L的应用
CN113884674A (zh) 一种牛支原体胶体金免疫检测试纸条、制备方法及其应用
CN106198974A (zh) 一种快速检测虹鳟鱼血清中ihnv抗体的elisa检测试剂盒
CN111537736A (zh) 一种鸡毒支原体抗体的间接elisa检测试剂盒及检测方法
CN115806594B (zh) 用于检测非洲猪瘟病毒的重组抗原蛋白及其制备方法、检测试剂盒和应用
CN117886896B (zh) 非洲猪瘟多表位重组蛋白asfvmea及应用
CN117417416B (zh) 用于检测非洲猪瘟病毒的重组抗原蛋白及其制备方法、elisa试剂盒和应用
CN110229827B (zh) 一种犬吉氏巴贝斯虫表面蛋白及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200807