CN112198265A - 用于同时检测血液类样本中多种类固醇激素的预处理方法、检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于同时检测血液类样本中多种类固醇激素的预处理方法、检测方法及试剂盒。该预处理的方法包括1)使用甲基叔丁基醚初步萃取所述血清样本中的所述类固醇激素；2)离心，取上清液用碱性溶液充分碱洗；3)碱洗后离心，取上清冷冻吹干，将所得固体组分复溶，得到用于同时检测多种类固醇激素的待测液。该方法至少能够同时分离17‑羟基孕酮、雄烯二酮、皮质醇、21‑脱氧皮质醇以及11‑脱氧皮质醇五种类固醇激素，分离效果好，操作简便。

Description

用于同时检测血液类样本中多种类固醇激素的预处理方法、 检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，具体而言，涉及一种用于同时检测血液类样本中多种类固醇激素的预处理方法、检测方法及试剂盒。

背景技术

先天性肾上腺皮质增生症(congenitaladrenalhyperplasia，CAH)是一组因肾上腺皮质激素合成途径中酶缺陷引起的疾病，属常染色体隐性遗传病。酶缺陷包括21-羟化酶、11β-羟化酶、3-类固醇脱氢酶、17-羟化酶缺陷等，其中21-羟化酶缺乏症(21-OHD)是CAH中最常见的类型(占90％～95％)，大多数是由于编码21-羟化酶的CYP21A2基因突变所致。其次是11β-羟化酶缺乏症(11β-OHD)，占5％～8％，其他非常罕见。

CAH主要影响皮质醇和醛固酮生成，皮质醇影响性激素的分泌，引起患儿男性化表现。醛固酮的作用则是通过肾脏对钠的重吸收，保持水钠平衡。约有75％的CAH患儿由于醛固酮的缺乏导致患儿的失盐、生长停滞、血容量减少性休克等，激素失衡还可导致对于男性化女性的性别错误判断，成年女性出现多毛、不育等问题，所以CAH的及时诊断发现和治疗十分重要。

针对常见的CAH(21-OHD和11β-OHD)二级筛查或鉴别诊断，建议同时测定17-羟基孕酮(17-OHP)、雄烯二酮(A4)、皮质醇(cortisol)、11-脱氧皮质醇(11-DF)、21-脱氧皮质醇(21-DF)等多种类固醇激素。特别是同时测定21-脱氧皮质醇，在疑难性21-羟化酶缺乏症患者的鉴别诊断中非常有必要和意义，21-脱氧皮质醇是糖皮质激素合成通路中的一种中间产物，正常情况下，糖皮质激素合成的主要底物17-羟基孕酮经21羟化酶羟基化生成11-脱氧皮质醇，最终生成皮质醇；但有极少部分的17-羟基孕酮经11β-羟化酶生成21-脱氧皮质醇。在CYP21A2杂合子患者中，由于21-羟化酶活性仅是减弱或部分缺失，日常并不会有临床症状表现。针对这部分患者的产前遗传咨询很难通过临床表现或咨询发现，通过进行激发试验，大量的17-羟基孕酮无法短时间内经21-羟化酶(酶活性减弱或部分缺失)代谢，而11β-羟基酶活性正常，21-脱氧皮质醇就会堆积起来(增高)，若仅测定17-羟基孕酮、雄烯二酮、皮质醇和11-脱氧皮质醇容易漏诊，难以准确鉴别正常人群和CYP21A2杂合子患者；若能同时测定21-脱氧皮质醇、17-羟基孕酮、雄烯二酮、皮质醇和11-脱氧皮质醇，则几乎可以百分百的区分出CYP21A2杂合子患者和正常人群，对疑难21-羟化酶缺乏症患者进行鉴别诊断。

类固醇激素主要以蛋白结合的形式存在，且人体血液中含有非常多的高亲和力结合蛋白，组成成分复杂，不同激素含量差异较大，且存在较多结构类似物及同分异构体，容易互相干扰。要实现准确定量，对灵敏度和准确度有较高要求，需要选择合适的样本预处理方式富集目标物，提升灵敏度，同时还要消除或降低基质干扰。目前国内多采用免疫法测定血液中的类固醇激素，已有大量文献证实免疫法在测定类固醇激素时往往因为结构类似物和底物的干扰，造成测定结果不准确，定量限高、线性范围较窄等问题。同时每种免疫方法只能测定一种类固醇激素，检测时间长。

