CN113433234B - 尿液中18-羟皮质醇的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种尿液中18‑羟皮质醇的检测方法。本发明的检测方法包括以下步骤：样品前处理：取尿液样本，与18‑羟皮质醇稳定同位素内标的工作液混合，再在所得混合液中加水稀释，混合后离心，取上清液作为待测样品溶液，注入高效液相色谱串联质谱仪测定18‑羟皮质醇的含量。本发明的检测方法前处理简单、快速、特异性强、试剂耗材成本低、易于规模化操作。

Description

尿液中18-羟皮质醇的检测方法
技术领域
本发明涉及18-羟皮质醇检测的技术领域，特别是涉及尿液中18-羟皮质醇的检测方法。
背景技术
原发性醛固酮增多症(Primary aldosteronism，PA)，简称原醛症，指肾上腺皮质球状带分泌过量的醛固酮而导致肾素-血管紧张素***受抑制，导致潴钠排钾、血容量增多，以高血压伴有或不伴有低血钾为主要临床表现的综合症。原醛症是继发性高血压的常见病因之一，在高血压人群中的发病率为10％左右。研究发现醛固酮过多会导致心肌肥厚、心力衰竭和肾功能受损。原醛症主要分为6个亚型，其中醛固酮瘤(aldosterone-producingadenoma，APA)和双侧肾上腺增生(Bilateral Adrenal Hyperplasia BAH)是占比较大的两种亚型，分别占35％和60％。
国外在临床研究原醛症时发现，尿液18-羟皮质醇(18-hydroxycortisol，18-OHF)的含量在糖皮质激素可抑制性醛固酮增多症(glucocorticoid suppressiblehyperaldosteronism，GSH)、APA和BAH上无明显重叠。因此18-OHF的测定有助于PA亚型的鉴别诊断，被认为是区分APA、GSH和其他亚型的新型标志物，同时还可作为APA的手术治疗效果评估的指标。
18-OHF的传统检测方法有气相色谱质谱法(GC-MS)、放射免疫法(RIA)、酶联免疫法(EIA)、时间分辨荧光法和高效液相色谱法(HPLC)，这些方法都存在前处理过程复杂且步骤繁琐，检测结果抗干扰能力差、检测耗时长、检测成本高等缺点。近年来，液相色谱串联质谱法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)也被运用于检测18-羟皮质醇18-OHF，相较于传统检测方法，液相色谱串联质谱法检测18-羟皮质醇具有灵敏度低、成本低、耗时短等优点。为去除样品蛋白干扰，检测前需要对样品进行前处理除杂，而目前已发表文献中所报道的前处理方法普遍为固相萃取法(Solid Phase Extraction,SPE)，但SPE方法存在步骤多、操作复杂、耗时长、试剂耗材成本高和污染环境等问题。
此外，18-OHF和6β-羟皮质醇都是人体内自然存在的化合物，两者具有相同的分子量，互为同分异构体，定量检测18-OHF时容易被内源性同分异构体6β-羟皮质醇干扰，导致18-OHF难以准确定量检测，因此需要开发出一种快速区分两种化合物以实现18-OHF准确定量检测的分析方法。
因此本领域技术人员迫切解决的一个技术问题就是：如何针对18-OHF，提供一种前处理简单、快速、特异性强、试剂耗材成本低、易于规模化操作的检测方法。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种前处理简单、快速、特异性强、试剂耗材成本低、易于规模化操作的尿液中18-羟皮质醇的检测方法。
具体技术方案如下：
尿液中18-羟皮质醇的检测方法，包括以下步骤：
样品前处理：取尿液样本，与18-羟皮质醇稳定同位素内标的工作液混合，再在所得混合液中加入水稀释，混合后离心，取上清液作为待测样品溶液，注入高效液相色谱串联质谱仪测定18-羟皮质醇的含量。
在其中一些实施例中，所述18-羟皮质醇稳定同位素内标的工作液的溶剂为甲醇、乙腈或乙醇。
在其中一些实施例中，所述18-羟皮质醇稳定同位素内标的工作液的溶剂为甲醇。
在其中一些实施例中，所述尿液样本与所述18-羟皮质醇稳定同位素内标的工作液的体积比为1:(1.5～2.5)，优选为1:2。
