CN117434276A

CN117434276A - 一种thsd7a抗体检测试剂盒及其用途

Info

Publication number: CN117434276A
Application number: CN202311695672.4A
Authority: CN
Inventors: 张清宇
Original assignee: Nanjing Yijian Medical Technology Co ltd
Current assignee: Nanjing Yijian Medical Technology Co ltd
Priority date: 2023-12-12
Filing date: 2023-12-12
Publication date: 2024-01-23

Abstract

本发明公开了一种THSD7A抗体检测试剂盒及其用途，所述试剂盒包含试剂Ra和试剂Rd，所述试剂Ra为磁微粒与THSD7A多肽或其抗体结合片段交联形成的偶联物；所述试剂Rd用于检测在所述THSD7A多肽或其抗体结合片段与生物样品中的THSD7A的自身抗体之间形成的抗原抗体复合物，其中，所述试剂Rd带有发光标记。本发明的试剂盒可配合全自动化学发光仪使用，使THSD7A抗体检测更加方便、准确、快速，具有稳定性好，灵敏度高，重复性好等优点，同时大大缩短了检测时间，35分钟就可出第一个检测，而且操作简易方便，真正实现了检测全自动化。

Description

一种THSD7A抗体检测试剂盒及其用途

技术领域

本发明属于免疫检测领域，具体涉及膜性肾病抗体检测试剂。

背景技术

膜性肾病是引起肾病综合征的主要原因之一。约15％的膜性肾病病例是继发性膜性肾病，其余的膜性肾病病例是特发性的，也称为自身免疫性原发性膜性肾病。约一半的未治疗特发性膜性肾病患者将发展成需要透析或肾移植的终末期肾病。

PLA2R1是特发性膜性肾病的主要自身抗原，可用于诊断和监测肾移植术之前和之后特发性膜性肾病的治疗，但是仅有约70％的患有特发性膜性肾病的患者具有抗PLA2R1自身抗体，所以存在诊断、预后和诊疗不表达PLA2R1自身抗原的特发性膜性肾病患者的需要。

1型血小板反应蛋白7A域(THSD7A)为特发性膜性肾病(IMN)两大主要靶抗原之一，近年来，随着我国IMN的发病率迅速增长，对IMN的准确诊断显的尤为重要。既往对MN患者的诊断依赖于肾穿刺活检，其虽为诊断金标准，但也是高风险的创伤性检查手段，因此有必要建立一种不伤害受检人的体外诊断THSD7A抗体的方法。目前市面上检测THSD7A抗体主要为BCA法，但操作繁琐、无法定量。

磁微粒化学发光免疫分析法是化学发光免疫分析法与磁性微粒载体技术相结合的一种检测方法，它利用磁微粒具有超顺磁性、成本低、能耗少和无污染等特点，将待测物抗原(抗体)包被磁微粒形成磁微粒-免疫复合物，发光标记物标记待测物抗原(抗体)制备标记结合物，通过免疫反应形成抗原-抗体-标记抗原(抗体)复合物，发光强度与待测物抗体(抗原)的含量成正比。由于悬浮性磁微粒作为载体具有较高的比表面积，能够更为充分地与样品反应，加之外加磁场的灵活应用，较酶标板载体具有更高的灵敏度和特异性、更快的检测速度和更好的重复性等优点，因此磁微粒化学发光免疫分析法日益受到人们的青睐，在生命科学、临床医学以及环境、食品、药物等领域得到广泛应用。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种THSD7A检测试剂盒及其制备方法。

根据本发明的一个方面，提供了一种THSD7A抗体检测试剂盒，所述试剂盒包含试剂Ra和试剂Rd，其中，所述试剂Ra为磁微粒与THSD7A多肽或其抗体结合片段交联形成的偶联物；所述Rd试剂用于检测在所述THSD7A多肽或其抗体结合片段与生物样品中的THSD7A的自身抗体之间形成的抗原抗体复合物，其中，所述Rd试剂带有发光标记。