目前采用串联质谱法测定多种类固醇激素，一般采用以下样本预处理方法进行血液样本处理：一是样本经蛋白沉淀后再进行液液萃取，为提高提取效率，需要使用移液器尽可能多的转移萃取后上层液体，这样既增加了转移操作难度，同时也会有提取的损耗，对人员要求较高；二是样本经蛋白沉淀后进行衍生化，再进行液液萃取，虽可以提高待测物的灵敏度，但操作繁琐，人员要求高，且需要进行衍生化实验，耗时较长；三是样本经蛋白沉淀后使用固相萃取法，这种预处理方法对人员要求较高，不仅操作步骤多，且投入较大(固相萃取柱等耗材较为昂贵)。

由于不同人体内同一种或不同种类的类固醇激素的含量差异也较大，因此要求检测方法的线性范围宽，且某些化合物(如21-脱氧皮质醇)在人体内含量极低，为准确区分正常人员和异常人员的测定值，对灵敏度要求更高，目前方法一般采用加大样品取样量、样品进样量来提高灵敏度，还需要使用灵敏度较高的设备。若同时测定含量极低和含量较高化合物(如皮质醇)，离子化效率也存在差异，同时还会存在检测器饱和的情况(含量高化合物)，需要对含量较高的化合物测定方法进行多种质谱参数的调整及优化。为实现准确的定量，避免结构类似物或同分异构体存在同样的碎片离子通道或共流出等影响，还需要实现色谱分离，尽可能避免干扰。

由于类固醇激素作为内源性激素，在人体或动物体内也均有一定的分布，若选择人或动物血液作为替代基质，往往需要进行复杂、繁琐、耗时的预处理去除本底后才能使用，同时商业化的血液基质也较难获取，成本较高。

发明内容

本发明涉及一种用于同时检测血液类样本中多种类固醇激素的预处理方法，其中所述多种类固醇激素包括17-羟基孕酮、雄烯二酮、皮质醇、21-脱氧皮质醇以及11-脱氧皮质醇，其特征在于，所述预处理方法包括如下步骤：

1)使用甲基叔丁基醚初步萃取所述血液类样本中的所述类固醇激素；

2)离心，取上清液用碱性溶液充分碱洗；

3)碱洗后离心，取上清液冷冻吹干，将所得固体组分复溶，得到用于同时检测多种类固醇激素的待测液。

此外，本发明还提供一种同时检测血液类样本中多种类固醇激素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

按上述所述的预处理方法处理得到待测液；

将所述待测液导入高效液相色谱中，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，其中，所述流动相A为含0.1v/v％-0.5v/v％甲酸的甲醇溶液，所述流动相B为含0.1v/v％-0.5v/v％甲酸的水溶液；

将经过所述高效液相色谱分离后的组分再结合质谱进行检测，采用同位素内标法定量建立得到的校准曲线计算各种类固醇激素的含量。

本发明通过合理优化设置的样本预处理方法及色谱方法，能够同时从血清中分离得到五种类固醇激素，分离纯度高，且分离方法简单易操作。

进一步地，本发明还涉及一种用于检测血液类样本中类固醇激素的试剂盒，其包括：

类固醇激素内标及标准品、含30v/v％～45v/v％甲醇的水溶液、甲基叔丁基醚、如上所述的碱性溶液、含0.1v/v％～0.5v/v％甲酸的甲醇溶液以及含0.1v/v％～0.5v/v％甲酸的水溶液；

其中类固醇激素为17-羟基孕酮、雄烯二酮、皮质醇、21-脱氧皮质醇以及11-脱氧皮质。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的分离方法采用了一种操作简单、价格低廉的样本预处理净化方法，可有效地去除血液类样本中酸性杂质对待测物测定的干扰，且不需要经过衍生化、移液器转移、固相萃取富集等复杂的操作，对人员操作要求低，效率高，且使用试剂、耗材成本低，适用于不同类型血液类样本(例如干血斑、血清、血浆等)的预处理。

(2)由于样本提取效率高，所以样本的取样量较少，可比现有的方法节省50％以上的取样量，样本经过优化的前处理步骤，色谱进样量少，可最大化的保护设备，减少设备的维护频率和色谱柱的使用寿命。

(3)通过预处理步骤和色谱质谱条件的选择优化，本发明所提供的检测方法可实现十余种类固醇激素的色谱质谱分离，特异性强，能对17OHP、A4、cortisol、21-DF以及11-DF进行准确定量。

(4)本发明的方法通过对多种类固醇激素进行质谱条件的优化，不仅能避免出现某些化合物响应饱和的情况，还能提升低浓度化合物的响应，可提供极宽的动态线性范围，高灵敏度(定量限较低)，同时兼顾高、低不同浓度的多种激素进行准确定量。

