CN117554550A - 血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法和组合稳定剂 - Google Patents
血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法和组合稳定剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法和组合稳定剂及其应用。该检测方法首先通过向采血管中添加组合稳定剂,所述组合稳定剂由以下质量分数的组分组成:抗坏血酸0.5%~2%、5‑羟基阿魏酸0.15%~1%、甲酸0.5~2%以及纯水,所述纯水补足至100%;从而保证了分析前样本的稳定性,其次通过对样本进行衍生化并在衍生化过程中加入衍生稳定剂L‑抗坏血酸以提高衍生化效率,提高了检测灵敏度、特异性、检测通量及检测准确度,具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及儿茶酚胺代谢物检测技术领域,具体涉及一种血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法和组合稳定剂及其应用。
背景技术
嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(pheochromocytoma andparaganglioma,PPGL)是一种少见的内分泌疾病,国内尚缺乏PPGL患病数据。国外报道在普通高血压门诊中PPGL的患病率为0.2%~0.6%,在儿童高血压患者中患病率为1.7%,在肾上腺意外瘤中约占5%。各年龄段均可发病,发病高峰为30~50岁,男女发病率基本相同。
甲氧基肾上腺素(MN)、甲氧基去甲肾上腺素(NMN)和3-甲氧酪胺(3-MT)是儿茶酚胺的中间代谢产物,是嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PPGL)定性诊断的重要依据。PPGL是分别起源于肾上腺髓质或肾上腺外交感神经链的肿瘤,合成和分泌儿茶酚胺(CA)等物质,易引起患者血压升高等一系列临床症状,并造成心、脑、肾等严重并发症。MN和NMN分别是肾上腺素(E),去甲肾上腺素(NE)的中间代谢产物(合称MNs),仅在肾上腺髓质嗜铬细胞或PPGL肿瘤体内代谢生成,并且以高浓度水平持续存在,MNs的半衰期较CA更长,也更加稳定,其特异度和灵敏度高,能反映PPGL肿瘤的功能状态。2016年及2020年中华医学会内分泌学分会发表的《嗜铬细胞瘤和副神经节瘤诊断治疗专家共识》将测定血浆和尿液中的MN及NMN作为筛查嗜铬细胞瘤的首选检测指标。3-MT是多巴胺(DA)的中间代谢产物,2020版PPGL指南指出,检测3-MT可提高筛查头颈部副神经节瘤(PGL)的灵敏度;PPGL患者血浆3-MT浓度明显增高则高度提示为转移性肿瘤。而上述3种化合物在体内含量低,均为pg级。
目前,检测血浆中MN、NMN及3-MT的方法中,最常用的是高效液相色谱和电化学联用检测法,但存在灵敏度低,样本需求量大,前处理时间长,组分干扰强等弊端,无法满足临床检测需求。基于免疫检测方法由于交叉反应和非特异性的结合会导致检测准确度低,且不同的免疫测试,其结果不能相互比较,故不具备普适性。液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)是一种采用液相色谱分离质谱检测的分析技术,具有高灵敏度、高特异性和高选择性的特点。已有多篇文献报道应用LC-MS/MS检测儿茶酚胺代谢物,目前报道中一般采用非衍生离子交换SPE浓缩处理提取待测物,但采用该方法处理样本时,中、重度溶血样本会对待测物有不同程度的影响。此外,待测物极性大,难保留,采用非衍生法测定待测物,需要使用HILIC色谱柱增强保留,但临床一些样本中含有干扰峰,难以与待测物分离,使其检测结果异常。
对于儿茶酚胺代谢物的准确定量,除了提高检测方法的准确度和精密度外,另一亟待解决的问题是儿茶酚胺代谢物分析前的稳定性。因为儿茶酚胺类物质多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素极易被儿茶酚氧位甲基转移酶(COMT)分别代谢为3-MT、MN和NMN,导致样本中待测物含量的升高。此外儿茶酚胺代谢物的化学结构显示,其结构中带有一个酚羟基和一个带氨基的侧链,易在中性或碱性条件下被氧化成醌,导致待测物含量降低。因此,患者样本中儿茶酚胺代谢物浓度在分析前会发生不同程度的升高或降低。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,提供了一种血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法和组合稳定剂及其应用。该检测方法首先通过向采血管中添加组合稳定剂,保证分析前样本的稳定性,其次通过对样本进行衍生化并在衍生化过程中加入衍生稳定剂以提高衍生化效率,提高了检测灵敏度、特异性、检测通量及检测准确度。
