CN117169205B - 基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测方法，属于分析检测领域。包括以下步骤：(1)取待测溶液样品，加入黄嘌呤氧化酶，在37℃条件下共孵育15分钟，得初步孵育液；(2)将初步孵育液、TMB溶液、乙酸溶液和NiPt NPs溶液混合，在37℃条件下共孵育30分钟，得孵育液；(3)利用比色法测定孵育液在652nm处的最大吸收值；(4)代入次黄嘌呤的紫外吸收标准曲线，计算得到待测溶液样品中次黄嘌呤的浓度。本发明的基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测方法，能够简单快速地测定出次黄嘌呤含量，准确性高，具有良好的经济价值，对水产品新鲜度监测具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测方法，属于分析检测领域。
背景技术
水产品在死亡和暴露于温度变化、氧气不足等环境条件下，会发生代谢酶的活性变化，进而导致次黄嘌呤的积累。次黄嘌呤一般通过以下途径积累：三磷酸腺苷(ATP)→二磷酸腺苷(ADP)→单磷酸腺苷(AMP)→肌苷酸(IMP)→次黄嘌呤核苷(HxR)→次黄嘌呤(Hx)→尿酸(UA)。
次黄嘌呤的产生与水产品早期的新鲜度和变质程度密切相关。不同的水产品，积累途径会有所差别。次黄嘌呤在一些情况下可能会对人体健康产生负面影响。在某些水产品中，如鱼类和贝类，次黄嘌呤的含量可能会受到一些细菌的污染和生长而导致增加。因此，研究次黄嘌呤在水产品中的含量和来源，以及与食品安全相关的因素，有助于制定相应的质量控制和监测策略。
现有技术中，次黄嘌呤的检测方法主要有毛细管电泳、高效液相色谱和电化学方法。这些方法有许多局限性，如需要大型仪器，需要熟练的技术人员进行实验，成本较高，很少用于现场分析。因此，迫切希望开发一种简单、快速、低成本的次黄嘌呤检测方法。
比色法(colorimetry)是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。比色法可以通过肉眼可见的颜色变化(定性分析)和测量紫外吸收值(定量分析)，从而实现靶标检测。比色法一般需要探针识别和信号转导。近年来，在信号转导方面出现了一种新材料——纳米酶。自2007年四氧化三铁的类酶效应被报道以来，纳米酶引起了全世界的关注。作为新兴的转导介质，纳米酶不仅具有纳米材料的物理和化学特性，而且具有类似于天然酶的催化功能。此外，催化活性可以通过修饰形貌和尺寸来调节，产生具有多种酶活性的催化剂，成为跨越材料科学、生物传感、生物化学和医学诊断领域的重要桥梁。
中国发明专利申请CN 109856102 A公开了一种检测水产品次黄嘌呤的生物传感器，基于铂纳米(Pt NPs)的催化活性，构建了一种荧光生物传感器，用于检测水产品中次黄嘌呤Hx的含量。但是其成本较高，纳米材料的用量较大，所需时间较长，操作更为复杂，并且未进行关于纳米材料的相关动力学参数的研究。更为关键的是，本发明是基于肉眼可见的颜色变化，因其不需要昂贵的荧光标记物或激发光源从而使得制备成本远低于荧光生物传感器，并且比色变化对环境因素的敏感度一般较低，因此比色生物传感器在一些复杂的实际样品中更稳定可靠。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测方法，属于分析检测领域。本发明的方法，通过简单的溶剂混合法获得具有高催化效率的纳米材料NiPt NPs，然后利用纳米材料NiPt NPs与黄嘌呤氧化酶(XOD)构成的生物传感器检测次黄嘌呤，能够简单快速地测定出次黄嘌呤含量，具有良好的经济价值。本发明还对纳米材料的动力学参数进行了测定，这为纳米材料在其他领域的应用提供了参考。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测方法，包括以下步骤：
(1)取待测溶液样品，加入黄嘌呤氧化酶，在37℃条件下共孵育15分钟，得初步孵育液；