(5)本方法提供了一种可替代的纯溶剂空白基质，基质效应的影响可忽略，相比于人的血液基质更容易获取，操作方便，价格低廉，可至少节省48小时的基质预处理时间。

(6)本发明提供的用于检测血液类样本中类固醇激素的试剂盒，能够用于快速先天性肾上腺皮质增生症(CAH)诊断。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1～5依次为本发明一个实施例中VWF、sigma、caision、Vetec的BSA水溶液、以及35％甲醇水的Cortisol本底测定图谱；

图6～10依次为本发明一个实施例中VWF、sigma、caision、Vetec的BSA水溶液、以及35％甲醇水的17-OHP本底测定图谱；

图11～15依次为本发明一个实施例中VWF、sigma、caision、Vetec的BSA水溶液、以及35％甲醇水的A4本底测定图谱；

图16～20依次为本发明一个实施例中VWF、sigma、caision、Vetec的BSA水溶液、以及35％甲醇水的21-DF本底测定图谱；

图21～25依次为本发明一个实施例中VWF、sigma、caision、Vetec的BSA水溶液、以及35％甲醇水的11-DF本底测定图谱；

图26为本发明一个实施例中样本碱洗前的A4测定图谱；

图27为与图26同一样本的碱洗后的A4测定图谱；

图28为本发明一个实施例中样本碱洗前的17-OHP测定图谱；

图29为与图28同一样本的碱洗后的17-OHP测定图谱；

图30为本发明一个实施例中XB-C18柱分离21-DF色谱图；

图31为本发明一个实施例中C18柱分离21-DF色谱图；

图32为本发明一个实施例中XB-C18柱总离子流图；

图33为本发明一个实施例中C18柱总离子流图；

图34为本发明一个实施例中加入多种干扰物质后多种类固醇检测的总离子流图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。

本发明涉及一种用于同时检测血液类样本中多种类固醇激素的预处理方法，其中所述多种类固醇激素包括17-羟基孕酮、雄烯二酮、皮质醇、21-脱氧皮质醇以及11-脱氧皮质醇，其特征在于，所述预处理方法包括如下步骤：

1)使用甲基叔丁基醚初步萃取所述血液类样本中的所述类固醇激素；

2)离心，取上清液用碱性溶液充分碱洗；

3)碱洗后离心，取上清液冷冻吹干，将所得固体组分复溶，得到用于同时检测多种类固醇激素的待测液。

本发明所提供的预处理方法，保证了后续检测时的检测精度。碱洗的优点是多样的，其一可除去酸性杂质干扰物，避免对定量产生影响，其二，样本洁净程度提高，避免了血液类样本中复杂基质的干扰，信噪比增高，可检测更低浓度的样品，其三对色谱柱和检测设备也可起保护作用。

在本发明中，血液类样本可以是干血斑血清或血浆等。

在一些实施方式中，所述血液类样本与所述甲基叔丁基醚的体积比为1:(8～12)，也可以选择1:9、1:10或1:11。

在一些实施方式中，步骤2)中所述碱性溶液为氨水溶液；

进一步的，所述氨水溶液浓度为0.1wt％～0.5wt％，还可以选择0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％；

进一步的，所述上清与所述氨水溶液的体积比为(2.5～4.5)：1，还可以选择3:1、3.5:1、4:1。

在一些实施方式中，所述取上清用碱性溶液充分碱洗的操作之前，还包括将所述上清在-50℃～-80℃条件下冰冻30min～60min；

在一些实施方式中，所述取上清冷冻吹干的操作中，具体为将所述上清在-50℃～-80℃条件下冰冻30min～60min，氮气吹干；

冰冻的温度还可以选择55℃、60℃、65℃、70℃或75℃；冰冻的时间还可以选择35min、40min、45min、50min或55min。

在一些实施方式中，所述离心的条件为10000rpm～13000rpm离心3min～7min。

在一些实施方式中，所述离心的条件为10000rpm离心5min。

在一些实施方式中，将所得固体组分复溶所用的复溶液体积为80μL～120μL。

此外，本发明还涉及一种同时检测血液类样本中多种类固醇激素的方法，其包括如下步骤：

按如上所述的预处理方法处理得到待测液；

将所述待测液导入高效液相色谱中，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，其中，所述流动相A为含0.1v/v％-0.5v/v％的甲酸的甲醇溶液，所述流动相B为含0.1v/v％-0.5v/v％的甲酸的水溶液；

