CN112646806A - 一种土壤dna快速提取方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高效提取土壤微生物DNA的方法，本试剂盒无需有机溶剂，使用胍盐和无机盐缓冲液DNA提取试剂盒相结合的方法，能够有效去除腐殖质，脂类和糖类物质对DNA提取的干扰，能适应于各种土壤类型，能够有效地富集DNA，并去除腐殖质的污染。DNA纯度和浓度检测实验结果证明本发明提取方法获得的DNA既能够达到下游实验的要求，也能有效的降低腐殖质的影响。

Description

一种土壤DNA快速提取方法及试剂盒
技术领域
本发明属于微生物学和分子生物学技术领域，具体涉及一种高效提取土壤微生物DNA的方法及试剂盒。
背景技术
由于土壤微环境的多样化，土壤微生物具有高度多样性。这些高度多样性的微生物及群落功能的研究不但可以了解生命如何耐受极端环境、新的生物能源、生命进化以及微生物与环境之间的相互作用，还可以用于人类疾病新型诊断，新型治疗等方法的开发。
研究土壤微生物多样性的有效手段是对土壤中的DNA进行分离纯化及分析，跟踪某些目标菌株或重组基因在自然环境中的行为；也可以用来揭示土壤微生物生态***中的基因的多样性及其随环境的变化；还以从各种不同来源的土壤中抽提和纯化土壤微生物基因组DNA是非常关键的一步。
基因组DNA提取的主要目标是高纯度，高浓度并且能代表多种微生物DNA，从而从微生物群落中获得最具代表性的DNA，并进行下一步分析(如PCR、SSCP、宏观基因组测序、质谱分析等)。但是来自环境中的样品含有非常复杂的成分，尤其是土壤中的腐质酸类物质在提取过程中很难有效去除，腐殖质有类似于核酸的物理化学性质。因此，大部分腐殖质连同被吸附的有机分子一起与DNA共同分离。腐殖酸对后续的有生物酶参与的分析，比如PCR扩增、内切酶消化、高通量测序等有极大的抑制作用。在大多数宏基因组研究中，从各种来源的土壤样本中分离出不含腐殖质的高纯度宏基因组DNA，是很大的挑战。此外，细胞裂解后粗提DNA的每一个纯化步骤，例如在DNA分子研究之前进行的重复性纯化步骤，不可避免的引起了DNA的损失。大部分基因组DNA提取方法全都存在缺陷，例如细胞裂解不完全，DNA吸附于土壤表层，土壤提取物中含有酶抑制剂以及DNA的丢失、降解和剪切。因此，研究一种高效提取土壤微生物基因组DNA的试剂盒，对于大规模开展土壤微生物基因组学研究显得十分必要。
发明内容
为解决土壤微生物DNA提取纯化过程中，不同土壤样本中腐殖质难以去除以及DNA回收率低等问题，本发明提供了—种20分钟内从各种土壤样本中提取不含腐殖质、高纯度、高浓度微生物基因组DNA的方法及试剂盒。
为了实现上述发明目的，本发明提供一种从生物量低且富含腐殖质的土壤中提取微生物总DNA的方法，其包括如下步骤：
所述用于评价土壤微生物群落多样性的土壤DNA提取方法，包括以下步骤：
(1) 称取新鲜土壤0. 5-1g于2mL EP管中，加入200μL Pre-Wash溶液，在漩涡振荡器上振荡2min；
(2) 加入600μL土壤裂解液，涡旋震荡5 min至样本充分混匀；70℃孵育10 min，孵育期间震荡2-3次；
(3) 12,000 rpm离心3 min。取上清液至新的1.5ml离心管中；
(4) 将步骤(3)获得的上清液转移到新的EP管中，随后上清液加入100µL杂质沉淀剂，涡旋混匀后冰浴5min。12,000rpm离心3min；
(5) 将步骤(4) 获得的上清液转移500µL到新的EP管中，加入250µL DNA结合液和500µL 乙醇；
(6) 将步骤(5) 获得的上清混合液转移到DNA吸附硅胶柱，以12000rpm的转速离心1min，移除离心液并保留DNA吸附柱；
(7) DNA吸附柱重新放入收集管中，向DNA吸附柱中加入500μL蛋白杂质去除液，以12000rpm的转速离心2min，移除离心液并保留DNA吸附柱；
(8) 将DNA吸附柱重新放入收集管中，向DNA吸附柱中加入500μL蛋白杂质去除液，以12000rpm的转速离心2min，移除离心液并保留DNA吸附柱；
(9) 将DNA吸附柱放入收集管中，向DNA吸附柱中加入700μL DNA漂洗液，以12000rpm的转速离心2min；将收集管中的离心液移除并保留DNA吸附柱，15000rpm转速下空管离心5min；
(10) 将DNA吸附柱放入收集管中，向DNA吸附柱中加入100μL DNA洗脱液，静置2min，15000rpm转速下离心2min ，离心液即为土壤DNA溶液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1. 与目前已有的土壤DNA方法相比，本发明所述的DNA提取方法操作简单，不但可以手动操作快速完成，还可以用于核酸纯化自动化工作站；
