CN113917036B - 一种鹿花菌素的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鹿花菌素的检测方法及试剂盒，属于分析检测技术领域。本发明首先将鹿花菌素水解为甲基肼，然后采用对甲基苯甲醛对鹿花菌素水解产物进行衍生化，并使用氘代对甲基苯甲醛与甲基肼的反应产物作为内标，通过液相色谱串联质谱法对待测液进行分析。本发明衍生化反应速度快，所需时间短，效率远高于现有检测方法，并且衍生化产物的色谱峰峰形及分离度能够得到有效改善和提高，明显提高了方法的准确度和灵敏度，通过内标法消除样品基质产生的基质效应，满足了准确定量的需求，提高检测结果的准确性。

Description

一种鹿花菌素的检测方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，特别是涉及一种鹿花菌素的检测方法及试剂盒。
背景技术
近年来因误食毒蘑菇引发的中毒事件在我国呈蔓延趋势，引起社会广泛关注，也成为食品安全领域极为突出的问题。2020年国家食品安全风险评估中心基于我国食源性疾病暴发监测***的数据统计发现，2003～2017年间31.8％的食源性中毒事件由毒蘑菇中毒引起，位居各类食源性中毒诱发因素之首。目前已鉴定出的蘑菇毒素有100 多种，我国仅对鹅膏肽类等少数几种蘑菇毒素建立了相关的检测方法，对于大多数的蘑菇毒素尚无任何检测方法。鹿花菌(Gyromitra esculenta)是假羊肚菌的一种，其外观与可食用羊肚菌极其相似，普通人很难通过肉眼辨识，故常被误食而产生中毒。鹿花菌的主要毒性成分为鹿花菌素(Gyromitrin)，其可影响神经递质γ-氨基丁酸的生成，中毒症状一般与消化道及神经***有关，中毒初始阶段表现为反胃、呕吐、腹泻及便血，后期会出现严重的神经***问题，严重可导致死亡。鉴于我国鹿花菌中毒事件频发的现状，开发可靠有效的鹿花菌素检测方法，对鹿花菌中毒溯源及毒蘑菇鉴定具有重要意义。
由于鹿花菌素的化学结构特性，其在质谱上难以离子化且无明显光学特性，直接检测鹿花菌素的难度极大。目前国内外对鹿花菌素的检测技术研究十分匮乏，仅有1项研究报道了鹿花菌素的检测方法。流程包括：首先将鹿花菌素水解为甲基肼，再用五氟苯甲酰氯对甲基肼进行衍生化，最后利用气相色谱串联质谱法进行检测(Journal ofChromatographyA,2006，1125，229–233)。该方法中鹿花菌素水解为甲基肼需要2h，衍生化时间为1h，然后还需净化处理，用气相色谱串联质谱法进行检测需30min，整个检测时间约4.5h，对鹿花菌干品的检出限为300μg/kg。该方法操作繁琐且耗时，检测灵敏度偏低，限制了该技术的应用与推广。此外，该方法没有选择样品基质效应对定量结果的影响，难以满足准确定量的需求。鉴于此，开发一种操作简单且定量准确的鹿花菌素检测方法是亟需解决的技术难点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鹿花菌素的检测方法及试剂盒，通过内标法消除了基质效应，具有操作简单、样品通量高、灵敏度高、检测准确度高的优点。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种鹿花菌素的检测方法，所述方法包括以下步骤：
将待测样本与提取溶剂混合提取后所得的提取液进行离心，收集上清液；
将所述上清液用乙醇和盐酸酸解，得到鹿花菌素水解液；将所述鹿花菌素水解液与对甲基苯甲醛混合进行衍生化反应，得到待测样本的衍生化产物；通过液相色谱串联质谱法对衍生化产物进行检测分析，计算得到所述待测样本中鹿花菌素的含量。
优选的，所述待测样本包括蘑菇、尿液或血浆。
优选的，当所述待测样本为蘑菇时，所述提取溶剂为乙腈溶液或甲醇溶液；所述待测样本为尿液或血浆时，所述提取溶剂为乙腈。
优选的，所述乙醇的质量百分浓度为30％～70％，所述盐酸的浓度为3～5mol/L。
优选的，所述酸解的温度为40～60℃，所述酸解的时间为 40～80min。