在其中一些实施例中，所述混合液与水的体积比为1:(1-5)，优先为1:(1-3)，进一步优选为3:7。
在其中一些实施例中，所述高效液相色谱串联质谱仪的色谱条件包括：
色谱柱：C18色谱柱；
柱温：(35±3)℃；
进样器温度：(15±2)℃；
进样量：(4±2)μL；
流速：0.3-0.5mL/min；
流动相为：流动相A为0.1wt％～0.3wt％甲酸的水溶液，流动相B为0.1wt％～0.3wt％甲酸的甲醇溶液，采用梯度洗脱。
在其中一些实施例中，所述高效液相色谱串联质谱仪的液相洗脱梯度为：
0～1min，流动相A的体积百分比为60～80％，流动相B的体积百分比为20～40％；
1～3.5min，流动相A的体积百分比由60～80％降低到30～40％，流动相B的体积百分比由20～40％升高到60～70％；
3.5～3.51min，流动相A的体积百分比由30～40％降低到0～20％，流动相B的体积百分比由60～70％升高到80～100％；
3.51～4.50min，流动相A的体积百分比为0～20％，流动相B的体积百分比为80～100％；
4.50～4.60min，流动相A的体积百分比由0～20％升高到60～80％，流动相B的体积百分比由80～100％降低到20～40％；
4.60～5.50min，流动相A的体积百分比为60～80％，流动相B的体积百分比为20～40％。
在其中一些实施例中，所述高效液相色谱串联质谱仪的液相洗脱梯度为：
0～1min，流动相A的体积百分比为(70±5)％，流动相B的体积百分比为(30±5)％；
1～3.5min，流动相A的体积百分比由(70±5)％降低到(35±5)％，流动相B的体积百分比由(30±5)％升高到(65±5)％；
3.5～3.51min，流动相A的体积百分比由(35±5)％降低到(10±5)％，流动相B的体积百分比由(65±5)％升高到(90±5)％；
3.51～4.50min，流动相A的体积百分比为(10±5)％，流动相B的体积百分比为(90±5)％；
4.50～4.60min，流动相A的体积百分比由(10±5)％升高到(70±5)％，流动相B的体积百分比由(90±5)％降低到(30±5)％；
4.60～5.50min，流动相A的体积百分比为(70±5)％，流动相B的体积百分比为(30±5)％。
在其中一些实施例中，所述高效液相色谱串联质谱仪的质谱条件包括：
电喷雾离子源，正离子模式，多反应监测模式。
在其中一些实施例中，离子源参数包括：气帘气：(33.0±2)psi，碰撞气：(7.0±0.2)psi，离子源电压：(5500±10)V，离子源温度：(540.0±10)℃，雾化气：(55.0±5)psi，辅助加热气：(60.0±5)psi。
在其中一些实施例中，所述内标为d4-18-OHF。
在其中一些实施例中，所述高效液相色谱串联质谱仪的质谱参数包括：
18-OHF：定量离子对379.2/267.2；
18-OHF：定性离子对379.2/285.2；
d4-18-OHF内标离子对383.3/271.2。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的发明人在对尿液中肾上腺皮质激素的测定研究中意外发现，尿液18-OHF的检测比较特殊，仅仅通过在尿液样本中加入内标的工作液混合、稀释后，就可以直接进行上机分析。
进一步地，同位素内标的工作液的溶剂为甲醇、乙腈或乙醇，采用纯有机溶剂作为内标溶剂，可利用其蛋白沉淀的功能对尿液中存在的少量蛋白质进行沉淀，故而实现了无需现有技术中的固相萃取方法(SPE)对样品进行前处理。本发明仅5个前处理步骤、30min内就可以在灵敏度、精密度、定量限、线性范围均满足临床应用要求的前提下，实现对尿液18-OHF的检测。本发明不仅大大节省了检测时间和检测步骤，实现了简单、快速、成本低且易于规模化的操作，同时使得检测通量更高，精密度更好，能够准确测定尿液18-OHF的含量。
进一步地，本发明的发明人还发现，液相条件对于实现尿液中高特异性地检测18-羟皮质醇具有很关键的影响，在本发明特定的液相条件，尤其是特定的液相洗脱程序下，结合本发明的其他步骤和工艺参数，最快速、最简单地实现了18-羟皮质醇与其同分异构体6β-羟皮质醇的分离(6β-羟皮质醇的保留时间为0.55min，而18-OHF的保留时间为2.2min)，实现了非常高的特异性，有效避免了6β-羟皮质醇对18-羟皮质醇定量的影响。并且总运行时间仅需5.5min，保留时间仅需2.2min。