具体地,通过以下几个方面的技术方案实现了本发明:
在第一个方面中,本发明提供了一种血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法,包括以下步骤:
(1)采集患者全血样本3~4mL置于含有抗凝剂的采血管中;
(2)向上述采血管中加入9~11μL组合稳定剂,再将采血管轻轻颠倒数次混匀;
(3)将步骤(2)混匀后的采血管置于3000rpm,25℃,离心分离10min,取上清液置于1.5mLEP管中,得待测血浆样本;
(4)取步骤(3)得到的待测血浆样本置于离心管中,加入10~20μL内标工作溶液混合,再加入300~900μL沉淀剂进行蛋白沉淀,经离心分离,得上清液;
(5)将步骤(4)得到的上清液中依次加入5~10μL衍生稳定剂水溶液、50~200μL衍生剂的乙腈溶液及100~300μL缓冲液,混合后在温度为30~90℃进行衍生化反应,反应时间为5~30min,得到衍生化样本;
(6)将步骤(5)得到的衍生化样本加入经甲醇活化、去离子水平衡的固相萃取小柱中进行过柱,经淋洗、洗脱,收集洗脱液,再经离心分离,得上清液;
(7)将步骤(6)得到的上清液进行LC-MS/MS检测;
(8)将步骤(7)检测得到的待测血浆样本中儿茶酚胺代谢物峰面积与内标峰面积的比值代入到标准曲线方程中,计算得到待测血浆样本中儿茶酚胺代谢物的浓度;
其中,所述组合稳定剂由以下质量分数的组分组成:抗坏血酸0.5%~2%、5-羟基阿魏酸0.15%~1%、甲酸0.5~2%以及纯水,所述纯水补足至100%;
上述步骤(5)中所述的衍生稳定剂为L-抗坏血酸,L-抗坏血酸水溶液的浓度为0.05%~0.2%;
所述儿茶酚胺代谢物为甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和3-甲氧酪胺。
上述步骤(4)中:
所述的内标工作溶液是将甲氧基肾上腺素-d3、甲氧基去甲肾上腺素-d3及3-甲氧酪胺-d4混合后,用含0.1%~0.5%的谷胱甘肽的50%乙腈水溶液稀释制得的。
所述的沉淀剂为乙腈、甲醇或甲醇与乙腈的混合溶液。
上述步骤(5)中:
所述的衍生剂为丹磺酰氯,丹磺酰氯的乙腈溶液的浓度为1~10mg/mL。
所述的缓冲液选自Na2CO3-NaHCO3、Na2HPO4-NaH2PO4、K2HPO4-KH2PO4中的一种,pH值为8~13。
上述步骤(6)中:
所述的固相萃取小柱的填料为C8、C18。
所述的淋洗是用淋洗液1、2分别先后淋洗;所述的淋洗液1选自含0.1%甲酸水溶液、乙腈-水(1:9,v/v)、甲醇-水(1:9,v/v)中的一种,淋洗液1用量为100~300μL;所述的淋洗液2选自50%乙腈水溶液、乙腈、甲醇中的一种,淋洗液2用量为20~100μL。
所述的洗脱用的洗脱液选自含体积分数为0.1%~0.3%甲酸的甲醇、含体积分数为0.1%~0.3%甲酸的乙腈水(8:2,v/v)溶液、含体积分数为0.1%~0.3%甲酸的乙腈中的一种,洗脱液用量为100~300μL。
上述步骤(7)中:
所述液相色谱的条件为:
色谱柱:ACQUITY UPLC BEH Phenyl,1.7μm,2.1×50mm;柱温40℃;进样室温度10℃;进样量5μL;以流动相A和流动相B进行梯度洗脱,所述流动相A为0.5~5mmol/L甲酸铵水溶液,所述流动相B为乙腈溶液,梯度洗脱程序如下:
所述质谱参数为:
离子化模式:ESI+;气帘气(CUR):30psi;碰撞气(CAD):9psi;喷雾电压(IS):5500V;温度(TEM):450℃;Gas1:60psi;Gas2:60psi;多反应检测(MRM)。
上述步骤(8)中,所述标准曲线方程的建立包括以下步骤:
1)将儿茶酚胺代谢物甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和3-甲氧酪胺的标准品用含0.1%~0.5%的谷胱甘肽的50%乙腈水溶液稀释到若干不同浓度,每个浓度的标准品溶液中加入所述的组合稳定剂,标准品溶液与组合稳定剂的体积比为3~4mL:9~11μL;然后加入内标工作溶液混合,再加入沉淀剂进行蛋白沉淀,经离心分离,得上清液;