根据一个实施方式，所述Rd试剂是抗人IgG抗体，所述发光标记是吖啶酯或碱性磷酸酶，所述发光标记与所述抗人IgG抗体形成偶联物。

根据一个实施方式，所述试剂Ra的保存液配方为：50mM Bicine、0.9% NaCl、0-0.05% BSA、0.03-0.05%甘氨酸和/或0.03-0.05%精氨酸、总浓度5%蔗糖和/或海藻糖、0.1%Proclin-300，pH7.5；所述试剂Rb的保存液配方为：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、0-1%的 BSA、0-1% 酪蛋白、总浓度为5% 的甘露醇和/或海藻糖和/或蔗糖、0.1% Proclin-300，pH 6.5。优选地，所述Ra的保存液配方为：50mM Bicine、0.9% NaCl、0.05% BSA、0.05%精氨酸、5%蔗糖、0.1% Proclin-300，pH7.5，所述试剂Rb的保存液配方为：50mM PB、0.9%NaCl、0.1% 吐温-20、1% 酪蛋白酸钠、5% 甘露醇、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

根据一个实施方式，所述试剂盒还包含PLA2R1多肽或其抗体结合片段。

根据一个实施方式，所述试剂盒还包含标准品和磷酸盐缓冲液。

根据一个实施方式，所述生物样品是全血、血清、血浆或肾活检。

根据一个实施方式，所示试剂盒用于诊断膜性肾病的用途。优选地，所述膜性肾病是特发性膜性肾病。

根据本发明的另一个方面，提供了所述试剂盒用于评估对患者中的膜性肾病的治疗的有效性的体外方法，所述方法包括：(i)点测定在第一时间点从所述患者获得的样品中的抗THSD7A自身抗体的水平，(ii)测定在第二时间点从所述患者获得的样品中的抗THSD7A自身抗体的水平，以及(iii)比较两个时间点的自身抗体的水平，其中：与所述第一时间点相比，所述第二时间点中抗THSD7A自身抗体水平的降低表明治疗有效，和/或与所述第一时间点相比，所述第二时间点中抗THSD7A自身抗体水平的增加表明治疗无效。

本发明的试剂盒可配合全自动化学发光仪使用，使THSD7A抗体检测更加方便、准确、快速，具有稳定性好，灵敏度高，重复性好等优点，同时大大缩短了检测时间，35分钟及可出第一个检测，而且操作简易方便，真正实现了检测全自动化。

此外，本发明的试剂盒适于诊断膜性肾病，尤其是特发性膜性肾病，以及PLA2R1阴性膜性肾病患者。

本申请的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施方式及其说明用于解释本申请。在附图中。

图1为本发明试剂盒在不同样品浓度的拟合曲线。

图2为本发明检测试剂与欧蒙THSD7A抗体ELISA检测试剂盒的拟合曲线。

实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施方式及各个实施方式中的特征可以相互组合。

下面将参考附图并结合实施方式来详细说明本申请。

本发明人发现磁微粒化学发光法配合全自动化学发光仪使用，可更加方便、准确、快速检测THSD7A抗体。

定义。

术语“膜性肾病”具有其在本领域中的一般含义，包括由继发性因素诸如***性红斑狼疮、乙型肝炎或梅毒等引起的继发性膜性肾病和原发性自身免疫性膜性肾病（特发性膜性肾病）。

术语“生物标志物”和“标志物”在本文中可互换使用。它们是指作为生物过程、生物事件和/或病理状况的独特指示物的物质。根据本发明，THSD7A蛋白(或THSD7A多肽)及其任何抗体结合片段和抗THSD7A自身抗体是膜性肾病、特别是特发性膜性肾病的生物标志物。

术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，是指多种长度的氨基酸序列，以其中性(不带电)形式或盐形式，并且未修饰或通过糖基化、侧链氧化、磷酸化、瓜氨酸化或转谷氨酰胺修饰。在某些实施方案中，氨基酸序列是全长天然蛋白。在其他实施方案中，氨基酸序列是全长蛋白质的较小片段。在其它实施方案中，氨基酸序列通过附接于氨基酸侧链的附加取代基修饰，诸如添加N-或C-末端的蛋白质标签、糖基单位、脂质或无机离子诸如磷酸盐，以及涉及链的化学转化修饰，诸如巯基的氧化。因此，术语“蛋白质”(或其等同术语)旨在包括经历不显著改变其特定性质的那些修饰的全长天然蛋白质或其片段的氨基酸序列。特别地，术语“蛋白质”包括蛋白质同种型，即由相同基因编码但在pI或MW或两者上不同的变体。此类同种型在其氨基酸序列(例如，作为选择性剪接或有限的蛋白水解的结果)方面可以不同，或者可以由差异翻译后修饰(例如糖基化、酰化、磷酸化)引起。