2. 本发明所述的DNA提取方法是在细胞裂解以前对土壤样品进行预处理，将胞外DNA及腐殖质进行去除，避免了后续分离纯化步骤存在腐殖质去除困难的问题；
3. 本发明所述的DNA提取方法适用性强，提取的土壤微生物DNA的OD260/OD230及OD260/OD280接近标准值，可直接应用于下游各种分子操作，不需要再次进行纯化；
4. 提取过程不使用酚、氯仿，减少对实验人员的身体健康伤害。
附图说明
图1是用本试剂盒提取的土壤DNA电泳图，从图1中可以看出，用本试剂盒提取的土壤DNA较明亮，无蛋白质杂带，表明该土壤DNA浓度较高，杂质较少；
图2是土壤DNA16S-rRNA基因PCR扩增电泳图，其中16S：16s rRNA基因；Marker：Marker 2000；从图2中可以看出，用该土壤DNA可以扩增出明亮的，预期大小的专一目的条带，表明该土壤DNA满足普通PCR扩增要求；
图3a是土壤DNA荧光定量PCR(qPCR)扩增曲线图，可以看出，荧光PCR扩增正常，表明试剂盒提取的DNA浓度满足荧光定量PCR的要求；
图3b是土壤DNA荧光定量PCR(qPCR)融解曲线图，可以看出，溶解峰型单一锐利，表明试剂盒提取的DNA纯度较高。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。
实施例1
(1) 称取0. 5g稻田湿润土壤样本于2mL EP管中，加入200μL Pre-Wash溶液，在漩涡振荡器上振荡2min；
(2) 加入600μL土壤裂解液，涡旋震荡5 min至样本充分混匀；70℃孵育10 min，孵育期间震荡2-3次；
(3) 12,000 rpm离心3 min。取上清液至新的1.5ml离心管中；
(4) 将步骤(3)获得的上清液转移到新的EP管中，随后上清液加入100µL杂质沉淀剂，涡旋混匀后冰浴5min。12,000rpm离心3min；
(5) 将步骤(4) 获得的上清液转移500µL到新的EP管中，加入250µL DNA结合液和500µL 乙醇；
(6) 将步骤(5) 获得的上清混合液转移到DNA吸附硅胶柱，以12000rpm的转速离心1min，移除离心液并保留DNA吸附柱；
(7) DNA吸附柱重新放入收集管中，向DNA吸附柱中加入500μL蛋白杂质去除液，以12000rpm的转速离心2min，移除离心液并保留DNA吸附柱；
(8) 将DNA吸附柱重新放入收集管中，向DNA吸附柱中加入500μL蛋白杂质去除液，以12000rpm的转速离心2min，移除离心液并保留DNA吸附柱；
(9) 将DNA吸附柱放入收集管中，向DNA吸附柱中加入700μL DNA漂洗液，以12000rpm的转速离心2min；将收集管中的离心液移除并保留DNA吸附柱，15000rpm转速下空管离心5min；
(10) 将DNA吸附柱放入收集管中，向DNA吸附柱中加入100μL DNA洗脱液，静置2min，15000rpm转速下离心2min ，离心液即为土壤DNA溶液。
实施例2
(1) 称取0. 5g化工厂附近干燥土壤样本于2mL EP管中，加入300μL Pre-Wash溶液，在漩涡振荡器上振荡2min；
(2) 加入700μL土壤裂解液，涡旋震荡5 min至样本充分混匀；70℃孵育10 min，孵育期间震荡2-3次；
(3) 12,000 rpm离心3 min。取上清液至新的1.5ml离心管中；
(4) 将步骤(3)获得的上清液转移到新的EP管中，随后上清液加入100µL杂质沉淀剂，涡旋混匀后冰浴5min。12,000rpm离心3min；
(5) 将步骤(4) 获得的上清液转移500µL到新的EP管中，加入250µL DNA结合液和500µL 乙醇和10µL DNA吸附磁性微珠，涡旋振荡混匀；
(6) 将(5)中的EP管置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去，将EP管取下磁力架，加入400μL蛋白杂质去除液，涡旋振荡混匀；
(7) 将(6)中的EP管置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去，将EP管取下磁力架，加入700μL DNA漂洗液，涡旋振荡混匀；
(8) 将(7)中的EP管置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去，将EP管取下磁力架，加入700μL DNA漂洗液，涡旋振荡混匀；
(9) 将(8)中的EP管置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪将液体吸取弃去，磁力架上放置5min；将EP管取下磁力架，加入50μL DNA洗脱液，静置2min，涡旋振荡混匀；