2)将步骤1)得到的上清液采用上述步骤(5)、上述步骤(6)依次进行相同的处理操作,得若干标样,标样进行LC-MS/MS检测;
3)将步骤2)得到的标准品系列样本中,以待测物峰面积和内标峰面积比值(y)为纵坐标,待测物浓度(x)为横坐标,进行线性回归,权重为1/x2,得标准曲线方程。
在第二个方面中,本发明提供了一种组合稳定剂,所述组合稳定剂由以下质量分数的组分组成:抗坏血酸0.5%~2%、5-羟基阿魏酸0.15%~1%、甲酸0.5~2%、以及纯水,所述纯水补足至100%。
在第三个方面中,本发明提供了一种上述组合稳定剂在血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测中的应用,所述的组合稳定剂用于稳定血浆中的儿茶酚胺代谢物。
本发明相对于现有技术,具有以下有益效果:
(1)本发明提供的组合稳定剂,既能避免血浆中儿茶酚胺代谢物自身氧化降解,同时又能避免其他内源性物质的转化,保证了分析前样本的稳定性,解决了现有条件下儿茶酚胺代谢物样本采集后仅能在采血管中短时间放置的问题,提高了检测结果的准确度。
(2)本发明提供的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法,通过对样本进行衍生化,改变了待测物的性质。与非衍生方法相比,降低了待测物的极性,使得待测物在色谱柱上的保留增强,能够与样本中复杂的干扰峰分离,且分析时间短,样本通量高。其次,经衍生化后的结构中含有伯胺基团,能够有效增加待测物的离子化效率,提高了检测灵敏度。
(3)本发明提供的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法,通过对样本进行衍生化过程中加入衍生稳定剂L-抗坏血酸,能够显著提高衍生化效率,提高了检测灵敏度,三种待测物的响应可提高4~8倍左右。并且,该检测方法进样量仅需5μL,即可同时对血浆中甲氧基肾上腺素(MN)、甲氧基去甲肾上腺素(NMN)及3-甲氧酪胺(3-MT)进行准确定量,减小了大体积进样时产生的溶剂效应,以及对色谱柱及仪器造成的污染。
(4)本发明提供的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法,该方法分别通过蛋白沉淀、衍生化及固相萃取等多步前处理步骤,较大程度上去除了血浆样本中复杂的干扰物质,有效避免了溶血样本对于检测结果的影响,提高了临床异常溶血样本的检测准确性。因此,采用本发明的检测方法能够为嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PPGL)的诊断提供更为及时且准确的参考依据。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1为血浆样本中甲氧基肾上腺素及其内标的离子流色谱图。
图2为血浆样本中甲氧基去甲肾上腺素及其内标的离子流色谱图。
图3为血浆样本中3-甲氧酪胺及其内标的离子流色谱图。
图4为本发明衍生化条件下待测物与干扰峰分离情况及非衍生化条件下待测物与干扰峰分离情况。其中图A中MN保留时间为2.37min,干扰峰保留时间为2.30min;图B中MN保留时间为2.58min,干扰峰保留时间为2.23min。
图5为本发明衍生化过程中未加衍生稳定剂与添加衍生稳定剂后的三种儿茶酚胺代谢物离子强度比较色谱图。其中图A为添加衍生稳定剂的离子强度色谱图;图B为未添加衍生稳定剂的离子强度色谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为市售产品。
实施例1
一种血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法,包括以下步骤:
(1)将儿茶酚胺代谢物甲氧基肾上腺素(MN)、甲氧基去甲肾上腺素(NMN)及3-甲氧酪胺(3-MT)的标准品用含0.2%的谷胱甘肽的50%乙腈水溶液稀释到表1所示的浓度:
表1:不同浓度的标准品溶液
(2)前处理试剂的配制
沉淀剂:甲醇-乙腈(1:1)
衍生剂溶液:2mg/mL丹磺酰氯的乙腈溶液
缓冲液:Na2CO3-NaHCO3,pH值为11
衍生稳定剂溶液:0.2%抗坏血酸水溶液
