JP2023525219A - タンパク質－アルギニンデイミナーゼ１（ｐａｄ１）自己抗原を使用する関節リウマチの診断及び評価のための組成物及び方法 - Google Patents
タンパク質－アルギニンデイミナーゼ１（ｐａｄ１）自己抗原を使用する関節リウマチの診断及び評価のための組成物及び方法 Download PDFInfo
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Abstract
本開示は、関節リウマチ（ＲＡ）患者における診断及び予後情報に関する臨床バイオマーカーとしての、ＰＡＤタンパク質、例えばＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４、又はその抗原断片の使用に関する。本開示はさらに、生物学的サンプル中のＰＡＤタンパク質、例えば抗ＰＡＤ１、又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４に対する自己抗体の検出のための方法及び組成物を提供する。
Description
[0001] 本出願は、その全体が参照により本明細書に援用される２０２０年５月１５日出願の米国特許仮出願第６３／０２５，８５４号による利益を主張する。
[0002] 本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に援用される配列表を含む。２０２１年５月１４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、１３５１０－０３９－２２８＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズが３３６，５３２バイトである。
１．分野
[0003] 本開示は一般に、分子及び細胞生物学及び免疫学の分野に関し、より詳細には、関節リウマチ（ＲＡ）患者の血清中の１つ以上のＰＡＤタンパク質、例えばＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及び他のＰＡＤタンパク質の組み合わせ、又はその抗原断片に対する自己抗体を検出する方法に関する。ＲＡを有するか又は有することが疑われる患者を診断する方法も本明細書で提供される。
[0003] 本開示は一般に、分子及び細胞生物学及び免疫学の分野に関し、より詳細には、関節リウマチ（ＲＡ）患者の血清中の１つ以上のＰＡＤタンパク質、例えばＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及び他のＰＡＤタンパク質の組み合わせ、又はその抗原断片に対する自己抗体を検出する方法に関する。ＲＡを有するか又は有することが疑われる患者を診断する方法も本明細書で提供される。
２．背景
[0004] 関節リウマチ（ＲＡ）は、炎症、疼痛、及び滑膜で裏打ちされた関節へのその後の損傷を特徴とする慢性自己免疫疾患である。他の関節炎状態とは異なり、ＲＡは、心臓血管系、呼吸器系及び筋系を含むがこれらに限定されない他の器官系に影響を及ぼし得る全身疾患である。疾患の正確な病因は不明であるが、ＲＡは、免疫系による自己タンパク質（自己抗体）に対する抗体の産生を特徴とする。ＲＡに関与する最も一般的な自己抗体は、リウマチ因子（ＲＦ）及び抗シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ）を含み、これらは、この疾患の分類基準の一部である。ＡＣＰＡは、ＲＡ患者において検出される血清学的因子の中で顕著な特徴であり、したがって有用な診断マーカー及び予後マーカーとして役立つ。（例えば、Aletaha D. et al., Ann. Rheum. Dis. 2010, 69, 1580-1588; Taylor et al., Autoimmune Dis; 2011:815038 (2011)参照）。しかしながら、ＲＡの臨床的不均一性は、信頼できるバイオマーカーとしてのＡＣＰＡ及びＲＦ単独の使用を排除する。びらん性疾患を有する患者は、関節損傷を予防するために、疾患の初期段階においてより積極的な治療を必要とする。ＲＡ及び疾患進行の患者を特異的に同定する、より正確なバイオマーカーが必要とされる。
[0004] 関節リウマチ（ＲＡ）は、炎症、疼痛、及び滑膜で裏打ちされた関節へのその後の損傷を特徴とする慢性自己免疫疾患である。他の関節炎状態とは異なり、ＲＡは、心臓血管系、呼吸器系及び筋系を含むがこれらに限定されない他の器官系に影響を及ぼし得る全身疾患である。疾患の正確な病因は不明であるが、ＲＡは、免疫系による自己タンパク質（自己抗体）に対する抗体の産生を特徴とする。ＲＡに関与する最も一般的な自己抗体は、リウマチ因子（ＲＦ）及び抗シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ）を含み、これらは、この疾患の分類基準の一部である。ＡＣＰＡは、ＲＡ患者において検出される血清学的因子の中で顕著な特徴であり、したがって有用な診断マーカー及び予後マーカーとして役立つ。（例えば、Aletaha D. et al., Ann. Rheum. Dis. 2010, 69, 1580-1588; Taylor et al., Autoimmune Dis; 2011:815038 (2011)参照）。しかしながら、ＲＡの臨床的不均一性は、信頼できるバイオマーカーとしてのＡＣＰＡ及びＲＦ単独の使用を排除する。びらん性疾患を有する患者は、関節損傷を予防するために、疾患の初期段階においてより積極的な治療を必要とする。ＲＡ及び疾患進行の患者を特異的に同定する、より正確なバイオマーカーが必要とされる。
[0005] タンパク質－アルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）は、シトルリン化として知られるプロセスであるシトルリンへのアルギニン残基の変換を介して、ＲＡにおいて自己抗原を生成する際に中心的な役割を果たすカルシウム依存性酵素である。ＡＣＰＡ及びＲＦの他に、ＰＡＤ酵素を標的とする自己抗体もＲＡに記載されている（例えばTakizawa et al., Scand. J. Rheumatol. 3: 212-215 (2005); Roth et al., Clin. Exp. Rheumatol. 1: 12-18 (2006); Halvorsen et al., Ann. Rheumatol. Dis. 67:414-417 (2008); Zhao et al., J. Rheumatol., 35:969-974 (2008); Darrah et al., Sci. Trans. Med., 5(186):186ra65 (2013); Darrah et al., Front. Immunol., 9:2696 (2018)参照）。したがって、ＰＡＤは、ＲＡ病因において中心的な役割を果たすようである。
[0006] ＰＡＤファミリーの合計５つのメンバー：ＰＡＤ１、２、３、４、及び６がヒトにおいて報告されている。５つのＰＡＤタンパク質の中で、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４は、関節リウマチ（ＲＡ）の病因において中心的な役割を果たすことが知られており、ＰＡＤ３と共に、それらも抗原標的として同定されている（例えば、Curran, A.M., et al., Nature Reviews Rheumatology, 2020; Darrah, E., et al., Ann Rheum Dis, 2012. 71(1): p. 92-8参照）。特に、特に、ＰＡＤ４（抗ＰＡＤ４）に対する抗体の検出は、疾患の重症度のマーカー及びより悪いベースラインのＸ線画像の関節損傷を有する患者と関連しており（例えば、Darrah E, et al. J Rheumatol., 46:329-330 (2019)参照）、一方、ＰＡＤ２（抗ＰＡＤ２）に対する抗体の検出は、ＲＡにおけるより少ない腫脹関節及びより少ない間質性肺疾患（ＩＬＤ）と関連している（例えば、Darrah et al., Front. Immunol., 9:2696 (2018)参照）。
[0007] 抗ＰＡＤ４の検出はＲＡと強く関連し、およそ９６％の特異性を有するが、ＰＡＤ４抗体は、通常、２０～４５％の有病率でＲＡ患者のサブグループに見出される（例えば、Ren J., et al., Clinical rheumatology, 36:2431-2438 (2017)参照）。抗ＰＡＤ２の検出は、一般に、抗ＰＡＤ４と関連せず、ＲＡ患者の約１８．５％に見られる。したがって、ＲＡの診断及び疾患進行の評価のためのさらなるバイオマーカーに対する満たされていない必要性が存在する。本開示は、この必要性を満たし、関連する利点も提供する。
３．概要
[0008] 一態様において、関節リウマチ（ＲＡ）の診断方法が本明細書で提供され、該方法は：（ａ）ＲＡを有することが疑われる対象由来の生物学的サンプルを、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質又はその抗原断片と接触させることと、（ｂ）少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片と反応性の自己抗体の存在を検出することと、を含み、前記自己抗体の存在はＲＡを示し、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む。
[0008] 一態様において、関節リウマチ（ＲＡ）の診断方法が本明細書で提供され、該方法は：（ａ）ＲＡを有することが疑われる対象由来の生物学的サンプルを、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質又はその抗原断片と接触させることと、（ｂ）少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片と反応性の自己抗体の存在を検出することと、を含み、前記自己抗体の存在はＲＡを示し、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む。
[0009] 特定の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１又はその抗原断片である。他の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片である。
[0010] いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質はさらに、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６又はその抗原断片からなる群から選択される１つ以上のＰＡＤタンパク質を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ２又はその抗原断片である。他の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ３又はその抗原断片である。さらなる実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、ＰＡＤ２、及びＰＡＤ３又はその抗原断片である。尚さらなる実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６又はその抗原断片である。
[0011] 関節リウマチ（ＲＡ）の進行を監視する方法も本明細書で提供され、該方法は：（ａ）ＲＡを有するか又は有することが疑われる対象由来の生物学的サンプルを、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質又はその抗原断片と接触させることと、（ｂ）少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片と反応性の自己抗体の存在を検出することと、を含み、前記自己抗体の存在は、疾患進行を示し、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む。
[0012] いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１又はその抗原断片である。他の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片である。特定の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質はさらに、ＰＡＤ３又はその抗原断片を含む。いくつかの実施形態では、前記自己抗体の存在は、ＲＡステージを示す。
[0013] 本開示はまた、関節リウマチ（ＲＡ）の進行を監視する方法を提供し、該方法は：（ａ）ＲＡを有する対象由来の生物学的サンプルを、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質又はその抗原断片と接触させることと、（ｂ）少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片に結合した自己抗体の非存在を検出することと、を含み、前記自己抗体の非存在は、疾患進行を示し、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む。
[0014] いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１又はその抗原断片である。他の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片である。特定の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質はさらに、ＰＡＤ３又はその抗原断片を含む。いくつかの実施形態では、前記自己抗体の存在は、ＲＡステージを示す。
[0015] 本開示のいくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、全血、血清、血漿滑液又は痰を含む。特定の実施形態では、生物学的サンプルは、血清又は血漿を含む。
[0016] 本開示のいくつかの態様では、抗原断片は、６～１２０、１２～１００、１８～８０、２４～６０、３０～５０又は３５～４５アミノ酸残基を含む。
[0017] いくつかの実施形態では、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片は、天然源からの単離、化学合成又は組換え発現を含む方法によって得られる。特定の実施形態では、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片は、化学合成によって得られる。
[0018] 本明細書で提供されるように、いくつかの実施形態では、検出は、イムノアッセイを含む。特定の実施形態では、イムノアッセイは、蛍光免疫吸着アッセイ（ＦＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、多重イムノアッセイ、タンパク質／ペプチドアレイイムノアッセイ、固相ラジオイムノアッセイ（ＳＰＲＩＡ）、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＩＦ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、粒子ベースの多分析物試験（ＰＭＡＴ）、及びドットブロットアッセイからなる群から選択される。
[0019] いくつかの実施形態では、検出は、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片に結合した前記自己抗体を、検出プローブと接触させることを含む。特定の実施形態では、検出プローブは、前記自己抗体に結合する。いくつかの実施形態では、検出プローブは、抗体又はその機能性断片を含む。他の実施形態では、検出プローブは、レポータータグを含む。
[0020] 特定の実施形態では、レポータータグは標識である。特定の実施形態では、標識は、フルオロフォア、酵素、化学発光部分、放射性部分、有機色素及び小分子からなる群から選択される。
[0021] いくつかの実施形態では、標識は蛍光標識である。特定の実施形態では、蛍光標識はフィコエリトリン（ＰＥ）である。
[0022] いくつかの実施形態では、レポータータグは、リガンド又は粒子を含む。特定の実施形態では、リガンドはビオチンである。いくつかの実施形態では、粒子は、ナノ粒子を含む。
[0023] ＰＡＤタンパク質に特異的な自己抗体を補足することができる少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質、又はその抗原断片；前記自己抗体を認識する検出プローブ、及び固体支持体を含む検出キットが本明細書で提供され、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む。
[0024] 特定の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１又はその抗原断片である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片である。
[0025] いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質はさらに、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６又はその抗原断片からなる群から選択される１つ以上のＰＡＤタンパク質を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ２又はその抗原断片である。他の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ３又はその抗原断片である。さらなる実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、ＰＡＤ２、及びＰＡＤ３又はその抗原断片である。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６又はその抗原断片である。
[0026] いくつかの実施形態では、キットはさらに、標識を含む。いくつかの実施形態では、標識は、フルオロフォア、酵素、化学発光部分、放射性部分、有機色素及び小分子からなる群から選択される。
[0027] いくつかの実施形態では、キットはさらに、陽性対照を含む。
[0028] いくつかの実施形態では、キットはさらに、１つ以上の補助試薬を含む。特定の実施形態では、１つ以上の補助試薬は、インキュベーション緩衝液、洗浄緩衝液、検出緩衝液及び検出器具からなる群から選択される。
[0029] いくつかの実施形態では、抗原断片は、６～１２０、１２～１００、１８～８０、２４～６０、３０～５０又は３５～４５アミノ酸残基を含む。
[0030] いくつかの実施形態では、検出プローブは、抗体又はその機能性断片を含む。他の実施形態では、検出プローブは、レポータータグを含む。特定の実施形態では、レポータータグは標識である。いくつかの実施形態では、標識は、フルオロフォア、酵素、化学発光部分、放射性部分、有機色素及び小分子からなる群から選択される。
[0031] いくつかの実施形態では、標識は蛍光標識である。特定の実施形態では、蛍光標識はフィコエリトリン（ＰＥ）である。
[0032] いくつかの実施形態では、レポータータグは、リガンド又は粒子を含む。特定の実施形態では、リガンドはビオチンである。いくつかの実施形態では、粒子は、ナノ粒子を含む。
[0033] いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズ、球体、粒子、膜、チップ、スライド、プレート、ウェル及び試験管からなる群から選択される。特定の実施形態では、ビーズ、球体又は粒子は、約０．１～約１００マイクロメートルの直径を有する。いくつかの実施形態では、膜は、ニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）及びポリ二フッ化ビニリデンからなる群から選択される。
[0034] いくつかの実施形態では、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片は、前記固体支持体にコンジュゲートされる。
４．図面の簡単な説明
[0035]コホートＩからのＲＡ及び非ＲＡ患者の区別を示す、抗ＰＡＤ１ ＩｇＧ（黒丸）、抗ＰＡＤ２ ＩｇＧ（暗灰色四角）、抗ＰＡＤ３ ＩｇＧ（三角）、抗ＰＡＤ４ ＩｇＧ（白丸）、及び抗ＰＡＤ６ ＩｇＧ（薄灰色四角）の受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を示す。実線は、区別なしを示す。各マーカーの曲線下面積（ＡＵＣ）は、凡例に示されている。略語：ＴＰＦ：真陽性率；ＦＰＦ：偽陽性率。
[0036]コホートＩＩからのＲＡ及び非ＲＡ患者の区別を示す、抗ＰＡＤ１（白丸）、抗ＰＡＤ２（黒丸）、抗ＰＡＤ３（白三角）、抗ＰＡＤ４（灰色四角）、及び抗ＰＡＤ６（黒灰色四角）の受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を示す。実線は、区別なしを示す。各マーカーの曲線下面積（ＡＵＣ）は、凡例に示されている。略語：ＴＰＦ：真陽性率；ＦＰＦ：偽陽性率。
[0037]非ＲＡ患者からのＲＡ患者の区別における抗ＰＡＤ１抗体の高い特異性を示す。非ＲＡ対照は、橋本病（ＨＤ）、突発性炎症性筋疾患（ＩＩＭ）、シェーグレン症候群（ＳｊＳ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、健康な個体（ＨＩ）、若年性突発性関節炎（ＪＩＡ）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、感染性疾患（ＩＤ）、変形性関節症（ＯＡ）、及び小型血管炎（ＳＶＶ）からのサンプルを含んでいた。
[0038]ＲＡ患者（ｎ＝３３）及び対照（ｎ＝３６）における抗ＰＡＤレベルの二次元主成分分析（ＰＣＡ）プロットを示す。抗ＰＡＤ１、抗ＰＡＤ３及び抗ＰＡＤ４は、ＰＣ１に対する主な寄与を有し、これは分散の５１．７％を説明し、抗ＰＡＤ２及び抗ＰＡＤ６はＰＣ２に対する主な寄与を有し、これは分散の２０．８％を説明する。略語：ＰＣ：主成分。
[0039]抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４の間の相関を示し、コホートＩＩ由来のいくつかのサンプルはＰＡＤ１又はＰＡＤ４と高いレベルで反応する。
[0040]ＲＡ及び非ＲＡ患者間の区別を示す、抗ＰＡＤ１、抗ＰＡＤ４、抗ＰＡＤ１／抗ＰＡＤ４、及び抗ＰＡＤ１／抗ＰＡＤ２／抗ＰＡＤ６の受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を示す。実線は、区別なしを示す。各マーカーの曲線下面積（ＡＵＣ）は、凡例に示されている。略語：ＴＰＦ：真陽性率；ＦＰＦ：偽陽性率。
[0041]抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ及び抗ＰＡＤ４ ＩｇＡについての受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を示す。合計５１人のＲＡ患者及び１５人の対照を試験して、ＲＡを対照から区別する能力を抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ及び抗ＰＡＤ４ ＩｇＡについて評価した。２つの抗原についてのＲＯＣ曲線を示し、抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ及び抗ＰＡＤ４ ＩｇＡの等しい又は優れた性能を示す。略語：ＴＰＦ：真陽性率；ＦＰＦ：偽陽性率