附图说明
图1为临床样品色谱图；
图2为18-OHF线性回归曲线；
图3为18-OHF和6β-OHF的在同一个色谱条件中的出峰分离情况色谱图。
具体实施方式
本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
由于，血液和尿液等体液中含有蛋白，肾上腺皮质激素类容易与蛋白结合形成结合态，只有很少会以游离态的形式分布。因此，肾上腺皮质激素在进行液相检测上机前都需要进行样品前处理，使得待测化合物从样品中游离出来，便于定量检测。但是，不同的肾上腺皮质激素具有不同的理化性质，相应的前处理方法也不同，在进行试验验证前，研发人员没办法知道哪种肾上腺皮质激素应该适合哪种前处理方法。所以，通常而言，由于固相萃取法(SPE法)普适性较强，因此现有的18-羟皮质醇等肾上腺皮质激素的前处理方法普遍都使用固相萃取的方法。SPE法的前处理步骤包括取样，加内标，加水稀释，混匀、离心、SPE柱活化，SPE柱平衡，上样，淋洗，洗脱，氮吹，复溶共12个步骤，样品前处理过程十分复杂繁琐。SPE上样前，需要对SPE耗材(一般为SPE小柱或者96孔萃取板)进行活化和平衡，活化一般选用纯有机溶剂除去小柱内的杂质并使萃取剂填料舒展；平衡一般选用纯水或者样品溶剂使萃取柱填料的溶剂环境与目标分析物的溶液组成相似。固相萃取过程中，活化和平衡过程中，为尽量使填料完全舒展并浸润于平衡液中，所用溶剂应在重力作用下自然浸润萃取柱填料并从柱中滴落，故每一步耗时都较长，而上样、淋洗和洗脱步骤虽然可以采用加正压或者负压的方式加快液体滴落速度，但耗时仍然不短，此外，在将洗脱液氮吹复溶时也需要较长时间，在加热的情况下也需要1小时才能将洗脱液蒸发完毕，即使熟练且富有经验的技术员完成整个前处理操作仍需耗时3小时，工作量大且耗时长。
此外，固相萃取的前处理方法涉及到使用固相萃取板或者固相萃取小柱，都是一次性使用且成本较高。以固相萃取最常用的C18萃取柱为例，一盒(100个)萃取小柱的价格一般为1600元左右，在项目开发建立阶段就需消耗600-800个小柱，即在实验室搭建用固相萃取法处理样品的方法时，仅仅萃取柱这一项耗材，实验室所需承担的经济成本就至少高达1万元。且固相萃取各步骤中(活化、平衡、淋洗、洗脱)都需要比较多的溶剂，不仅检测的试剂耗材成本较高，还会对环境的造成污染。
本发明的发明人在对尿液中肾上腺皮质激素的测定研究中发现，18-OHF的检测十分特殊，仅仅通过在尿液样本中加入特定内标溶液(尤其是以甲醇作为溶剂的内标溶液)混合、稀释后，就可以直接进行上机分析，无需现有技术中需要用固相萃取法(SPE)对样品进行前处理。本发明仅5个前处理步骤、30min内就可以在灵敏度、精密度、定量限、线性范围均满足临床应用要求的前提下，实现对尿液18-OHF的检测。相比现有技术12步骤且超过3小时的样品处理时间，不仅大大节省了检测时间和检测步骤，简单、快速、成本低、易于规模化操作，并且检测通量更高，精密度更好。具体方案如下：
尿液中18-羟皮质醇的检测方法，包括以下步骤：
样品前处理：取尿液样本，与18-羟皮质醇稳定同位素内标的工作液混合，再在所得混合液中加水稀释，混合后离心，取上清液作为待测样品溶液，注入高效液相色谱串联质谱仪测定18-羟皮质醇的含量。
优选地，所述18-羟皮质醇稳定同位素内标的工作液的溶剂为甲醇、乙腈或乙醇。选择这些溶剂时，发现可以与尿液样本水溶液中的蛋白结合并使其沉淀。
其中，本发明选择d4-18-OHF作为内标，保证了内标与目标分析物在色谱分离过程中表现的一致性。
优选地，所述18-羟皮质醇稳定同位素内标的工作液的溶剂为甲醇。发现选择甲醇为内标工作液的溶剂时，上清液清亮，产生的是絮状物，易于分离，相比乙腈毒性更少，对试验操作者的危害更低。如果采用乙腈为溶剂，产生的是细小沉淀，相对絮状沉淀会更难分离。此外，甲醇与乙醇相比黏度更小，对检测***的损害小。
优选地，所述尿液样本与所述18-羟皮质醇稳定同位素内标的工作液的体积比为1:(1.5～2.5)，优选为1:2。