将经过所述高效液相色谱分离后的组分再结合质谱进行检测，采用同位素内标法定量建立得到的校准曲线计算各种类固醇激素的含量。

在一些实施方式中，所述同位素内标法所采用的同位素内标进一步优选为D8-17OHP、¹³C3-A4、D4-cortisol、¹³C3-11-DF以及D8-21-DF。

在一些实施方式中，所述流动相A还可以选择含0.2v/v％、0.3v/v％或0.4v/v％甲酸的甲醇溶液。

在一些实施方式中，所述流动相B还可以选择含0.2v/v％、0.3v/v％或0.4v/v％甲酸的水溶液。

在一些实施方式中，所述高效液相色谱所用的反相柱的填充材料为十八烷基，优选为Phenomenex Kinetex-C18或Phenomenex Kinetex-XB-C18柱，进一步优选为Phenomenex Kinetex-C18。

在一些实施方式中，所述反相柱的柱温为30℃～60℃，也可以选择35℃、40℃、45℃、50℃或55℃。

在一些实施方式中，进行高效液相色谱时的进样量为15μL～25μL，优选20μL。

在一些实施方式中，所述梯度洗脱的参数为：

0.01min～7.00min，流动相A：40％～65％；7.00min～7.50min，流动相A：65％；7.50min～8.5min，流动相A：65％～100％；8.50min～8.60min，流动相A：100％～40％；8.60min～9.00min，流动相A：100％；

其中上述条件涉及分析时间、流动相A和B的体积百分比的各个数值参数的浮动范围为该数值参数±20％，或±15％，或±10％，或±5％。

在一些实施方式中，所述梯度洗脱的流速为0.3mL/min～0.5mL/min，优选为0.4mL/min。

在一些实施方式中，所述血液类样本的含量为80μL～120μL，优选100μL；所述高效液相色谱的进样量为15μL～25μL，优选20μL。

在一些实施方式中，所述同位素内标法中所用的空白基质为30v/v％～45v/v％的甲醇水溶液，也可以采用35v/v％或40v/v％的甲醇水溶液。

质谱方法建立中对于空白基质的选择也十分重要，原则上最好选用与样品同源的基质作为空白基质，但当同源的基质难以获取时，可选择与其类似的基质作为替代。目前，使用串联质谱检测类固醇激素一般选择动物(如牛血清)作为人血清的替换基质，但由于类固醇激素为内源性物质，动物血清中往往也会含有部分激素本底残留，故在使用之前，还需要对溶解后的牛血清进行预处理，一般采用活性炭吸附的方法，确保其本底干净，而活性炭吸附的操作十分繁琐，且耗时较长，处理一批激素本底干净的动物血清至少需要48小时以上。本发明所提供的检测方法用30v/v％～45v/v％的甲醇水溶液替代常用的牛血清蛋白基质，不需经过繁琐的预处理，简单易得且基质效应满足要求的空白基质。

在一些实施方式中，所述检测血液类样本中类固醇激素的方法过程中不包括活性炭吸附的步骤。

在一些实施方式中，所述质谱为四极杆质谱，条件为正离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描MRM。

在一些实施方式中，所述质谱针对不同检测对象的碰撞能量分别为：

17-羟基孕酮：20V～24V；雄烯二酮：28V～32V；皮质醇：18V～22V；21-脱氧皮质醇：35V～45V；11-脱氧皮质醇：33V～37V。

本方法通过对质谱条件的优化，解决不同类固醇激素在人体含量差异大，高浓度样本易在质谱上饱和的问题，可实现人体含量不同浓度不同的激素的准确定量，项目性能稳定。

本方法由于预处理过程中提取效率高，样本洁净程度高，只需要80μL～120μL的取样量，15μL～25μL的进样量进行多种类固醇激素的测定，线性范围宽，定量限低，还可根据临床应用需求调整取样量和进样量，进一步扩充线性范围和降低定量限。

本发明所提供的检测方法性能优越，精密度可达＜5％。不仅可实现对17-OHP、A4、Cortisol、21-DF、11-DF五种类固醇激素的检测，加入其他结构类似的类固醇激素(睾酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、孕酮、可的松、皮质酮)也可实现检测，可根据应用范围组合多种检测物质。

进一步地，本发明还涉及一种用于检测血液类样本中类固醇激素的试剂盒，其包括：

类固醇激素内标及标准品、含30v/v％～45v/v％甲醇的水溶液、甲基叔丁基醚、如上所述的碱性溶液、含0.1v/v％～0.5v/v％甲酸的甲醇溶液以及含0.1v/v％～0.5v/v％的甲酸的水溶液；

