CN112903836B - 体外培育熊胆粉中异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了体外培育熊胆粉中异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷的测定方法，包括如下步骤：称取体外培育熊胆粉样品按照50‑200mg/5ml的比例置于水中，然后振荡8‑15分钟至样品完全溶解；将上述处理得到的溶液上样于活化的亲水亲脂平衡固相萃取柱，冲洗，洗脱，收集洗脱液，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；将上述供试品溶液注入液相色谱‑质谱仪进行检测。本发明提供的测定方法通过对净化、检测步骤中的条件以及参数进行了调整和优化，具有中间精密度良好、准确度高、重复性良好的优点，此外，以稀释10倍的浓度作为该方法检出限，方法检出限为0.68mg/kg，因此为体外培育熊胆粉中IPTG残留量的检测提供了可靠易操作的方法，促进了对体外培育熊胆粉的安全性把控。

Description

体外培育熊胆粉中异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的测定 方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及体外培育熊胆粉中异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的测定方法。

背景技术

熊胆，由熊科动物黑熊或棕熊干燥胆囊胆汁得到，具有清热、平肝、明目的功效。熊胆是四大名贵动物药之一，有2000余年的入药历史，有大量的处方都含有熊胆成分。我国每年熊胆粉产量约30吨，仍然满足不了人类健康的需求。目前高端熊胆粉供需矛盾的日益突出和低端原料用熊胆粉市场需求的持续增加，使得熊胆粉的价格节节攀升，市场价格已经超过了5000元/kg。更为严峻的是，国内外动物保护组织对活熊取胆的长期抵制，给国内熊胆粉的生产和相关产业的发展带来了前所未有的阻力。因此，加快人工熊胆的研发是促进熊胆产业可持续发展的关键。申请号为201410588581.5的现有专利公开了一种人工熊胆粉及其制备方法，具体生产了一种体外培育(生物转化)熊胆粉，其以禽类胆粉为原料，通过体外模拟胆汁酸肝肠循环，采用两步酶促法与双酶联用循环转化技术对禽胆粉进行生物转化获得，其原料来源广泛易得，不需要再添加其他化学物质，可以促进熊胆产业健康发展。

但上述体外培育熊胆粉制备过程所需的关键酶菌体--A酶菌体和B酶菌体是通过7α-HSDH和7β-HSDH两个重组质粒转化到宿主菌E.coli BL21(DE3)中，经抗性筛选并通过多级培养后获得的。IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)是A酶菌体/B酶菌体诱导外源基因表达的诱导剂。为加强对体外培育(生物转化)熊胆粉的安全性把控，需对发酵过程中的主要添加物，特别是IPTG进行含量限度检查，但目前未有检测体外培育熊胆粉中IPTG残留量的方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了体外培育熊胆粉中异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的测定方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了体外培育熊胆粉中异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的测定方法，包括如下步骤：

步骤一，溶解样品：称取体外培育熊胆粉样品按照50-200mg/5ml的比例置于水中，然后振荡8-15分钟至样品完全溶解；

步骤二，净化处理：将步骤一处理得到的溶液上样于活化的亲水亲脂平衡固相萃取柱，冲洗，洗脱，收集洗脱液，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；

步骤三，将上述供试品溶液注入液相色谱-质谱仪进行检测。

进一步地，上述固相萃取柱为亲水亲脂平衡固相萃取柱或强阴离子交换反相吸附填料固相萃取柱。

进一步优选地，上述固相萃取柱为Waters Oasis HLB固相萃取柱，其规格为500mg/6cc。

进一步地，步骤二中依次采用甲醇和水对上述亲水亲脂平衡固相萃取柱进行活化；甲醇和水的体积比为1:1。

进一步地，步骤二中采用水进行冲洗，采用甲醇溶液进行洗脱。

进一步优选地，步骤二中采用20％的甲醇溶液进行洗脱两次。

进一步地，步骤三中检测采用Waters CORTECS T3色谱柱，其规格为100mm×2.1mm，2.7μm。

进一步地，液相色谱采用的流动相是水，流速为0.30ml/min。

进一步地，质谱检测的条件为：采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)负离子模式下多反应监测(MRM)；多反应监测的离子对及质谱参数如下：

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明提供的体外培育熊胆粉中异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的测定方法通过对净化、检测步骤中的条件以及参数进行了调整和优化，具有中间精密度良好、准确度高、重复性良好的优点，此外，以稀释10倍的浓度作为该方法检出限，方法检出限为0.68mg/kg，因此为体外培育熊胆粉中IPTG残留量的检测提供了可靠易操作的方法，促进了对体外培育(生物转化)熊胆粉的安全性把控。

附图说明

图1为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的MRM色谱图。

具体实施方式

针对申请号为201410588581.5的现有专利中的人工熊胆粉，本发明提供了体外培育熊胆粉中异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的测定方法，包括如下步骤：