[0041]抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ及び抗ＰＡＤ４ ＩｇＡについての尤度比プロットを示す。合計５１人のＲＡ患者及び１５人の対照を試験して、ＲＡを対照から区別する能力を抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ及び抗ＰＡＤ４ ＩｇＡについて評価した。抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ（左）及び抗ＰＡＤ４ ＩｇＡ（右）の両方についての尤度及びオッズ比（ＯＲ）を示す。
[0042]抗ＰＡＤ自己抗体間の相関を示す。抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ及び抗ＰＡＤ１ ＩｇＧ間の相関を示す。有意な相関が観察されたが、個々の患者は様々なレベルの抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ及び抗ＰＡＤ１ ＩｇＧを有した。
[0042]抗ＰＡＤ自己抗体間の相関を示す。抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ及び抗ＰＡＤ４ ＩｇＡ間の相関を示す。
[0043]カルシウムの非存在又は存在下で社内で生成されたＰＡＤ１タンパク質、並びに他の市販のＰＡＤ及び異なる実験対照を含む異なるＰＡＤ抗原のドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析を示す。タンパク質ラダー内の各バンドに関連した分子量は、ゲル及びブロットの左側に示される。
[0043]カルシウムの非存在又は存在下で社内で生成されたＰＡＤ１タンパク質、並びに他の市販のＰＡＤ及び異なる実験対照を含む異なるＰＡＤ抗原の抗修飾シトルリン（ＡＭＣ）免疫ブロット分析を示す。タンパク質ラダー内の各バンドに関連した分子量は、ゲル及びブロットの左側に示される。
５．詳細な説明
[0044] 本開示は、部分的に、ＰＡＤ１がＲＡにおける新規な自己抗原であり、ＰＡＤ１に対する自己抗体（「抗ＰＡＤ１」）の検出が、ＲＡの診断バイオマーカーとして役立つことの発見に基づく。本開示の態様はまた、部分的に、抗ＰＡＤ１の検出を１つ以上の抗ＰＡＤ自己抗体、例えば抗ＰＡＤ４の検出と組み合わせて、ＲＡ及び非ＲＡ患者の間の区別の感度を増加させることができるという発見に基づく。したがって、本開示は、ＲＡの存在を示し得る新たなバイオマーカーを提供することによって、ＲＡ患者に利益をもたらす。
[0044] 本開示は、部分的に、ＰＡＤ１がＲＡにおける新規な自己抗原であり、ＰＡＤ１に対する自己抗体（「抗ＰＡＤ１」）の検出が、ＲＡの診断バイオマーカーとして役立つことの発見に基づく。本開示の態様はまた、部分的に、抗ＰＡＤ１の検出を１つ以上の抗ＰＡＤ自己抗体、例えば抗ＰＡＤ４の検出と組み合わせて、ＲＡ及び非ＲＡ患者の間の区別の感度を増加させることができるという発見に基づく。したがって、本開示は、ＲＡの存在を示し得る新たなバイオマーカーを提供することによって、ＲＡ患者に利益をもたらす。
[0045] 特に定義されない限り、本出願で使用される技術及び科学用語を含む全ての用語は、本発明が属する当業者が通用理解するものと同じ意味を有する。一般に、本明細書及び以下に記載される実験方法で使用される命名は、関連技術分野において広く知られ、且つ一般に使用されている。
[0046] 本明細書を解釈する目的で、用語の以下の説明が適用され、適宜、単数形で使用される用語は複数形も含み、逆も同様である。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、数値の範囲が提供される場合、その範囲は、その範囲を規定する数字も含むものと理解されることにも留意する必要がある。文脈が明白に指示しない限り、列挙される範囲内の介在する各整数、及び例えば選択された介在する整数の１０分の１単位を含むその分数、又は列挙される範囲の下限は、本開示内に含まれることが意図されることも理解される。
[0047] 本明細書で使用される場合、用語「含む(comprise)」、「含むこと(comprising)」、「含む(include)」、「含むこと(including)」、「有する」、「有すること」、「含む(contain)」、「含むこと(containing)」及びその任意の変形は、非排他的包含をカバーすることを意図し、したがって、要素又は要素のリストを含む(include)有する又は含む(contain)プロセス、方法、プロダクト・バイ・プロセス、又は物質の組成は、それらの要素のみを含むのではなく、明示的にリストされない、又はそのようなプロセス、方法、プロダクト・バイ・プロセス、若しくは物質の組成に固有の他の要素を含むことができる。
[0048] 本明細書で使用される場合、用語「自己抗体」は、自己抗体産生動物中に存在する自己免疫抗原又はそのエピトープ、例えば自己タンパク質、炭水化物、核酸又は他の分子に結合する免疫グロブリン分子を意味することが意図される。抗体は、例えば、ヒト、ハツカネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマなどの哺乳動物を含む任意の動物起源に由来することができる。一般に、動物免疫系は、身体自体の健康なタンパク質、細胞、及び組織を認識及び無視することができる。しかしながら、時には、免疫系は身体の正常な成分の１つ以上を「自己」として認識することを止め、自己抗体の産生をもたらし、これは炎症及び組織損傷などの特定の症状に繋がる。
[0049] 本明細書で使用される場合、用語「抗原断片」は、抗原の一部分を意味することが意図される。この用語は、６～１２０、１２～１００、１８～８０、２４～６０、３０～５０又は３５～４５アミノ酸残基を含む。
[0050] 本明細書で使用される場合、ＰＡＤＩとしても知られる用語「ペプチジルアルギニンデイミナーゼ」又は「ＰＡＤ」は、シトルリンを生成する脱イミノ化又は脱メチルイミノ化によって、タンパク質アルギニン残基の翻訳後修飾を触媒する酵素のファミリーを指す（例えば、Wang and Wang, Biochim. Biophys. Acta., 1829:1126-35 (2013)参照）。ＰＡＤの５つのアイソタイプがヒトにおいて同定されており、ＰＡＤ１、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、ＰＡＤ４及びＰＡＤ６を含む。このようなＰＡＤポリペプチドの全部、ＰＡＤ１、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、ＰＡＤ４及びＰＡＤ６は、本明細書で使用される場合、用語「ＰＡＤ」の意味に含まれる。
[0051] 本明細書で使用される場合、用語「反応性」は、自己抗体及びＰＡＤタンパク質又はその抗原断片を参照して使用される場合、自己抗体がＰＡＤタンパク質又はその抗原断片を特異的に認識することを意味する(me)ことが意図される。一般に、これは、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片に結合し又は別様に相互作用して、抗原－抗体複合体を形成することを含むであろう。したがって、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片と反応性の自己抗体は、ＰＡＤタンパク質又は抗原断片に対して唯一であり、特定のＰＡＤタンパク質に対する自己抗体は、特定のＰＡＤタンパク質のみと反応性であると理解される。
[0052] 本明細書で使用される場合、ＲＡステージに対する参照は、臨床的及び放射線学的基準により分類される、ＲＡの４つの主要なステージを指すことが意図される。ステージＩ（早期ＲＡ）は、一般に、Ｘ線検査で観察される破壊的な変化がなく、関節包の初期炎症、及び滑膜組織の膨張を含み得る。ステージＩＩ（中等度の進行）は、一般に、わずかな軟骨下破壊を伴う又は伴わない関節周囲の骨粗鬆症のＸ線画像の証拠；わずかな軟骨破壊の可能性；関節可動性が限定されている可能性、しかし関節変形は観察されない；隣接する筋肉萎縮症が存在する；関節外軟組織病変（例えば、小結節及び腱鞘炎）の可能性を含む。ステージＩＩＩ（重度の進行）は、一般に、関節周囲骨粗鬆症に加えて、軟骨及び骨破壊のＸ線画像の証拠；線維性又は骨性強直症を伴わない関節変形（例えば、亜脱臼、尺骨偏位、又は過伸展）；筋萎縮が広範囲である；関節外軟部組織病変（例えば、結節、腱鞘炎）の可能性を含む。ステージＩＶ（最終進行）は一般に、ステージＩＩＩの基準と共に、線維性又は骨性強直症の存在を含む。
[0053] 本明細書で使用される場合、用語「固体支持体」は、自己抗体の検出で使用するための自己免疫抗原又はその断片の１つ以上の沈着の固体又は半固体基礎として役立ち得る任意の材料を意味することが意図される。固体支持体の代表的な例としては、例えば、ビーズ、微小粒子及びナノ粒子を含む粒子、マイクロ－又はマルチ－ウェルプレートのウェル、ゲル、コロイド、シート、チップ、電極、試験管、及び当業者に公知の他の構成が挙げられる。代表的な粒子は、例えば、ビーズ、球体又は他の固体支持体担体を含む。
[0054] 本明細書で使用される場合、用語「補助剤」は、検出方法に適用可能な試薬又は成分を意味することが意図される。補助試薬は、例えば、固定化緩衝液、固定化試薬、希釈緩衝液、二次抗体、レポーター試薬、検出試薬、ブロッキング緩衝液、洗浄緩衝液、検出緩衝液、停止溶液、システム濯ぎ緩衝液、システム清浄溶液、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
[0055] タンパク質－アルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）酵素は、１９７７年に最初に記載された。ＰＡＤファミリーの合計５つのメンバー：ＰＡＤ１、２、３、４、及び６がヒトにおいて報告されており、それらの間には有意なタンパク質配列相同性がある。５つのＰＡＤタンパク質の中でも、ＰＡＤ２及びＰＡＤ４は、関節リウマチ（ＲＡ）の発病に重要な役割を有することが知られ、ＰＡＤ３と一緒に、それらは抗原標的として同定されている。しかしながら、約ＰＡＤ１又はＰＡＤ６については殆ど分かっていない。
[0056] 本明細書で使用される場合、ＰＡＤＩ１、及びＰＤＩ１としても知られる用語「ペプチジルアルギニンデイミナーゼ１」又は「ＰＡＤ１」は、酵素のＰＡＤファミリーの一メンバーを指す。
[0057] 本明細書で使用される場合、ＰＡＤＩ２、ＰＡＤ－Ｈ１９及びＰＤＩ２としても知られる用語「ペプチジルアルギニンデイミナーゼ２」又は「ＰＡＤ２」は、酵素のＰＡＤファミリーの一メンバーを指す。ＰＡＤ２は、分泌腺、脳、子宮、脾臓、膵臓及び骨格筋において豊富に発現される。ＰＡＤ２の既知の基質は、ミエリン塩基性タンパク質、ビメンチン及びマクロファージを含む。Vossenaar et al., Annals of the Rheumatic Diseases, 63:373-81 (2004); Watanbe et al., Biochim Biophys Acta., 966:375-383 (1988); Watanabe et al., J. Biol Chem., 264:15255-15260 (1989); Nagata et al., Experientia, 46:72-74 (1990); Urano et al., Am J Dermatopathol., 12(3):249-55 (1990), Vossenaar et al., Arthritis and Rheum., 48:2489-2500 (2003)を参照されたい。約７２６のコード化単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）及び少なくとも１８４の既知のオルソログがＰＡＤ２について同定されている（例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：１１２４０参照）。用語「ＰＡＤ２」は、そのようなＰＡＤ２変異体及びＰＡＤ２オルソログの全てを含む。例示的なヒトＰＡＤ２（ｈＰＡＤ２）ヌクレオチド配列は、ジェンバンクにおいてジェンバンク受入番号ＮＭ＿００７３６５（配列番号１）の下で見出すことができ、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿０３１３９１（配列番号２）の下で見出される見出されるアミノ酸配列を有する例示的なヒトＰＡＤ２をコードする。このＰＡＤ２及び他の例示的なＰＡＤ２酵素のジェンバンク受入番号及びジェンバンクＧＩ番号は、下記の表１に見出すことができる。このようなＰＡＤ２ポリペプチド及びその変異体の全ては、本明細書で使用されるように、用語「ＰＡＤ２」の意味に含まれる。
[0058] いくつかの実施形態では、ＰＡＤ２、又はその抗原断片は、成熟ヒトＰＡＤ２（ｈＰＡＤ２；ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０３１３９１のアミノ酸２５－６６５；ＧＩ：１２２９３９１５９）の配列番号２のアミノ酸、又は天然に存在するその変異体を含む：
配列番号２
配列番号２
[0059] 本明細書で使用される場合、ＰＡＤＩ３、ＰＤＩ３及びＵＨＳ１としても知られる用語「ペプチジルアルギニンデイミナーゼ３」又は「ＰＡＤ３」は、酵素のＰＡＤファミリーの一メンバーを指す。ＰＡＤ３は表皮に検出され、そこでＰＡＤ３は最終分化に役割を果たし、また、毛包に検出され、そこでＰＡＤ３はフィラグリン及びトリコヤリン（ｔｒｉｃｈｏｙａｌｉｎ）を含む構造タンパク質を修飾する。Chavanas et al., J Dermatol Sci., 44:63-72 (2006); Kanno et al., J. Invest Dermatol. 115(5):813-23 (2000); Nachat et al., J Investig Dermatol., 125:34-41 (2005)を参照されたい。約７３８のコード化ＳＮＰ及び少なくとも１０９の既知のオルソログがＰＡＤ３について同定されている（例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：５１７０２参照）。用語「ＰＡＤ３」は、そのようなＰＡＤ３変異体及びＰＡＤ３オルソログの全てを含む。例示的なヒトＰＡＤ３（ｈＰＡＤ３）ヌクレオチド配列は、ジェンバンクにおいてジェンバンク受入番号ＮＭ＿０１６２３３（配列番号５）の下で見出すことができ、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿０５７３１７（配列番号６）の下で見出される見出されるアミノ酸配列を有する例示的なヒトＰＡＤ３をコードする。このＰＡＤ３及び他の例示的なＰＡＤ３酵素のジェンバンク受入番号及びジェンバンクＧＩ番号は、下記の表２に見出すことができる。このようなＰＡＤ３ポリペプチド及びその変異体の全ては、本明細書で使用されるように、用語「ＰＡＤ３」の意味に含まれる。
[0060] いくつかの実施形態では、ＰＡＤ３、又はその抗原断片は、成熟ヒトＰＡＤ３（ｈＰＡＤ３；ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０５７３１７のアミノ酸２５－６６４；ＧＩ：１２２９３９１６１）の配列番号６のアミノ酸、又は天然に存在するその変異体を含む：
配列番号６
配列番号６
[0061] 本明細書で使用される場合、ＰＡＤ、ＰＡＤＩ４、ＰＤＩ４、ＰＡＤＶ、ＰＤＩ５及びＰＡＤＩ５としても知られる用語「ペプチジルアルギニンデイミナーゼ４」又は「ＰＡＤ４」は、酵素のＰＡＤファミリーの一メンバーを指す。ＰＡＤ４は、正常な生理学的条件下で顆粒球及び単球を含む白血球中に検出され得（Vossenaar et al., Annals of the Rheumatic Diseases, 63:373-81 (2004); Asaga et al., J. Leukocyte Biology 70:46-51 (2001)）、一般に核内に局在する（Nakashima et al., JBC 277:49562-68 (2002)）。約７３７のコード化ＳＮＰ及び少なくとも１０８の既知のオルソログがＰＡＤ４について同定されている（例えば、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３５６９参照）。用語「ＰＡＤ４」は、そのようなＰＡＤ４変異体及びＰＡＤ４オルソログの全てを含む。例示的なヒトＰＡＤ４（ｈＰＡＤ４）ヌクレオチド配列は、ジェンバンクにおいてジェンバンク受入番号ＮＭ＿０１２３８７．２（配列番号６１）の下で見出すことができ、ジェンバンク受入番号ＮＰ＿０３６５１９．２（配列番号６２）の下で見出される見出されるアミノ酸配列を有する例示的なヒトＰＡＤ４をコードする。このＰＡＤ４及び他の例示的なＰＡＤ４酵素のジェンバンク受入番号及びジェンバンクＧＩ番号は、下記の表３に見出すことができる。このようなＰＡＤ４ポリペプチド及びその変異体の全ては、本明細書で使用されるように、用語「ＰＡＤ４」の意味に含まれる。
[0062] いくつかの実施形態では、ＰＡＤ４、又はその抗原断片は、成熟ヒトＰＡＤ４（ｈＰＡＤ４；ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０３６５１９のアミノ酸２５－６６３；ＧＩ：２１６５４８４８７）の配列番号６２のアミノ酸、又は天然に存在するその変異体を含む：
配列番号６２
配列番号６２
[0063] 表１、２及び３は、２つの配列識別名、ＧＩ番号及びジェンバンク受入番号を含む。ＧＩ番号及びジェンバンク受入番号は、公に利用可能なデータベースにおける参照配列にアクセスするために、唯一の識別名として並列に配置される。表１は、ＰＡＤ２についてのＧＩ番号及びジェンバンク受入番号を含み、表２は、ＰＡＤ３についてのＧＩ番号及びジェンバンク受入番号を含み、表３は、ＰＡＤ４についてのＧＩ番号及びジェンバンク受入番号を含む。
[0064] 表１、２及び３の配列識別名は、各々、野生型ＰＡＤ２、３及び４について提供されている。本明細書の野生型核酸及びアミノ酸配列は、集団間で優位な核酸及びアミノ酸配を指し、それらの各々の変異体に対する参照としての役割を果たすことを理解するべきである。例として、表３の配列番号６１（ＧＩ番号：１５１９３１４３４０及び受入番号：ＮＭ＿０１２３８７）は、ｈＰＡＤ４の野生型核酸配列を特定する一方、配列番号６２（ＧＩ番号：２１６５４８４８７及び受入番号：ＮＰ＿０３６５１９）は、ｈＰＡＤ４の野生型核酸配列を特定する。
[0065] 表１、２及び３の配列識別名はまた、各々、ＰＡＤ２、３及び４の変異体についても提供されている。変異体は、野生型核酸配列と類似しているが、野生型核酸配列とは異なる核酸配列を指すことを理解するべきである。
[0066] 下記の表のいずれかの変異体は、例えば、選択的スプライシング（例えばスプライス変異体）をもたらし得る核酸置換を含むことができる。例として、表３の配列番号６９（ＧＩ番号：７６７９０３５１９及び受入番号：ＸＭ＿０１１５４１１５０．１：ｃ．２３Ｇ＞Ａ）は、配列番号６１のｈＰＡＤ４核酸スプライス変異体である。
[0067] 下記の表のいずれかの変異体はまた、例えば、核酸置換（例えばＳＮＰ）を含むことができる。例として、表３の配列番号６３（ＧＩ番号：２１６５４８４８６及び受入番号：ＮＭ＿０１２３８７．２：ｃ．２３Ｇ＞Ａ）は、配列番号６１のｈＰＡＤ４核酸変異体であり、Ｇ（グアノシン）によるＡ（アデニン）の置換をもたらす核酸位置２３の単一核酸置換を含む。
[0068] 変異体は、野生型アミノ酸配列と類似しているが野生型アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列も指すことを理解するべきである。
[0069] 下記の表のいずれかの変異体は、例えば、選択的スプライシング（例えばスプライス変異体）の結果であり得るアミノ酸置換をさらに含むことができる。例として、上述の配列番号６９によりコードされる表３の配列番号７０（ＧＩ番号：７６７９０３５２０及び受入番号：ＸＰ＿０１１５３９４５２．１：ｐ．Ａｒｇ８Ｈｉｓ）は、Ａｒｇ（アルギニン）によるＨｉｓ（ヒスチジン）の置換をもたらす位置８のアミノ酸置換を含むｈＰＡＤ４である。
[0070] 下記の表のいずれかの変異体は、例えば、遺伝（例えばＳＮＰ）の結果であり得るアミノ酸置換をさらに含むことができる。例として、上述の配列番号６３によりコードされる表３の配列番号６４（ＧＩ番号：２１６５４８４８７及び受入番号：ＮＰ＿０３６５１９．２：ｐ．Ａｒｇ８Ｈｉｓ）は、Ａｒｇ（アルギニン）によるＨｉｓ（ヒスチジン）の置換をもたらす位置８のアミノ酸置換を含むｈＰＡＤ４である。
[0071] 「ポリペプチド」は、２～３０アミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５又は３０アミノ酸）を有する短いオリゴペプチドと、例えば、３０アミノ酸を超える、５０アミノ酸を超える、１００アミノ酸を超える、１５０アミノ酸を超える、２００アミノ酸を超える、３００アミノ酸を超える、４００アミノ酸を超える、５００アミノ酸を超える、又は６００アミノ酸を超えるより長いアミノ酸鎖とを含むことに留意するべきである。いくつかの実施形態では、ＰＡＤは、全長の野生型ポリペプチドであり得る。ＰＡＤポリペプチドは、天然の遺伝暗号によりコードされない非天然アミノ酸を含み得る。
[0072] いくつかの実施形態では、精製ポリペプチドは、ＰＡＤ抗原断片を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＤ抗原断片は、全長ＰＡＤポリペプチドの３を超える、５を超える、１０を超える、１５を超える、２０を超える、２５、５０を超える、７５超、１００を超える、１２５を超える、１５０を超える、２００を超える、２５０を超える、３００を超える、３５０を超える、４００を超える、５００を超える、又は６００を超える連続アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＤ抗原断片は、全長ＰＡＤの１００％未満、９５％未満、９０％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、又は５％未満の連続アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＤ抗原断片は、ＰＡＤペプチド断片である。
[0073] いくつかの実施形態では、ＰＡＤ又はその抗原断片は、哺乳動物ＰＡＤであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＤ又はその抗原断片は、ヒトであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＤ又はその抗原断片は、本開示の生物のうちの１つのＰＡＤ又はその抗原断片であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＤ又はその抗原断片は、表１～３の変異体又は単一ヌクレオチド多型のいずれかを含むことができる。