内标工作溶液:将甲氧基肾上腺素-d3、甲氧基去甲肾上腺素-d3及3-甲氧酪胺-d4混合后,用含0.2%的谷胱甘肽的50%乙腈水溶液稀释制得
活化液:甲醇
平衡液:去离子水
淋洗液1:0.1%甲酸水溶液
淋洗液2:50%乙腈水溶液
洗脱液:含0.2%甲酸的80%乙腈水溶液
(3)采集患者全血样本3mL置于含有抗凝剂的采血管中,加入9μL由抗坏血酸1%、5-羟基阿魏酸0.5%、甲酸0.5%及纯水组成的组合稳定剂,再将采血管轻轻颠倒数次混匀;然后将混匀后的采血管置于3000rpm,25℃,离心分离10min,取上清液,得待测血浆样本;
(4)将上述不同浓度的标准品溶液中分别加入由抗坏血酸1%、5-羟基阿魏酸0.5%、甲酸0.5%及纯水组成的组合稳定剂,混合均匀,标准品溶液与组合稳定剂的体积比为1mL:3μL;
(5)样本前处理过程
1)蛋白沉淀
分别取上述步骤(4)得到的不同浓度的标准品溶液、上述步骤(3)得到的待测血浆样本各300μL加入不同的1.5mLEP管中,再分别加入15μL内标工作溶液,涡旋混匀后,加入600μL沉淀剂,涡旋混匀,4℃,15000rpm,离心分离5min。
2)衍生化
各取步骤1)离心分离后上清800μL,依次加入10μL衍生稳定剂水溶液、200μL衍生剂溶液及200μL缓冲液,涡旋混匀,置于70℃条件下,衍生化反应5min。
3)固相萃取
(a)96孔固相萃取板活化、平衡
向96孔固相萃取板各孔中加入300μL甲醇,使其自然流干,再向96孔萃取板各孔中加入300μL去离子水,使其自然流干。
(b)上样
向活化平衡后的96孔固相萃取板对应孔中,加入衍生化后样本溶液,使其自然流干。
(c)淋洗
向96孔固相萃取板对应孔中加入300μL淋洗液1,使其自然流干,再向96孔萃取板各孔中加入100μL淋洗液2,使其自然流干。
(d)洗脱
将96孔固相萃取板与新的96孔收集板组合,向96孔固相萃取板对应孔中加入200μL洗脱液,使其自然流干,然后使用正压装置提供一定压力,使其快速压干。
将收集的洗脱液置于离心机中,4℃,15000rpm,离心分离5min,取上清于96孔进样板中,封膜,上机检测。
4)上机检测
配制流动相A:1000mL去离子水中,加入0.315g甲酸铵,超声混匀,待用。
配制流动相B:1000mL乙腈溶液,超声,待用。
(a)液相色谱条件
采用超高效液相色谱串联质谱检测***:AB SCIEX Triple QuadTM 4500MD色谱柱:ACQUITYUPLC BEH Phenyl 1.7um(2.1*50mm)
柱温:40℃
进样室温度:10℃;
进样量:5μL
梯度洗脱程序如表2所示:
表2:梯度洗脱程序
(b)质谱参数为
离子化方式:正离子电喷雾离子源(ESI+);
扫描模式:多反应离子监测模式(MRM);
Curtain Gas(CUR):30psi;
Collision Gas(CAD):9psi;
IonSpray Voltage(IS):5500V;
Temperature(TEM):450℃;
Gas1:60psi;
Gas2:60psi;
化合物的具体质谱参数如表3所示:
表3:化合物的质谱参数
*为定量离子
5)检测结果计算
在标准品系列样本中,以待测物峰面积和内标峰面积比值(y)为纵坐标,待测物浓度(x)为横坐标,进行线性回归,权重为1/x2,得标准曲线方程。将待测血浆样本中儿茶酚胺代谢物峰面积和内标峰面积的比值代入标准曲线方程中,计算得到待测血浆样本中儿茶酚胺代谢物的浓度,检测结果如表4所示,儿茶酚胺代谢物的离子流色谱图如图1~图3所示。
表4:LC-MS/MS法检测血浆中儿茶酚胺代谢物浓度结果
对比例1
血浆中儿茶酚胺代谢物的非衍生化检测方法,步骤包括:
非衍生化前处理方法:
取待测血浆样本300μL加入1.5mL EP管中,加入15μL内标工作溶液,涡旋混匀后,加入30μL 1%氨水稀释,涡旋混匀,进行固相萃取。固相萃取过程同实施例1。
非衍生化色谱条件:
色谱柱:Waters,ACQUITYUPLC@BEH HILIC,2.1×100mm,1.7μm
流动相:(A)10mmol/L甲酸铵,水-乙腈(95:5,v/v),调pH为3;(B)乙腈溶液柱温:35℃;
进样室温度:10℃;
进样量:10μL
梯度洗脱程序如表5所示:
表5:梯度洗脱程序
非衍生化质谱条件:
离子化方式:正离子电喷雾离子源(ESI+);
扫描模式:多反应离子监测模式(MRM);
Curtain Gas(CUR):30psi;
Collision Gas(CAD):9psi;
IonSpray Voltage(IS):5500V;