术语THSD7A（Thrombospondin Type 1 Domain Containing 7A，含有I型血小板应答蛋白结构域的7A）具有本领域中的一般含义，并且指在足细胞上高表达的1657个氨基酸的蛋白质，并且在血管发生期间通过FAK依赖性机制参与内皮细胞迁移和丝状伪足形成。该术语可以包括天然存在的THSD7A及其变体和修饰形式。THSD7A可以来自任何来源，但通常是哺乳动物(例如人和非人灵长类动物或其他哺乳动物物种)THSD7A，特别是人THSD7A。在Q9UPZ6(UniProt数据库)和NP_056019(GenPept数据库，前体序列)中提供示例性人天然THSD7A氨基酸序列，并且在NM_015204(GenBank数据库，前体序列)中提供示例性人天然THSD7A mRNA序列。

如本文所用，表述“THSD7A的片段”是指THSD7A的连续元件。通常，所述片段是生物活性片段，即它包含THSD7A的一种或多种功能性质。在本发明的上下文中，THSD7A的“片段”包含、优选由THSD7A的整个氨基酸序列的至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少94％，至少96％，至少98％，至少99％组成。优选地，所述片段包含THSD7A的整个氨基酸序列中至少100个，至少200个，至少300个，至少400个，至少500个，至少600个，至少700个，至少800个，至少900个，至少1000个，至少1100个，至少1120个，至少1250个，至少1300个，至少1400个，至少1500个，至少1600个，至少1620个，至少1640个氨基酸。优选地，所述片段被针对THSD7A的自身抗体识别。测定片段与所述自身抗体相互作用的能力可以通过上述或本领域已知的用于测定直接结合的方法之一完成。

THSD7A抗体存在于约15％的患有特发性膜性肾病的患者的血清中（其中不存在抗PLA2R1自身抗体）。

术语PLA2R1（分泌性磷脂酶A2受体，也称为PLA2R1）具有在本领域中的一般含义，并且本文中指M型磷脂酶A2受体，其是通过PLA2R1基因在人类中编码的受体，特别地已知为特发性膜性肾病的主要抗原肾病。在NP_001007268(GenPept数据库)中提供示例性人天然PLA2R1氨基酸序列，并且在NM_001007267(GenBank数据库)中提供示例性人天然THSD7AmRNA序列。值得注意的是，本文公开的所有对数据库的引用诸如代码或登录号均指可在2014年7月24日在线获得的版本。

术语“PLA2R1阴性患者”或“THSD7A阴性患者”是指其血清不含分别针对PLA2R1或THSD7A的自身抗体(或至少不含可检测的自身抗体)的患者。相反，“PLA2R1阳性患者”或“THSD7A阳性患者”是指其血清含有分别针对PLA2R1或THSD7A的自身抗体的患者。

术语“自身抗体”具有其在本领域中的一般含义，并且是指由受试者(或患者)的免疫***产生的并针对受试者(或患者)自身蛋白质(例如THSD7A)的抗体。自身抗体可攻击身体自身的细胞、组织和/或器官，引起炎症和细胞损伤。术语“识别THSD7A的自身抗体”可以与“抗THSD7A自身抗体”互换使用。在患者中发现的大多数抗THSD7A自身抗体是IgG4亚类；也发现了亚类IgG3、IgG2和IgG1。

当在本文中与抗原(例如THSD7A)结合使用时，术语“抗体结合片段”是指保留抗原结合抗体以形成抗体抗原复合物的能力的抗原片段。特别地，本发明的抗原的抗体结合片段保留了结合对膜性肾病特异性的自身抗体的能力。抗原的合适的抗体结合片段可以由本领域技术人员通过简单试验来鉴定，以确定其结合膜性肾病的特异性自身抗体的能力。

如本文所用，术语“患者”是指人类受试者或另一哺乳动物受试者（例如灵长类动物、狗、猫、山羊、马、猪、小鼠、大鼠、兔等），它们可患有膜性肾病、特别是特发性膜性肾病。优选地，患者是人类患者。更优选地，所述患者被怀疑患有膜性肾病、特别是特发性膜性肾病。

术语“生物样品”在本文中以其最广泛的含义使用。生物样品通常被获得用于受试者。所述受试者是哺乳动物，优选人。通常，生物样品通常从患者获得。通常，所述样品包含一组代表性的自身抗体。