[0074] 本開示は、ＲＡを診断する方法を提供する。方法は：（ａ）ＲＡを有することが疑われる対象由来の生物学的サンプルを、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質又はその抗原断片と接触させることと、（ｂ）少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片に結合した自己抗体の存在を検出することと、を含み、前記自己抗体の存在は、ＲＡを示し、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１又はその抗原断片を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１又はその抗原断片及び別のＰＡＤタンパク質、例えばＰＡＤ４、又はその抗原断片を含む。しかしながら、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片の他の組み合わせは本開示に有用であり得、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４に限定されないことが理解される。
[0075] 本明細書で提供されるように、本開示は、ＰＡＤ１がＲＡにおける新規な自己抗原であり、ＰＡＤ１又はその抗原断片に対する自己抗体の検出が、ＲＡ及び非ＲＡ患者を高い感度で区別できることを最初に同定した。したがって、いくつかの実施形態では、ＲＡの診断方法は、ＰＡＤ１又はその抗原断片である少なくとも１つのＰＡＤタンパク質を含む。
[0076] 本開示はまた、部分的に、ＲＡの診断のためにＰＡＤ１又はその抗原断片を１つ以上のさらなるＰＡＤタンパク質又はその抗原断片と組み合わせることができるという知見に基づく。例えば、ＰＡＤ１又はその抗原断片に対する自己抗体及び１つ以上のさらなるＰＡＤタンパク質又はその抗原断片に対する自己抗体の検出のために、ＰＡＤ１又はその抗原断片を、１つ以上のさらなるＰＡＤタンパク質又はその抗原断片と組み合わせることができる。したがって、いくつかの実施形態では、ＲＡの診断方法は、ＰＡＤ１又はその抗原断片及び１つのさらなるＰＡＤタンパク質又はその抗原断片を含む。他の実施形態では、ＲＡの診断方法は、ＰＡＤ１又はその抗原断片及び２つのさらなるＰＡＤタンパク質又はその抗原断片を含む。尚さらなる実施形態では、ＲＡの診断方法は、ＰＡＤ１又はその抗原断片及び３つのさらなるＰＡＤタンパク質又はその抗原断片を含む。またさらなる実施形態では、ＲＡの診断方法は、ＰＡＤ１又はその抗原断片及び全ての４つのさらなるＰＡＤタンパク質又はその抗原断片を含む。
[0077] 特に、本明細書で提供されるように、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片の組み合わせは、ＲＡ及び非ＲＡ患者を高い感度で区別することができる。したがって、特定の実施形態では、ＲＡの診断方法は、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片を含む。しかしながら、ＲＡの診断方法は、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６又はその抗原断片のいずれかと組み合わせたＰＡＤ１又はその抗原断片も含み得ることがさらに理解される。例えば、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片の組み合わせに加えて、ＰＡＤ１又はその抗原断片は、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、若しくはＰＡＤ６又はその抗原断片と個々に組み合わせることができる。ＰＡＤ１又はその抗原断片はまた、ＰＡＤ２及びＰＡＤ３、ＰＡＤ２及びＰＡＤ６、若しくはＰＡＤ３及びＰＡＤ６又はその抗原断片の各々と組み合わせることができる。さらに、ＰＡＤ１又はその抗原断片はまた、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６又はその抗原断片と組み合わせることができる。
[0078] 他の実施形態では、ＲＡの診断方法は、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６又はその抗原断片のいずれかと組み合わせたＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片は、ＰＡＤ３又はその抗原断片と組み合わせることができる。他の実施形態では、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片は、ＰＡＤ２又はその抗原断片と組み合わされる。またさらなる実施形態では、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片は、ＰＡＤ６又はその抗原断片と組み合わされる。いくつかの実施形態では、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片は、ＰＡＤ３及びＰＡＤ２又はその抗原断片と組み合わされる。他の実施形態では、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片は、ＰＡＤ３及びＰＡＤ６又はその抗原断片と組み合わされる。さらに他の実施形態では、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片は、ＰＡＤ２及びＰＡＤ６又はその抗原断片と組み合わされる。さらに他の実施形態では、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片は、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６又はその抗原断片と組み合わされる。
[0079] 本明細書で提供されるように、上述した少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片を生物学的サンプルと接触させ得、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片と反応性の自己抗体の存在を検出し得る。本明細書に記載されるＰＡＤタンパク質の特異性は十分な感度を有するので、生物学的サンプル中に自己抗体が検出される場合、生物学的サンプルドナーはＲＡを有するとみなされ得る。例として、及び非限定的に、ＰＡＤ１又はその抗原断片が使用され得、抗ＰＡＤ１自己抗体が本明細書に記載される方法に従って検出され得る。同様に、別の例示的な実施形態は、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片を含み得、自己抗体が本明細書に記載される方法に従って検出される場合、生物学的サンプルドナーはＲＡを有するとみなされ得る。
[0080] 特定の実施形態では、検出されるＰＡＤ自己抗体は、特定のアイソタイプである。例えば、いくつかの実施形態では、検出されるＰＡＤ自己抗体は、ＩｇＡアイソタイプ（例えば、抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ又は抗ＰＡＤ４ ＩｇＡ）である。他では、検出される自己抗体は、ＩｇＧアイソタイプ（例えば、抗ＰＡＤ１ ＩｇＧ又は抗ＰＡＤ４ ＩｇＧ）である。特定の実施形態では、自己抗体アイソタイプは、抗ＰＡＤ１ ＩｇＡである。他の実施形態では、自己抗体アイソタイプは抗ＰＡＤ４ ＩｇＧである。尚さらなる実施形態では、自己抗体アイソタイプは抗ＰＡＤ４ ＩｇＡである。特定の実施形態では、ＩｇＧ及びＩｇＡアイソタイプの両方の検出が組み合わされて、自己抗体の検出を増加させる。したがって、本開示全体において、特定のアイソタイプの列挙なしでの抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ４自己抗体に対する参照は、ＩｇＡ及びＩｇＧなどの特定のアイソタイプを含み得ることが理解される。
[0081] ２つ以上のＰＡＤタンパク質又はその抗原断片が使用される本発明のいくつかの態様では、本開示は、どの自己抗体が検出されるかを同定できる選択肢を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片が使用され、自己抗体の検出は、ＰＡＤ１又はＰＡＤ４又はその抗原断片との反応に対して追跡することができる。或いは、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ３又はその抗原断片が使用され得、自己抗体の検出は、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、又はＰＡＤ３又はその抗原断片との反応に対して追跡することができる。上記に提供した例は、単なる例示であることに留意するべきであり、２つ以上のＰＡＤタンパク質又はその抗原断片の他の組み合わせを本開示に従って使用できることが理解される。
[0082] ２つ以上のＰＡＤタンパク質又はその抗原断片が使用され、自己抗体が検出される場合、どのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片が自己抗体と反応性であったかを決定することが望ましい可能性がある。自己抗体の検出をその自己抗原基質と関連付ける様々な技術及びアッセイデザインが当技術分野で公知である。例えば、例示的な一手法は、２つ以上のＰＡＤタンパク質又は抗原断片の各々が、固体支持体上の独特の空間を占めるように、２つ以上のＰＡＤタンパク質又はその抗原断片の空間的分離を含む。別の例示的な手法は、２つ以上のＰＡＤタンパク質又は抗原断片の各々が順次アッセイされるように、一時的分離を含む。これらの例は例示であるが、利用可能なデザインの全てを網羅することを意図するものではなく、２つ以上のＰＡＤタンパク質又はその抗原断片を含む本開示の実施形態は、多重に適切であることが当技術分野で知られる任意の技術にて使用できることが理解される。
[0083] 本明細書で提供されるように、各々が特定のＰＡＤタンパク質又はその抗原断片に反応性の２つ以上の異なる自己抗体の検出は、個々の自己抗体単独の検出と比較して、ＲＡの診断能力を改善することができる。例えば、本明細書に開示されるように、抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４の検出は、抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ４単独よりも、ＲＡ患者を非ＲＡ患者からより良好に区別することができた。したがって、２つ以上の異なる自己抗体の検出の組み合わせは、ＲＡ診断を改善することができる。
[0084] 本開示のいくつかの態様では、２つ以上の異なる自己抗体が検出される場合、複合スコアが形成される。例えば、いくつかの実施形態では、複合スコアは、検出される２つ以上の異なる自己抗体の組み合わせによって生成され得る。複合スコアはまた、例えば、次の例示的な等式＝（抗ＰＡＤ１＋抗ＰＡＤ４）／（抗ＰＡＤ６）を使用して、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片のうちの１つの負の関連を含めることにより形成することができる。複合スコアの形成はまた、人工知能（ＡＩ）ベースのスコアを生成することを含み得る。
[0085] いくつかの態様では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片と反応性である自己抗体の検出は、自己抗体の存在を定量することを含む。しかしながら、本開示のいくつかの用途では、定性アッセイが望ましい可能性があり、定量は必要ではないことも理解される。例えば、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片に対する自己抗体の検出は、ＲＡの診断に十分である。
[0086] 関節リウマチ（ＲＡ）の進行を監視する方法も本明細書で提供され、該方法は、（ａ）ＲＡを有するか又は有することが疑われる対象由来の生物学的サンプルを、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質又はその抗原断片と接触させることと、（ｂ）少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片と反応性の自己抗体の存在を検出することと、を含み、前記自己抗体の存在は、疾患進行を示し、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む。
[0087] 例えば、特定の実施形態では、例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を含む抗ＰＡＤ自己抗体などの抗ＰＡＤ自己抗体の量の増加は、疾患進行を示し得る。他の実施形態では、２つ以上の抗ＰＡＤ１抗体の間の比の変化は、疾患進行を示し得る。抗ＰＡＤ自己抗体の量の変化は、同じ対象から得られた以前の生物学的サンプルに対する、又は参照標準に対するものであり得る。
[0088] したがって、いくつかの実施形態では、関節リウマチ（ＲＡ）の進行を監視する方法は、ＲＡを有するか又は有することが疑われる対象由来の生物学的サンプルを、ＰＡＤ１又はその抗原断片と接触させることと、抗ＰＡＤ１の存在を検出することと、を含む。他の実施形態では、関節リウマチ（ＲＡ）の進行を監視する方法は、ＲＡを有するか又は有することが疑われる対象由来の生物学的サンプルを、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片と接触させることと、抗ＰＡＤ１及び／又は抗ＰＡＤ４の存在を検出することと、を含む。
[0089] 本開示はまた、抗ＰＡＤ３の検出が、ＲＡ患者由来の生物学的サンプル中の抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４と相関することも示す。したがって、いくつかの実施形態では、関節リウマチ（ＲＡ）の進行を監視する方法は、ＲＡを有するか又は有することが疑われる対象由来の生物学的サンプルを、ＰＡＤ１及びＰＡＤ３又はその抗原断片と接触させることと、抗ＰＡＤ１及び／又は抗ＰＡＤ３の存在を検出することと、を含む。加えて、いくつかの実施形態では、関節リウマチ（ＲＡ）の進行を監視する方法は、ＲＡを有するか又は有することが疑われる対象由来の生物学的サンプルを、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ３又はその抗原断片と接触させることと、抗ＰＡＤ１、抗ＰＡＤ４、及び／又は抗ＰＡＤ３の存在を検出することと、を含む。
[0090] ＲＡステージは、通常、臨床的及び放射線学的基準により分類される４つの主要なステージに特徴付けられる。ステージＩ（早期ＲＡ）は、一般に、Ｘ線検査で観察される破壊的な変化がなく、及関節包の初期炎症、及び滑膜組織の膨潤を含み得る。ステージＩＩ（中等度の進行）は、一般に、わずかな軟骨下破壊を伴う又は伴わない関節周囲の骨粗鬆症のＸ線画像の証拠；わずかな軟骨破壊の可能性；関節可動性が限定されている可能性、しかし関節変形は観察されない；隣接する筋肉萎縮症が存在する；関節外軟組織病変（例えば、小結節及び腱鞘炎）の可能性を含む。ステージＩＩＩ（重度の進行）は、一般に、関節周囲骨粗鬆症に加えて、軟骨及び骨破壊のＸ線画像の証拠；線維性又は骨性強直症を伴わない関節変形（例えば、亜脱臼、尺骨偏位、又は過伸展）；を含み、筋萎縮が広範囲であり；関節外軟部組織病変（例えば、結節、腱鞘炎）が可能である。ステージＩＶ（最終進行）は一般に、ステージＩＩＩの基準と共に、線維性又は骨性強直症の存在を含む。
[0091] 上述したように、抗ＰＡＤ４は、一般に重度のＲＡに関連し、多くの場合、関節びらんを有するＲＡ患者を示す。したがって、いくつかの実施形態では、抗ＰＡＤ１の検出は、中等度～重度のステージのＲＡを示す。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４の検出は、中等度～重度のステージのＲＡを示す。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ３の検出は、中等度～重度のステージのＲＡを示す。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＤ１、抗ＰＡＤ４、及び抗ＰＡＤ３の検出は、中等度～重度のステージのＲＡを示す。特定の実施形態では、中等度～重度のステージのＲＡは、関節びらんの存在を含む。
[0092] 抗ＰＡＤ２の検出パターンは、一般に抗ＰＡＤ３又は抗ＰＡＤ４と関連しないことも知られており、進行性関節損傷と逆相関する。したがって、いくつかの実施形態では、抗ＰＡＤ２の検出は、中等度～重度ではないステージのＲＡを示す。
[0093] 本開示は、抗ＰＡＤ２及び抗ＰＡＤ６がＲＡ患者由来の生物学的サンプルにおいて相関することも見出した。したがって、いくつかの実施形態では、抗抗ＰＡＤ６の検出は、中等度～重度のステージではないＲＡを示す。他の実施形態では、抗ＰＡＤ２及び抗ＰＡＤ６の検出は、中等度～重度のステージではないＲＡを示す。
[0094] 本開示の他の態様では、疾患進行を監視する方法は、（ａ）ＲＡを有する対象由来の生物学的サンプルを、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質又はその抗原断片と接触させることと、（ｂ）少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片と反応性の自己抗体の非存在を検出することであって、前記自己抗体の非存在は疾患進行を示す、検出することと、を含み、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む。
[0095] 例えば、特定の実施形態では、例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を含む抗ＰＡＤ自己抗体などの抗ＰＡＤ自己抗体の量の非存在は、疾患進行の低下又は変化がないことを示し得る。特定の実施形態では、抗ＰＡＤ自己抗体の量の低下又は変化がないことは、同じ対象から得られた以前の生物学的サンプル、又は参照標準に対してであり得る。
[0096] 上述したように、抗ＰＡＤ４の存在は、ＲＡのより重度の形態を有するＲＡ患者にしばしば見出され、抗ＰＡＤ４の検出は抗ＰＡＤ１、及び抗ＰＡＤ３と強く相関する。したがって、ＲＡを有することが既知の患者において、抗ＰＡＤ４、抗ＰＡＤ１、及び／又は抗ＰＡＤ３の非存在は、重度が低い形態のＲＡを示し得る。抗ＰＡＤ４、抗ＰＡＤ１、及び／又は抗ＰＡＤ３の非存在は、抗ＰＡＤ２及び／又は抗ＰＡＤ６の存在が検出される場合、さらにより情報価値があり得る。逆に、抗ＰＡＤ１、抗ＰＡＤ４、及び／又は抗ＰＡＤ３の存在、並びに抗ＰＡＤ２及び／又は抗ＰＡＤ６の非存在は、ＲＡについて情報価値があり得る。
[0097] したがって、いくつかの実施形態では、関節リウマチ（ＲＡ）の進行を監視する方法は、ＲＡを有する対象由来の生物学的サンプルを、ＰＡＤ１又はその抗原断片と接触させることと、抗ＰＡＤ１の非存在を検出することと、を含む。他の実施形態では、関節リウマチ（ＲＡ）の進行を監視する方法は、ＲＡを有する対象由来の生物学的サンプルを、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片と接触させることと、抗ＰＡＤ１及び／又は抗ＰＡＤ４の非存在を検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、関節リウマチ（ＲＡ）の進行を監視する方法は、ＲＡを有する対象由来の生物学的サンプルを、ＰＡＤ１及びＰＡＤ３又はその抗原断片と接触させることと、抗ＰＡＤ１及び／又は抗ＰＡＤ３の存在を検出することと、を含む。加えて、いくつかの実施形態では、関節リウマチ（ＲＡ）の進行を監視する方法は、ＲＡを有するか又は有することが疑われる対象由来の生物学的サンプルを、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ３又はその抗原断片と接触させることと、抗ＰＡＤ１、抗ＰＡＤ４、及び／又は抗ＰＡＤ３の非存在を検出することと、を含むことができる。特定の実施形態では、前記自己抗体の非存在は、早期ステージのＲＡを示す。特定の実施形態では、早期ステージのＲＡは、関節への損傷が殆ど～全くないことを含む。
[0098] 加えて、健康な対照個体と比較した、対象における例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を含む抗ＰＡＤの増加の存在は、ＲＡの存在、又はＲＡを発症するリスクを示し得る。したがって、抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４などのＰＡＤに対する自己抗体のかなりの増加は、ＲＡの診断に使用することができる。抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４などの抗ＰＡＤの検出、及び対照に対するレベルの比較の例示的な方法は、本明細書で提供され及び下記にさらに記載される。
[0099] いくつかの実施形態では、健康な対照個体と比較して増加した、抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４などの抗ＰＡＤのレベルの検出は、ＲＡを有する対象を示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物及び方法を用いたＲＡの診断後、ＲＡの存在は、ＲＡの発症又は存在に関連した多様な症状に基づいてさらに裏付けることができる。
[00100] ＲＡに関連した臨床症状は、例えば、大小の両側関節の疼痛及び膨張、回帰性発症、単関節症状、並びに腱鞘炎及び滑液包炎のような関節外滑膜炎、多発筋痛様発症、並びに倦怠感、体重減少、疲労、発熱及び能力障害を含む他の症状を含む。Grassi et al., Eur. J. Radiol., Suppl 1:S 18-24 (1998); Aletaha and Smolen, JAMA, 320(13):1360-1372 (2018)。
[00101] いくつかの実施形態では、健康な対照と比較して増加した、対象における例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を含む抗ＰＡＤのレベルの検出は、重度のＲＡを有することを示す。他の実施形態では、同じ抗ＰＡＤのレベルの増加を有さないＲＡ対象と比較して増加した、対象における例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を含む抗ＰＡＤのレベルの検出は、重度のＲＡを有することを示す。いくつかの実施形態では、重度のＲＡを有することは、当技術分野の方法により決定される関節びらんの程度又はＸ線画像による進行のリスクによって考慮される。健康な対照と比較して、又は例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を含む抗ＰＡＤの増加したレベルを有さないＲＡ対象と比較して増加した、対象における例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を含む抗ＰＡＤのレベルの検出は、関節びらんが重度であるより進行したＲＡを有する、より高い可能性を有することを示す。いくつかの実施形態では、例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を含む抗ＰＡＤの増加を有する対象は、重度の関節びらんが存在するより進行したＲＡを有する可能性が５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超又は９０％超であり得る。他の実施形態では、増加した抗ＰＡＤを有する対象は、重度の関節びらんが存在するより進行したＲＡを有する可能性が２倍超、３倍超、４倍超、５倍超、６倍超、７倍超、８倍超、９倍超、又は１０倍超であり得る。