优选的，所述鹿花菌素水解液与对甲基苯甲醛的体积比为1： 1～2。
优选的，所述衍生化反应的温度为30～50℃，所述衍生化反应的时间为20～60min。
优选的，所述检测方法中还添加有内标物。
更优选的，所述内标物为鹿花菌素标准品经乙醇和盐酸水解后的产物与氘代对甲基苯甲醛混合反应所得。
本发明还提供了一种检测鹿花菌素的试剂盒，包括独立分装的提取试剂、酸解试剂和衍生化试剂；所述提取试剂为乙腈或甲醇；所述酸解试剂为乙醇水溶液和盐酸溶液；所述衍生化试剂包括对甲基苯甲醛和氘代对甲基苯甲醛。
本发明提供了一种鹿花菌素的检测方法，将鹿花菌素首先水解为甲基肼，再采用对甲基苯甲醛对甲基肼进行衍生化，水解及衍生化反应速度快，所需时间短，50℃下仅需1h即可完全水解及衍生化反应。经实验检测可知，本发明检测灵敏度在尿液、血浆中的定量限为 4μg/L，在蘑菇中的定量限为20μg/kg，极大缩短了检测时间，提高了检测通量。并且采用氘代对甲基苯甲醛作为衍生化试剂与鹿花菌素水解液进行反应，反应产物作为内标进行鹿花菌素的定量检测，通过内标法消除了基质效应，衍生化产物的色谱峰峰形及分离度能够得到有效改善和提高，明显提高了方法准确度和灵敏度，适用于鹿花菌毒素的溯源以及含该毒素的蘑菇鉴定。
附图说明
图1为甲基肼经(A)对甲基苯甲醛、(B)邻硝基苯甲醛和(C)苯甲醛衍生化后的MRM图谱。
图2为尿液中鹿花菌素衍生化产物的MRM图谱。
图3为鹿花菌素衍生化产物的标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种鹿花菌素的检测方法，所述方法包括以下步骤：
将待测样本与提取溶剂混合提取后所得的提取液进行离心，收集上清液；
将所述上清液用乙醇和盐酸酸解，得到鹿花菌素水解液；将所述鹿花菌素水解液与对甲基苯甲醛混合进行衍生化反应，得到待测样本的衍生化产物；通过液相色谱串联质谱法对衍生化产物进行检测分析，计算得到所述待测样本中鹿花菌素的含量。
本发明中，所述酸解和衍生化反应的方程式如下：
Figure BDA0003314110990000041
本发明中，所述待测样本包括蘑菇、尿液或血浆。当所述待测样本为蘑菇时，所述待测样本和提取溶剂的用量比优选为1g：4～5mL，所述提取溶剂优选为乙腈溶液或甲醇溶液；当所述待测样本为尿液或血浆时，所述待测样本和提取溶剂的体积比优选为1～2:1，所述提取溶剂优选为乙腈溶液。本发明中，所述提取优选为超声提取或振荡提取，所述提取的时间优选为5～10min，更优选为8～9min。本发明对所述超声提取的功率和振荡提取的频率没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的条件即可。本发明中，所述离心的转速优选为4000r/min 以上，更优选为5000～12000r/min，所述离心的时间优选为5min。
本发明中，将所述上清液用乙醇和盐酸酸解，得到鹿花菌素水解液。所述上清液与乙醇和盐酸的体积比优选为1～4:1～2:1～2，更优选为2：1：1。本发明中，所述乙醇的质量百分浓度优选为30％～70％，更优选为40％～50％；所述盐酸的浓度优选为3～5mol/L，更优选为 4mol/L。所述酸解的温度优选为40～60℃，更优选为50℃；所述酸解的时间优选为40～80min，更优选为40min。本发明中，所述酸解的过程实际上是将鹿花菌素水解为甲基肼的过程，所述鹿花菌素水解液即为甲基肼。本发明酸解时优选在混匀仪上进行，所述混匀仪的振荡优选为400rpm以上，更优选为500～1000rpm。
本发明中，将所述鹿花菌素水解液与对甲基苯甲醛混合进行衍生化反应，得到待测样本的衍生化产物。所述鹿花菌素水解液与对甲基苯甲醛的体积比为优选为1：1～2。本发明中，所述对甲基苯甲醛优选为对甲基苯甲醛溶液，所述对甲基苯甲醛的浓度优选为 10～50mg/mL，更优选为20mg/mL。本发明中，所述衍生化反应的温度优选为30～50℃，更优选为40～45℃；所述衍生化反应的时间优选为20～60min，更优选为20min。本发明进行衍生化反应时优选在混匀仪上进行，所述混匀仪的振荡优选为400rpm以上，更优选为 500～1000rpm。