样品可以是可以测定本发明的生物标志物的任何生物组织或流体。这样的样品包括但不限于可以含有或不含有细胞，例如血液(例如全血、血清或血浆)的体液。这样的样品还包括活检(例如肾活检)。术语生物样品还包括通过处理生物样品衍生的任何材料。衍生材料包括但不限于从样品中分离的细胞(或其后代)或从样品提取的蛋白质。生物样品的处理可以涉及以下一种或多种：过滤、蒸馏、提取、浓缩、干扰组分的灭活、试剂的添加等。

在本发明的上下文中，术语“对照”，当用于表征受试者时，是指健康的受试者或已被诊断患有除肾病以外的特定疾病的患者。术语“对照样品”是指从健康受试者或诊断患有除肾病症之外的疾病的患者获得的一个或多于一个样品。

术语“正常”和“健康”在本文中可互换使用。他们是指没有显示与肾脏疾病相关的任何症状，并且没有诊断出患有膜性肾病或其他肾病的受试者。优选地，正常受试者没有使用影响肾***的药物上，并且没有被诊断为患有任何其他疾病。在某些实施方案中，与获得待测试的生物样品的受试者相比，正常受试者具有相似的性别、年龄和/或体重指数。术语“正常”在本文中也用于限定从健康受试者获得的样品。

如本文所用，术语“参考水平”是指在从对照获得的生物样品中测量的水平，或优选至从几个对照获得的生物样品中测量的几个水平的平均值。

如本文所用，术语“诊断”以最广泛的含义使用，并且包括膜性肾病的诊断、预后、诊疗和监测。

如本文所用，术语“治疗”是指减轻或缓解与膜性肾病(特别是特发性膜性肾病)相关的医学病况相关的至少一种不良作用或症状。这些包括减少抗THSD7A自身抗体的量，减少、抑制或终止抗THSD7A自身抗体的产生，抑制免疫***，并且当它们结合肾小球时减少与自身抗体的活性相关的炎症和降解/损伤。

如本文所用，术语“诊疗”是指例如通过诊断方法鉴定可能受益于特定治疗的患者的鉴定。

如本文所用，术语“治疗有效量”是指可以减少可溶性抗THSD7A自身抗体的量的活性剂的量。与在治疗开始之前存在于血清中的自身抗体的量相比，减少的量为自身抗体减少至少10％，特别是至少20％，更特别地至少40％，优选地至少60％，更优选地至少80％，甚至更优选地至少95％。

如本文所用，术语“药物组合物”是指本发明的活性剂(例如THSD7A多肽或其片段，表达所述THSD7A多肽或其片段的载体或表达所述THSD7A多肽或其片段的宿主细胞，如下所述)与药学工业中通常使用的化学品和化合物的药学上可接受的载体组合。

本发明提供了一种磁微粒化学发光免疫检测试剂盒、其制备方法及用途。通过磁微粒化学发光法，实现定量地检测样本中THSD7A抗体的目的。

本发明使用的试剂、耗材信息如表1所示。

表1 本发明使用的试剂、耗材信息

实施例1 THSD7A抗体磁微粒化学发光试剂盒的制备：THSD7A抗体磁微粒化学发光试剂盒的制备方法包括：

1、试剂Ra的制备：

（1）磁微粒活化&偶联

反应液：10-100 mM MES（优选10 mM MES），pH 5.0-6.5（优选pH 6.0）；

羧基磁微粒：粒径为1-3 μm（优选3 μm）。

步骤：

取10 mg羧基磁微粒，用1 mL磁微粒反应液清洗3次，每次清洗时涡旋混匀（约30s），用磁力架吸附磁微粒聚集完全后，弃去上清；

向清洗后的磁微粒中加入0.5 ml磁微粒活化液，涡旋混匀（约30s）；

先加入0.25 mL 5-20 mg/mL（优选10 mg/mL）的EDC溶液，涡旋混匀（约30s），再加入0.25 mL 5-20 mg/mL（优选10 mg/mL）的NHS溶液，涡旋混匀（约30s）；