Temperature(TEM):450℃;
Gas1:60psi;
Gas2:60psi;
化合物的具体质谱参数如表6所示:
表6:化合物的质谱参数
*为定量离子
本发明实施例1的衍生化处理方法检测色谱图与对比例1的非衍生化处理方法检测色谱图对比如图4所示。从图4可以看出,通过对样本进行衍生化,改变了待测物的性质。与非衍生方法相比,降低了待测物的极性,使得待测物在色谱柱上的保留增强,能够与样本中复杂的干扰峰分离,且分析时间短,样本通量高,还提高了检测灵敏度。
实施例2
本发明衍生化过程中加入衍生稳定剂,以提高衍生化效率,具体提高效果见表7和图5所示。
表7:衍生化过程中衍生稳定剂对待测物及内标离子强度的影响
从表7和图5可以看出,通过对样本进行衍生化过程中加入衍生稳定剂L-抗坏血酸,能够显著提高衍生化效率,提高了检测灵敏度,三种待测物的响应可提高4~8倍左右。
实施例3
血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法的准确度和精密度考察,结果如表8所示。
表8:LC-MS/MS法检测血浆中儿茶酚胺代谢物浓度的准确度和精密度考察
从表8可以看出,本发明提供的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法,具有高的检测准确度和精密度。
实施例4
血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法的异常样本干扰数据考察,干扰物浓度如表9所示,干扰结果如表10所示。
表9:血浆样本中重度干扰物浓度
表10:儿茶酚胺代谢物液相色谱串联质谱检测方法重度干扰结果
从表10可以看出,实验组中重度结合黄疸、重度非结合黄疸、重度脂血以及重度溶血血浆样本与对照组血浆样本,计算浓度偏差均<±15%,表明上述干扰血浆样本对测定结果均无干扰,满足预期用途要求。
实施例5
一种用于提高血浆中儿茶酚胺代谢物稳定性的组合稳定剂及其稳定效果
一种组合稳定剂,其由抗坏血酸1%、5-羟基阿魏酸0.5%、甲酸0.5%及纯水组成。其稳定化效果如表11、表12所示。
表11:儿茶酚胺代谢物离心前6h稳定性数据及检验结果
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表12:儿茶酚胺代谢物离心后16h稳定性数据及检验结果
从表11、表12可以看出,在儿茶酚胺代谢物中添加组合稳定剂后,儿茶酚胺代谢物在采血管离心前可在室温条件下稳定放置至少6h,离心后可在采血管中稳定放置16h。说明本发明的组合稳定剂能够显著提高血浆中儿茶酚胺代谢物的稳定性,保证分析前样本的稳定性,提高了检测结果的准确度。
显然,上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定。本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样,倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (9)
1.一种血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)采集患者全血样本3~4mL置于含有抗凝剂的采血管中;
(2)向上述采血管中加入9~11μL组合稳定剂,再将采血管轻轻颠倒数次混匀;
(3)将步骤(2)混匀后的采血管置于3000rpm,25℃,离心分离10min,取上清液置于1.5mLEP管中,得待测血浆样本;
(4)取步骤(3)得到的待测血浆样本置于离心管中,加入10~20μL内标工作溶液混合,再加入300~900μL沉淀剂进行蛋白沉淀,经离心分离,得上清液;
(5)将步骤(4)得到的上清液中依次加入5~10μL衍生稳定剂水溶液、50~200μL衍生剂的乙腈溶液和100~300μL缓冲液,混合后在温度为30~90℃进行衍生化反应,反应时间为5~30min,得到衍生化样本;
(6)将步骤(5)得到的衍生化样本加入经甲醇活化、去离子水平衡的固相萃取小柱中进行过柱,经淋洗、洗脱,收集洗脱液,再经离心分离,得上清液;
(7)将步骤(6)得到的上清液进行LC-MS/MS检测;
(8)将步骤(7)检测得到的待测血浆样本中儿茶酚胺代谢物峰面积与内标峰面积的比值代入到标准曲线方程中,计算得到待测血浆样本中儿茶酚胺代谢物的浓度;
其中,所述组合稳定剂由以下质量分数的组分组成:抗坏血酸0.5%~2%、5-羟基阿魏酸0.15%~1%、甲酸0.5~2%以及纯水,所述纯水补足至100%;