(2)将初步孵育液、TMB(四甲基联苯胺)溶液、乙酸溶液和NiPt NPs溶液混合，在37℃条件下共孵育30分钟，得孵育液；
(3)利用比色法测定孵育液在652nm处的最大吸收值；
(4)代入次黄嘌呤的紫外吸收标准曲线，计算得到待测溶液样品中次黄嘌呤的浓度。
进一步地，所述待测溶液样品是水产品经预处理得到的，所述水产品选自鱼、虾、蟹、贝等鲜活品，具体可选自皮皮虾、基围虾、三疣梭子蟹、蛤蜊、鲍鱼。所述预处理的方法为：利用TCA(三氯乙酸)法(该方法为现有技术中的常规方法)提取水产品中的次黄嘌呤，得待测溶液样品。
进一步地，所述步骤(1)中，所述黄嘌呤氧化酶的浓度为0.2U/mL。
进一步地，所述步骤(2)的具体操作为：将20μL的初步孵育液、27μL的TMB溶液、93μL的乙酸溶液和1μL的NiPt NPs溶液混合，在37℃条件下共孵育30分钟，得孵育液，其中，TMB溶液的浓度为8mM；乙酸溶液的浓度为1M，pH值为5.0；NiPt NPs溶液的粒子浓度为6.8×10-11M。
进一步地，所述步骤(2)中，NiPt NPs溶液是通过以下方法制备得到的：将10mg氯铂酸、7mg氯化镍、80mg聚乙烯吡咯烷酮和10mL四甘醇加入到90mL超纯水中，150℃加热30分钟；然后加入1mL的乙醛-四甘醇混合溶液，继续保持150℃加热30分钟；冷却至室温，即得NiPt NPs溶液，粒子浓度为1.4×10-9M，4℃避光保存；所述乙醛-四甘醇混合溶液中二者的体积比为1:1。
进一步地，所述步骤(4)中，次黄嘌呤的紫外吸收标准曲线是通过以下方法建立的：配制次黄嘌呤的梯度系列浓度样品，加入黄嘌呤氧化酶，在37℃条件下共孵育15分钟，得初步孵育液；将初步孵育液、TMB溶液、乙酸溶液和NiPt NPs溶液混合，在37℃条件下共孵育30分钟，得孵育液；利用比色法测定孵育液在652nm处的最大吸收值；建立次黄嘌呤浓度与吸收值的标准曲线。
更进一步地，配制次黄嘌呤的梯度系列浓度样品的具体方法为：称量0.0065g的次黄嘌呤，加入到1mL的1M的NaOH溶液中，再加入1mL的1M的盐酸，用超纯水定容至5mL，得次黄嘌呤母液；将次黄嘌呤母液用超纯水稀释成浓度范围在0～0.6mM的梯度系列浓度样品。
更进一步地，所述黄嘌呤氧化酶的浓度为0.2U/mL。
更进一步地，孵育液中，初步孵育液的用量为20μL；TMB溶液的浓度为8mM，用量为27μL；乙酸溶液的浓度为1M，pH值为5.0，用量为93μL；NiPt NPs溶液的粒子浓度为6.8×10-11M，用量为1μL。
本发明的基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测方法，检测原理为：XOD与Hx孵育后产生H2O2，在具有高催化效率的纳米材料NiPt NPs和乙酸环境下产生羟基自由基(·OH)，可以使得无色的TMB氧化为蓝色的oxTMB，检测紫外吸收值，即可实现Hx的定量检测。其中，纳米材料NiPt NPs具有高催化效率和优异的稳定性，与XOD联用，构成比色生物传感器。
与CN 109856102 A相比，本发明的纳米材料为NiPt NPs，用量极少，仅需1μL，远远少于CN 109856102 A中Pt NPs的用量(50μL)，所用时间短，仅需45分钟，远远少于CN109856102A中所用的时间(90分钟)。此外，本发明还对纳米材料的动力学参数进行了测定，这为纳米酶在其他领域的应用提供了参考。更为关键的是，本发明是基于肉眼可见的颜色变化，因其不需要昂贵的荧光标记物或激发光源从而使得制备成本远低于荧光生物传感器，并且比色变化对环境因素的敏感度一般较低，因此比色生物传感器在一些复杂的实际样品中更稳定可靠。
本发明的基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测方法，能够简单快速地测定出次黄嘌呤含量，准确性高，具有良好的经济价值，对水产品新鲜度监测具有重要意义。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