[00102] 重度のＲＡでは、関節中の骨及び軟骨の喪失が存在する場合に関節びらんが起こる。関節びらんの重症度は、例えば、例えば、Ｓｈａｒｐスコア方法により決定することができる。Sharp, Arthritis Rheum., 32:221-229 (1989); Brower, Arthritis Rheum., 33:316-324 (1990)を参照されたい。Ｓｈａｒｐスコアは、Ｘ線画像に基づいて、関節の狭窄及びびらんを評価する。びらんスコアは０～３．５の範囲であり、関節腔狭窄スコアは０～４の範囲である。スコア０は狭窄又はびらんを伴わない正常な関節を示し、スコア３．５～４は、びらん及び狭窄を伴う異常な関節を示す。本開示のいくつかの実施形態では、対象における関節びらんはＳｈａｒｐスコアの使用により決定される。
[00103] 他の実施形態では、重度のＲＡを有することは、健康評価質問表（ＨＡＱ）能力障害指数（ＤＩ）により決定される。Fries et al., Arthritis Rheum, 23(2):137-145 (1980); Bruce and Fries, Health Qual Life Outcomes, 1(1):20 (2003)。ＨＡＱは、着衣、起立、食事、歩行、衛生、手の届く範囲、握力及び活動を含む８つのセクションにおける身体能力を評価する。各セッションの実行には、０（何の困難さもない）から３（実行できない）までのスコアが割り当てられる。８つのセクションのスコアを合計し、８で割ってＤＩを生成する。０～３の範囲のＤＩは、能力障害を予測し、人は、課題を何の困難さもなく完了することができる（ＤＩ ０）、幾分かの困難さを有する（ＤＩ １）、多くの困難さを有する（ＤＩ ２）、又は不可能である（ＤＩ ３）。
[00104] いくつかの実施形態では、健康な対照個体と比較して増加した、例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を含む抗ＰＡＤのレベルの検出は、対象がＲＡの臨床症状を発症するリスクがあることを示す。いくつかの実施形態では、対象は、例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を含む抗ＰＡＤの増加の決定から３ヵ月未満、６ヵ月未満、９ヵ月未満、１２ヵ月未満、１８ヵ月未満、２年未満、３年未満、４年未満、５年未満、６年未満、７年未満、８年未満、９年未満、１０年未満、１２年未満、１４年未満、又は１６年未満以内にＲＡの臨床症状を発症するリスクがあり得る。
[00105] いくつかの実施形態では、健康な対照個体と比較して増加した、例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を含む抗ＰＡＤのレベルの存在は、対象が、増加した抗ＰＡＤの決定から５年以内に、ＲＡの臨床症状を発症する可能性が５％超、１０％超、１５％超、２０％超、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、４５％超、５０％超、６０％超、７０％超、又は８０％超又は９０％超であることを示す。いくつかの実施形態では、例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を含む抗ＰＡＤの増加したレベルの存在は、健康な対照個体と比較して、対象が、増加した抗ＰＡＤレベルの決定から５年以内に、ＲＡの臨床症状を発症する可能性が２倍超、３倍超、４倍超、５倍超、６倍超、７倍超、８倍超、９倍超、又は１０倍超であることを示し得る。
[00106] 例えば、抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４などの抗ＰＡＤは、対象から得られた多様な異なる生物学的サンプル中に検出され得る。そのようなサンプルは、例えば、固体組織及び生物学的流体を含む。本明細書で使用される場合、用語「生物学的サンプル」は、分析又は診断に使用することができる生物の身体からの任意の標本を指す。本開示の文脈において、対象から得られた生物学的サンプルは、自己抗体を含むか又は含むことが疑われる任意のサンプルであり得、抗ＰＡＤ自己抗体が検出され得る任意の材料を包含する。例えば、生物学的サンプルは、自己抗体を含む液体サンプル、例えば全血、血漿、血清、滑液、羊水、痰、胸水、腹水、中央脊椎液、尿、唾液、涙液又は他の体液を含むことができる。生物学的サンプルはまた、骨髄、組織、頬側又は細胞の他の固体若しくは半固体凝集体などの固体組織サンプルを含むことができる。
[00107] いくつかの実施形態では、例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を含む抗ＰＡＤは、全血、血漿、血清、滑液又は痰中に検出される。本開示のいくつかの実施形態では、抗ＰＡＤのレベルが検出される。他の実施形態では、抗ＰＡＤ－ＰＡＤ複合体が本明細書に記載の組成物及び方法を用いて形成され得、複合体中の抗ＰＡＤが検出され得る。したがって、本開示は、抗ＰＡＤ－ＰＡＤ複合体を含む組成物を提供する。
[00108] 本開示の生物学的サンプルは、例えば、ヒト、サル、チンパンジー、オランウータン及びゴリラなどの霊長類、ネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ及びブタなどの家畜、並びにマウス、ラット、ハムスター及びモルモットなどのげっ歯類などの哺乳動物を含む任意の生物から得ることができる。
[00109] いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、複数のサンプルであり得る。いくつかの実施形態では、複数のサンプルは、１２時間超、１日間超、２日間超、３日間超、４日間超、５日間超、６日間超、７日間超、１０日間超、１４日間超、３週間超、１ヵ月超、２ヵ月超、３ヵ月超、４ヵ月超、５ヵ月超、６ヵ月超、９ヵ月超、１２ヵ月超、１８ヵ月超、２４ヵ月超、３０ヵ月超、３年超、４年超又は５年超の過程にわたって定期的に得ることができる。
[00110] いくつかの実施形態では、本開示のサンプルは、新鮮な状態で収集及び処理され得る。他の実施形態では、本開示のサンプルは、後日凍結、保存及び処理され得る。
[00111] いくつかの実施形態では、本開示は、対象において例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を含む抗ＰＡＤのレベルを決定して、対象がＲＡ、重度のＲＡ又は重度の関節びらんを含む関節びらんを有するか否かを決定する方法を提供する。本明細書で使用される場合、用語「対象」、「生物」、「個人」又「患者」は、同義語として、及び互換的に使用され、脊椎哺乳動物指すことに留意される。哺乳動物は、ヒト、サル、チンパンジー、オランウータン及びゴリラなどの霊長類、ネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ及びブタなどの家畜、並びにマウス、ラット、ハムスター及びモルモットなどのげっ歯類を含む。この開示の対象は、健康な対象、無症状対象、及び疾患対象を含むことができる。
[00112] いくつかの実施形態では、疾患対象は、異常な、例えば抗ＰＡＤ１レベル又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４レベルを含む抗ＰＡＤレベルに関連した任意の疾患に罹患し得る。用語「異常な抗ＰＡＤレベル」は、健康な対象の集団に見られるメジアン抗ＰＡＤレベルからかなり逸脱する、サンプル中の抗ＰＡＤ１レベル又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４レベルなどの抗ＰＡＤレベルを指すことに留意される。いくつかの実施形態では、異常な抗ＰＡＤレベルは、メジアン抗ＰＡＤレベルよりも高い可能性がある。いくつかの実施形態では、異常な抗ＰＡＤレベルは、メジアン抗ＰＡＤレベルよりも低い可能性がある。
[00113] いくつかの実施形態では、健康な対象は、特定の疾患に決して罹患していない可能性がある。いくつかの実施形態では、健康な対象は、以前に疾患を有した可能性がある。いくつかの実施形態では、健康な対象は、日常的な健康診断を受けている可能性がある。いくつかの実施形態では、健康な対象は、例えば臨床試験の対照群のメンバーであり得る。いくつかの実施形態では、健康な対象は、当技術分野で周知の特定のリスク因子の存在により決定して、疾患にかかるリスクにあり得る。そのようなリスク因子は、非限定的に、遺伝的素因、個人の病歴、家族の病歴、ライフスタイル要因、環境要因、診断指標などを含む。
[00114] いくつかの実施形態では、対象は無症状であり得る。無症状対象は、ＲＡを発症するリスクが本質的にないか又は低いリスクのみを有する（例えば、無症状患者が後の５年間にＲＡを発症する１０％未満、５％未満、３％未満、又は１％未満の可能性がある）健康な対象を含む。無症状対象はさらに、ＲＡを発症する高いリスクを有する（例えば、無症状患者が後の５年間にＲＡを発症する５０％超、７０％超、９０％超、又は９５％超の可能性がある）健康な対象を含む。無症状対象はさらに、ＲＡの軽度の早期診断指標を示し得るが、それ以外では疾患又は訴えがない（例えば、滑膜関節疼痛がない、全身炎症性障害がない）疾患対象を含む。いくつかの実施形態では、無症状患者は、関節痛患者であり得る。
[00115] いくつかの実施形態では、対象はＲＡを有し得る。いくつかの実施形態では、対象は、関節疼痛を伴うＲＡを有し得る。いくつかの実施形態では、対象は、系統的炎症性障害を伴うＲＡを有し得る。いくつかの実施形態では、対象は、若年性突発性関節炎（ＪＩＡ）を有し得る。いくつかの実施形態では、対象は、ＲＡ前症候群を有し得る。いくつかの実施形態では、ＲＡ前症候群は、関節痛であり得る。
[00116] いくつかの実施形態では、対象は、ＲＡを有することが疑われ得る。本明細書で使用される場合、対象は、当技術分野で周知の特定のリスク因子の存在によって決定して、「ＲＡを有することが疑われ」得る。そのようなリスク因子は、非限定的に、遺伝的素因、個人の病歴、ライフスタイル要因、環境要因、診断指標などを含む。
[00117] いくつかの実施形態では、対象は、ＲＡを発症するリスクにあり得る。いくつかの実施形態では、対象は、ＲＡを発症する遺伝的素因、又はＲＡ若しくは他の自己免疫疾患の家族歴を有し得る。いくつかの実施形態では、対象は、ＲＡの発症を促進する特定のライフスタイル要因（例えば、喫煙）に晒され得、又は対象は、ＲＡの臨床疾患症状を示し得る。いくつかの実施形態では、対象は、ＲＡを診断する、又はＲＡを発症するリスクを評価する臨床検査を受けている患者であり得る。
[00118] いくつかの実施形態では、対象は、例えば、対象の血液又は別の身体組織若しくは流体中に存在する、例えば、抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を含む抗ＰＡＤを有し得る（抗ＰＡＤ陽性対象）。いくつかの実施形態では、対象は、正常な健康な対象と比較して、例えば、対象の血液又は別の身体組織若しくは流体中の高い抗ＰＡＤレベルを有し得る。いくつかの実施形態では、対象は、例えば、対象の血液又は別の身体組織若しくは流体中に存在する抗ＰＡＤを有さない可能性がある（抗ＰＡＤ陰性対象）。
[00119] いくつかの実施形態では、対象は、例えば、対象の血液又は別の組織若しくは体液中に存在する抗ＰＡＤ１を有し得（抗ＰＡＤ１陽性対象）、又は対象は、正常な健康な対象と比較して、例えば、対象の血液又は別の組織若しくは体液中の高い抗ＰＡＤ１レベルを有し得る。いくつかの実施形態では、対象は、抗ＰＡＤ１について陰性であり得る。
[00120] いくつかの実施形態では、対象は、例えば、対象の血液又は別の組織若しくは体液中に存在する抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を有し得（抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４陽性対象）、又は対象は、正常な健康な対象と比較して、例えば、対象の血液又は別の組織若しくは体液中の高い抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４レベルを有し得る。いくつかの実施形態では、対象は、抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４について陰性であり得る。
[00121] いくつかの実施形態では、対象は、治療ナイーブであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、ＲＡの治療（例えば、薬物治療）を受けている可能性がある。いくつかの実施形態では、対象は、寛解中であり得る。いくつかの実施形態では、寛解は、薬物により誘導され得る。いくつかの実施形態では、寛解は、薬物を使用しない可能性がある。
[00122] いくつかの実施形態では、対象は、ＲＡの動物モデルであり得る。いくつかの実施形態では、動物モデルは、ＲＡのマウス、ウサギ、又は霊長類モデルであり得る。いくつかの実施形態では、動物モデルは、動物をＰＡＤで免疫化又はワクチン接種することにより、例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４を含む抗ＰＡＤ応答を誘導することを含み得る。
[00123] 用語「健康な対照個体」、「健康な対象」、及び本明細書の文法的等価物は、互換的に使用され、既知の又は非ＲＡ対象を表すように決定されたベースライン又は標準を超える、増加した抗ＰＡＤレベル、ＲＡ又は関節びらんを有さない対象を指すことに留意するべきである。
[00124] 対象を非ＲＡ対象として決定又は定義するベースライン又は標準は、基準範囲である。診断又は健康関連分野では、基準範囲は、特定のパーセンタイルによって指定される、健康な対照個体であり得る参照対照において観察される値の範囲である。基準範囲は、当業者により決定される任意の値の範囲であり得る。CLSI, “How to define and determine reference intervals in the clinical laboratory: approved guideline,” C28:A2 (2000)を参照されたい。いくつかの場合、基準範囲は、測定される特定の分析物、又は研究される疾患に応じてストリンジェント又はより低いストリンジェントであり得る。当業者は、基準範囲を決定する際に使用される適切なストリンジェンシーを理解するであろう。したがって、いくつかの実施形態では、基準範囲は、９５ｔｈパーセンタイルに設定され得る。特異度を増加させ、感度を低下させる、例えばストリンジェンシーを増加させるためには、９６ｔｈパーセンタイル又は９７ｔｈ、又は９８ｔｈ、又は９９ｔｈなどのより高いカットオフを使用することができる。
[00125] 本開示では、例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４などの抗ＰＡＤは、特定のタイプの抗ＰＡＤレベルが、健康な対照対象における対応する特定のタイプの抗ＰＡＤレベルに対して少なくとも９５ｔｈパーセンタイルを超える場合、対象において増加したとみなされ得る。他の実施形態では、例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４などの抗ＰＡＤは、特定のタイプの抗ＰＡＤレベルが９６ｔｈ、９７ｔｈ、９８ｔｈ又は９９ｔｈパーセンタイルを超える場合、対象において増加したとみなされ得る。
[00126] いくつかの実施形態では、例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４などの抗ＰＡＤの存在は、健康な対象における背景に対するシグナルの比較に基づく可能性がある。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＤの存在は、健康な対象の集団において観察される平均又はメジアン抗ＰＡＤレベルに対して増加又は減少し得る。いくつかの実施形態では、例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４などの抗ＰＡＤは、健康な対象に存在しない可能性がある。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＤレベルは、抗ＰＡＤレベルの決定に使用される各々のアッセイのノイズを超えて検出することができない。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＤは、抗ＰＡＤレベルが抗ＰＡＤレベルの決定に使用される各々のアッセイのノイズを超えて検出できる場合、サンプル中に存在するとみなされ得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＤは、抗ＰＡＤ検出アッセイのシグナルが、対照サンプルの平均(average)又は平均(mean)シグナルなどのノイズよりも少なくとも２標準偏差高い場合、サンプル中で増加したとみなされ得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＤは、抗ＰＡＤのレベルが所定の閾値レベルを超える場合、サンプル中に存在するとみなされ得る。抗ＰＡＤ閾値レベルは、多様な因子、例えば臨床試験の特定の目的、又は特定の抗ＰＡＤレベルの診断的及び予後的意義、又は抗ＰＡＤレベルの検出を含まないＲＡについての別の診断試験の結果に基づいて、臨床医などの当業者により決定され得る。
[00127] いくつかの実施形態では、本開示は、ＰＡＤ又はその抗原断片を含むポリペプチドを提供する。ＰＡＤは、本明細書で提供される方法で使用され、又は本明細書で提供されるキットに含まれ得る。
[00128] ＰＡＤ又はその抗原断片は、当技術分野で周知の様々な方法を用いて得ることができる。例えば、ＰＡＤ又はその抗原断片は、天然源から単離され、化学合成によって生成され、又は組換えタンパク質発現によって生成され得る。
[00129] いくつかの実施形態では、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片は、天然源からの単離、化学合成又は組換え発現を含む方法によって得られる。特定の実施形態では、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片は、天然源からの単離を含む方法によって得られる。特定の実施形態では、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片は、組換え発現を含む方法によって得られる。特定の実施形態では、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片は、化学合成によって得られる。特定の実施形態では、ＰＡＤタンパク質は、下の実施例に記載される方法によって得られる。
[00130] いくつかの実施形態では、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片は、組換え発現を含む方法によって得られ、カルシウムが使用される。いくつかの実施形態では、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片は、組換え発現を含む方法によって得られ、カルシウムは使用されない。
[00131] いくつかの実施形態では、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片は、シトルリン化ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片である。他の実施形態では、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片は、シトルリン化ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片である。
[00132] 組換えポリペプチドの発現及び精製、細胞、組織又は体液からのポリペプチドの精製、並びにポリペプチドの化学合成の例示的な方法は、当技術分野で周知であり、Scopes R.K., Protein Purification-Principles and Practice, Springer Advanced Texts in Chemistry, 3rd Edition (1994); Simpson R.J. et al., Basic Methods in Protein Purification and Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1st Edition (2008); Green M.R. and Sambrook J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 4th Edition (2012); Jensen K.J. et al., Peptide Synthesis and Applications (Methods in Molecular Biology), Humana Press, 2nd Edition (2013))に記載されているものに見出すことができる。
[00133] 天然源から精製又は単離されたポリペプチドは、ポリペプチドが天然に発現される供給源からのポリペプチドの単離及び精製を指す。いくつかの実施形態では、ＰＡＤの天然源は、生物の細胞、組織又は体液であり得る。いくつかの実施形態では、細胞、組織又は体液は、例えば、本開示の生物由来の全血、血清、血漿、滑液又は痰を含むことができる。ＰＡＤ又はその抗原断片は、本明細書に記載及び提供される任意の生物学的サンプルから同様に単離することができる。
[00134] 用語「精製された」又は「単離された」は、天然に見出される成分の複合混合物から部分的に又は完全に単離されたポリペプチドを指すことに留意するべきである。したがって、いくつかの実施形態では、本開示のＰＡＤは、部分的に精製され又は実質的に精製され得る。部分的な精製は、天然に見出される１つ以上の成分からの単離をもたらす。実質的な精製は、天然に見出される全ての成分からの単離をもたらす。本明細書に開示される部分的な精製は、本明細書で提供される方法及び組成物によって達成することができる。いくつかの実施形態では、部分的に精製されたＰＡＤは、捕捉プローブを用いて行うことができる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、ＰＡＤに特異的なポリペプチド又はその機能性断片である。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、抗ＰＡＤ抗体である。本明細書に例示される実質的な精製は、当技術分野で公知の方法によって達成することができる。いくつかの実施形態では、ＰＡＤは、抽出、沈殿及び可溶化のプロセスによって実質的に精製される。