本发明中，所述检测方法中还添加有内标物。所述内标物优选为鹿花菌素标准品经乙醇和盐酸水解后的产物与氘代对甲基苯甲醛混合反应所得。本发明中，所述鹿花菌素标准品与乙醇和盐酸的体积比优选为2:1:1；所述水解后的产物与氘代对甲基苯甲醛的体积比优选为1:1～2。本发明利用该内标物进行鹿花菌素的定量检测，能够与待测样品的衍生化产物发生反应，使得待测样品的衍生化产物的色谱峰峰型好，分离度高，能够显著提高检测准确度和灵敏度。
本发明在对待测样本的衍生化产物进行液相色谱串联质谱检测分析前，将内标物与待测样本的衍生化产物进行混合后调节pH值至碱性。所述内标物与待测样本的衍生化产物的体积比优选为0.2～1:1。本发明中，所述调节pH值的试剂优选为氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的浓度优选为5～15mol/L，更优选为10mol/L；所述pH值优选调节至9～12。本发明将内标物与待测样本的衍生化产物进行混合后调节pH值至碱性可以终止内标物和待测样本的衍生化产物之间再发生衍生化反应，确保定量的准确性。
本发明中，所述液相色谱串联质谱分析使用的质谱优选为三重四级杆质谱，采用的模式优选为多反应监测模式。所述液相色谱串联质谱分析的液相色谱条件包括：流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为乙腈，流动相B为醋酸铵水溶液，所述含醋酸铵的浓度为5mmol/L；流动相的流速为0.3～0.4mL/min；色谱柱为Acquity UPLC BEH C18柱，柱温为40℃。所述液相色谱串联质谱分析的质谱条件包括：检测方式为电喷雾离子源正离子模式，喷雾电压为5500V，离子源温度为500℃，气帘气压力为35psi，鞘气压力为50psi，辅助气压力为50psi。在本发明的具体实施例中，使用的仪器优选为Waters Acquity UPLC液相色谱仪和AB SCIEX 5500三重四级杆质谱仪。
本发明中，通过液相色谱串联质谱法得到待测样本的衍生化产物的谱图后，本发明根据谱图和标准曲线计算得到待测样本中鹿花菌素的含量；标准曲线为鹿花菌素的浓度(X)和对甲基苯甲醛衍生化产物与氘代对甲基苯甲醛衍生化产物峰面积比值(Y)的关系曲线。本发明对所述标准曲线的获得方法没有特殊要求，采用本领域技术人员熟知的方法即可。
本发明还提供了一种检测鹿花菌素的试剂盒，包括独立分装的提取试剂、酸解试剂和衍生化试剂；所述提取试剂为乙腈或甲醇；所述酸解试剂为乙醇水溶液和盐酸溶液；所述衍生化试剂包括对甲基苯甲醛和氘代对甲基苯甲醛。本发明中，所述试剂盒按照上述方案所述的方法进行应用，利用所述的试剂盒能够方便快捷的对样本中的鹿花菌素进行检测。
本发明中，所用原料、试剂与设备均为已知产品，采用常规市售产品即可。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1鹿花菌素水解为甲基肼条件的优化
1、仪器设备
Waters Acquity UPLC液相色谱仪(美国Waters公司)、AB SCIEX 5500三重四级杆质谱仪(美国AB SCIEX公司)、ThermoMixer C恒温混匀仪(德国Eppendorf公司)、高速离心机、电子分析天平、移液枪等。
2、材料和试剂
鹿花菌素标准品购买自天津阿尔塔公司；对甲基苯甲醛购自上海磐靠生物科技有限公司；氘代对甲基苯甲醛购自广州谱恩科技有限公司；乙腈和甲醇(色谱纯)购自上海泰坦科技股份有限公司。
3、溶液配制
(1)准确称取10mg鹿花菌素的标准品至10mL容量瓶中，使用甲醇定容，作为标准贮备液，避光保存于-20℃。混合工作溶液使用甲醇对标准贮备液进行梯度系列稀释得到。
(2)准确称取5g对甲基苯甲醛至50mL容量瓶中，使用甲醇定容，遮光保存于室温条件下。