26~37℃（优选37℃）混匀反应20-40 min（优选30min），用磁力架吸附磁微粒，等磁微粒聚集完全后，弃去上清；

用1 ml磁微粒标记液清洗活化后的磁微粒3次，每次清洗时涡旋混匀（约30s），用磁力架吸附磁微粒聚集完全后，弃去上清；

向清洗后的磁微粒中加入0.5 mL磁微粒标记液，涡旋混匀后加入0.05~0.2 mg（优选0.1 mg）的THSD7A蛋白，26~37℃（优选37℃）混匀1-4h（优选2h）。

（2）磁微粒封闭

封闭液：10-100 mM PBS，含0.1-5% BSA和0.05-0.5M乙醇胺，pH 6.5-8.0；优选：10mM PBS，含1%BSA和0.5M乙醇胺，pH 7.4。

步骤：用磁力架吸附磁微粒聚集完全后，弃去上清；取1 mL现配的封闭液加入到磁微粒中，涡旋混匀，26~37℃（优选37℃）混匀反应1~12 h（优选3h）。

（3）老化&保存

优化试剂Ra保存液，具体过程如下：

①配制保存液，选定缓冲体系&pH如表2所示。

表2 试剂Ra保存液初始配方信息

将封闭后的磁珠用保存液清洗3次，再使用保存液配制到10 mL，做好标记，45℃老化1天后，保存于2~8℃冰箱中，避免冰冻。一部分存于4℃冰箱中，一部分存于37℃老化箱中，7日后测试二者发光值并作对比，其中使用5种梯度稀释的THSD7A抗体作为阳性参考品，表3显示了试剂A-I的反光值下降百分比。

表3 试剂A-I的反光值下降百分比

由上表可见，方案E整体效果更好，所以采用E的缓冲体系及pH作为接下来组分优化的基础试剂。

②优化保存液中的蛋白以及糖类组分，选定缓冲体系&pH如表4所示。

表4试剂Ra保存液蛋白和糖类组分优化配方信息

将封闭后的磁珠用保存液清洗3次，再使用保存液配制到10mL，做好标记，45℃老化1天后，保存于2~8℃冰箱中，避免冰冻。一部分存于4℃冰箱中，一部分存于37℃老化箱中，7日后测试二者发光值并作对比，其中使用5种梯度稀释的THSD7A抗体作为阳性参考品，表5显示了试剂1-7的反光值下降百分比。

表5 试剂1-7的反光值下降百分比

由表5可见，蛋白类方案1、4、5保存效果较好，糖类方案1&2保存效果较好，将四者主要成分进行组合，配制以下保存液（表6）：

表6 试剂Ra保存液第三次筛选配方信息

将封闭后的磁珠用保存液清洗3次，再使用保存液配制到10 mL，做好标记，45℃老化1天后，保存于2~8℃冰箱中，避免冰冻。一部分存于4℃冰箱中，一部分存于37℃老化箱中，7日后测试二者发光值并作对比：其中使用2种梯度稀释的THSD7A抗体作为阳性参考品，表7显示了试剂1#-17#的反光值下降百分比。

表7 试剂1#-17#的反光值下降百分比

由表7可见，效果最好的方案为5#，即50mM Bicine、0.9% NaCl、0.05% BSA、0.05%精氨酸、5%蔗糖、0.1% Proclin-300，pH7.5；

其他效果较好的方案有。

方案4#：50mM Bicine、0.9% NaCl、0.05%BSA、0.05% 甘氨酸、5%海藻糖、0.1%Proclin-300，pH7.5。

方案9#：50mM Bicine、0.9% NaCl、0.05% 甘氨酸、0.05%精氨酸、5%蔗糖、0.1%Proclin-300，pH7.5。

方案11#：50mM Bicine、0.9% NaCl、0.05% BSA、0.05%甘氨酸、2.5%海藻糖、2.5%蔗糖、0.1% Proclin-300，pH7.5。

方案14#：50mM Bicine、0.9% NaCl、0.03% BSA、0.03%精氨酸、0.03%甘氨酸、5%海藻糖、0.1% Proclin-300，pH7.5。

将封闭后的磁珠用保存液5#清洗3次，用磁力架吸附磁微粒聚集完全后弃上清，再使用保存液5#配制到10 mL，做好标记，45℃老化1天后，保存于2~8℃冰箱中，避免冰冻。

③与对照磁珠保存液（货号：BMLB-70，厂家：BioMag）进行稳定性对比，分别测试配制当天的发光值以及37℃老化7天后的发光值，每个THSD7A抗体浓度重复测试三次，取平均值进行对比，表8显示了两种标准品浓度下发光值，从表8可以看出，本发明的试剂Ra保存液在配制当天以及在37℃老化7天后，发光值都显著高于购买的保存液。