[00135] 組換えポリペプチドは、細菌細胞（例えば、大腸菌(E.coli)）、酵母細胞（例えば、Ｓ．セレビシエ(S.cerevisiae)）、昆虫細胞（例えば、Ｓ?９）、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ）などにおいて発現させ、それらから精製することができる。組換えポリペプチドは、切断可能なタグ（例えば、ＴＥＶ－切断部位を含むタグ）を含む、タンパク質検出用のタグ又は親和性精製タグ（例えば、Ｈｉｓ－タグ、ＧＳＴ－タグ、Ｍｙｃ－タグ）を含む融合タンパク質として発現及び精製され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＰＡＤは、生物から得られた細胞、組織又は体液から精製され得る。組織又は体液は、生物から得られた任意の組織又は体液を含むことができる。いくつかの実施形態では、組織又は体液は、血液、血清、血漿、滑液、尿又は乳（例えば、ヤギ、ウシ、ヒツジ由来）を含むことができる。当業者は、細胞、組織又は体液からポリペプチドを精製するための方法が、当技術分野で周知であることを認識するであろう。
[00136] いくつかの実施形態では、ＰＡＤ又はその抗原断片は、例えば、Jensen,K.J.（上記）に記載の方法を用いて化学合成される。
[00137] いくつかの実施形態では、ＰＡＤ抗原断片は、全長ＰＡＤを酵素的に消化することによって生成され得る。全長ＰＡＤは、例えば、上述した例示的な方法のいずれかによって得ることができる。酵素消化は、例えば、プロテアーゼ又はペプチダーゼを用いて行うことができる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ又はペプチダーゼは、エキソプロテアーゼ又はエキソペプチダーゼであり得る。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ又はペプチダーゼは、エンドプロテアーゼ又はエンドペプチダーゼであり得る。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ又はペプチダーゼは、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸塩プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、又はメタロプロテアーゼを含むことができる。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ又はペプチダーゼは、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン及びカテプシンＢ、Ｌ、Ｄ、Ｋ、又はＧを含む任意のカテプシンを含むことができる。
[00138] いくつかの実施形態では、ＰＡＤ又はその抗原断片は、天然のＰＡＤであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＤ又はその抗原断片は、変性又は折り畳まれていないＰＡＤであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＤ又はその抗原断片は、非天然アミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、α－アミノ基においてメチル化されて、メチル化バックボーンを有するポリペプチドを生成し得る。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、Ｒ－アミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、染料（例えば、蛍光染料）又は親和性タグを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＰＡＤ又はその抗原断片は、化学修飾を含むことができる。化学修飾は、例えば、ビオチン、蛍光染料を用いた化学修飾を含むことができる。当業者は、非天然アミノ酸をポリペプチドに導入する方法を認識し、化学修飾されたポリペプチドは当技術分野で周知である。
[00139] いくつかの実施形態では、単離された、化学合成された若しくは組換えＰＡＤ又はその抗原断片は、複数のＰＡＤであり得る。用語「複数」は、２つ以上のメンバー、例えばポリペプチドメンバー又は他の参照分子の集団を指すことに留意するべきである。いくつかの実施形態では、複数のメンバーの２つ以上のメンバーは、同じメンバーであり得る。例えば、複数のポリペプチドは、同じアミノ酸配列を有する２つ以上のポリペプチドメンバーを含むことができる。例示のために、同じアミノ酸配列を有する複数のメンバーは、表１に例示したＰＡＤの任意の１つの２つ以上のメンバーを含むことができる。いくつかの実施形態では、複数のメンバーの２つ以上のメンバーは、異なるメンバーであり得る。例えば、複数のポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する２つ以上のポリペプチドメンバーを含むことができる。例示のために、異なるアミノ酸配列を有する複数のメンバーは、表１に例示した２つ以上のＰＡＤの少なくとも１つのメンバーを含むことができる。複数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００以上の異なるメンバーを含む。複数はまた、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００、５００００、１ｘ１０５、２ｘ１０５、３ｘ１０５、４ｘ１０５、５ｘ１０５、６ｘ１０５、７ｘ１０５、８ｘ１０５、９ｘ１０５、１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６又は１ｘ１０７以上の異なるメンバーを含むことができる。複数は、例えば、上記の例示的な複数の数字の間の全ての整数を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＤは、本開示の生物由来の複数のＰＡＤであり得る。
[00140] 本明細書で提供されるように、ＲＡは、抗ＰＡＤ１、又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４の検出によって、本開示の対象において決定され得る。いくつかの実施形態では、検出はさらに、抗ＰＡＤ３、抗ＰＡＤ２、及び／又は抗ＰＡＤ６を含むことができる。本明細書に記載の抗ＰＡＤのいずれかの検出は、例えば、ＩｇＧに特異的な抗体の使用により行うことができる。当技術分野におけるＩｇＧ結合分子を使用することができる。加えて、ＩｇＡに特異的な抗体も抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４の検出に使用することができる。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ及びＩｇＡ検出の組み合わせが行われ得る。
[00141] 本開示の標識は、本明細書に特定される検出プローブのいずれかにコンジュゲートされ得る。コンジュゲーションは、上述した非共有又は共有架橋を含むことができる。いくつかの構成では、検出プローブにコンジュゲートされた標識は、上述したさらなる基質又は結合剤を必要とする。例として、検出プローブにコンジュゲートされたＨＲＰ標識は、検出プローブを検出するために、上記に開示した基質を必要とする。標識の多数の他の構成が当技術分野で公知である。本開示は、本明細書で例示し及び／又は当技術分野で公知の全ての標識構成を含む。いくつかの実施形態では、標識構成は、ＰＡＤ（例えば、ＰＡＤ１又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４）、ＰＡＤ：抗ＰＡＤ複合体結合剤、抗ＰＡＤ ＩｇＧ、抗ＩｇＧ、抗ＰＡＤ ＩｇＡ又は抗ＩｇＡにコンジュゲートしたＰＥを含むことができる。代替的な実施形態では、標識構成は、例えばＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む特定のＰＡＤにコンジュゲートしたＰＥを含むことができる。さらなる実施形態では、標識構成は、例えば、抗ＰＡＤ１ ＩｇＧ、抗ＰＡＤ１ ＩｇＧ及び抗ＰＡＤ４ ＩｇＧを含む抗ＰＡＤ ＩｇＧ、抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ、抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ及び抗ＰＡＤ４ ＩｇＡ又はそれらの組み合わせにコンジュゲートしたＰＥを含むことができる。
[00142] 本開示の標識により生成されたシグナルの検出、測定及び／又は定量方法は、当技術分野で周知であり、蛍光、発光、化学発光又は吸光度、反射率、透過率、複屈折又は屈折率の検出を含む。光学的方法は、共焦点及び非共焦点顕微鏡法などのイメージング方法、並びにマイクロプレートリーダーなどの非イメージング方法を含む。いくつかの実施形態では、生物学的サンプル中の例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４などの抗ＰＡＤの検出方法は、生物学的サンプル中の蛍光、比色又は吸光度シグナルの可視化、定量又はその両方を含むことができる。
[00143] 本開示のいくつかの実施形態では、例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４などの抗ＰＡＤの存在は、イムノアッセイによって検出することができる。イムノアッセイ及び生物物理学的タンパク質－相互作用アッセイを行うための方法及びプロトコルは、当技術分野で周知である。例えば、Wild D., The Immunoassay Handbook, Elsevier Science, 4thEdition (2013); Fu H., Protein-Protein Interactions, Humana Press, 4thEdition (2004)を参照されたい。例示的なイムノアッセイは、蛍光免疫吸着剤アッセイ（ＦＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、多重イムノアッセイ、タンパク質／ペプチドアレイイムノアッセイ、固相ラジオイムノアッセイ（ＳＰＲＩＡ）、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＩＦ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び粒子ベースの多分析物試験（ＰＭＡＴ）、又はドットブロットアッセイを含む。
[00144] いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡはサンドイッチＥＬＩＳＡであり得る。いくつかの実施形態では、サンドイッチＥＬＩＳＡは、この開示の精製ポリペプチドを、下記に例示するように固体支持体上に固定化する初期工程を含むことができる。例えば、ＰＡＤ又はその抗原断片は、マイクロタイタープレートウェル又はキュベットの壁上に固定化され得る。いくつかの実施形態では、対象由来のサンプルを、この開示のＰＡＤ又はその抗原断片と接触させることは、サンプルを固定化ＰＡＤ又はその抗原断片に曝露することを含むことができる。
[00145] いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡは直接ＥＬＩＳＡであり得る。いくつかの実施形態では、直接ＥＬＩＳＡは、ＰＡＤ又はその抗原断片を、本明細書に開示した固体支持体のいずれかに固定化する初期工程を含むことができる。例えば、ＰＡＤ又はその抗原断片は、マイクロタイタープレートウェル又はキュベットの壁に固定化され得る。いくつかの実施形態では、対象由来のサンプルを、この開示のＰＡＤ又はその抗原断片と接触させることは、患者のサンプルに含まれる抗ＰＡＤを固定化ＰＡＤに曝露することを含むことができる。本明細書に開示した方法のいずれかにおいて、本明細書及び当技術分野に開示した（上記参照）イムノアッセイのいずれかを使用することができ、又は使用のために改変することができる。
[00146] いくつかの実施形態では、抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４などの抗ＰＡＤは、粒子ベースの多分析物試験によって検出することができる。例えば、ＰＭＡＴでは、異なるタイプの粒子が同時に使用され、各タイプは、その粒子の表面上に、特定の分子種の特定の結合パートナーが固定化されている。溶液中で、検出されるべき分析物分子は、対応する粒子タイプ上のそれらの結合パートナーに結合する。次いで、多重アッセイの全ての粒子－結合分析物分子をマークする二次マーカーを添加することにより、結合が光学的に検出される。ＰＭＡＴは、フローサイトメトリー、捕捉サンドイッチイムノアッセイ又は競合イムノアッセイなどの当技術分野で公知の多様なフォーマットを用いて行うことができる。例えば、デュアルレーザーフローベースの検出機器を使用し、自己抗体などの分析物部分の結合を、二次マーカーの蛍光を介して検出することができる。いくつかの実施形態では、ＰＭＡＴ粒子はビーズであり得る。ＰＭＡＴを実行するために、自己免疫疾患に特異的に関連する１つ以上の自己抗体の存在を同定し得、患者は、ＰＭＡＴにより同定された自己抗体に特異的に関連する自己免疫疾患が診断され得る。
[00147] いくつかの実施形態では、ドットブロット又はラインイムノアッセイ（ＬＩＡ）を用いて、生物学的サンプル中の抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４などの抗ＰＡＤを検出することができる。ドットブロットの方法及びプロトコルは、当技術分野で周知であり、ポリペプチド濃度を推定することを含む。Joint ProteomicS Laboratory (JPSL) of the Ludwig Institute for Cancer Research, Estimating protein concentration by dot blotting of multiple samples, Cold Spring Harbor Protocols, New York (2006)を参照されたい。
[00148] いくつかの実施形態では、イムノアッセイは、捕捉プローブを固体支持体に十分な時間固定化して結合を起こさせることにより行うことができる。捕捉プローブは、目的の分析物に結合する結合剤を含む。抗ＰＡＤ、例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４の検出に関連して、捕捉プローブは、抗ＰＡＤ、ＰＡＤ：抗ＰＡＤ複合体又は抗ＰＡＤに特異的に結合する任意の結合剤であり得る。例示的な捕捉プローブは、ＰＡＤ及び／又は特定のＰＡＤ、例えばＰＡＤ１、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３及び／又はＰＡＤ４、並びにその抗原断片を含む。他の例示的な捕捉プローブは、抗ＩｇＧ抗体及び／又は抗ＩｇＡ抗体、及びその機能性断片、抗ＩｇＧ及び／又はＩｇＡ結合ポリペプチド及びその機能性断片、抗体を含む抗ＰＡＤ ＩｇＧ及び／又は抗ＰＡＤ ＩｇＡ結合ポリペプチド、及びその機能性断片、及び／又はＰＡＤ：抗ＰＡＤ複合体結合ポリペプチド及びその機能性断片並びに結合剤を含む。
[00149] イムノアッセイはさらに、ブロッキング工程、洗浄工程及び追加的又は代替的に、溶出工程を含むことができる。ブロッキング工程は、イムノアッセイの固体支持体をブロッキング緩衝液中に十分な時間及び温度で接触させて、ブロッキングを可能にすることを含むことができる。例示的なブロッキング緩衝液は、例示的な固体支持体と同様に、下記に特定される。洗浄工程は、イムノアッセイの固体支持体を洗浄緩衝液と接触させて、固体支持体へのポリペプチドの非特異的結合を除去することを含む。例示的な洗浄緩衝液は、下記に記載されている。溶出緩衝液は、当技術分野で公知の、又は本明細書に開示される多様な溶出緩衝液のいずれかを含むことができる。溶出緩衝液は、例えば、ｐＨ２．５～３の０．１Ｍグリシン：ＨＣｌ溶液を含む。ポリペプチド複合体はイムノアッセイの固体支持体から溶出して、例えば、ＰＡＤ及び抗ＩｇＧ複合体又はＰＡＤ及び抗ＩｇＡの検出及び測定を補助することができる。
[00150] 本開示はまた、ＲＡの診断、又はＲＡ進行の監視に使用することができるキットを提供する。キットは、ＰＡＤタンパク質に特異的な自己抗体を補足することができる少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質、又はその抗原断片；前記自己抗体を認識する検出プローブ、及び固体支持体を含むことができ、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含むことができる。特定の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１又はその抗原断片である。他の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片である。
[00151] いくつかの実施形態では、ＰＡＤ１又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む本開示のキットはさらに、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６又はその抗原断片からなる群から選択される１つ以上のＰＡＤタンパク質を含むことができる。特定の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ２又はその抗原断片である。他の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ３又はその抗原断片である。さらに他の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、ＰＡＤ２、及びＰＡＤ３又はその抗原断片である。さらなる実施形態では、少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６又はその抗原断片である。
[00152] キットは、本明細書で提供され、また当技術分野で周知の他の検出プローブのいずれかを含むことができる。例えば、検出プローブは、抗体又はリガンドを含むことができる。検出プローブは、固体支持体上に固定化され得る。用語「固定化」は「結合」と互換的に使用され、両方の用語は、別に示さない限り、明示的に又は文脈により、共有及び非共有結合を含むことに留意するべきである。いくつかの実施形態では、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片は、固体支持体に固定化される。
[00153] この開示の方法に関連して例示されるように、キットは、本明細書に記載され又は例示される標識のいずれかを含むことができる。例えば、キットの標識は、フルオロフォア、酵素、化学発光部分、放射性部分、有機色素、小分子、ポリペプチド又はその機能性断片を含むことができる。いくつかの実施形態では、キットの標識はＰＥを含む。いくつかの実施形態では、キットの標識はＦＩＴＣを含む。いくつかの実施形態では、本開示の標識は、上記に例示した本開示の検出プローブにコンジュゲートされる。
[00154] キットは、本明細書で提供され又は当技術分野で特定される任意の固体支持体を含むことができる。本明細書で使用される場合、用語「固体支持体」、「固体表面」及び他の文法的等価物は、この開示のＰＡＤ、例えばＰＡＤ１又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４、又はその抗原断片の結合に適切な又は適切なように修飾され得る任意の材料を指す。可能な材料は、非限定的に、ガラス及び修飾又は官能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、メチルスチレン、ポリウレタン、テフロン（商標）などを含む）、常磁性材料、トリアソル(thoria sol)、カーボングラファイト、酸化チタン、ラテックス又は架橋デキストラン、例えばセファロース、セルロース多糖、ナイロン又はニトロセルロース、セラミックス、樹脂、ケイ素及び修飾ケイ素を含むシリカ又はシリカ系材料、炭素金属、無機ガラス、光ファイバー束、並びに多様な他のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、マイクロタイターウェルプレート（例えば、９６－ウェル、３８４－ウェル又は１５３６－ウェルプレート）内に位置し得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、フローセル又はフローセル装置（例えば、Biacore（商標）チップ又はタンパク質チップ上のフローセル）内に位置し得る。
[00155] いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズ、ミクロスフェア、粒子、膜、チップ、スライド、ウェル及び試験管であり得る。ビーズは、ミクロスフェア又は粒子を含む。本明細書の「ミクロスフェア」又は「粒子」又は文法的等価物は、マイクロメートル又はナノメートル寸法の小さい、個別の非平面粒子を意味する。いくつかの実施形態では、ビーズは球状であり得、他の実施形態では、ビーズは不規則である。代替的又は追加的に、ビーズは多孔質であり得る。ビーズサイズはナノメートル～ミリメートルの範囲であり、いくつかの実施形態では約０．２～約２００ミクロンのビーズが好ましい。他の実施形態では、ビーズサイズは、約０．５～約５ミクロンの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、０．２ミクロンより小さい、及び２００ミクロンを超えるビーズが使用され得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、表面内のウェル又は凹部のアレイを含むことができる。これは、フォトリソグラフィ、スタンピング技術、成形技術及びマイクロエッチング技術を含む多様な技術を用いて、当技術分野で公知のように製作することができる。当業者が理解するように、用いられる技術は、アレイ基材の組成及び形状に依存するであろう。
[00156] いくつかの実施形態では、固体支持体は、精製タンパク質を規則正しいパターンに固定化するのに適したパターン化表面を含むことができる（例えば、タンパク質チップ）。「パターン化表面」は、固体支持体の露出層内又は上の異なる領域の配置を指す。例えば、領域の１つ以上は、１つ以上の精製タンパク質が存在するフィーチャであり得る。フィーチャは、精製タンパク質が存在しない介在領域によって分離され得る。いくつかの実施形態では、パターンは、行及び列にあるフィーチャのｘ－ｙフォーマットであり得る。いくつかの実施形態では、パターンは、フィーチャ及び／又は介在領域の反復配置であり得る。いくつかの実施形態では、パターンは、フィーチャ及び／又は介在領域のランダム配置であり得る。本明細書に記載される方法及び組成物に使用できる例示的なパターン化表面は、米国特許出願公開第２００８／０２８０７８５ Ａ１号、米国特許出願公開第２００４／０２５３６４０ Ａ１号、米国特許出願公開第２００３／０１５３０１３ Ａ１号及び国際公開第２００９／０３９１７０ Ａ２号に記載されている。