(3)准确称取100mg氘代对甲基苯甲醛至10mL容量瓶中，使用甲醇定容，作为贮备液，遮光保存于室温条件下。
4、鹿花菌素酸解为甲基肼过程
(1)酸解中乙醇溶液的选择
取1mL尿液样本与1mL乙腈稀释的鹿花菌素标准品至2mL试管中，剧烈震荡涡旋1min后置高速离心机12000r/min离心5min。取上清液0.4mL至1.5mL试管中，先加入0.2mL乙醇水溶液，质量百分浓度分别为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％，再加入 0.2mL浓度为4mol/L的盐酸溶液，置恒温混匀仪转速为1000rpm的条件下50℃反应120min。然后取200μL水解后溶液至1.5mL试管中，加入200μL浓度为1mg/mL的对甲基苯甲醛溶液，置恒温混匀仪转速为1000rpm的条件下50℃反应60min，过0.22μm有机系微孔滤膜后得到的过滤液进液相色谱串联质谱仪进行分析，通过比较峰面积大小判断鹿花菌素水解为甲基肼的效率。
(2)酸解中盐酸溶液的选择
取1mL尿液样本与1mL乙腈稀释的鹿花菌素标准品至2mL试管中，剧烈震荡涡旋1min后置高速离心机12000r/min离心5min。取上清液0.4mL至1.5mL试管中，先加入0.2mL质量百分浓度为50％的乙醇水溶液，再加入0.2mL盐酸溶液，浓度分别为1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L和5mol/L，置恒温混匀仪转速为1000rpm的条件下 50℃反应120min。然后取200μL水解后溶液至1.5mL试管中，加入 200μL浓度为1mg/mL的对甲基苯甲醛溶液，置恒温混匀仪转速为 1000rpm的条件下50℃反应60min，过0.22μm有机系微孔滤膜后得到的过滤液进液相色谱串联质谱仪进行分析，通过比较峰面积大小判断鹿花菌素水解为甲基肼的效率。
(3)酸解中温度和时间的选择
取1mL尿液样本与1mL乙腈稀释的鹿花菌素标准品至2mL试管中，剧烈震荡涡旋1min后置高速离心机12000r/min离心5min。取上清液0.4mL至1.5mL试管中，先加入0.2mL质量百分浓度为50％的乙醇水溶液，再加入0.2mL浓度为4mol/L的盐酸溶液，置恒温混匀仪转速为1000rpm的条件下室温、50℃反应20、40、60、80、100 和120min。然后取200μL水解后溶液至1.5mL试管中，加入200μL 浓度为1mg/mL的对甲基苯甲醛溶液，置恒温混匀仪转速为1000rpm 的条件下50℃反应60min，过0.22μm有机系微孔滤膜后得到的过滤液进液相色谱串联质谱仪进行分析，通过比较峰面积大小判断鹿花菌素水解为甲基肼的效率。
5、液相色谱和质谱条件
(1)色谱条件
流动相：乙腈(A)和醋酸铵水溶液(B)；流速为0.3mL/min；色谱柱为Acquity UPLCBEH C18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；柱温为40℃；进样体积为5μL。梯度洗脱程序如下：0min，10％A；1min， 10％A；3min，90％A；5min，90％A；5.2min，10％A；6min，10％ A。
(2)质谱条件
电喷雾离子源正离子模式(ESI+)；离子源参数为：喷雾电压为 5500V；离子源温度为500℃；气帘气压力为8psi；鞘气压力为50psi；辅助气压力为50psi；气帘气为35psi。待测样本的衍生化产物和内标物的质谱参数如表1所示。
表1衍生化产物的质谱参数
Figure BDA0003314110990000081
在本发明的质谱条件下，鹿花菌素衍生化产物能够被准确的检测出。
6、结果分析
(1)以尿液为样本，酸解反应在不同乙醇浓度下所得检测结果如表2所示。
表2不同乙醇浓度对鹿花菌素水解物信号响应的影响
Figure BDA0003314110990000091