上述步骤(5)中所述的衍生稳定剂为L-抗坏血酸,L-抗坏血酸水溶液的浓度为0.05%~0.2%;
所述儿茶酚胺代谢物为甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和3-甲氧酪胺。
2.根据权利要求1所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法,其特征在于,上述步骤(4)中:所述的内标工作溶液是将甲氧基肾上腺素-d3、甲氧基去甲肾上腺素-d3及3-甲氧酪胺-d4混合后,用含0.1%~0.5%的谷胱甘肽的50%乙腈水溶液稀释制得的;所述的沉淀剂为乙腈、甲醇或甲醇与乙腈的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法,其特征在于,上述步骤(5)中,所述的衍生剂为丹磺酰氯,丹磺酰氯的乙腈溶液的浓度为1~10mg/mL;所述的缓冲液选自Na2CO3-NaHCO3、Na2HPO4-NaH2PO4、K2HPO4-KH2PO4中的一种,pH值为8~13。
4.根据权利要求1所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法,其特征在于,上述步骤(6)中,所述的固相萃取小柱的填料为C8、C18;
所述的淋洗是用淋洗液1、2分别先后淋洗;所述的淋洗液1选自含0.1%甲酸水溶液、乙腈-水(1:9,v/v)、甲醇-水(1:9,v/v)中的一种,淋洗液1用量为100~300μL;所述的淋洗液2选自50%乙腈水溶液、乙腈、甲醇中的一种,淋洗液2用量为20~100μL;
所述的洗脱用的洗脱液选自含体积分数为0.1%~0.3%甲酸的甲醇、含体积分数为0.1%~0.3%甲酸的乙腈水(8:2,v/v)溶液、含体积分数为0.1%~0.3%甲酸的乙腈中的一种,洗脱液用量为100~300μL。
5.根据权利要求1所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法,上述步骤(7)中,所述液相色谱的条件为:
色谱柱:ACQUITY UPLC BEH Phenyl,1.7μm,2.1×50mm;柱温40℃;进样室温度10℃;以流动相A和流动相B进行梯度洗脱,所述流动相A为0.5~5mmol/L甲酸铵水溶液,所述流动相B为乙腈溶液,梯度洗脱程序如下:
进样量5μL。
6.根据权利要求1所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法,其特征在于,上述步骤(7)中,所述质谱参数为:离子化模式:ESI+;气帘气(CUR):30psi;碰撞气(CAD):9psi;喷雾电压(IS):5500V;温度(TEM):450℃;Gas1:60psi;Gas2:60psi;多反应检测(MRM)。
7.根据权利要求1所述的血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法,其特征在于,上述步骤(8)中,所述标准曲线方程的建立包括以下步骤:
1)将儿茶酚胺代谢物甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和3-甲氧酪胺的标准品用含0.1%~0.5%的谷胱甘肽的50%乙腈水溶液稀释到若干不同浓度,每个浓度的标准品溶液中加入所述的组合稳定剂,标准品溶液与组合稳定剂的体积比为3~4mL:9~11μL;然后加入内标工作溶液混合,再加入沉淀剂进行蛋白沉淀,经离心分离,得上清液;
2)将步骤1)得到的上清液采用上述步骤(5)、上述步骤(6)依次进行相同的处理操作,得若干标样,标样进行LC-MS/MS检测;
3)将步骤2)得到的标准品系列样本中,以待测物峰面积和内标峰面积比值(y)为纵坐标,待测物浓度(x)为横坐标,进行线性回归,权重为1/x2,得标准曲线方程。
8.一种组合稳定剂,其特征在于,所述组合稳定剂由以下质量分数的组分组成:抗坏血酸0.5%~2%、5-羟基阿魏酸0.15%~1%、甲酸0.5~2%、以及纯水,所述纯水补足至100%。
9.权利要求9所述的组合稳定剂在血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测中的应用,其特征在于,所述的组合稳定剂用于稳定血浆中的儿茶酚胺代谢物。
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