其中类固醇激素为17-羟基孕酮、雄烯二酮、皮质醇、21-脱氧皮质醇以及11-脱氧皮质。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种测定多种类固醇的方法，所述方法包括以下步骤：

A、配置标准曲线：

空白基质：取不同比例的甲醇、水混合配置比例为35％的甲醇水溶液，充分混合后超声除去气泡即得。

以35％甲醇水溶液为空白基质分别配制17-OHP为271nmol/L，A4为41.7nmol/L，cortisol浓度为600nmol/L，21-DF为38.5nmol/L，11-DF为27.1nmol/L的高浓度样本，逐一对倍稀释，得到不同浓度的曲线点。

B、样本预处理方法

1)吸取100μL样品至2.0mL离心管中，加入50μL的内标，加入800μL-1200μL提取液甲基叔丁基醚(MTBE)，漩涡剧烈震荡5min；

2)10000rpm、常温离心5min；

4)-70℃冰冻60min，上层转至2.0mL离心管中，加入350μL 0.1wt％氨水漩涡剧烈震荡5min；

5)10000rpm、常温离心5min；

6)-70℃冰冻50min，上层转至1.5mL离心管中，氮气吹干；

7)加入100μL复溶液，漩涡剧烈震荡5min后，10000rpm、常温离心5min，转移至1.5mL进样瓶中；

8)使用LC-MS/MS进行测定。

C、液相方法

表1、液相梯度

流动相A＝0.3％甲酸，甲醇(V/V)

流动相B＝0.3％甲酸，水(V/V)

色谱柱：Phenomenex Kinetex-C18，2.6μm，100×2.1mm

柱温：45℃

进样量：20μL

流速：0.4mL/min

本发明中流动相A为0.1％甲酸，甲醇(V/V)

本发明中流动相A为0.1％甲酸，水(V/V)

D、质谱条件

表2、质谱参数

其中，DP为去簇电压，EP为入口电压，CE为碰撞电压

雾化气(source gas1)：35.0psi；

辅助加热气(source gas 2)：50.0psi；

离子源温度(source temp)：450℃；

气帘气(curtain gas)：50.0psi；

碰撞气(collision gas)：9psi；

离子化电压IS：4500V。

其检测结果如图33所示。

检测方法验证如下：

(1)线性范围和定量限：以35％甲醇水溶液为空白基质分别配制17OHP为271nmol/L，A4为41.7nmol/L，cortisol浓度为601nmol/L，11-DF为27.1nmol/L，21-DF为38.5nmol/L的高浓度样本，逐一对倍稀释，得到不同浓度的曲线点；每个浓度的样本每天平行处理2个，测定3天，分别检测一次；用内标标准曲线法定量，各激素的峰面积与相应内标化合物面积的比值为纵坐标，各激素浓度与内标物的浓度比值为横坐标，权重1/x，绘制标准曲线。结果表明：17-OHP、A4、Cortisol、21-DF和11-DF方法的检出限(LOD)分别为0.016nmol/L、0.010nmol/L、0.073nmol/L、0.009nmol/L、0.003nmol/L；17OHP、A4、Cortisol、11-DF、21-DF的定量限(LOQ)分别为0.033nmol/L、0.020nmol/L、0.147nmol/L、0.027nmol/L、0.038nmol/L；17OHP、A4、Cortisol、11-DF、21-DF分别在0.033-271nmol/L、0.020-41.7nmol/L、0.147-601nmol/L、0.027-27.1nmol/L、0.038-38.5nmol/L浓度范围内，线性良好，相关系数R²>0.99。

(2)精密度：收集混合人源血清样本，通过加标得到低(L)、中(M)、高(H)三个不同浓度水平的样本，批内精密度为短时间内测定12组数据，批间精密度为连续5天，采用实施例1中的方法每天测定4组数据，收集20组数据，计算其均值、SD、RSD，如表3-6所示。