(10) 将(9)中的EP管置于磁力架上，放置1min，等磁珠全部吸附后，用移液枪吸取全部上清，磁珠弃去；
(11) 采用nonodorp仪器测定最后得到溶液的DNA浓度平均为97ng/μL，使用Nanodrop 2000测定其260/280比值平均为1.82。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域中的普通技术人员来说，在不脱离本发明核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种土壤DNA高效提取试剂盒，其特征在于：由以下七种溶液组成：
(1) Pre-Wash溶液：为KCl和硫酸铵的混合溶液，其中，KCl的浓度为500mM-2M之间，优选浓度为650mM-1.25M之间；硫酸铵的浓度为200-950mM之间，优选浓度为350-450mM之间；
(2) 土壤裂解液：为柠檬酸钠、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、SDS和NaCl的混合溶液，混合溶液中柠檬酸钠的浓度为10-100mM之间，优选浓度为50mM；CTAB的质量浓度为0.1-1%之间，优选质量浓度为0.2-0.5%之间；SDS的质量浓度为0.2-2％之间，优选质量浓度为0.5-1％之间；NaCl的浓度为20-600mM之间，优选浓度为50-200mM之间；
(3) 杂质沉淀剂：为曲拉通X-100和EDTA的混合溶液，其中，曲拉通X-100体积比浓度为0.5-3%之间，优选体积比浓度为1-2%之间；EDTA的浓度为10-100mM之间，优选浓度为20-50mM之间；
(4) DNA结合液：为NaCl、乙酸钠和PEG8000的混合溶液，其中，NaCl的浓度为500mM-2M之间，优选浓度为1-2M之间；PEG8000质量浓度为10-30%之间，优选浓度为15-20%之间，乙酸钠的浓度为500mM-2M之间，优选浓度为1-1.5M之间，用醋酸调溶液的pH值为4-5之间，优选PH为4.5；
(5) 蛋白杂质去除液：为硫酸铵和乙醇的混合溶液，其中，硫酸铵的浓度为300mM-2M之间，优选浓度为205-450mM之间；乙醇浓度为40-60 vt％之间，优选浓度为50 vt％；
(6) DNA漂洗液：为NaCl和乙醇的混合物，其中，乙醇的浓度为65-85 vt %之间，优选浓度为75-80 vt %之间；NaCl的浓度为20-200mM之间，优选浓度为50-100mM之间；
(7) DNA洗脱液：5mM的Tris-HCl缓冲液，pH值8.0-8.5。
2.一种通过权利要求1所述的土壤DNA提取试剂盒提取土壤DNA的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1) 称取新鲜土壤0. 5-1g于2mL EP管中，加入200μL Pre-Wash溶液，在漩涡振荡器上振荡2min；
(2) 加入600μL土壤裂解液，涡旋震荡5 min至样本充分混匀；70℃孵育10 min，孵育期间震荡2-3次；
(3) 12,000 rpm离心3 min，取上清液至新的1.5ml离心管中；
(4) 将步骤(3)获得的上清液转移到新的EP管中，随后上清液加入100µL杂质沉淀剂，涡旋混匀后冰浴5min，12,000rpm离心3min；
(5) 将步骤(4) 获得的上清液转移500µL到新的EP管中，加入250µL DNA结合液和500µL 乙醇；
(6) 将步骤(5) 获得的上清混合液转移到DNA吸附硅胶柱，以12000rpm的转速离心1min，移除离心液并保留DNA吸附柱；
(7) DNA吸附柱重新放入收集管中，向DNA吸附柱中加入500μL蛋白杂质去除液，以12000rpm的转速离心2min，移除离心液并保留DNA吸附柱；
(8) 将DNA吸附柱重新放入收集管中，向DNA吸附柱中加入500μL蛋白杂质去除液，以12000rpm的转速离心2min，移除离心液并保留DNA吸附柱；
(9) 将DNA吸附柱放入收集管中，向DNA吸附柱中加入700μL DNA漂洗液，以12000rpm的转速离心2min；将收集管中的离心液移除并保留DNA吸附柱，15000rpm转速下空管离心5min；
(10) 将DNA吸附柱放入收集管中，向DNA吸附柱中加入100μL DNA洗脱液，静置2min，15000rpm转速下离心2min ，离心液即为土壤DNA溶液。
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