优选地，所述混合液与水的体积比为1:(1-5)，优选为3:7。
优选地，所述高效液相色谱串联质谱仪的流动相为：流动相A为0.1wt％～0.3wt％甲酸的水溶液，流动相B为0.1wt％～0.3wt％甲酸的甲醇溶液，采用梯度洗脱。
进一步优选地，所述高效液相色谱串联质谱仪的流动相为：流动相A为0.15wt％～0.25wt％甲酸的水溶液，流动相B为0.15wt％～0.25wt％甲酸的甲醇溶液。选择此浓度范围的流动相，相比流动相A为0.1％甲酸的水溶液和流动相B为甲酸的醇溶液，可以有效提高18-羟皮质醇的离子化程度，有利于提高响应值。
优选地，所述高效液相色谱串联质谱仪的液相洗脱梯度为：
0～1min，流动相A的体积百分比为60～80％，流动相B的体积百分比为20～40％；
1～3.5min，流动相A的体积百分比由60～80％降低到30～40％，流动相B的体积百分比由20～40％升高到60～70％；
3.5～3.51min，流动相A的体积百分比由30～40％降低到0～20％，流动相B的体积百分比由60～70％升高到80～100％；
3.51～4.50min，流动相A的体积百分比为0～20％，流动相B的体积百分比为80～100％；
4.50～4.60min，流动相A的体积百分比由0～20％升高到60～80％，流动相B的体积百分比由80～100％降低到20～40％；
4.60～5.50min，流动相A的体积百分比为60～80％，流动相B的体积百分比为20～40％；
选择此特定的液相条件，结合本发明其他步骤和参数，本发明首次实现了18-羟皮质醇与其同分异构体6β-羟皮质醇能够很好的分离(6β-羟皮质醇的保留时间为0.55min，而18-OHF的保留时间为2.2min)，实现了其他液相条件所不能实现的非常高的特异性和高效性，有效避免了6β-羟皮质醇对18-羟皮质醇定量的影响，并且总运行时间仅需5.5min，保留时间仅需2.2min，而现有的方法往往需要超过10-15min的检测时间，并且检测通量往往比本发明低。
优选地，所述高效液相色谱串联质谱仪的液相色谱条件还包括：
色谱柱：Sigma Asentis Express C18色谱柱，规格为(50×2.1mm,2.7μm)；但不限于此，也可以使用其他厂家该型号的色谱柱进行替换。
柱温：(35±3)℃；
进样器温度：(15±2)℃；
进样量：(4±2)μL。
优选地，所述高效液相色谱串联质谱仪的质谱条件还包括：
质谱仪：AB Sciex 4500三重四极杆质谱仪；电喷雾离子源，正离子模式，多反应监测模式；
离子源参数包括：气帘气：(33.0±2)psi，碰撞气：(7.0±0.2)psi，离子源电压：(5500±10)V，离子源温度：(540.0±10)℃，雾化气：(55.0±5)psi，辅助加热气：(60.0±5)psi。
优选地，采用体积分数为30～40％的甲醇水溶液作为空白基质配制标准曲线溶液。
优选地，所述内标为d4-18-OHF，但不限于此，也可以选择其他同位素取代的18-羟皮质醇，例如其他碳代和氘代的18-羟皮质醇，只要使得内标的分子量应比目标分析物至少大3个道尔顿，即若目标分析物的分子量为M，则所选取的稳定同位素标记的内标分子量至少为M+3。
优选地，采用体积分数为30～40％的甲醇水溶液作为空白基质配制标准曲线溶液，进一步优选为33～37％的甲醇水溶液作为空白基质配制标准曲线溶液。通过基质效应考察无相对基质效应，此范围的甲醇水溶液可以替代尿液制备标准曲线实现准确定量且纯溶剂制备的曲线稳定期更长，省去制备空白尿液的步骤，有利于实现规模化应用。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
1试剂配制
储备液配制：用甲醇配制浓度为2mg/mL的18-OHF储备液，以及浓度为1mg/mL的d4-18-OHF的内标储备液；
曲线工作液配制：以35％(v/v)甲醇水溶液为空白基质，使用容量瓶配制一系列标准工作曲线工作液，曲线中18-OHF的浓度范围为17.13-8772nmol/L；
内标工作液配制：用纯甲醇稀释内标储备液，配制浓度为2113.8nmol/L的内标工作液。
2样本处理
直接稀释法的前处理步骤如下：