(3)准确度：取低、中、高三个浓度水平的血清样本，通过加标回收率实验验证了方法的准确度，结果回收率均在85％-115％之间，方法准确度满足要求，如表7所示。

表3、批内精密度

表4、批内精密度

表5、批间精密度

表6、批间精密度

表7加标回收率

综合上述验证实验，本实施例的线性范围、定量限、精密度和准确度等各项指标均能满足临床样本检测的要求，本方法中17-OHP批内精密度为1.0％～3.5％，批间精密度为2.0％～3.2％；A4批内精密度为1.0％～4.0％，批间精密度为2.0％～3.0％；皮质醇批内精密度为1.0％～3.0％，批间精密度为2.0～4.0％；11-DF批内精密度为2.0％～4.0％，批间精密度为2.0％～5.5％；21-DF批内精密度为2.0％～9.0％，批间精密度为3.0％～5.0％，各激素指标的批内及批间精密度都表现出非常优越的性能。目前，很多测定血清中多种类固醇激素的方法中，一般为了节省检测时间，只实现质谱分离(选择不同的离子通道)，没有完全实现色谱分离，造成所建立的方法重现性欠缺(精密度在5％～15％之间)，特别是针对低浓度水平的样本测定，精密度可高达到10％～20％。而本实施例通过较好的预处理方法净化样本，同时本方法除了在质谱离子对的选择上能实现待测物与结构类似干扰物及同分异构体干扰物的质谱分离，还通过对色谱柱的选择和液相条件的优化，实现各待测化合物在液相的完全分离，避免共流出杂质对定量的影响。

实施例2

由于不同的类固醇激素在血清中的含量差异大，部分类固醇激素含量非常的低，如11-脱氧皮质醇，为了提高待测物的检测灵敏度，可使用增加取样量或进样量的方式，目前的方法一般采用至少200μL以上的取样量，20μL～50μL的进样量，本方法由于预处理过程中提取效率高，样本洁净程度高，只需要100μL的取样量，20μL的进样量进行5种类固醇激素的测定，线性范围宽，定量限低，还可根据临床应用需求调整取样量和进样量，进一步扩充线性范围和降低定量限，提高检测灵敏度。

实施例3

为实现对低含量的激素(如21-脱氧皮质醇)进行准确测定，需要使用高灵敏度的仪器，但同时测定含量高的激素，还会存在检测器饱和的问题，影响高浓度样本的测定浓度范围。本方法采用AB SCIEX API 5500三重四极杆质谱仪，通过对质谱参数碰撞能量的优化，使人体含量各异的激素项目在质谱上的响应相近，兼顾高低浓度样本的测定，同时，由于碰撞能量是使待测物组分在质谱中碎裂而施加在碰撞室上的电压参数，对于项目性能影响较大，若调整幅度过大，可能导致项目在检测过程中信号不稳定，故还需要评估优化的幅度是否合适。

经过质谱参数优化，各人体含量各异的激素指标线性高点在质谱上的响应基本趋于同一数量级，可满足对人体不同浓度的激素项目的高低浓度水平进行准确定量，具有较宽的动态线性范围(如实施例1中线性范围验证结果所示)。同时，通过对样本内标的监测，可知该参数优化后项目性能稳定，重现性较好。

表8质谱参数优化前后比对

表9质谱参数优化后指标稳定性监测

实施例4

空白基质选择

a.分别称取4个不同品牌的牛血清蛋白400mg，使用去离子水定容到10mL，充分溶解，即得牛血清蛋白基质；

b.分别取上述配置的4种不同品牌的牛血清蛋白基质和35％甲醇水溶液，按照实施例1方法进行样本预处理后，上机测定；

VWF、sigma、caision、Vetec的BSA水溶液、35％甲醇水的Cortisol本底测定图谱依次如图1～5所示；VWF、sigma、caision、Vetec的BSA水溶液、35％甲醇水的17-OHP本底测定图谱依次如图6～10所示；VWF、sigma、caision、Vetec的BSA水溶液、35％甲醇水的A4本底测定图谱依次如图11～15所示；VWF、sigma、caision、Vetec的BSA水溶液、35％甲醇水的21-DF本底测定图谱依次如图16～20所示；VWF、sigma、caision、Vetec的BSA水溶液、35％甲醇水的11-DF本底测定图谱依次如图21～25所示。

从色谱图上可得，未经预处理(活性炭吸附)的牛血清蛋白基质样本，4个不同品牌的产品均不同程度的检出皮质醇，而其他激素17-OHP、A4、11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇则部分检出，说明类固醇激素作为内源性物质，在动物体内或多或少存在一定含量，商品化的牛血清蛋白在作为激素项目的血清替代基质的时候，需要进行预处理操作，而本方法提供纯溶剂空白基质(35％甲醇水)，背景噪音低，无本底检出，且不需要经过繁琐的预处理操作，即可现配现用，且配制方法简单易行，基质效应的影响可忽略(如实施例5的基质效应评估结果所示)。