[00157] いくつかの実施形態では、固体支持体は、その表面に、例えばＰＡＤ１又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４などのＰＡＤ、又はその抗原断片が結合され得る。いくつかの実施形態では、例えば、表１～３に例示されている任意のＰＡＤ（その抗原断片を含む）を、固体支持体に結合することができる。いくつかの実施形態では、本開示の任意のＰＡＤ又はその抗原断片は、リンカー分子を介して固体支持体に固定化され得る。いくつかの実施形態では、本開示の任意のＰＡＤ又はその抗原断片などの分子が、支持体を使用することが意図される条件下で、例えば、抗体の結合又は検出を必要とする用途において、支持体に固定化又は結合されたままであることが、必要とする全てである。
[00158] キットは、陽性対照を含むことができる。いくつかの実施形態では、陽性対照は、検出可能な量の、又は閾値を超えるレベルの、例えば抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４などの抗ＰＡＤを含むサンプルであり得る。いくつかの実施形態では、陽性対照は、閾値を超える抗ＰＡＤのレベルを有する疾患対象から得ることができる。追加的又は代替的に、陽性対照は、本明細書に記載される方法のいずれかを用いてインビトロで合成された抗ＰＡＤを含み得る。他の実施形態では、キットは、陰性対照を含むことができる。陰性対照は、検出可能な量ではない、又は閾値未満のレベルの抗ＰＡＤを含むサンプルであり得る。いくつかの実施形態では、陰性対照は、健康な対照個体から得ることができ、又はインビトロで合成することができる。例えば、陰性対照は、水又は緩衝液を含むことができる。
[00159] キット又は本開示はさらに、１つ以上の補助試薬を含むことができる。本明細書で使用される場合、「補助試薬」は、キットの意図する目的を実行するのに有用な、物質、混合物、材料又は成分を指す。補助試薬は、コンジュゲーション試薬を含む試薬、緩衝液、標準、陽性対照、標識、説明書などを含むことができる。
[00160] この開示の方法に関連して本明細書で提供及び例示されるように、この開示のキットは、レポータータグを含むことができる。レポータータグは、バイオマーカーの検出のためのシグナルを生成するように機能する。レポータータグは、例えば、本明細書で使用される検出プローブのいずれかに、非共有又は共有架橋を介して結合することができる。
[00161] いくつかの実施形態では、本開示のキットの試薬は、共有及び非共有コンジュゲーション試薬を含む、当技術分野で公知の任意のコンジュゲーション試薬を含むことができる。共有コンジュゲーション試薬は、この開示のポリペプチドを表面上に共有結合により固定化するのに使用できる任意の化学的又は生物学的試薬を含むことができる。共有コンジュゲーション試薬は、カルボキシルからアミンへの反応性基、例えばＥＤＣ若しくはＤＣＣなどのカルボジイミド、アミン反応性基、例えばＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル若しくはイミドエステル、スルフヒドリル反応性架橋剤、例えばマレイミド、ハロアセチル、若しくはピリジルジスルフィド、カルボニル反応性架橋剤基、例えばヒドラジド若しくはアルコキシアミン、光反応性架橋剤、例えばアリールアジド若しくはジジリン(dizirine)、又は化学選択的ライゲーション基、例えばシュタウディンガー反応対を含むことができる。非共有固定化試薬は、この開示のポリペプチドを表面上に非共有結合により固定化するのに使用できる任意の化学的又は生物学的試薬、例えば親和性タグ、例えばビオチン又は捕捉試薬、例えばストレプトアビジン又は抗タグ抗体、例えば抗Ｈｉｓ６若しくは抗Ｍｙｃ抗体を含むことができる。
[00162] 本開示のキットは、コンジュゲーション試薬の組み合わせを含むことができる。そのような組み合わせは、例えばこの開示のタンパク質を表面、例えばカルボキシル化デキストランマトリクス上（例えば、BIAcore（商標）ＣＭ５チップ又はデキストランベースのビーズ上）に固定化するのに使用できる、例えばＥＤＣ及びＮＨＳを含む。コンジュゲーション試薬の組み合わせは、予め混合した試薬の組み合わせとして保存されてもよく、又は組み合わせの１つ以上のコンジュゲーション試薬は他のコンジュゲーション試薬とは別個に保存されてもよい。
[00163] 他の実施形態では、キットの試薬は、被覆緩衝液などの試薬を含むことができる。被覆緩衝液は、炭酸ナトリウム－水酸化ナトリウム又はリン酸ナトリウムを含むことができる。いくつかの実施形態では、被覆緩衝液は、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ３（例えば、約ｐＨ９．６）であってもよい。
[00164] いくつかの実施形態では、キットの試薬は、洗浄緩衝液を含むことができる。洗浄緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）のようなトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）ベースの緩衝液、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のようなリン酸緩衝液を含むことができる。洗浄緩衝液は、イオン性又は非イオン性洗剤などの洗剤から構成され得る。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、約０．０５％のTween（登録商標）２０を含む約ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液であり得る。他の実施形態では、洗浄緩衝液は、BIO-FLASH（商標）Special Wash Solution (Inova Diagnostics,Inc.、San Diego、CA)であり得る。
[00165] いくつかの実施形態では、キットの試薬は、希釈緩衝液を含むことができる。当技術分野で公知の任意の希釈緩衝液が本開示のキットに含まれ得る。典型的な希釈緩衝液は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体タンパク質、及びTween（登録商標）２０などの洗剤を含む。いくつかの実施形態では、希釈緩衝液は、約１％ ＢＳＡのＢＳＡ及び約０．０５％のTween（登録商標）２０を含む約ｐＨ７．４のＰＢＳであり得る。
[00166] いくつかの実施形態では、試薬は、検出又はアッセイ緩衝液を含むことができる。当技術分野で公知の任意の検出又はアッセイ緩衝液が本開示のキットに含まれ得る。検出又はアッセイ緩衝液は、比色検出若しくはアッセイ緩衝液、蛍光検出若しくはアッセイ緩衝液又は化学発光検出若しくはアッセイ緩衝液であり得る。比色検出又はアッセイ緩衝液は、ＰＮＰＰ（ｐ－ニトロフェニルリン酸）、ＡＢＴＳ（２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸））又はＯＰＤ（ｏ－フェニレンジアミン）を含む。蛍光検出又はアッセイ緩衝液は、QuantaBlu（商標）又はQuantaRed（商標）(Thermo Scientific、Waltham、MA)を含む。化学発光検出又はアッセイ緩衝液は、ルミノール又はルシフェリンを含むことができる。検出又はアッセイ緩衝液はまた、Ｈ２Ｏ２などのトリガー、及びイソルミノール－コンジュゲートなどのトレーサーを含むことができる。いくつかの実施形態では、検出試薬は、１つ以上のBIO-FLASH（商標）Ｔｒｉｇｇｅｒ溶液(Inova Diagnostics,Inc.、San Diego、CA)を含むことができる。いくつかの実施形態では、本開示のキットの試薬は、較正又は試験に有用な溶液を含むことができる。
[00167] いくつかの実施形態では、キットの試薬は、停止溶液を含むことができる。当技術分野で公知の任意の停止溶液がこの開示のキットに含まれ得る。この開示の停止溶液は、検出試薬及び対応するアッセイシグナルのさらなる発生を終結又は遅延させる。停止溶液は、例えば、低ｐＨ緩衝液（例えば、グリシン－緩衝液、ｐＨ２．０）、カオトロピック剤（例えば、塩化グアニジニウム、ドデシル硫酸ナトリウム－（ＳＤＳ））又は還元剤（例えば、ジチオトレイトール、β－メルカプトエタノール）などを含むことができる。
[00168] いくつかの実施形態では、この開示のキットの試薬は、清浄試薬を含むことができる。清浄試薬は、当技術分野で公知の任意の清浄試薬を含むことができる。いくつかの実施形態では、清浄試薬は、自動アッセイシステムの製造業者により推奨される清浄試薬であってもよい。いくつかの実施形態では、清浄試薬は、BIO-FLASH（商標）System Rinse又はBIO-FLASH（商標）System Cleaning溶液(Inova Diagnostics,Inc.、San Diego、CA)を含むことができる。
[00169] キットの検出プローブは、上述した検出プローブのいずれかを含むことができる。簡単に言えば、キットの検出プローブは、抗体及びリガンドを含むことができる。したがって、抗ＰＡＤに特異的な検出プローブは、例えば、ＰＡＤ、ＰＡＤ：抗ＰＡＤ複合体結合剤、抗ＰＡＤ ＩｇＧ及び／又は抗ＰＡＤ ＩｇＡ結合剤並びにＩｇＧ及び／又はＩｇＡ結合剤を含む。抗ＰＡＤ ＩｇＧ検出プローブは、抗ＰＡＤ１ ＩｇＧ、抗ＰＡＤ２ ＩｇＧ、抗ＰＡＤ３ ＩｇＧ、抗ＰＡＤ４ ＩｇＧ、及び／又は抗ＰＡＤ６ ＩｇＧへの結合剤を含む。抗ＰＡＤ ＩｇＡ検出プローブは、抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ、抗ＰＡＤ２ ＩｇＡ、抗ＰＡＤ３ ＩｇＡ、抗ＰＡＤ４ ＩｇＡ、及び／又は抗ＰＡＤ６ ＩｇＡへの結合剤を含む。
[00170] キットの検出プローブは、本明細書で以前に開示した標識のいずれかにコンジュゲートされ得る。例えば、検出プローブは、フルオロフォア、酵素、化学発光部分、放射性部分、有機色素、小分子、ポリペプチド又はその機能性断片にコンジュゲートされ得る。フルオロフォアの例は、フィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、ＢＯＤＩＰＹ及びAlexaFluor（登録商標）染料のような蛍光染料を含む。蛍光染料はまた、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）－染料又は時間分解（ＴＲ）－ＦＲＥＴ染料を含むことができる。フルオロフォア標識はまた、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）などの蛍光タンパク質を含む。酵素標識の例は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）又は西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む。基質３，３’５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、又は２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）のいずれかがＨＲＰに適用される場合、有色（発色）又は光（化学発光）シグナルが生成される。放射性部分標識は、炭素－１４又はトリチウムを含む。小分子標識は、ビオチン、アガロースビーズ及び蛍光標識磁気ビーズなどの樹脂、又は金コロイドなどのナノ粒子を含む。ポリペプチド又は機能性断片標識は、ビオチンに対する親和性を有するアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンを含む。ポリペプチド又は機能性断片標識はまた、ヘマグルチニン（ＨＡ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はｃ－ｍｙｃを含む。
[00171] いくつかの実施形態では、この開示で提供されるキットは、生物学的サンプルの収集に適した構成要素を含むことができる。構成要素は、収集チューブ、カラム、注射器、針などを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、キットの構成要素を使用するための説明書を含むことができる。説明書は、キットの内部又は外部の任意の形態であり得る。説明書は、プロトコル及び分析技術に関する詳細を提供する。
[00172] いくつかの実施形態では、本開示のキットは、自動アッセイシステムに対する器具を含むことができる。自動アッセイシステムは、任意の製造業者によるシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、自動アッセイシステムは、例えば、BIO-FLASH（商標）、BEST 2000（商標）、DS2（商標）、ELx50 WASHER、ELx800 WASHER、ELx800 READER、及びAutoblot S20（商標）(Inova Diagnostics,Inc.、San Diego、CA)を含むことができる。他の実施形態では、キットの器具は、検出器具であり得る。検出器具は、当技術分野の任意の検出器具を含むことができる。検出器具は、本開示のレポータータグの標識を検出又は測定することが可能である。したがって、検出器具は、蛍光、発光、化学発光又は吸光度、反射率、透過率、複屈折又は屈折率を検出又は測定することが可能である。いくつかの実施形態では、検出器具は、共焦点及び非共焦点顕微鏡法、マイクロプレートリーダー、フローサイトメーターなどを含むことができる。
[00173] 本開示のキットの成分は、様々な物理的状態にあり得る。例えば、成分のいくつか又は全部は、水溶液中で凍結乾燥され、又は凍結され得る。そのような成分は、ＰＡＤ１又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４などのＰＡＤ、検出プローブ、並びに補助試薬を含む。補助試薬は、固定化緩衝液、インキュベーション緩衝液、洗浄緩衝液、希釈緩衝液、検出又はアッセイ緩衝液及びブロッキング緩衝液を含む。当業者は、様々なタイプのインキュベーション、洗浄、検出及びブロッキング緩衝液が存在することを認識する。
[00174] この開示のキットは、特定のアッセイ技術に適合(tailor)させることができる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に例示したアッセイ技術に適合させることができる。例えば、いくつかの実施形態では、キットは、ＦＩＡキット、ＣＩＡキット、ＲＩＡキット、多重イムノアッセイキット、タンパク質／ペプチドアレイイムノアッセイキット、ＳＰＲＩＡキット、ＩＩＦキット、ＥＬＩＳＡ、ＰＭＡＴキット、又はドットブロットキットであり得る。いくつかの実施形態では、ＥＬＳＡキットは、洗浄緩衝液、サンプル希釈剤、二次抗体－酵素コンジュゲート、検出試薬及び停止溶液を含むことができる。いくつかの実施形態では、ドットブロットキットは、洗浄緩衝液、サンプル希釈剤、二次抗体－酵素コンジュゲート、検出試薬、及び停止溶液を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＣＩＡキットは、洗浄緩衝液、サンプル希釈剤、トレーサー（例えば、イソルミノール－コンジュゲート）及びトリガー（例えば、Ｈ２Ｏ２）を含むことができる。いくつかの実施形態では、多重キットは、洗浄緩衝液、サンプル希釈剤及び二次抗体－酵素コンジュゲートを含むことができる。いくつかの実施形態では、キットは、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームに適合させることができ、例としてxMAP（登録商標）ビーズを含む。
[00175] キットは、各々がＰＡＤ１又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４などのＰＡＤ、又はその抗原断片と反応性の抗ＰＡＤ１又は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４などの抗ＰＡＤを検出する手段を提供することにより、ＲＡの診断、又はＲＡの監視に使用することができる。キットは、本明細書に記載され、及び当技術分野で公知の技術のいずれかによって、抗ＰＡＤ自己抗体を検出することができる。抗ＰＡＤ及びＰＡＤ、又はその抗原断片の複合体は、１つの抗ＰＡＤに対して１又は１を超える化学量論を有し得る。いくつかの実施形態では、複合体は、ＰＡＤ又はその抗原断片当たり１つの抗ＰＡＤ抗体を有し得る。いくつかの実施形態では、複合体は、ＰＡＤ又はその抗原断片当たり２つの抗ＰＡＤを有し得る。いくつかの実施形態では、複合体は、ＰＡＤ又はその抗原断片当たり２つを超える抗ＰＡＤを有し得る。２つの抗原の結合化学量論を測定する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）及び超遠心分離法を含む。
[00176] いくつかの実施形態では、抗ＰＡＤ及びＰＡＤ、又はその抗原断片の複合体は、同一の化学量論を有する複数の複合体であり得る。例えば、複数の複合体おける全複合体は、精製ＰＡＤ又はその抗原断片当たり１つの抗ＰＡＤを有する。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＤ及びＰＡＤ又はその抗原断片の複合体は、異なる化学量論を有する複数の複合体であり得る。例えば、複数の複合体おけるいくつかの複合体は、ＰＡＤ又はその抗原断片当たり１つの抗ＰＡＤを有し得、複数の複合体におけるいくつかの他の複合体は、ＰＡＤ又はその抗原断片当たり１つを超える抗ＰＡＤを有し得る。
[00177] いくつかの実施形態では、ＰＡＤ又はその抗原断片は、より高い親和性で抗ＰＡＤにより結合され得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＤ結合部位は、２倍超、３倍超、４倍超、５倍超、８倍超、１０倍超、１５倍超、２０倍超、２５倍超、５０倍超、１００倍超、３００倍超、１，０００倍超、３，０００倍超、１０，０００倍超、３０，０００倍超、又は１００，０００倍超のより高い結合親和性で抗ＰＡＤにより結合され得る。より大きい結合親和性は、抗ＰＡＤ－ＰＡＤ複合体についてのより低い解離定数（ＫＤ）、又は抗ＰＡＤ及びＰＡＤの各々についてのより高い結合定数（ＫＡ）により証明される。いくつかの実施形態では、抗ＰＡＤ－ＰＡＤ複合体についての解離定数（ＫＤ）は、１ｍＭ未満、３００ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、３ｎＭ未満、１ｎＭ未満、３００ｐＭ未満、１００ｐＭ未満、３０ｐＭ未満、１０ｐＭ未満、３ｐＭ未満、又は１ｐＭ未満であり得る。抗原に対する抗体の結合親和性を測定する方法は、当技術分野で周知であり、ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を含む。
[00178] 本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態により範囲を限定されない。実際に、記載されたものに加えて本発明の様々な改変が、前述の記載及び付随する図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
[00179] 本出願を通して、様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物の、それら全体における開示は、本発明が属する最先端技術をより完全に記載するために、本出願において参照により本明細書に援用される。上記に提供された例を参照して本発明を記載してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく様々な改変を為し得ることを理解するべきである。
６．実施例
実施例Ｉ
関節リウマチ（ＲＡ）における新規な抗原標的としてのＰＡＤ１及びＰＡＤ６の同定
[00180] この実施例は、ＰＡＤ１及びＰＡＤ６がＲＡにおける新規な抗原標的であり、また抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ６がＲＡ患者の同定に使用できることを示す。
実施例Ｉ
関節リウマチ（ＲＡ）における新規な抗原標的としてのＰＡＤ１及びＰＡＤ６の同定
[00180] この実施例は、ＰＡＤ１及びＰＡＤ６がＲＡにおける新規な抗原標的であり、また抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ６がＲＡ患者の同定に使用できることを示す。
[00181] ５つの既知のタンパク質－アルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）ファミリーメンバー（ＰＡＤ１、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ６）のいずれかに対する抗体の存在が、ＲＡ患者及び非ＲＡ対照間を区別できるか否かを決定するために、粒子－ベースの多分析物技術（ＰＭＡＴ）に基づく抗ＰＡＤ ＩｇＧの検出のためにパネルを開発した。パネルは、異なるヒト組換えＰＡＤタンパク質（ＰＡＤ１、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ６）及び抗ヒトＩｇＧコンジュゲートに連結した常磁性粒子を使用した。このパネルを使用して、ＲＡ患者由来の血清を使用する患者の第１のコホート（「コホートＩ」）（ｎ＝３３）及び非ＲＡ対照（ｎ＝３６）を試験した。対照は、明らかに健康な個体（ｎ＝１０）と、感染性疾患（ｎ＝１０）、全身性エリテマトーデス（ｎ＝７）、全身性硬化症（ｎ＝９）及びシェーグレン症候群（ｎ＝１）を有する患者とから構成された。
[00182] 結果は、５つの抗ＰＡＤ ＩｇＧ全部が、ＲＡ患者及び非ＲＡ対照間を区別する能力を示すことを明らかにした（図１）。９０％を超える特異度で、抗ＰＡＤ４ ＩｇＧ、次いで抗ＰＡＤ３ ＩｇＧは、最良の診断性能を示した。抗ＰＡＤ２、抗ＰＡＤ３、及び抗ＰＡＤ４（各々、ｐ値＜０．０００１、０．００１４、及び０．００３９）についてＲＡ対非ＲＡ対照において有意に高いレベルの抗体が観察され、これはＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ４が自己抗原であることを確認した。驚くべきことに、より高いレベルの抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ６も、ＲＡ対非ＲＡ対照において観察された（各々、ｐ値０．００４１、及び０．０１４０）。
[00183] 同様の結果が、合計２７５人のＲＡ患者及び２８５人の対照を含むより大規模な研究（「コホートＩＩ」）でも達成された（図２）。注目すべきことに、ＲＡ及び非ＲＡ対照間の区別は、より大規模な研究においても抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４について同等であった。
[00184] 合わせて、これらの結果は、抗ＰＡＤ２、抗ＰＡＤ３、及び抗ＰＡＤ４の同定が、ＲＡ患者を非ＲＡ対照から区別するのに有用であることを確認し、ＰＡＤ１及びＰＡＤ６も同じ目的に有用であり得ることを最初に同定した。
実施例ＩＩ
ＲＡ患者の血清における抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４検出の相関の性能
[00185] この実施例は、抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４の性能がＲＡ患者の血清において強く相関することを示す。
ＲＡ患者の血清における抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４検出の相関の性能