步骤一，溶解样品：称取样品置于水中，然后振荡至样品完全溶解；

步骤二，净化处理：将步骤一处理得到的溶液上样于活化的亲水亲脂平衡固相萃取柱，冲洗，洗脱，收集洗脱液，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；

步骤三，将上述供试品溶液注入液相色谱-质谱仪进行检测。

在本发明一优选的实施方式中，步骤一中样品与水的比例为50-200mg/5ml；更优选为100mg/5ml。

在本发明一优选的实施方式中，步骤一中振荡的时间为8-15分钟；优选为8-10分钟；更优选为10分钟。

在本发明一优选的实施方式中，上述固相萃取柱为亲水亲脂平衡固相萃取柱或强阴离子交换反相吸附填料固相萃取柱；优选为亲水亲脂平衡固相萃取柱；更优选为WatersOasis HLB固相萃取柱，其规格为500mg/6cc。

在本发明一优选的实施方式中，步骤二中依次采用甲醇和水对上述亲水亲脂平衡固相萃取柱进行活化；甲醇和水的体积比为1:1。

在本发明一优选的实施方式中，步骤二中采用水进行冲洗，采用甲醇溶液进行洗脱；优选采用20％的甲醇溶液进行洗脱两次。

在本发明一优选的实施方式中，步骤三中检测采用Waters CORTECS T3色谱柱，其规格为100mm×2.1mm，2.7μm。

在本发明一优选的实施方式中，液相色谱检测以水为流动相，至待测成分全部出峰后以乙腈-水(98:2)充分清洗色谱柱；流速0.30ml/min。

在本发明一优选的实施方式中，质谱检测的条件为：采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)负离子模式下多反应监测(MRM)；多反应监测的离子对及质谱参数如下表1：

表1质谱监测的离子对及质谱参数

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例对体外培育熊胆粉中异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的测定方法中的条件和参数进行探究，具体的策略如下：

1.提取方法

取体外培育(生物转化)熊胆粉粉末100mg，精密称定，置15ml离心管中，加水5ml，振荡10分钟至完全溶解。

2.净化方法

以此溶液直接进样测定，结果回收率约为60％。推测原因为，熊胆粉基质成分复杂，易产生基质效应，从而影响目标化合物的响应。故而通过固相萃取柱净化的方式以降低基质影响，考察两种固相萃取柱：(1)利用待测物(中性)与熊胆粉基质(酸性)的pH差别采用强阴离子交换反相吸附填料固相萃取柱(Waters Oasis MAX)；(2)利用待测物(强极性化合物)与熊胆粉基质的极性差别采用亲水亲脂平衡固相萃取柱(Waters Oasis HLB)。

(1)强阴离子交换反相吸附填料固相萃取柱净化：取上述溶液全部上样于预先依次用4ml甲醇和4ml水活化的Waters Oasis MAX固相萃取柱(规格500mg/6cc)；用2ml 5％氨水冲洗盛提取液的离心管，将冲洗液上样，弃去洗液；再加入4ml甲醇洗脱，收集洗脱液，滤过，取续滤液，进样测定。结果加样回收率为59％。

(2)反相固相萃取柱净化：经反复摸索固相萃取上样、清洗、洗脱溶剂，确定方法为：取上述溶液全部上样于预先依次用4ml甲醇和4ml水活化的Waters Oasis HLB固相萃取柱(规格500mg/6cc)；用2ml去离子水冲洗盛提取液的离心管，将冲洗液上样，弃去洗液；再分两次加入20％甲醇共6ml洗脱，收集洗脱液，滤过，取续滤液，进样测定。结果加样回收率为76％。

故最终采用Waters Oasis HLB固相萃取柱进行净化处理，并对供试品溶液进行稀释以降低基质效应，进一步提高回收率。

此外，对样品取样量进行了考察。比较四种取样量：100mg、250mg、500mg、1000mg，结果仅100mg取样量回收率较好，其他大取样量回收率均低于10％。表明该规格固相萃取柱仅能承载100mg熊胆粉，增大取样量则过载；若进一步提高固相萃取柱规格，则检测成本过高。故最终样品取样量为100mg。

3.色谱质谱条件

3.1色谱条件

以甲醇-水(50:50)为流动相，IPTG保留时间为0.583min；以水为流动相时，IPTG保留时间为5.958min且峰形良好。故选择采用Waters CORTECS T3(100mm×2.1mm，2.7μm)色谱柱；以水为流动相；流速0.30ml/min。

在大批次进样时，发现部分样品重复性较差，推测样品中存在部分保留较强残留于色谱柱中的成分，与后续样品共馏出产生基质增强效应，故以水为流动相洗脱至待测成分出峰后，以乙腈-水(98:2)充分清洗色谱柱，情况得以改善。

3.2质谱条件

采用三重四极杆质谱检测器，电喷雾离子化(ESI)负离子模式下多反应监测(MRM)，监测离子对及参数如表1所示。IPTG的MRM色谱图见图1。

实施例2

本实施例在实施例1的基础上提供一种异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的测定方法，其包括如下步骤：