由于牛血清蛋白作为替代基质需要进行预处理操作，可采用活性炭吸附的方式降低或消除本底，操作繁琐，配置一批次可用的替代基质至少需要耗时48小时，而本方法提供的纯溶剂基质(可根据情况调整溶剂组分和比例)仅需要10分钟即可现配现用，且操作步骤简单易行，而且经过初步验证，该方法配置的曲线至少可稳定半年以上。

表10牛血清蛋白及纯溶剂基质的配置流程及耗时

实施例5

基质效应评估

收集六个不同来源的病人样本；

b.使用配制标准曲线的空白基质(35％甲醇-水)溶解至少高、低两个不同浓度水平的标准溶液；

c.分别将标准溶液和6个不同来源的病人基质样本按1:1、3:2比例进行混合得混合样本；

d.将标准溶液、病人样本和混合样本各平行处理3个样，上机检测。

要求：混合样本的响应值(待分析物/内标)与病人样本和标准溶液响应均值的差异应小于20％，则说明无相对基质效应。

表11混合前样品的响应值(待分析物/内标)

表12样品基质效应数据(1)

表13样品基质效应数据(2)

从结果看，混合样本的响应值(待分析物/内标)与病人样本和标准溶液响应均值的差异均小于20％，说明本发明所选择的基质(25％-45％的甲醇水溶液)可作为人血清替代基质用于类固醇激素项目的检测中，基质效应可忽略，获取简单易得，可节约至少48小时的预处理时间，人员操作要求低，还可避免选用人或动物血清(去除激素)作为替代基质的时候，由于预处理不干净对曲线本底造成的叠加效应，进而影响对样品的准确定量。

实施例6

随机挑选20例样本，每个样品平行取2次，其中一组按照本发明实施例1中的预处理方法进行样品处理，另一组不进行本发明中的碱洗步骤，其他与本发明预处理方法一致；结果如图26～29所示。

将两组数据进行峰型比较，可发现，部分病人样品中由于基质较复杂，若不进行碱洗除杂，可在待测物出峰附近出现杂质干扰，导致基线抬高的现象，影响样品定量的准确性和稳定性，经过碱洗的样品，其一可除去酸性杂质干扰物，避免对定量产生影响，其二，样本洁净程度提高，基线降低，信噪比增高，可检测更低浓度的样品，其三对色谱柱和检测设备也可起保护作用。

实施例7

为验证不同C18色谱柱对分离效果的影响，本发明使用Phenomenex Kinetex-C18(2.6μm，100×2.1mm)、Phenomenex Kinetex-XB-C18(2.6μm，100×2.1mm)两款不同色谱柱进行样本分析，图30为XB-C18柱分离21-DF色谱图，可知21-DF与结构类似干扰物没有完全实现色谱分离，对测定结果存在影响；图31为C18柱分离21-DF色谱图，可实现21-DF与结构类似干扰物的色谱分离，且Phenomenex Kinetex-C18(2.6μm，100×2.1mm)对目标化合物有较好的保留和较高的柱效，可明显提高目标化合物的检测灵敏度，同时，在保留时间上有明显的提前，可节约0.5min的检测时间。XB-C18柱和C18柱总离子流图分别如图32和图33所示。

结果表明，相对而言Phenomenex Kinetex-C18(2.6μm，100×2.1mm)对多种类固醇及其结构类似物分离效果更佳，分析时间更短，有助于提高检测的特异性和灵敏度。

实施例8

a.取一混合病人的血清样本，分别加入睾酮(TT)、双氢睾酮(DHT)、脱氢表雄酮(DHEA)、孕酮(Progesterone)、可的松(cortisone)、皮质酮(corticosterone)等干扰物，观察结构类似物和同分异构体干扰物是否会对待测物造成干扰，能否实现色谱分离。

b.从色谱图(图34)上可知，本方法所检测的5种类固醇激素均可实现色谱分离。

目前测定多种类固醇激素的方法中，为节省分析时间，大多数一般仅实现质谱分离，但对于同分异构体化合物(如11-脱氧皮质醇、21-脱氧皮质醇、皮质酮)存在共同的离子通道，若不实现色谱分离，存在共流出会造成结果假增高的情况。本方法经过色谱柱的选择，液相梯度的优化和质谱离子对的选择，在加入多种类似物或同分异构体干扰物后，不仅各种待测激素可实现色谱分离，添加的干扰物睾酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、孕酮、可的松、皮质酮等多种类固醇激素也可实现色谱分离，说明本发明所提供的方法特异型性强，不仅可检测5种类固醇激素，还可扩充检测睾酮、双氢睾酮、脱氢表雄酮、孕酮、可的松、皮质酮等多种类固醇激素，且所涉及的类固醇激素均可实现色谱分离，可避免共流出造成的质谱干扰。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (12)