根据表2可以看出，当乙醇质量百分浓度为30～70％时，鹿花菌素水解为甲基肼的信号响应值无显著差异，即乙醇质量百分浓度为 50％是最佳反应浓度。
(2)以尿液为样本，酸解反应在不同盐酸浓度下所得检测结果如表3所示。
表3不同盐酸浓度对鹿花菌素水解物信号响应的影响
Figure BDA0003314110990000092
根据表3可以看出，当盐酸浓度为3～5mol/L时，鹿花菌素水解为甲基肼的信号响应值无显著差异，即选择盐酸浓度为4mol/L是最佳反应浓度。
(3)以尿液为样本，酸解反应在不同温度和时间条件下所得检测结果如表4所示。
表4不同温度和时间对鹿花菌素水解物信号响应的影响
Figure BDA0003314110990000093
根据表4可以看出，当温度为50℃时，鹿花菌素水解为甲基肼的信号值优于常温，即50℃是最佳反应温度。当时间为20min时，鹿花菌素还没有完全水解为甲基肼，时间为40min以上时信号响应值无明显差异，说明时间超过40min时鹿花菌素能完全水解为甲基肼，即40min为最佳反应时间。
(4)以蘑菇为样本，对蘑菇水解为甲基肼条件的优化时，结果和(1)～(3)中相似，后续均加入50％乙醇和4mol/L盐酸后50℃反应40min。
实施例2衍生化反应条件的优化
1、衍生化试剂的选择
本实施例仅验证衍生化反应的条件，直接用甲基肼进行衍生化反应，省略酸解反应的步骤。取200μL浓度为20ng/mL的甲基肼溶液至1.5mL试管中，加入200μL浓度为1mol/mL的衍生化试剂，分别为对甲基苯甲醛、邻硝基苯甲醛和苯甲醛，置恒温混匀仪转速为1000rpm的条件下50℃反应60min，过0.22μm有机系微孔滤膜后得到的过滤液进液相色谱串联质谱仪进行分析，通过比较峰形、峰面积大小判断衍生化效率。
2、衍生化过程
(1)衍生化试剂浓度的选择
本次实验仅验证衍生化反应的条件，直接用甲基肼进行衍生化反应，省略酸解反应的步骤。取1mL尿液样本与1mL乙腈稀释的甲基肼至2mL试管中，剧烈震荡涡旋1min后置高速离心机12000r/min 离心5min，取上清液0.4mL至1.5mL试管中，先加入0.2mL质量百分浓度为50％的乙醇水溶液，再加入0.2mL浓度为4mol/L的盐酸溶液，剧烈震荡涡旋1min后，取200μL溶液至1.5mL试管中，加入200μL 衍生化试剂对甲基苯甲醛，浓度分别为0.5、1、2、10、20、50和 100mg/mL，置恒温混匀仪转速为1000rpm的条件下50℃反应60min，过0.22μm有机系微孔滤膜后得到的过滤液进液相色谱串联质谱仪进行分析，通过比较峰面积大小判断衍生化效率。
(2)衍生化时间的选择
取1mL尿液样本与1mL乙腈稀释的甲基肼至2mL试管中，剧烈震荡涡旋1min后置高速离心机12000r/min离心5min，取上清液 0.4mL至1.5mL试管中，先加入0.2mL质量百分浓度为50％的乙醇水溶液，再加入0.2mL浓度为4mol/L的盐酸溶液，剧烈震荡涡旋1min 后，取200μL溶液至1.5mL试管中，加入200μL浓度为20mg/mL的对甲基苯甲醛，置恒温混匀仪转速为1000rpm的条件下50℃反应10、 20、40、60和100min，过0.22μm有机系微孔滤膜后得到的过滤液进液相色谱串联质谱仪进行分析，通过比较峰面积大小判断衍生化效率。
(3)衍生化温度的选择
取1mL尿液样本与1mL乙腈稀释的甲基肼至2mL试管中，剧烈震荡涡旋1min后置高速离心机12000r/min离心5min，取上清液 0.4mL至1.5mL试管中，先加入0.2mL质量百分浓度为50％的乙醇水溶液，再加入0.2mL浓度为4mol/L的盐酸溶液，剧烈震荡涡旋1min 后，取200μL溶液至1.5mL试管中，加入200μL浓度为20mg/mL的对甲基苯甲醛，置恒温混匀仪转速为1000rpm的条件下30、50、60 和70℃反应60min，过0.22μm有机系微孔滤膜后得到的过滤液进液相色谱串联质谱仪进行分析，通过比较峰面积大小判断衍生化效率。