表8 保存液5#与对照保存液的发光值数据

2、试剂Rb的制备：

10-100 mM PBS，含0.1-5% BSA、0.05-1% 吐温-20、0.04-0.1% Proclin-300、1-20mg/mL阻断剂和1-20mg/mL鼠IgG，pH7.0-8.0；该试剂为无色透明溶液。

3、试剂Rd的制备：

（1）标记

标记液：10-100 mM HEPES，pH7.0-9.0；优选10 mM HEPES，pH 8.0；

吖啶酯：NSP-DMAE-NHS或NSP-SA-NHS；优选NSP-SA-NHS；

取0.1 mg 抗人自身抗体（抗人IgG）加入到离心管中，用吖啶酯标记液，稀释至0.05-0.5mg/ml（优选0.1mg/ml）；

加入10-50 μg 吖啶酯溶液，涡旋混匀，用铝箔纸包裹，26-37℃混匀1-3h；优选加入20μg 吖啶酯溶液，涡旋混匀，用铝箔纸包裹，37℃混匀1h。

（2）封闭

配制5~20 mg/mL赖氨酸溶液（溶剂为吖啶酯标记液），取100 μL加入到吖啶酯溶液中，涡旋混匀，用铝箔纸包裹，16~37℃混匀0.5~3h；优选地，配制10 mg/mL赖氨酸溶液（溶剂为吖啶酯标记液），取100 μL加入到吖啶酯溶液中，涡旋混匀，用铝箔纸包裹，37℃混匀0.5h。

（3）纯化

将反应完的溶液使用脱盐柱和超滤管将未结合的吖啶酯进行洗脱。

老化&保存

优化试剂Rd保存液，具体过程如下：

①配制保存液，选定缓冲体系&pH如表9所示。

表9 试剂Rd保存液初始配方信息

将纯化后的吖啶酯标记物使用保存液配制到20mL，做好标记，45℃老化1天后，保存于2-8℃冰箱中，避免冰冻。一部分存于4℃冰箱中，一部分存于37℃老化箱中，7日后测试二者发光值并作对比，其中使用5种梯度稀释的THSD7A抗体作为阳性参考品，表10显示了试剂A-J的反光值下降百分比。

表10 试剂A-J的反光值下降百分比

表10可见，A、E、F、J整体保存效果更好，将四者主要成分进行组合，配制以下保存液，

②配制保存液，选定缓冲体系如表11所示。

表11 试剂Rd保存液1#-17#配方信息

将纯化后的的吖啶酯标记物使用保存液配制到20 mL，做好标记，45℃老化1天后，一部分存于4℃冰箱中，一部分存于37℃老化箱中，7日后测试二者发光值并作对比其中使用2种梯度稀释的THSD7A抗体作为阳性参考品，表7显示了试剂1#-17#的反光值下降百分比。

表12 试剂1#-17#的反光值下降百分比

由表12可见，效果最好的为14#保存液，即50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、1%酪蛋白酸钠、5% 甘露醇、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

将纯化后的吖啶酯标记物使用保存液14#配制到20mL，做好标记，45℃老化1天后，保存于2-8℃冰箱中，避免冰冻。

其他效果较好的方案有：

方案2#：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、1% BSA、2.5% 海藻糖、2.5% 甘露醇、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

方案3#：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、1% BSA、2.5% 蔗糖、2.5% 甘露醇、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

方案4#：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、1% 酪蛋白、2.5% 蔗糖、2.5% 海藻糖、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

方案5#：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、1% 酪蛋白、2.5% 海藻糖、2.5% 甘露醇、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

方案6#：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、1% 酪蛋白、2.5% 蔗糖、2.5% 甘露醇、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

方案7#：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、0.5% BSA、0.5% 酪蛋白、5% 海藻糖、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

方案8#：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、0.5% BSA、0.5% 酪蛋白、5% 蔗糖、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

方案9#：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、0.5% BSA、0.5% 酪蛋白、5% 甘露醇、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

方案10#：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、0.5% BSA、0.5% 酪蛋白、2.5% 蔗糖、2.5% 海藻糖、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

方案11#：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、0.5% BSA、0.5% 酪蛋白、2.5% 甘露醇、2.5% 海藻糖、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