1.一种用于同时检测血液类样本中多种类固醇激素的预处理方法，其中所述多种类固醇激素包括17-羟基孕酮、雄烯二酮、皮质醇、21-脱氧皮质醇以及11-脱氧皮质醇，其特征在于，所述预处理方法包括如下步骤：

1)使用甲基叔丁基醚初步萃取所述血液类样本中的所述类固醇激素；

2)离心，取上清液用碱性溶液充分碱洗；

3)碱洗后离心，取上清液冷冻吹干，将所得固体组分复溶，得到用于同时检测多种类固醇激素的待测液。

2.根据权利要求1所述的用于同时检测血液类样本中多种类固醇激素的预处理方法，其特征在于，所述血液类样本与所述甲基叔丁基醚的体积比为1:(8～12)。

3.根据权利要求1所述的用于同时检测多种类固醇激素的血液类样本预处理方法，其特征在于，步骤2)中所述碱性溶液为氨水溶液，所述氨水溶液浓度为0.1wt％～0.5wt％，且所述上清液与所述氨水溶液的体积比为(2.5～4.5)：1。

4.根据权利要求1所述的用于同时检测血液类样本中多种类固醇激素的预处理方法，其特征在于，所述取上清液用碱性溶液充分碱洗的操作之前，还包括将所述上清液在-50℃～-80℃条件下冰冻30min～60min。

5.根据权利要求1所述的用于同时检测血液类样本中多种类固醇激素的预处理方法，其特征在于，所述取上清液冷冻吹干的操作中，具体为将所述上清液在-50℃～-80℃条件下冰冻30min～60min，氮气吹干。

6.一种同时检测血液类样本中多种类固醇激素的方法，其特征在于，包括如下步骤：

按权利要求1～5任一项所述的预处理方法处理得到待测液；

将所述待测液导入高效液相色谱中，以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，其中，所述流动相A为含0.1v/v％-0.5v/v％甲酸的甲醇溶液，所述流动相B为含0.1v/v％-0.5v/v％甲酸的水溶液；

将经过所述高效液相色谱分离后的组分再结合质谱进行检测，采用同位素内标法定量建立得到的校准曲线计算各种类固醇激素的含量。

7.根据权利要求6所述的同时检测血液类样本中多种类固醇激素的方法，其特征在于，所述高效液相色谱所用的反相柱的填充材料为十八烷基。

8.根据权利要求6所述的同时检测血液类样本中多种类固醇激素的方法，其特征在于，所述以流动相A和流动相B进行梯度洗脱的参数为：0.01min～7.00min，流动相A：40％～65％；7.00min～7.50min，流动相A：65％；7.50min～8.5min，流动相A：65％～100％；8.50min～8.60min，流动相A：100％～40％；8.60min～9.00min，流动相A：100％；其中上述条件涉及分析时间、流动相A和B的体积百分比的各个数值参数的浮动范围为该数值参数±20％。

9.根据权利要求6所述的同时检测血液类样本中多种类固醇激素的方法，其特征在于，所述待测液的体积为80μL～150μL；所述高效液相色谱的进样量为15μL～25μL。

10.根据权利要求6所述的同时检测血液类样本中多种类固醇激素的方法，其特征在于，所述采用同位素内标法定量建立得到的校准曲线计算各种类固醇激素的含量的操作中，所述同位素内标法中所用的空白基质为30v/v％～45v/v％的甲醇水溶液。

11.根据权利要求6所述的同时检测血液类样本中多种类固醇激素的方法，所述质谱为三重四极杆质谱，针对不同检测对象的碰撞能量分别为：

17-羟基孕酮：20V～24V；雄烯二酮：28V～32V；皮质醇：18V～22V；21-脱氧皮质醇：35V～45V；11-脱氧皮质醇：33V～37V。

12.一种用于检测血液类样本中类固醇激素的试剂盒，其包括：

类固醇激素内标及标准品、含30v/v％～45v/v％甲醇的水溶液、甲基叔丁基醚、权利要求1或3中所定义的碱性溶液、含0.1v/v％～0.5v/v％甲酸的甲醇溶液以及含0.1v/v％～0.5v/v％甲酸的水溶液；

其中类固醇激素为17-羟基孕酮、雄烯二酮、皮质醇、21-脱氧皮质醇以及11-脱氧皮质醇。

Images