3、衍生化反应的终止
取衍生化反应液200μL，加入10～15μL浓度为10mol/L的氢氧化钠溶液，充分涡旋后，混合溶液用pH试纸进行测试，将pH值调节至9-12。
4、结果分析
(1)以尿液为样本，以对甲基苯甲醛、邻硝基苯甲醛和苯甲醛为衍生化试剂条件下的MRM图谱如图1所示。
根据图1可以看出，对甲基苯甲醛与甲基肼衍生化后，出1个峰且峰面积最大，没有杂峰，邻硝基苯甲醛与甲基肼衍生化后，出现2 个峰且都呈线性，可能存在同分异构体情况，苯甲醛与甲基肼衍生化后，没有出现明显的峰形且杂峰干扰较大，所以选择对甲基苯甲醛作为衍生化试剂。
(2)以尿液为样本，不同对甲基苯甲醛浓度下的检测结果如表 5所示。
表5不同对甲基苯甲醛浓度对甲基肼衍生化后峰面积响应的影响
Figure BDA0003314110990000111
根据表5可以看出，当对甲基苯甲醛浓度为20mg/mL时，甲基肼衍生化后的信号响应值最高，即对甲基苯甲醛浓度为20mg/mL是最佳甲基肼衍生化条件的浓度。
(3)以尿液为样本，不同衍生化时间条件下所得检测结果如表 6所示。
表6不同衍生化时间对甲基肼峰面积响应的影响
Figure BDA0003314110990000121
根据表6可以看出，当衍生化时间为10min时，甲基肼的信号响应值低于其它衍生化时间的产物，衍生化时间为20～60min时，甲基肼的信号响应值相差不大，说明衍生化时间为20min以上时都能衍生完全，为节省检测时间，选择衍生化20min作为最佳反应时间。
(4)以尿液为样本，不同衍生化温度条件下所得检测结果如表 7所示。
表7不同衍生化温度对甲基肼峰面积响应的影响
Figure BDA0003314110990000122
根据表7可以看出，衍生化温度在40～50℃条件下，甲基肼的信号响应值无明显差异，50℃能相对高一点；当衍生化温度达60℃以上时，甲基肼的信号值反而降低，推测可能原因为在较高的温度下，衍生化试剂可继续与甲基肼中的仲胺发生反应，从而生成其它的衍生化产物，导致检测信号的降低。因此，选择50℃条件下进行衍生化反应。
(5)以蘑菇为样本，对蘑菇提取液进行衍生化条件的优化时，结果和(1)～(4)中相似，后续均在添加20mg/mL的甲基苯甲醛浓度下50℃反应20min。
实施例3
采用实施例1和实施例2中确定的最佳提取方法和衍生化条件进行处理，然后进行液相色谱串联质谱仪分析测定。取1mL尿液样本与1mL乙腈稀释的鹿花菌素标准品至2mL试管中，剧烈震荡涡旋 1min后置高速离心机12000r/min离心5min。取上清液0.4mL至1.5mL试管中，先加入0.2mL质量百分浓度为50％的乙醇水溶液，再加入0.2mL浓度为4mol/L的盐酸溶液，置恒温混匀仪转速为1000rpm的条件下50℃反应40min。然后取200μL水解后溶液至1.5mL试管中，加入200μL浓度为20mg/mL的对甲基苯甲醛溶液，置恒温混匀仪转速为1000rpm的条件下50℃反应20min，过0.22μm有机系微孔滤膜后得到的过滤液进液相色谱串联质谱仪进行分析，结果如图2所示。
由图2可以看出，鹿花菌素衍生化产物在MRM谱图中的峰型较好，且具有较好的分离度。
实施例4检测鹿花菌素的方法学验证
1、线性
空白纯水溶液使用不同浓度的鹿花菌素溶液加标，采用实施例1 和实施例2中确定的最佳提取方法和衍生化条件进行处理，再用相同的方法将氘代对甲基苯甲醛衍生化后的溶液作为内标，添加到加标溶液中，配置成浓度为0.5、1、2、5、10、20、50、100、200ng/mL的标准液，然后进行液相色谱串联质谱仪分析测定。以峰面积作为Y 轴，鹿花菌素的浓度作为X轴，绘制标准曲线，所得结果如图3所示。
根据图3可以看出，鹿花菌素标准曲线的R2值均大于0.99，在纯水基质中线性良好。
2、回收率