步骤一，对照品溶液的制备：取异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷对照品适量，精密称定，加水制成200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml的系列溶液，作为对照品溶液；

步骤二，供试品溶液的制备：取样品粉末0.1g，精密称定，置离心管中，加水5ml，振荡10分钟至完全溶解，溶液上样于亲水亲脂平衡固相萃取柱(推荐Waters Oasis HLB固相萃取柱，规格500mg/6cc，预先依次用4ml甲醇和4ml水活化)，用2ml水清洗，弃去清洗液，再用20％甲醇洗脱两次，每次3ml，合并洗脱液至10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

步骤三，分别精密吸取上述对照品溶液和供试品溶液各5μl，注入液相色谱-质谱仪，测定，其中色谱和质谱的条件按照实施例1中所设定的。

供试品溶液若检出与对照品保留时间相同的色谱峰，且所选择的离子丰度比与相当浓度对照品溶液的离子丰度比符合下表2规定，可判定具有该成分。

表2所选择的离子丰度比与相当浓度对照品溶液的离子丰度比对照表

以对照品定量离子对峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线，从标准曲线上读出供试品溶液中异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度，计算，即得。

实施例3

本实施例对实施例2中提供的方法进行方法学验证，具有验证的性能参数与方法如下：

(1)专属性

因体外培育(生物转化)熊胆粉均检测出IPTG，无空白基质样品，故取等体积去离子水按供试品溶液的制备方法制备空白溶液，进样测定，结果无干扰。

(2)线性

取IPTG对照品适量，精密称定，加水制成242.4520ng/ml、121.2260ng/ml、60.6130ng/ml、24.2452ng/ml、12.1226ng/ml的系列溶液，作为对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液5μl，注入液相质谱仪，记录峰面积，以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果在12.1226～242.4520ng/ml范围内呈良好的线性关系，y＝133.723838x+358.760359，r＝0.9984。

(3)仪器精密度

精密吸取对照品溶液(242.4520ng/ml)5μl，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD，结果见表3。

表3对照品溶液平行试验结果

(4)稳定性

取同一供试品溶液，分别于制备好后放置0h、8h、15h时进样测定。结果表明，供试品溶液在15小时内基本稳定，结果见表4。

表4稳定性试验结果

(5)重复性

取同一样品，依上述方法操作，一式6份，制备6份供试品溶液，进样测定，计算浓度/称样量，结果见表5。

表5重复性试验结果

根据中国药典2020年版四部通则<9101>，样品中待测定成分含量为10ppm级别时，重复性限度为6％。因此，实施例2提供的方法的重复性良好。

(6)准确度

取体外培育(生物转化)熊胆粉(含量7.2392mg/kg)50mg，一式六份，精密称定，分别精密加入对照品溶液(232.4560ng/ml)1ml及水4ml，同供试品溶液的制备操作，即得加样溶液。进样5μl测定，计算加样回收率，结果见表6。

表6准确度试验结果

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根据中国药典2015年版四部通则<9101>，样品中待测定成分含量为10ppm级别时，回收率限度为80～115％，因此，本次试验回收率符合要求。

(7)检出限

因市场提供的体外培育(生物转化)熊胆粉中IPTG含量均较高，故采用浓度为6.7587ng/ml供试品溶液稀释2倍、5倍、10倍，均仍有检出。以稀释10倍的浓度作为本方法检出限，方法检出限为0.68mg/kg。

(8)中间精密度

为考察随机变动因素对精密度的影响，按照拟订的方法，由不同的分析人员在不同的日期、不同仪器设备对3批样品进行了含量测定，结果见表7。

表7中间精密度结果

结果表明：由不同的分析人员在不同的日期及不同仪器设备上测得的结果基本一致，方法的中间精密度良好。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (5)

1.体外培育熊胆粉中异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，溶解样品：称取体外培育熊胆粉样品按照50-200mg/5ml的比例置于水中，然后振荡8-15分钟至样品完全溶解；

步骤二，净化处理：将步骤一处理得到的溶液上样于活化的亲水亲脂平衡固相萃取柱，依次采用甲醇和水对所述亲水亲脂平衡固相萃取柱进行活化，采用水进行冲洗，采用甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，滤过，取续滤液，得到供试品溶液；

步骤三，将所述供试品溶液注入液相色谱-质谱仪进行检测；

步骤三中检测采用Waters CORTECS T3色谱柱，其规格为100mm×2.1mm，2.7 μm；液相色谱采用的流动相是水，流速为0.30ml/min。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述固相萃取柱为Waters Oasis HLB固相萃取柱，其规格为500mg/6cc。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤二中依次采用体积比为1:1的甲醇和水对所述亲水亲脂平衡固相萃取柱进行活化。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤二中采用20%的甲醇溶液进行洗脱两次。

5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，质谱检测的条件为：采用三重四极杆质谱检测器、电喷雾离子化负离子模式下多反应监测；所述多反应监测的离子对及质谱参数如下：

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