[00185] この実施例は、抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４の性能がＲＡ患者の血清において強く相関することを示す。
[00186] 実施例Ｉに記載したコホートＩからのサンプルの分析は、主成分分析（ＰＣＡ）が、全ての抗ＰＡＤ抗体間の関連を示したが、一方では抗ＰＡＤ１、３及び４の間、並びに抗ＰＡＤ２及び６の間のより密接な関連を示す、さらなる区別が存在したことを明らかにした（図３）。具体的には、最高の相関は抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４の間であり（スピアマンのｒｈｏ＝０．８７、ｐ＜０．０００１）、最低の相関は抗ＰＡＤ４及び抗ＰＡＤ２の間（スピアマンのｒｈｏ＝０．３８、ｐ＝０．００１５）、並びに抗ＰＡＤ４及び抗ＰＡＤ６の間であった（スピアマンのｒｈｏ＝０．３８、ｐ＝０．００１１）。これらの結果は、患者の両コホートにおいて観察された抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４の同様の性能と一致した（図１及び図２）。
[00187] 合わせて、相関結果は、抗ＰＡＤ１がＲＡの既知のマーカーである抗ＰＡＤ４と強く相関することを明らかにした。
実施例ＩＩＩ
疾患対照に対して区別される抗ＰＡＤ１検出
[00188] この実施例は、抗ＰＡＤ１の検出が、様々な疾患の間でＲＡ患者を同定するのにも有用であることを示す。
疾患対照に対して区別される抗ＰＡＤ１検出
[00188] この実施例は、抗ＰＡＤ１の検出が、様々な疾患の間でＲＡ患者を同定するのにも有用であることを示す。
[00189] 抗ＰＡＤ１がＲＡに特異的であるか否かを決定するために、非ＲＡ疾患対照由来の血清のサンプルをＲＡ患者と比較した。非ＲＡ対照は、橋本病（ＨＤ）、突発性炎症性筋疾患（ＩＩＭ）、シェーグレン症候群（ＳｊＳ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、健康な個体（ＨＩ）、若年性突発性関節炎（ＪＩＡ）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、感染性疾患（ＩＤ）、変形性関節症（ＯＡ）、及び小型血管炎（ＳＶＶ）由来のサンプルを含んでいた。自己抗体を通常有する異なるタイプの自己免疫疾患を含む様々な非ＲＡ対照に対する試験からの結果は、抗ＰＡＤ１がＲＡに特異的であり、各々約３０％及び９７％の感度及び特異度を有することを明らかにした（図３）。
[00190] したがって、抗ＰＡＤ１の検出は、異なるタイプの自己免疫疾患を含む他のタイプの疾患からＲＡを区別することができ、ＲＡを有する患者を同定するための新規な診断マーカーを表す。
実施例ＩＶ
抗ＰＡＤ１の検出とさらなる抗ＰＡＤ自己抗体の検出との組み合わせは、ＲＡの診断を改善した
[00191] この実施例は、抗ＰＡＤ１検出を１つ以上のさらなる抗ＰＡＤ自己抗体と組み合わせて、ＲＡの診断を改善することを示す。
抗ＰＡＤ１の検出とさらなる抗ＰＡＤ自己抗体の検出との組み合わせは、ＲＡの診断を改善した
[00191] この実施例は、抗ＰＡＤ１検出を１つ以上のさらなる抗ＰＡＤ自己抗体と組み合わせて、ＲＡの診断を改善することを示す。
[00192] ＲＡ患者を非ＲＡ患者から区別する際の抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４検出の性能は同様であり（図１～図２）、抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４間に強い相関が観察された（図４）。興味深いことに、抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４間の相関にもかかわらず、コホートＩＩ由来のサンプルの分析は、高いレベルでＰＡＤ１又はＰＡＤ４のいずれかと反応するサンプルが存在することを明らかにした（図５）。これは、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４に対する自己抗体間の交差反応性ではなく、抗体間で排他的エピトープが存在し得ること、並びに抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４の検出を組み合わせる新規な方法が性能を改善し得ることを示した。
[00193] コホートＩＩサンプルをＰＡＤ１及びＰＡＤ４を使用して試験した場合、ＰＡＤ１又はＰＡＤ４単独を超える改善された性能が観察された（図６）。具体的には、抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４の検出は０．７１８の曲線下面積（ＡＵＣ）を有し、一方抗ＰＡＤ１単独の検出は０．６８３のＡＵＣを有し、抗ＰＡＤ４単独の検出は０．６９６のＡＵＣを有した。したがって、それらの抗体として個々に有用であることに加えて、抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４の検出のためのＰＡＤ１及びＰＡＤ４の組み合わせは、各々、ＲＡ患者の診断を改善することができる。
[00194] 加えて、抗ＰＡＤ１抗体の検出は、抗ＰＡＤ２及び抗ＰＡＤ６と組み合わせてＲＡ及び非ＲＡ患者間を区別することができた。結果は、抗ＰＡＤ１、抗ＰＡＤ２及び抗ＰＡＤ６の検出が、単独又は組み合わせで、抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４と比較して、ＲＡの診断を改善することができることを示した（図６）。
[00195] まとめると、これらの実験は、抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４の検出の組み合わせが、いずれかの抗体単独と比較してＲＡの診断を改善することができることを明らかにした。加えて、これらの結果は、抗ＰＡＤ１の検出が他の抗ＰＡＤ自己抗体の検出と組み合わせられ、ＲＡ用途におけるその有用性について、抗ＰＡＤ４との組み合わせに限定されないことを示す。
実施例Ｖ
ＲＡ患者の血清中に同定された抗ＰＡＤ１のＩｇＡ及びＩｇＧアイソタイプ
[00196] この実施例は、ＩｇＧ及びＩｇＡアイソタイプを有する抗ＰＡＤ１がＲＡ患者において検出され得ること、及び抗ＰＡＤ１ ＩｇＡもＲＡを対照から区別できることを示す。
ＲＡ患者の血清中に同定された抗ＰＡＤ１のＩｇＡ及びＩｇＧアイソタイプ
[00196] この実施例は、ＩｇＧ及びＩｇＡアイソタイプを有する抗ＰＡＤ１がＲＡ患者において検出され得ること、及び抗ＰＡＤ１ ＩｇＡもＲＡを対照から区別できることを示す。
[00197] 上記に示すように、抗ＰＡＤ１ ＩｇＧは、ＲＡを非ＲＡ対照から区別する際の有用なバイオマーカーであり、抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４の組み合わせは診断を改善できることが見出された。抗ＰＡＤ１ ＩｇＡもＲＡを対照から区別できたか否かを決定するために、合計５１人のＲＡ患者及び１５人の対照を、ＰＡＤ１及びＰＡＤ４を抗原として使用して試験し、抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ及び抗ＰＡＤ４ ＩｇＡについてＲＡを対照から区別する能力を評価した。結果は、抗原としてのＰＡＤ１及びＰＡＤ４が、抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ及び抗ＰＡＤ４ ＩｇＡについて等しい又は優れた性能を示すことを明らかにした（図７Ａ）。
[00198] 加えて、抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ及び抗ＰＡＤ４ ＩｇＡの両方について尤度及びオッズ比（ＯＲ）を決定した。結果は、抗ＰＡＤ４ ＩｇＡに対する抗ＰＡＤ１ ＩｇＡの有意に高い区別を示す（図７Ｂ）。
[00199] 抗ＰＡＤ１ ＩｇＧ及び抗ＰＡＤ１ ＩｇＡのレベル間の比較も行った。結果は、有意な相関が観察されたが、個々の患者はＰＡＤ１に対する様々なレベルの抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ及び抗ＰＡＤ１ ＩｇＧを有することを示した（図８Ａ）。抗ＰＡＤ１ ＩｇＡ及び抗ＰＡＤ４ ＩｇＡ間の相間も行い、抗ＰＡＤ１及び抗ＰＡＤ４についての ＩｇＡアイソタイプ間の有意な相関が明らかとなった（図８Ｂ）。驚くべきことに、数人の患者は抗ＰＡＤ１ ＩｇＡについて高く陽性であったが、抗ＰＡＤ４ ＩｇＡについて陰性であり、これは抗ＰＡＤ１ ＩｇＡが、抗ＰＡＤ４で陰性であり得るＲＡを有する数人の患者を同定することができることを示した。
[00200] まとめると、これらの結果は、抗ＰＡＤ１ ＩｇＡがＲＡを対照から区別することができ、単独で又はＰＡＤ 自己抗原に対する他の自己抗体の検出と組み合わせて使用できることを示す。
実施例ＶＩ
ＲＡ患者の血清中で同定された抗ＰＡＤ４のＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭアイソタイプ
[00201] この実施例は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭアイソタイプを有する抗ＰＡＤ４ が、ＲＡ患者において検出され得ることを示す。
ＲＡ患者の血清中で同定された抗ＰＡＤ４のＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭアイソタイプ
[00201] この実施例は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭアイソタイプを有する抗ＰＡＤ４ が、ＲＡ患者において検出され得ることを示す。
[00202] ＲＡ患者においてどのアイソタイプの抗ＰＡＤ４が検出され得るかをさらに評価するために、ＰＡＤ４－連結ビーズを、ＲＡ患者の拡大コホート（ｎ＝６２）及びコホートＩからの同じ非ＲＡ対照（ｎ＝３６）に対して、抗ヒトＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＧコンジュゲートを用いて試験した。
[00203] ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＭを用いた抗ＰＡＤ４の拡大試験の結果は、３つのアイソタイプの全部がＲＡ患者の血清中で同定されることを明らかにした。より高いレベルの３つのアイソタイプが、びらんを有さない患者と比較した場合、びらん性疾患を有するＲＡ患者で観察されたが、この関連性は抗ＰＡＤ４ ＩｇＡのみで有意であった（ｐ＝０．００８６）。
実施例ＶＩＩ
抗ＰＡＤ１抗体は、抗シトルリン化タンパク質／ペプチド抗体とは異なるエピトープを認識した
[00204] この実施例は、ＲＡ患者において検出された抗ＰＡＤ１抗体が、抗シトルリン化タンパク質／ペプチド抗体（ＡＣＰＡ）により認識されるシトルリン化エピトープとは異なる、ＰＡＤ１酵素中の独特のエピトープを認識することを示す。
抗ＰＡＤ１抗体は、抗シトルリン化タンパク質／ペプチド抗体とは異なるエピトープを認識した
[00204] この実施例は、ＲＡ患者において検出された抗ＰＡＤ１抗体が、抗シトルリン化タンパク質／ペプチド抗体（ＡＣＰＡ）により認識されるシトルリン化エピトープとは異なる、ＰＡＤ１酵素中の独特のエピトープを認識することを示す。
目的
[00205] この研究の目的は、抗ＰＡＤ１抗体の標的としてアッセイで使用されるＰＡＤタンパク質を特徴付け、特に、それらの潜在的な自己シトルリン化及びシトルリン化状態を分析することであった。
[00205] この研究の目的は、抗ＰＡＤ１抗体の標的としてアッセイで使用されるＰＡＤタンパク質を特徴付け、特に、それらの潜在的な自己シトルリン化及びシトルリン化状態を分析することであった。
方法
天然及びシトルリン化ＰＡＤ抗原の生成
[00206] 天然及びシトルリン化ＰＡＤ１抗原を生成するために、全長ＰＡＤ１タンパク質を細菌細胞中で組換え発現させ、カルシウム（酵素の補因子）の非存在下で、又は抽出及び精製緩衝液中に存在する５～１０ｍＭ ＣａＣｌ２を用いて、専売クロマトグラフィー技術により精製した。
天然及びシトルリン化ＰＡＤ抗原の生成
[00206] 天然及びシトルリン化ＰＡＤ１抗原を生成するために、全長ＰＡＤ１タンパク質を細菌細胞中で組換え発現させ、カルシウム（酵素の補因子）の非存在下で、又は抽出及び精製緩衝液中に存在する５～１０ｍＭ ＣａＣｌ２を用いて、専売クロマトグラフィー技術により精製した。
シトルリン化状態の分析
[00207] 異なるＰＡＤ抗原のシトルリン化状態を、抗シトルリン（修飾）検出キット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．＃１７－３４７Ｂ）を用いた免疫ブロッティングにより確認した。
[00207] 異なるＰＡＤ抗原のシトルリン化状態を、抗シトルリン（修飾）検出キット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ．＃１７－３４７Ｂ）を用いた免疫ブロッティングにより確認した。
陽性対照（インビトロシトルリン化ヒストン）の調製
[00208] Ｈ３．１ヒト組換えヒストン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．Ｐ／Ｎ：Ｍ２５０３Ｓ）を８．５７１Ｕ／ｍｇの市販のヒト組換えＰＡＤ４と共に、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴを含む緩衝液中、３７℃で２．５時間インキュベートした。
[00208] Ｈ３．１ヒト組換えヒストン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ．Ｐ／Ｎ：Ｍ２５０３Ｓ）を８．５７１Ｕ／ｍｇの市販のヒト組換えＰＡＤ４と共に、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴを含む緩衝液中、３７℃で２．５時間インキュベートした。
抗修飾シトルリン（ＡＭＣ）免疫ブロッティング
[00209] 以下の抗原をＡＭＣアッセイにより試験した：
[00209] 以下の抗原をＡＭＣアッセイにより試験した：
[00210] 製造業者の手順に従ってアッセイを行った。手短には、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を２μｇ／ウェルの異なるタンパク質（シトルリン化ヒストン陽性対照を２及び４μｇ／ウェルで行った）サンプルを用いて行い、ゲルの１つからのタンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。製造業者の説明書に従って修飾緩衝液を調製し、これをブロットに加えた。ブロー（blow）を遮光容器に入れ、撹拌せずに３７℃で一晩インキュベートした。次いで、ブロットを水で濯ぎ、TBS-Tween中の５％無脂肪乾燥乳でブロットを１時間ブロックした。その後、ブロットを、新たに調製したＴＢＳＴ－ＭＩＬＫで希釈した１０ｍＬの１：１０００希釈の抗修飾シトルリン抗体と共に、一定に撹拌しながら室温で２時間インキュベートした。洗浄後、ブロットを、TBS-Tween中の１％乳中の１０ｍＬの１：２０００希釈のヤギａ－ヒトＨＲＰコンジュゲートと共に、一定に撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。膜を再び洗浄し、SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrateで展開し、iBright FL1000 Imaging Systemで読み取った。
Aptivaアッセイ及びＲＡ血清試験
[00211] 市販のＰＡＤ１、Ｃａ２＋なしで生成した３つの社内ＰＡＤ１抗原（Ｌｏｔ ＃２、Ｌｏｔ ＃４、及びＬｏｔ ＃５）、及びＣａ２＋を用いて生成した２つの社内ＰＡＤ１抗原（Ｌｏｔ ＃１、及びＬｏｔ ＃３）を含む異なるＰＡＤ１抗原バージョンを用いて、粒子－ベースの多分析物技術［ＰＭＡＴ、研究使用のみ（ＲＵＯ）、Inova Diagnostics、San Diego、US］に基づく抗ＰＡＤ１ ＩｇＧの検出用のパネルを以前記載されたように作製した。試験反応は、Aptiva（登録商標）技術（Inova Diagnostics、San Diego、US、ＲＵＯ）に基づく研究機器で行った。抗ＰＡＤ１ ＩｇＧパネルを使用して、市販のＰＡＤ１抗原に基づいて予想される異なる抗ＰＡＤ１状態のＲＡ患者（ｎ＝２２）由来の血清を試験した。
[00211] 市販のＰＡＤ１、Ｃａ２＋なしで生成した３つの社内ＰＡＤ１抗原（Ｌｏｔ ＃２、Ｌｏｔ ＃４、及びＬｏｔ ＃５）、及びＣａ２＋を用いて生成した２つの社内ＰＡＤ１抗原（Ｌｏｔ ＃１、及びＬｏｔ ＃３）を含む異なるＰＡＤ１抗原バージョンを用いて、粒子－ベースの多分析物技術［ＰＭＡＴ、研究使用のみ（ＲＵＯ）、Inova Diagnostics、San Diego、US］に基づく抗ＰＡＤ１ ＩｇＧの検出用のパネルを以前記載されたように作製した。試験反応は、Aptiva（登録商標）技術（Inova Diagnostics、San Diego、US、ＲＵＯ）に基づく研究機器で行った。抗ＰＡＤ１ ＩｇＧパネルを使用して、市販のＰＡＤ１抗原に基づいて予想される異なる抗ＰＡＤ１状態のＲＡ患者（ｎ＝２２）由来の血清を試験した。
結果
[00212] 強い明白なバンドが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル中で、各タンパク質に予想される分子量で全てのレーンで観察された（図９Ａ）。
[00212] 強い明白なバンドが、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル中で、各タンパク質に予想される分子量で全てのレーンで観察された（図９Ａ）。
[00213] 抗修飾シトルリン（ＡＭＣ）ブロット（図９Ｂ）では、陰性対照（レーン１１及び１２）のいずれについてもバンドは観察されなかった。強い比例バンドが、試験した２つの濃度で陽性対照について観察された（レーン１３及び１４）。予想通り、カルシウムの存在下で生成されたＰＡＤ１抗原（レーン２及び４）のみが、ブロットにおいてバンドを示し、これらのタンパク質がシトルリン化されており、したがって、それらはその生成中に自己シトルリン化を受けていたことを示した。カルシウムの非存在下で生成されたＰＡＤ１抗原について、又は、含まれるＰＡＤ４若しくはＰＡＤ６抗原について、ブロットにおいてバンドが観察できず、これらのタンパク質はシトルリン化されていないことを示した。興味深いことに、市販のＰＡＤ１タンパク質について弱いバンドが観察でき、これは部分的なシトルリン化を示した。
結論
[00214] まとめると、結果は、抗ＰＡＤ１抗体が非シトルリン化ＰＡＤ１を認識し、ＡＣＰＡとは異なることを示した。
[00214] まとめると、結果は、抗ＰＡＤ１抗体が非シトルリン化ＰＡＤ１を認識し、ＡＣＰＡとは異なることを示した。
７．実施形態
[00215] １．関節リウマチ（ＲＡ）の診断方法であって：
（ａ） ＲＡを有することが疑われる対象由来の生物学的サンプルを、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質又はその抗原断片と接触させることと、
（ｂ） 少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片と反応性の自己抗体の存在を検出することであって、前記自己抗体の存在はＲＡを示す、検出することと、を含み、
少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む、方法。
[00215] １．関節リウマチ（ＲＡ）の診断方法であって：
（ａ） ＲＡを有することが疑われる対象由来の生物学的サンプルを、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質又はその抗原断片と接触させることと、
（ｂ） 少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片と反応性の自己抗体の存在を検出することであって、前記自己抗体の存在はＲＡを示す、検出することと、を含み、
少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む、方法。
[00216] ２．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質がＰＡＤ１又はその抗原断片である、実施形態１の方法。
[00217] ３．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質がＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片である、実施形態１の方法。
[00218] ４．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質がさらに、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６又はその抗原断片からなる群から選択される１つ以上のＰＡＤタンパク質を含む。実施形態１～３のいずれか１つの方法。
[00219] ５．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質がＰＡＤ１、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ２又はその抗原断片である、実施形態４の方法。
[00220] ６．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質が ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ３又はその抗原断片である、実施形態４の方法。
[00221] ７．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質がＰＡＤ１、ＰＡＤ４、ＰＡＤ２、及びＰＡＤ３又はその抗原断片である、実施形態４の方法。
[00222] ８．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質がＰＡＤ１、ＰＡＤ４、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６又はその抗原断片である、実施形態４の方法。
[00223] ９．関節リウマチ（ＲＡ）の進行を監視する方法であって：
（ａ） ＲＡを有するか又は有することが疑われる対象由来の生物学的サンプルを、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質又はその抗原断片と接触させることと、
（ｂ） 少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片と反応性の自己抗体の存在を検出することであって、前記自己抗体の存在は疾患進行を示す、検出することと、を含み、
少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む、方法。
（ａ） ＲＡを有するか又は有することが疑われる対象由来の生物学的サンプルを、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質又はその抗原断片と接触させることと、