图1：标准曲线示意图。
图2：不同pH体系下的吸收值示意图。
图3：不同浓度的TMB体系下的吸收值示意图。
图4：比色生物传感器对次黄嘌呤及15种干扰物质的吸收值比较示意图。
图5：纳米材料NiPt NPs的TEM扫描图和粒径分布示意图。
图6：纳米材料NiPt NPs的EDS线扫中元素含量分布示意图。
图7：不同储存时间的纳米材料NiPt NPs的催化活性比较图。
图8：纳米材料NiPt NPs对TMB的米氏曲线示意图。
图9：纳米材料NiPt NPs对TMB的双倒数曲线示意图。
图10：纳米材料NiPt NPs对H2O2的米氏曲线示意图。
图11：纳米材料NiPt NPs对H2O2的双倒数曲线示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。
实施例1次黄嘌呤的紫外吸收标准曲线的建立
步骤如下：
①称量0.0065g的次黄嘌呤，加入到1mL的1M的NaOH溶液中，再加入1mL的1M的盐酸，用超纯水定容至5mL，得次黄嘌呤母液；
②将次黄嘌呤母液用超纯水稀释成浓度范围在0～0.6mM的梯度系列浓度样品，取50μL，加入50μL的0.4U/mL的黄嘌呤氧化酶溶液，在37℃条件下共孵育15分钟，得初步孵育液；所述黄嘌呤氧化酶溶液的溶剂为pH 7.4、0.01M的PB溶液(磷酸缓冲溶液)；
③将20μL的初步孵育液、27μL的TMB溶液、93μL的乙酸溶液和1μL的NiPt NPs溶液混合，在37℃条件下共孵育30分钟，得孵育液，其中，TMB溶液的浓度为8mM；乙酸溶液的浓度为1M，pH值为5.0；NiPt NPs溶液的粒子浓度为6.8×10-11M；
④利用比色法测定孵育液在652nm处的最大吸收值，建立次黄嘌呤浓度与吸收值的标准曲线，如图1所示。本方法对次黄嘌呤的线性回归方程为y＝0.5409x+0.0584(x为次黄嘌呤浓度，y为652nm处的吸收值)，相关系数(R2)为0.9932。线性范围为19～300μM，检测限(LOD)为8.5μM。
所述NiPt NPs溶液是通过以下方法制备得到的：将10mg氯铂酸、7mg氯化镍、80mg聚乙烯吡咯烷酮和10mL四甘醇加入到90mL超纯水中，置于三颈烧瓶中，150℃加热30分钟；然后加入1mL的乙醛-四甘醇混合溶液，继续保持150℃加热30分钟；冷却至室温，即得NiPtNPs溶液，粒子浓度为1.4×10-9M，4℃避光保存；所述乙醛-四甘醇混合溶液中二者的体积比为1:1。使用时，用超纯水稀释至粒子浓度为6.8×10-11M。
实施例2参数条件优化
考察不同pH体系和TMB终浓度分别对NiPt NPs、TMB、乙酸构成的显色体系的影响。
考察不同pH体系对NiPt NPs、TMB、乙酸构成的显色体系的影响：分别配制pH分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0的乙酸缓冲液，按照实施例1进行操作。检测H2O2(浓度为1mM)在652nm处的吸收值，结果如图2所示，当pH＝5.0时，显色体系效果最佳。
考察不同TMB终浓度对NiPt NPs、TMB、乙酸构成的显色体系的影响：按照实施例1进行操作，调节TMB终浓度分别为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0mM，检测H2O2(浓度为1mM)在652nm处的吸收值，结果如图3所示，当TMB终浓度为1.5mM时，显色体系效果最佳。
实施例3特异性实验
参照实施例1，研究了本发明的比色生物传感器对常见的15种干扰物质如尿素、Vc、Na+、K+、Zn2+、Mg2+、酪氨酸(Tyr)、谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、蔗糖、柠檬酸钠、葡萄糖、L-半胱氨酸、L-色氨酸、甘氨酸(Gly)的特异性，反应体系中次黄嘌呤的初始浓度为300μM，干扰物质的初始浓度为500μM，反应完成后在652nm处测定吸收值。