方案12#：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、0.5% BSA、0.5% 酪蛋白、2.5% 甘露醇、2.5% 蔗糖、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

方案13#：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、1% 酪蛋白、5% 蔗糖、0.1%Proclin-300，pH 6.5。

方案15#：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、1% BSA、1.67% 甘露醇、1.67% 海藻糖、1.67% 蔗糖、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

方案16#：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、1%酪蛋白、1.67% 甘露醇、1.67% 海藻糖、1.67% 蔗糖、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

方案17#：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、0.5% BSA、0.5% 酪蛋白、1.67% 甘露醇、1.67% 海藻糖、1.67% 蔗糖、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

③与购买的吖啶标记物保存液（厂家：武汉德晟）进行稳定性对比，分别测试配制当天的发光值以及37℃老化7天后的发光值，每个THSD7A抗体浓度重复测试三次，取平均值进行对比。从表13可以看出，本发明的试剂Ra保存液在配制当天以及在37℃老化7天后，发光值都显著高于购买的保存液。

表13 保存液14#与购买保存液的发光值数据

本发明的试剂Ra、Rb、Rd在2~8℃条件下密闭储存均可稳定12个月。

实施例2 THSD7A抗体磁微粒化学发光试剂盒检测方法

实施例1的试剂盒可与全自动化学发光仪联合使用。

检测工具：迎凯I2000全自动化学发光仪；

检测条件：间接法定量检测；

实施例1的试剂盒与全自动化学发光仪联合使用，其Ra用量为5-100 μL，Rb用量为5-400 μL，Rd用量为5-200 μL，样本用量为5-150 μL，检测时间为30min；优选地，实际Ra用量50 μL，Rb用量90 μL。Rd用量100 μL，样本用量10 μL，检测时间30min。

本试剂盒具体检测过程包括：

（1）检测：

试剂上机前，将试剂瓶盖拧下，瓶口内有硅胶材质的软盖，请手动转动试剂瓶下方的齿轮，摇匀磁微粒。试剂使用时，仪器会自动摇匀磁微粒，使其处于悬浮状态；

试剂盒的相关信息通过扫描试剂瓶的二维码自动读取，信息读取成功即存入仪器中，试剂瓶上的二维码含有该批次的主曲线信息；

试剂使用过程中避免泡沫产生；

点击测试启动后，***会自动执行以下操作：

1）将反应杯载入通道，

2）吸取10 μL样本和90 μL的Rb到反应杯中，

3）混合、孵育，

4）吸取10 μL的稀释后的样本和50 μL的试剂Ra磁性微粒到反应杯中，

5）混合、孵育并冲洗反应混合物，

6）吸取100 μL的试剂Rd吖啶酯到反应杯中，

7）混合、孵育并冲洗反应混合物，

8）添加激发液A和激发液B到反应杯中，

9）读取信号发光值，计算样本中THSD7A抗体含量，

10）将反应杯中的物质吸到废液中，并将反应杯推导固体废弃物中。

（2）校准：

①校准品的准备

放置室温平衡15~20 分钟，轻轻旋转至混匀；

将校准品瓶盖打开，将校谁品分装到适用的样本管中使用（分装量不得少于最少必需样本量），分装完成及时将校准品瓶盖柠紧。

②使用校准品定值条码

每个批号的校准品合有一个校准品定值条码以便于在测定仪上输入校准值，通过测试校淮品来校正主曲线。

③校准品的运行设置

1）装裁校准品：

将校准品1、校准品2和校准品3装载到迎凯I2000全自动化学发光仪上。为了测试项目能进行校准，确保相应的试剂己装载在测定仪上；

2）根据测定伩说明书操作仪器进行定标；

3）通过测定校准品1、校准品2和校准品3，将预先定义的主曲线进行矫正，得到工作曲线。

实施例3

THSD7A抗体磁微粒化学发光检测试剂盒各项性能指标测定

灵敏度实验

使用PBS梯度稀释THSD7A抗体（货号：RM3411，厂家：诺唯赞），使其浓度分别为625、1250、2500、5000、10000、20000、40000 ng/mL，将梯度稀释后的抗体和稀释液放入全自动化学发光仪中，选择THSD7A程序进行检测，每种样品重复测定两次，取平均值，绘制灵敏度曲线（图1）：其中横坐标表示THSD7A抗体浓度（单位是ng/mL），纵坐标表示灵敏度（单位是RLU）。其拟合方程为：y =14627151.45 / (1 + (x / 36375.77)1.00362802) + 14612074，其中R^2=0.999984701873，说明拟合度很好，在实际检测中根据发光值换算成浓度值时结果更准确。