(1)尿液样本混匀后，移取50μL尿液于1.5mL离心管中；
(2)再加入100μL内标工作液(浓度为2113.8nmol/L)(标准曲线点和质控同步处理)；涡旋混匀5min，离心5min(25℃，10000rpm)；
(3)再加入350μL水；
(4)涡旋混匀5min；
(5)离心5min(25℃，10000rpm)；移取上清液150μL至进样小瓶中，上机检测，进样量4μL。
3仪器条件
3.1质谱条件
检测仪器：超高效液相色谱串联质谱仪AB Sciex Triple Quad 4500
质谱仪：AB Sciex Triple Quad 4500
液相色谱仪：Shimadzu LC-20AD XR HPLC pump、Shimadzu SIL-20AC XR autosampler、Shimadzu CTO-20A column oven。
采用AB Sciex 4500三重四极杆质谱仪，使用电喷雾离子源(ESI)，在正离子模式下，多反应监测模式(MRM)。MRM扫描模式具体质谱参数如表1所示，离子源参数：气帘气(Curtain Gas,CUR)为33.0psi，碰撞气(Collision Gas,CAD)为7.0psi，离子源电压(IonSpray Voltage,IS)为5500V，离子源温度(Temperature,TEM)为540.0℃，雾化气(GS1)为55.0psi，辅助加热气(GS2)为60.0psi。
表1.质谱参数
Figure BDA0003129508440000101
3.2液相条件
色谱柱采用Sigma Asentis Express C18(50×2.1mm,2.7μm)；流动相A(水相)为含0.2％甲酸的水，流动相B(有机相)为含0.2％甲酸的甲醇；采用梯度洗脱模式，液相梯度如表2所示。柱温为35℃，进样器温度为15℃，进样量为4μL。
表2.液相梯度条件
步骤 分析时间(min) 流速(mL/min) 流动相A％ 流动相B％
1 0.00 0.40 70.0 30.0
2 1.00 0.40 70.0 30.0
3 3.50 0.40 35.0 65.0
4 3.51 0.40 10.0 90.0
5 4.50 0.40 10.0 90.0
6 4.60 0.40 70.0 30.0
7 5.50 0.40 70.0 30.0
4.1保留时间
本发明的液相条件采用梯度洗脱，流动相为0.2％甲酸水和0.2％甲酸甲醇，液相运行时间为5.5min，柱温35℃，进样器温度为15℃，进样量为4uL。具体的液相梯度条件见表2，在此条件下，如图1所示，18-OHF的保留时间约为2.27min，内标的保留时间约为2.24min。本发明实现了检测时间短，出峰时间快，检测通量高。
实施例1的效果通过对该方法进行验证来确认，具体验证参数和验证结果如下所示：
方法学验证
1.线性范围
每个浓度的曲线点检测6次；计算各浓度样本的平均值、CV和回收率；
表3.线性范围实验数据
Figure BDA0003129508440000111
Figure BDA0003129508440000121
从表3和图2可以看出，18-OHF的线性范围为17.13-8772nmol/L，6条曲线拟合优度的可决系数R2＝0.9995，说明该曲线线性对测定值的拟合程度十分良好；定量限(即曲线最低点)为17.13nmol/L，该线性范围和定量限足以满足临床样本检测需求。
2精密度
2.1批内精密度
取3个不同基质来源的混合尿液样本，加标得到低、中、高三个水平的样本进行重复性精密度实验；在一个批次内，分别对每个浓度水平的样本平行处理12个，每个进样1次；计算检测结果的均值X、标准偏差SD和变异系数CV。结果见表4。
表4. 18-OHF批内精密度实验数据
Figure BDA0003129508440000122
2.2批间精密度
取预先配制好的低、中、高浓度的尿液基质质控品，进行中间精密度实验；连续测定20组；计算每个水平检测结果的均值X、标准偏差SD和变异系数CV，要求CV应小于20。结果见表5。
表5. 18-OHF批间精密度实验数据
Figure BDA0003129508440000131