结果如图4所示。结果表明，只有次黄嘌呤反应后有肉眼可见的蓝色，其他干扰物质都不会对显色进行较大的程度的干扰，表明本发明的比色生物传感器对次黄嘌呤的特异性是可以接受的。
实施例4纳米材料NiPt NPs的部分表征
图5为纳米材料NiPt NPs的透射电子显微镜图像，结果显示纳米材料的平均粒径为2.45±0.52nm。
图6为纳米材料NiPt NPs的X射线能谱仪线扫图像，结果显示纳米材料中Pt元素含量高于Ni元素，这与原始添加量结果一致。
实施例5纳米材料NiPt NPs的催化活性的考察
按照实施例1的操作获得纳米材料NiPt NPs之后，于4℃环境避光储存，考察不同储存时间的纳米材料NiPt NPs的催化活性的变化(反应体系中H2O2的初始浓度为1mM)。
结果如图7所示。结果表明，在纳米材料合成两周时间内，具有良好的催化活性。在此时间段内进行操作，结果不会受到纳米材料活性的影响。
实施例6纳米材料NiPt NPs的催化动力学参数测定
为了量化纳米材料NiPt NPs的底物亲和力和催化效率，采用双倒数方法计算米氏常数(Km)和最大初始速度(Vmax),并通过ICP-MS测定纳米材料的浓度后计算催化效率Kcat。Km越小，表明纳米材料对底物亲和力越高，Kcat越大，表明纳米材料对底物催化效率越高。
在催化动力学实验中，首先测定了TMB的相关参数：H2O2终浓度为0.14mM，保持不变，TMB浓度变化，在37℃使用酶标仪测定酶的动力学。利用吸收值求反应速度，然后利用米氏方程获得米氏常数(Km)和最大初始速度(Vmax)。催化常数(Kcat)的计算则是利用公式Kcat＝Vmax/[E],[E]为颗粒浓度。其次测定了H2O2的相关参数：TMB终浓度为1mM，保持不变，H2O2浓度变化，步骤同上述。
纳米材料NiPt NPs对TMB的米氏曲线如图8所示，纳米材料NiPt NPs对TMB的双倒数曲线如图9所示。纳米材料NiPt NPs对H2O2的米氏曲线如图10所示，纳米材料NiPt NPs对H2O2的双倒数曲线如图11所示。通过计算得知，纳米材料NiPt NPs对TMB的米氏常数(Km)为1.0×10-3M，最大初始速度(Vmax)为5.9×10-7M s-1，催化常数(Kcat)为1.2×106s-1，纳米材料(NiPt NPs)的Kcat是天然辣根过氧化物酶的279.07倍。纳米材料NiPt NPs对H2O2的米氏常数(Km)为4.7×10-5M，最大初始速度(Vmax)为3.1×10-7M s-1。
实施例7基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测方法的建立
步骤如下：
(1)取待测溶液样品50μL，加入50μL的0.4U/mL的黄嘌呤氧化酶溶液，在37℃条件下共孵育15分钟，得初步孵育液；
(2)将20μL的初步孵育液、27μL的TMB溶液、93μL的乙酸溶液和1μL的NiPt NPs溶液混合，在37℃条件下共孵育30分钟，得孵育液，其中，TMB溶液的浓度为8mM；乙酸溶液的浓度为1M，pH值为5.0；NiPt NPs溶液的粒子浓度为6.8×10-11M；
(3)利用比色法测定孵育液在652nm处的最大吸收值；
(4)代入次黄嘌呤的紫外吸收标准曲线，计算得到待测溶液样品中次黄嘌呤的浓度。
实施例8基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测实例
以皮皮虾、基围虾、三疣梭子蟹、蛤蜊、鲍鱼为样品，以室温下放置时间为0小时的样品中含有的次黄嘌呤含量为基准，利用TCA法提取次黄嘌呤得待测溶液样品后，分别加入37.5μM、75μM的次黄嘌呤标准品，按照实施例1操作，测定652nm处的吸收值，代入实施例1中建立的次黄嘌呤标准曲线，得到样品中的次黄嘌呤测定浓度，每份样品测定三次，计算RSD和回收率。
所述TCA法提取次黄嘌呤的具体操作为：每个样品取肉10g，用浓度为0.1g/mL的TCA提取Hx，使用离心机在4℃以4000rpm离心20分钟，取上清液调节pH至6.0，然后过0.45μm的滤膜。