表14 本发明试剂在不同样品浓度的检测结果

（2）本发明检测试剂与欧蒙THSD7A抗体ELISA检测试剂盒（FA 1254-2005-51）：

从申请人收集的血清样品中随机抽取40例成年潜在膜性肾病患者的样本，分别采用本发明检测试剂（采用实施1配制的Ra、Rb、Rd试剂）和欧蒙THSD7A抗体ELISA检测试剂，结果见图2，两种试剂之间差异无统计学意义（P>0.05），相关系数r≥0.990。

（3）精密度实验

分别重复测试两个不同浓度水平(1250ng/mL和10000ng/mL)的控制物质，结果如表15所示，显示得到的变异系数CV分别为1.87%和2.56%，不仅满足行业内对化学发光法重复性的要求＜10%的要求，还远远优于其他THSD7A抗体检测方法的检测结果，说明本发明试剂的可重复性更好。

表15 本发明试剂检测的统计结果

以上所述仅为本申请的较佳实施方式而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种THSD7A抗体检测试剂盒，所述试剂盒包含试剂Ra和试剂Rd，其中，

所述试剂Ra为磁微粒与THSD7A多肽或其抗体结合片段交联形成的偶联物；

所述试剂Rd用于检测在所述THSD7A多肽或其抗体结合片段与生物样品中的THSD7A的自身抗体之间形成的抗原抗体复合物，其中，所述试剂Rd带有发光标记。

2.根据权利要求1所述的THSD7A抗体检测试剂盒，其中，所述试剂Rd是抗人IgG抗体，所述发光标记是吖啶酯或碱性磷酸酶，所述发光标记与所述抗人IgG抗体形成偶联物。

3.根据权利要求1所述的THSD7A抗体检测试剂盒，其中，所述试剂Ra的保存液配方为：50mM Bicine、0.9% NaCl、0-0.05% BSA、0.03-0.05%甘氨酸和/或0.03-0.05%精氨酸、总浓度5%的蔗糖和/或海藻糖、0.1% Proclin-300，pH7.5；所述试剂Rb的保存液配方为：50mMPB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、0-1%的BSA、0-1% 酪蛋白、总浓度为5% 的甘露醇和/或海藻糖和/或蔗糖、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

4.根据权利要求1所述的THSD7A抗体检测试剂盒，其中，所述试剂Ra的保存液配方为：50mM Bicine、0.9% NaCl、0.05% BSA、0.05%精氨酸、5%蔗糖、0.1% Proclin-300，pH7.5；所述试剂Rb的保存液配方为：50mM PB、0.9% NaCl、0.1% 吐温-20、1% 酪蛋白酸钠、5% 甘露醇、0.1% Proclin-300，pH 6.5。

5.根据权利要求1所述的THSD7A抗体检测试剂盒，所述试剂盒还包含PLA2R1多肽或其抗体结合片段。

6.根据权利要求1所述的THSD7A抗体检测试剂盒，所述试剂盒还包含标准品和磷酸盐缓冲液。

7.根据权利要求1所述的THSD7A抗体检测试剂盒，所述生物样品是全血、血清、血浆或肾活检。

8.权利要求1-7的任一项所述的THSD7A抗体检测试剂盒，其中，所示试剂盒用于诊断膜性肾病的用途。

9.根据权利要求8所述的THSD7A抗体检测试剂盒，所述膜性肾病是特发性膜性肾病。

10.权利要求1-9的任一项所述的THSD7A抗体检测试剂盒用于评估对患者中的膜性肾病的治疗的有效性的体外方法，所述方法包括：

(i)测定在第一时间点从所述患者获得的样品中的抗THSD7A自身抗体的水平，

(ii)测定在第二时间点从所述患者获得的样品中的抗THSD7A自身抗体的水平，以及

(iii)比较两个时间点的抗THSD7A自身抗体的水平，

其中：与所述第一时间点相比，所述第二时间点中所述抗THSD7A自身抗体水平的降低表明治疗有效，和/或

与所述第一时间点相比，所述第二时间点中所述抗THSD7A自身抗体水平的增加表明治疗无效。