在尿液、血浆、蘑菇样本中加标鹿花菌素，采用实施例1和实施例2中确定的最佳提取方法和衍生化条件进行处理，再用相同的方法将氘代对甲基苯甲醛衍生化后的溶液作为内标，添加到加标溶液中，然后进行液相色谱串联质谱仪分析，测试回收率，尿液和血浆的加标浓度分别为5、20、50、200μg/L，蘑菇的加标浓度分别为20、40、 200、400μg/kg。根据待测物的峰面积，使用图3的标准曲线进行定量，结果如表8所示。
表8尿液、血浆和蘑菇中鹿花菌素的加标回收率
Figure BDA0003314110990000131
根据表8可以看出，尿液、血浆和蘑菇中鹿花菌素的回收率良好，均在88％～117％之间。
3、灵敏度
通过对标准溶液的检出限(LODs)和定量限(LOQs)进行评价，建立了该方法的灵敏度，LODs和LOQs分别为接近或高于信噪比3 倍和10倍的浓度。通过在尿液、血浆和蘑菇基质中添加鹿花菌素标准溶液并进行梯度稀释，采用实施例1和实施例2中确定的最佳提取方法和衍生化条件进行处理，然后进行液相色谱串联质谱仪分析测定。得出鹿花菌素在尿液、血浆中的LODs为1ng/mL，LOQs为 4ng/mL，在蘑菇中的LODs为10ng/g，LOQs为20ng/g。
实施例5盲样测试
尿液(实验室内部人员提供)、血浆(小鼠血浆，采购于上海源叶生物科技有限公司)和蘑菇样品(香菇干品，购买自上海市奉贤区世纪联华超市)经盲样加标后，由其他试验人员共3名按照本发明的检测方法进行测试，提取条件和衍生化条件均为实施例1～2中确定的最佳条件，测试结果如表9所示：
表9盲样加标测试结果
Figure BDA0003314110990000141
其中，尿、血样本1-4中加标的浓度分别为：5、20、50、200μg/L，蘑菇样本1-4中加标的浓度分别为：20、40、200、400μg/kg。
表9中的结果表明，所有定量结果均达到满意结果，本发明提供的检测方法具有较高的准确度。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种鹿花菌素的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将待测样本与提取溶剂混合提取后所得的提取液进行离心，收集上清液；
将所述上清液用乙醇和盐酸酸解，得到鹿花菌素水解液；将所述鹿花菌素水解液与对甲基苯甲醛混合进行衍生化反应，得到待测样本的衍生化产物；通过液相色谱串联质谱法对衍生化产物进行检测分析，计算得到所述待测样本中鹿花菌素的含量；
所述检测方法中还添加有内标物，所述内标物为鹿花菌素标准品经乙醇和盐酸水解后的产物与氘代对甲基苯甲醛混合反应所得；
所述鹿花菌素水解液与对甲基苯甲醛的体积比为1：1～2；
所述衍生化反应的温度为30～50℃，所述衍生化反应的时间为20～60min；
所述检测的色谱条件为：流动相为乙腈A和醋酸铵水溶液B；流速为0.3mL/min；色谱柱为Acquity UPLC BEH C18柱；梯度洗脱程序为：0min，10％A；1min，10％A；3min，90％A；5min，90％A；5.2min，10％A；6min，10％A；
质谱条件为：电喷雾离子源正离子模式；离子源参数为：喷雾电压为5500V；离子源温度为500℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样本包括蘑菇、尿液或血浆。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，当所述待测样本为蘑菇时，所述提取溶剂为乙腈溶液或甲醇溶液；所述待测样本为尿液或血浆时，所述提取溶剂为乙腈。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙醇的质量百分浓度为30％～70％，所述盐酸的浓度为3～5mol/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酸解的温度为40～60℃，所述酸解的时间为40～80min。
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