实际样品皮皮虾、基围虾、三疣梭子蟹、蛤蜊、鲍鱼中加标回收率信息见表1。由表1可见，本发明的比色生物传感器对上述五种样品的测定结果的回收率在83.69％～118.0％的范围内，RSD≤8.75％，准确性高，有较好的应用前景。
表1样品中加标回收率信息
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (7)
1.一种基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取待测溶液样品，加入黄嘌呤氧化酶并使其浓度为0.2 U/mL，在37℃条件下共孵育15分钟，得初步孵育液；
（2）将20μL的初步孵育液、27μL的TMB溶液、93μL的乙酸溶液和1μL的NiPt NPs溶液混合，在37℃条件下共孵育30分钟，得孵育液，其中，TMB溶液的浓度为8 mM；乙酸溶液的浓度为1 M，pH值为5.0；NiPt NPs溶液的粒子浓度为6.8×10-11 M；
所述NiPt NPs溶液是通过以下方法制备得到的：将10 mg氯铂酸、7 mg氯化镍、80 mg聚乙烯吡咯烷酮和10 mL四甘醇加入到90 mL超纯水中，150℃加热30分钟；然后加入1 mL的乙醛-四甘醇混合溶液，继续保持150℃加热30分钟；冷却至室温，即得NiPt NPs溶液，粒子浓度为1.4×10-9 M，用超纯水稀释至粒子浓度为6.8×10-11 M；所述乙醛-四甘醇混合溶液中二者的体积比为1:1；
（3）利用比色法测定孵育液在652 nm处的最大吸收值；
（4）代入次黄嘌呤的紫外吸收标准曲线，计算得到待测溶液样品中次黄嘌呤的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测方法，其特征在于：所述待测溶液样品是水产品经预处理得到的，所述水产品选自鱼、虾、蟹、贝鲜活品；所述预处理的方法为：利用TCA法提取水产品中的次黄嘌呤，得待测溶液样品。
3.根据权利要求2所述的基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测方法，其特征在于：所述水产品选自皮皮虾、基围虾、三疣梭子蟹、蛤蜊、鲍鱼。
4.根据权利要求1所述的基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中，次黄嘌呤的紫外吸收标准曲线是通过以下方法建立的：配制次黄嘌呤的梯度系列浓度样品，加入黄嘌呤氧化酶，在37℃条件下共孵育15分钟，得初步孵育液；将初步孵育液、TMB溶液、乙酸溶液和NiPt NPs溶液混合，在37℃条件下共孵育30分钟，得孵育液；利用比色法测定孵育液在652 nm处的最大吸收值；建立次黄嘌呤浓度与吸收值的标准曲线。
5.根据权利要求4所述的基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测方法，其特征在于，所述配制次黄嘌呤的梯度系列浓度样品的具体方法为：称量0.0065 g的次黄嘌呤，加入到1mL的1 M的NaOH溶液中，再加入1 mL的1 M的盐酸，用超纯水定容至5 mL，得次黄嘌呤母液；将次黄嘌呤母液用超纯水稀释成浓度范围在0～0.6 mM的梯度系列浓度样品。
6.根据权利要求4所述的基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测方法，其特征在于：所述黄嘌呤氧化酶的浓度为0.2 U/mL。
7.根据权利要求4所述的基于比色生物传感器的次黄嘌呤的检测方法，其特征在于：所述孵育液中，初步孵育液的用量为20μL；TMB溶液的浓度为8 mM，用量为27μL；乙酸溶液的浓度为1 M，pH值为5.0，用量为93μL；NiPt NPs溶液的粒子浓度为6.8×10-11 M，用量为1μL。
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