由表4和表5可知，本方法的批内精密度小于1.7％，批间精密度小于2.2％，具有很好的精密度。
3加标回收实验
分别收集高、中、低浓度的病人基质样本，不同浓度水平的病人基质样本分别加入高、中、低浓度的标准溶液，进行加标回收率实验，且加标后的最终浓度需覆盖整个医学决定水平；将不同浓度的病人基质样本和加标后样本，每个浓度均平行处理3个样，计算出病人基质样本的平均值(基础浓度)，以及加标后的每个样本实际测定浓度(实测浓度)对应基质样本的回收率，要求回收率在85％～115％范围内，认为方法准确度可接受；
加标回收率计算公式如下：
Figure BDA0003129508440000132
表6. 18-OHF回收率试验结果
Figure BDA0003129508440000133
由表6的结果可知，此方法的平均回收率在98.6％-107.4％之间，满足回收率测试所要求的85％-115％，由此可知，本发明的直接稀释法回收率良好。
实施例2
与现有文献报道的固相萃取前处理方法相比，本发明采用直接稀释法，通过在样品中直接加入内标溶液、加水稀释混匀后，离心即可上机检测。采用直接稀释法处理样品，从取样到完成整个样品处理过程，仅需完成5个操作；相反地，若采用固相萃取法处理样品，整个过程需完成12个操作，如表7所示。相比之下，使用固相萃取法处理样品不仅操作复杂，耗时长，而且需要使用一次性耗材，成本高，环境污染大。如表8所示，以处理1000个样品为例，对比分析固相萃取法与本发明在前处理时间、试剂、耗材成本等各方面的差异。
表7.直接稀释法与固相萃取法样品前处理步骤比对
Figure BDA0003129508440000141
表8.直接稀释法与固相萃取法处理样本的各项成本对比结果
对比参数 直接稀释法 固相萃取法
前处理时间(96个样本) 30分钟 180分钟
试剂成本/元(1000个样本) 2000 4000
耗材成本/元(1000个样本) 1000 17000
表7、表8中的对比结果可证明，直接稀释法对比分析固相萃取法，在总操作步骤、前处理通量、前处理时间、耗材成本等各方面均有显著优势。
实施例3
在本方法优化的色谱条件下，还在最短的时间内实现了18-羟皮质醇与其内源性干扰物6β-羟基皮质醇的快速高效地分离，特异性好，同分异构体不干扰检测。
6β-羟基皮质醇是人尿液中存在的内源性化合物，和18-羟皮质醇互为同分异构体，难以完全分离。因此，验证该方法的特异性，需要看内源性化合物是否干扰18-羟皮质醇的定量检测。具体检测过程如下：
6β-OHF储备液配制：取5mg标准品用甲醇溶解，定容至5.0mL容量瓶中，得到浓度为1mg/mL(2.64mM)的6β-OHF储备液。
选择曲线基质(35％甲醇水)加入一定体积的6β-OHF溶液，和一定体积的18-OHF标准溶液，看6β-OHF的出峰位置是否干扰18-OHF的检测。采用“3”项下的色谱条件进行检测，结果见图3。
如4.1部分所述，采用“3”项下的色谱条件对临床样本进行检测，图1为其色谱分析图。根据图1所示，在临床样本中，目标分析物18-OHF的出峰时间为2.27min，而其内源性干扰物6β-OHF存在于临床样本中，且出峰时间为0.55min。采用本发明的方法能实现两者的完全分离，可避免其对目标分析物的定量造成干扰。
综合图1和图3信息可知，本发明的色谱条件不仅可以很好地分离18-OHF和其同分异构体6β-OHF，并且6β-OHF的保留时间为0.55min，18-OHF的保留时间为2.28min左右，6β-OHF完全不干扰18-OHF的检测，该方法的特异性好。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.尿液中18-羟皮质醇的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
样品前处理：取尿液样本，与18-羟皮质醇稳定同位素内标的工作液混合，再在所得混合液中加入水稀释，混合后离心，取上清液作为待测样品溶液，注入高效液相色谱串联质谱仪测定18-羟皮质醇的含量；
所述18-羟皮质醇稳定同位素内标的工作液的溶剂为甲醇、乙腈或乙醇；
所述尿液样本与所述18-羟皮质醇稳定同位素内标的工作液的体积比为1: (1.5~2.5)，所述混合液与水的体积比为1:(1-5) ；