（ｂ） 少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片と反応性の自己抗体の存在を検出することであって、前記自己抗体の存在は疾患進行を示す、検出することと、を含み、
少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む、方法。
[00224] １０．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質がＰＡＤ１又はその抗原断片である、実施形態９の方法。
[00225] １１．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質がＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片である、実施形態９の方法。
[00226] １２．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質がさらに、ＰＡＤ３又はその抗原断片を含む、実施形態９～１１のいずれか１つの方法。
[00227] １３．前記自己抗体の存在がＲＡステージを示す、実施形態９～１２のいずれか１つの方法。
[00228] １４．関節リウマチ（ＲＡ）の進行を監視する方法であって：
（ａ） ＲＡを有する対象由来の生物学的サンプルを、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質又はその抗原断片と接触させることと、
（ｂ） 少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片に結合した自己抗体の非存在を検出することであって、前記自己抗体の非存在は疾患進行を示す、検出することと、を含み、
少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む、方法。
（ａ） ＲＡを有する対象由来の生物学的サンプルを、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質又はその抗原断片と接触させることと、
（ｂ） 少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片に結合した自己抗体の非存在を検出することであって、前記自己抗体の非存在は疾患進行を示す、検出することと、を含み、
少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む、方法。
[00229] １５．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質がＰＡＤ１又はその抗原断片である、実施形態１４の方法。
[00230] １６．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質がＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片である、実施形態１４の方法。
[00231] １７．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質がさらに、ＰＡＤ３又はその抗原断片を含む、実施形態１４～１６のいずれか１つの方法。
[00232] １８．前記自己抗体の非存在が、ＲＡステージを示す、実施形態１４～１７のいずれか１つの方法。
[00233] １９．前記生物学的サンプルが、全血、血清、血漿 滑液又は痰を含む、実施形態１～１８のいずれか１つの方法。
[00234] ２０．前記生物学的サンプルが、血清又は血漿を含む、実施形態１～１９のいずれか１つの方法。
[00235] ２１．前記抗原断片が、６～１２０、１２～１００、１８～８０、２４～６０、３０～５０又は３５～４５アミノ酸残基を含む、実施形態１～２０のいずれか１つの方法。
[00236] ２２．前記ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片が、天然源からの単離、化学合成又は組換え発現を含む方法によって得られる、実施形態１～２１のいずれか１つの方法。
[00237] ２３．前記ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片が化学合成によって得られる、実施形態１～２２のいずれか１つの方法。
[00238] ２４．前記検出がイムノアッセイを含む、実施形態１～２３のいずれか１つの方法。
[00239] ２５．前記イムノアッセイが、蛍光免疫吸着剤アッセイ（ＦＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、多重イムノアッセイ、タンパク質／ペプチドアレイイムノアッセイ、固相ラジオイムノアッセイ（ＳＰＲＩＡ）、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＩＦ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、粒子ベースの多分析物試験（ＰＭＡＴ）、及びドットブロットアッセイからなる群から選択される、実施形態２４の方法。
[00240] ２６．前記検出が、ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片に結合した前記自己抗体を検出プローブと接触させることを含む、実施形態１～２５のいずれか１つの方法。
[00241] ２７．前記検出プローブが前記自己抗体に結合する、実施形態２６の方法。
[00242] ２８．前記検出プローブが抗体又はその機能性断片を含む、実施形態２６又は２７の方法。
[00243] ２９．前記検出プローブがレポータータグを含む、実施形態２６又は２７の方法。
[00244] ３０．前記レポータータグが標識である、実施形態２９の方法。
[00245] ３１．前記標識が、フルオロフォア、酵素、化学発光部分、放射性部分、有機色素及び小分子からなる群から選択される、実施形態３０の方法。
[00246] ３２．前記標識が蛍光標識である、実施形態３０又は３１の方法。
[00247] ３３．前記蛍光標識がフィコエリトリン（ＰＥ）である、実施形態３２の方法。
[00248] ３４．前記レポータータグが、リガンド又は粒子を含む、実施形態２９の方法。
[00249] ３５．前記リガンドがビオチンである、実施形態３４の方法。
[00250] ３６．前記粒子がナノ粒子を含む、実施形態３４の方法。
[00251] ３７．検出キットであって：
ＰＡＤタンパク質に特異的な自己抗体を補足することができる、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質、又はその抗原断片；
前記自己抗体を認識する検出プローブ、及び
固体支持体、を含み、
少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む、検出キット。
ＰＡＤタンパク質に特異的な自己抗体を補足することができる、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質、又はその抗原断片；
前記自己抗体を認識する検出プローブ、及び
固体支持体、を含み、
少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含む、検出キット。
[00252] ３８．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質がＰＡＤ１又はその抗原断片である、実施形態３７のキット。
[00253] ３９．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質がＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片である、実施形態３７のキット。
[00254] ４０．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質がさらに、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６又はその抗原断片からなる群から選択される１つ以上のＰＡＤタンパク質を含む、実施形態窶３７～３９のいずれか１つのキット。
[00255] ４１．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質が、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ２又はその抗原断片である、実施形態４０のキット。
[00256] ４２．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質が、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ３又はその抗原断片である、実施形態４０のキット。
[00257] ４３．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質が、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、ＰＡＤ２、及びＰＡＤ３又はその抗原断片である、実施形態４０のキット。
[00258] ４４．少なくとも１つのＰＡＤタンパク質が、ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３及びＰＡＤ６又はその抗原断片である、実施形態４０のキット。
[00259] ４５．さらに標識を含む、実施形態３７～４４のいずれか１つのキット。
[00260] ４６．前記標識が、フルオロフォア、酵素、化学発光部分、放射性部分、有機色素及び小分子からなる群から選択される、実施形態４５のキット。
[00261] ４７．さらに陽性対照を含む、実施形態３７～４６のいずれか１つのキット。
[00262] ４８．さらに１つ以上の補助試薬を含む、実施形態３７～４７のいずれか１つのキット。
[00263] ４９．前記１つ以上の補助試薬が、インキュベーション緩衝液、洗浄緩衝液、検出緩衝液及び検出器具からなる群から選択される、実施形態４８のキット。
[00264] ５０．前記抗原断片が、６～１２０、１２～１００、１８～８０、２４～６０、３０～５０又は３５～４５アミノ酸残基を含む、実施形態３７～４９のいずれか１つのキット。
[00265] ５１．前記検出プローブが、抗体又はその機能性断片を含む、実施形態３７～５０のいずれか１つのキット。
[00266] ５２．前記検出プローブがレポータータグを含む、実施形態３７～５０のいずれか１つのキット。
[00267] ５３．前記レポータータグが標識である、実施形態５２のキット。
[00268] ５４．前記標識が、フルオロフォア、酵素、化学発光部分、放射性部分、有機色素及び小分子からなる群から選択される、実施形態４５又は５３のキット。
[00269] ５５．前記標識が蛍光標識である、実施形態４５、５３又は５４のキット。
[00270] ５６．前記蛍光標識がフィコエリトリン（ＰＥ）である、実施形態５５のキット。
[00271] ５７．前記レポータータグがリガンド又は粒子を含む、実施形態５３のキット。
[00272] ５８．前記リガンドがビオチンである、実施形態５７のキット。
[00273] ５９．前記粒子がナノ粒子を含む、実施形態５７のキット。
[00274] ６０．前記固体支持体が、ビーズ、球体、粒子、膜、チップ、スライド、プレート、ウェル及び試験管からなる群から選択される、実施形態３７～５９のいずれか１つのキット。
[00275] ６１．前記ビーズ、球体又は粒子が約０．１～約１００マイクロメートルの直径を有する、実施形態６０のキット。
[00276] ６２．前記膜がニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）及びポリ二フッ化ビニリデンからなる群から選択される、実施形態６０のキット。
[00277] ６３．前記ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片が前記固体支持体にコンジュゲートされる、実施形態３７～６２のいずれか１つのキット。
[00278] 上述した実施形態は、単なる例示であることが意図され、当業者は日常的な実験、特定の化合物、材料及び手順の多数の等価物のみを使用して認識し又は確認することができるであろう。そのような等価物の全ては、本発明の範囲内であるとみなされ、添付の特許請求の範囲により包含される。
Claims (20)
- 関節リウマチ（ＲＡ）の診断方法であって：
（ａ）ＲＡを有することが疑われる対象由来の生物学的サンプルを、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質又はその抗原断片と接触させることと、
（ｂ） 前記少なくとも１つのＰＡＤタンパク質又はその抗原断片と反応性の自己抗体の存在を検出することを含み、ここで、前記自己抗体の存在はＲＡを示し、
前記少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含み、場合によりさらに、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６又はその抗原断片からなる群から選択される１つ以上のＰＡＤタンパク質を含む、方法。 - 前記少なくとも１つのＰＡＤタンパク質が
（ａ） ＰＡＤ１若しくはその抗原断片；
（ｂ） ＰＡＤ１及びＰＡＤ４若しくはその抗原断片；
（ｃ） ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ２又若しくはその抗原断片；
（ｄ） ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ３若しくはその抗原断片；
（ｅ） ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、ＰＡＤ２、及びＰＡＤ３若しくはその抗原断片；又は
（ｆ） ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６若しくはその抗原断片
を含む、請求項１に記載の方法。 - 前記生物学的サンプルが
（ａ） 全血、血清、血漿滑液若しくは痰；又は
（ｂ） 血清若しくは血漿
を含む、請求項１又は２に記載の方法。 - 前記抗原断片が、６～１２０、１２～１００、１８～８０、２４～６０、３０～５０又は３５～４５アミノ酸残基を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片が
（ａ） 天然源からの単離、化学合成若しくは組換え発現を含む方法；又は
（ｂ） 化学合成を含む方法
によって得られる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。 - 前記検出が：
（ａ） イムノアッセイであって、
前記イムノアッセイは、場合により蛍光免疫吸着剤アッセイ（ＦＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、多重イムノアッセイ、タンパク質／ペプチドアレイイムノアッセイ、固相ラジオイムノアッセイ（ＳＰＲＩＡ）、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＩＦ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、粒子ベースの多分析物試験（ＰＭＡＴ）、及びドットブロットアッセイからなる群から選択される、イムノアッセイ；及び／又は
（ｂ） 前記ＰＡＤタンパク質若しくはその抗原断片に結合した前記自己抗体を検出プローブと接触させること、を含み、
前記検出プローブが、場合により：
（ｉ） 前記自己抗体に結合し；
（ｉｉ） 抗体若しくはその機能性断片を含み；及び／又は
（ｉｉｉ） レポータータグを含み、
前記レポータータグは、場合により標識を含み、前記標識は、場合によりフルオロフォア、酵素、化学発光部分、放射性部分、有機色素及び小分子からなる群から選択され、及び／又は場合により蛍光標識であり、
前記蛍光標識は、場合によりフィコエリトリン（ＰＥ）であり；又は
（ｉｖ） リガンド若しくは粒子、前記リガンドは、場合によりビオチン若しくはナノ粒子を含む、
請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。 - 関節リウマチ（ＲＡ）の進行を監視する方法であって：
（ａ） ＲＡを有するか又は有することが疑われる対象由来の生物学的サンプルを、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質又はその抗原断片と接触させることと、
（ｂ）
（ｉ） 前記少なくとも１つのＰＡＤタンパク質若しくはその抗原断片と反応性の自己抗体の存在であって、前記自己抗体の存在は疾患進行を示す、自己抗体の存在、及び／又は
（ｉｉ） 前記少なくとも１つのＰＡＤタンパク質若しくはその抗原断片に結合した自己抗体の非存在であって、前記自己抗体の非存在は疾患進行を示す、自己抗体の非存在、を検出することと、を含み、
前記少なくとも１つのＰＡＤタンパク質は、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含み、場合によりさらに、ＰＡＤ３又はその抗原断片を含む、方法。 - 前記少なくとも１つのＰＡＤタンパク質が：
（ａ） ＰＡＤ１又はその抗原断片；
（ｂ） ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片
を含む、請求項７に記載の方法。 - 前記自己抗体の存在が、ＲＡステージを示す、請求項７又は請求項８に記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが
（ａ） 全血、血清、血漿滑液若しくは痰；又は
（ｂ） 血清若しくは血漿
を含む、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。 - 前記抗原断片が、６～１２０、１２～１００、１８～８０、２４～６０、３０～５０又は３５～４５アミノ酸残基を含む、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片が：
（ａ） 天然源からの単離、化学合成若しくは組換え発現を含む方法；又は
（ｂ） 化学合成を含む方法
によって得られる、請求項７～１１のいずれか１項に記載の方法。 - 前記検出が：
（ａ） イムノアッセイであって、
前記イムノアッセイは、場合により蛍光免疫吸着剤アッセイ（ＦＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、多重イムノアッセイ、タンパク質／ペプチドアレイイムノアッセイ、固相ラジオイムノアッセイ（ＳＰＲＩＡ）、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＩＦ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、粒子ベースの多分析物試験（ＰＭＡＴ）、及びドットブロットアッセイからなる群から選択される、イムノアッセイ；及び／又は
（ｂ） 前記ＰＡＤタンパク質若しくはその抗原断片に結合した前記自己抗体を、検出プローブと接触させること、
を含み、
前記検出プローブは、場合により：
（ｉ） 前記自己抗体に結合し；
（ｉｉ） 抗体若しくはその機能性断片を含み；及び／又は
（ｉｉｉ） レポータータグを含み、
前記レポータータグは、場合により標識を含み、前記標識は、場合によりフルオロフォア、酵素、化学発光部分、放射性部分、有機色素及び小分子からなる群から選択され、及び／又は場合により蛍光標識であり、
前記蛍光標識は、場合によりフィコエリトリン（ＰＥ）であり；又は
（ｉｖ） リガンド若しくは粒子、前記リガンドは、場合によりビオチン若しくはナノ粒子を含む、
請求項７～１２のいずれか１項に記載の方法。 - 検出キットであって：
（ａ） ＰＡＤタンパク質に特異的な自己抗体を補足することができる、少なくとも１つのペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）タンパク質、又はその抗原断片；
（ｂ） 前記自己抗体を認識する検出プローブ、及び
（ｃ） 固体支持体、
を含み、
前記少なくとも１つのＰＡＤタンパク質が、ＰＡＤ１、又はＰＡＤ１及びＰＡＤ４を含み、場合によりさらに、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６又はその抗原断片からなる群から選択される１つ以上のＰＡＤタンパク質を含む、キット。 - 前記少なくとも１つのＰＡＤタンパク質が：
（ａ） ＰＡＤ１又はその抗原断片’
（ｂ） ＰＡＤ１及びＰＡＤ４又はその抗原断片；
（ｃ） ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、及びＰＡＤ２又はその抗原断片；
（ｄ） ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、ＰＡＤ２、及びＰＡＤ３又はその抗原断片；
（ｅ） ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、ＰＡＤ２、及びＰＡＤ３又はその抗原断片；
（ｆ） ＰＡＤ１、ＰＡＤ４、ＰＡＤ２、ＰＡＤ３、及びＰＡＤ６又はその抗原断片
である、請求項１４に記載のキット。 - さらに：
（ａ） 標識であって、前記標識は、場合によりフルオロフォア、酵素、化学発光部分、放射性部分、有機色素及び小分子からなる群から選択される、標識；
（ｂ） 陽性対照；
（ｃ） １つ以上の補助試薬であって、前記１つ以上の補助試薬は、場合によりインキュベーション緩衝液、洗浄緩衝液、検出緩衝液及び検出器具からなる群から選択される、補助試薬
を含む、請求項１４又は請求項１５に記載のキット。 - 前記抗原断片が、６～１２０、１２～１００、１８～８０、２４～６０、３０～５０又は３５～４５アミノ酸残基を含む、請求項１４～１６のいずれか１項に記載のキット。
- 前記検出プローブが：
（ａ） 前記自己抗体に結合し；
（ｂ） 抗体若しくはその機能性断片を含み；及び／又は
（ｃ） レポータータグを含み、前記レポータータグは、場合により：
（ｉ） 標識であって、前記標識は、場合によりフルオロフォア、酵素、化学発光部分、放射性部分、有機色素及び小分子からなる群から選択され、及び／又は場合により蛍光標識である、標識、
ここで前記蛍光標識は、場合によりフィコエリトリン（ＰＥ）であり；又は
（ｉｉ） リガンド若しくは粒子であって、前記リガンドは、場合によりビオチン若しくはナノ粒子を含む、リガンド若しくは粒子
を含む、請求項１４～１７のいずれか１項に記載のキット。 - 前記固体支持体が、ビーズ、球体、粒子、膜、チップ、スライド、プレート、ウェル及び試験管からなる群から選択され、
前記ビーズ、球体又は粒子が、場合により約０．１～約１００マイクロメートルの直径を有し；
前記膜が、場合によりニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）及びポリ二フッ化ビニリデンからなる群から選択される、請求項１４～１８のいずれか１項に記載のキット。 - 前記ＰＡＤタンパク質又はその抗原断片が前記固体支持体にコンジュゲートされる、請求項１４～１９のいずれか１項に記載のキット。
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