所述高效液相色谱串联质谱仪的色谱条件包括：
色谱柱： C18色谱柱；
柱温：（35±5）℃；
进样器温度：（15±5）℃；
进样量：（2-6）μL；
流速：0.3-0.5 mL/min；
流动相A为0.1 wt%~0.3wt%甲酸的水溶液，流动相B为0.1 wt%~0.3wt%甲酸的甲醇溶液，采用梯度洗脱；
液相洗脱梯度为：
0~1min，流动相A的体积百分比为60~80%，流动相B的体积百分比为20~40%；
1~3.5 min，流动相A的体积百分比由60~80%降低到30~40%，流动相B的体积百分比由20~40%升高到60~70%；
3.5~3.51 min，流动相A的体积百分比由30~40%降低到0~20%，流动相B的体积百分比由60~70%升高到80~100%；
3.51~4.50min，流动相A的体积百分比为0~20%，流动相B的体积百分比为80~100%；
4.50~4.60min，流动相A的体积百分比由0~20%升高到60~80%，流动相B的体积百分比由80~100%降低到20~40%；
4.60~5.50min，流动相A的体积百分比为60~80%，流动相B的体积百分比为20~40%。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述18-羟皮质醇稳定同位素内标的工作液的溶剂为甲醇。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述尿液样本与所述18-羟皮质醇稳定同位素内标的工作液的体积比为1:2。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述混合液与水的体积比为1:(1-3)。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述混合液与水的体积比为3:7。
6.根据权利要求1~5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱仪的色谱条件包括：
柱温：35 ℃；
进样器温度：15 ℃；
进样量：4μL；
流速：0.4 mL/min。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱仪的液相洗脱梯度为：
0~1min，流动相A的体积百分比为（70±5）%，流动相B的体积百分比为（30±5）%；
1~3.5 min，流动相A的体积百分比由（70±5）%降低到（35±5）%，流动相B的体积百分比由（30±5）%升高到（65±5）%；
3.5~3.51 min，流动相A的体积百分比由（35±5）%降低到（10±5）%，流动相B的体积百分比由（65±5）%升高到（90±5）%；
3.51~4.50min，流动相A的体积百分比为（10±5）%，流动相B的体积百分比为（90±5）%；
4.50~4.60min，流动相A的体积百分比由（10±5）%升高到（70±5）%，流动相B的体积百分比由（90±5）%降低到（30±5）%；
4.60~5.50min，流动相A的体积百分比为（70±5）%，流动相B的体积百分比为（30±5）%。
8.根据权利要求1~5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱仪的质谱条件包括：
采用电喷雾离子源，正离子模式，多反应监测模式；
其中离子源参数包括：气帘气：（33.0±2） psi，碰撞气：（7.0±0.2）psi，离子源电压：（5500±10）V，离子源温度：（540.0±10）℃，雾化气：（55.0±5）psi，辅助加热气：（60.0±5）psi。
9.根据权利要求1~5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱仪的质谱参数包括：
18-OHF：定量离子对 379.2/267.2；
18-OHF：定性离子对 379.2/285.2；
d4-18-OHF：内标离子对 383.3/271.2。
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