CN103940812B - 一种分光光度法快速检测大肠菌群的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉一种分光光度法快速检测大肠菌群的方法，利用大肠菌群在37℃可以发酵乳糖产酸、产气特性，以自制培养基为主，其中添加指示剂溴甲酚紫和TTC溶液，大肠菌群发酵培养后不仅能生产红色沉淀，而且可使培养液发生了由紫色变为黄色的颜色变化，利用该发酵液颜色的变化程度与溶液中所含大肠菌群数量成正相关的特性，可得出待检样品液中大肠菌群的含量。本发明方法相比于现行国标方法，在检测时间上有了大幅缩减，在加样后培养60min?400min即可检测样品中的大肠菌群数值，试用范围较广，满足了众多检测领域要求检测时间短的需求，在未来快速检测领域会有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测技术领域，涉及大肠菌群的检测，尤其是一种分光光度法快速检测大肠菌群的方法及应用。
背景技术
大肠菌群是指在37℃下能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，主要来源于人畜粪便。大肠菌群在样品中的含量是检验食品卫生安全的重要指标。目前常用的检测方法有传统发酵法、纸片快速法、滤膜法、酶底物法、聚合酶链式法、荧光原位杂交法，但这些已知检测方法检测时间仍需24h-72h不等，对于工业废水、食品等生产检测而言，大肠菌群检测周期较长，导致大量样品滞留无法及时处理。为了解决已有方法的不足，缩短检测时间，提高水质检测、食品生产中检验的工作效率，探寻大肠菌群的快速检测方法是十分必要的。
目前，现有技术中大肠菌群检测技术例如滤膜法、酶底物法，分子生物学检测法存在成本较高、操作较为繁琐的缺陷；另外，目前纸片法也是大部分领域检测较为常用的方法，但纸片培养基存在需低温保存的缺点，不适宜野外作业。
通过检索，发现一篇与本发明专利申请相关的如下专利公开文献：
一种大肠菌群的快速检测方法（CN101914609A），本发明涉及一种大肠菌群的快速检测方法。利用大肠菌群细胞在短时间培养过程中会产气，可以发酵乳糖产酸，使大肠菌群细胞与伊红美兰结合，而使伊红美兰混合培养溶液生成的紫黑色或***沉淀，通过生物显微镜镜检计数，将紫黑色或***沉淀细菌经过革兰氏染色呈现阴性的细菌的图像个数，来计数大肠菌群数量的大肠菌群快速检测方法；或者由于伊红美兰混合培养溶液生成的紫黑色或***的沉淀，而使伊红美兰混合培养溶液颜色变化，利用伊红美兰混合培养溶液颜色变化的程度与大肠菌群细胞数量相关的特性，识别大肠菌群细胞数的大肠菌群快速检测方法，本发明方法适合生物学界、医药界、食品界以及各种物品中大肠菌群的快速检测。
经过对比，本发明与上述专利公开文件存在的区别在于培养基成分不同，液体培养基成分经过改良以缩短培养时间，变色原因不同，检测特殊纳米值不同，因此标曲不同，而且是国标承认纸片法所用指示剂成分（含溴甲酚紫和TTC）第一次用于液体培养基后分光光度法来检测，因此本发明专利申请与上述专利公开文件存在本质的不同。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种方法简单、可快速检测样品中的大肠菌群数量的分光光度法快速检测大肠菌群的方法，该方法可以应用于水质监测、生物、食品、卫生方面的大肠菌群的快速检测。
为了实现上述目的，本发明所采用的的技术方案如下：
一种分光光度法快速检测大肠菌群的方法，步骤如下：
⑴溶液配制：
乳糖发酵检测培养液：50-90μL2%（质量浓度）溴甲酚紫溶液、4g胰蛋白胨、0.5g乳糖、0.5gD-甘露醇、0.75gNaCl、0.02g十二醇硫酸钠、0.01g脱氧胆酸钠、100mL蒸馏水，pH6.8-7.2，115℃，15min灭菌后待用；
TTC溶液：TTC加入无菌水制成0.5-3%（质量浓度）溶液，避光保存、待用；
⑵检测过程：
①样品匀液的制备：
无菌操作取待检样品，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成体积比为1:10的样品匀液，或质量：体积（g：L）为1:10的样品匀液；
或者，如果液体待检样品检出限≤10cfu/mL时，直接用原液进行检测；
②过滤：
用中速定量滤纸过滤样品匀液，得滤液；按滤液：浓缩的待检液的体积比为5-10：1的比例用膜过滤器过滤滤液，得浓缩的待检液；取浓缩的待检液按体积比为1：5-10的比例加入含有乳糖发酵检测培养液中，同时，按浓缩的待检液：TTC溶液的体积比mL：μL为1：30-80的比例取TTC溶液到乳糖发酵检测培养液中，置于37℃培养；
③标准曲线的绘制：
培养60-400min后，检测培养基中有颜色变化并伴有红色沉底物质生产，取检测管中的培养液，经离心处理发酵液，5000-7000r/min离心，离心2min-5min，取上清液置于石英比色皿中用分光光度计进行检测，测量360nm—500nm特殊纳米处的吸光值，建立不同含量大肠菌群混合培养液颜色和大肠菌群含量之间的对应线性关系，绘制标准曲线；
④待检样品的检测：
检测样品时，按步骤①-③的方法进行处理和培养待检样品，培养液有变色和沉淀现象，按前述步骤将培养液离心后，取上清液在360nm—500nm处测定吸光值，记录数据，与③中标准曲线进行比对，根据对比结果确定未知样品中所含大肠菌群数，最终得出待检样品中所 含大肠菌群数值。
而且，所述步骤⑵③中标准曲线的的回归方程为：
lgY=14.89X-1.33
R2=0.991
公式中：Y：未知样品中大肠菌群的预计含量
X:360nm—500nm处的OD值
R：相关系数。
如上所述的分光光度法快速检测大肠菌群的方法在水质监测、生物、食品、卫生方面的大肠菌群的快速检测方面中的应用。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明方法相比于现行国标方法，在检测时间上有了大幅缩减，在加样后培养60min-400min即可检测样品中的大肠菌群数值，试用范围较广，满足了众多检测领域要求检测时间短的需求，在未来快速检测领域会有较好的应用前景。
2、本发明方法操作较为简便，培养基成本较低，不需低温保存，使用方便。
附图说明
图1为本发明的大肠菌群含量对数值和吸光度的关系图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法；本发明中所使用的试剂，如无特殊说明，均为本领域的常规试剂；本发明中的各原料百分数含量如无特殊规定，均为质量体积比。
本发明的整体思路及检测原理如下：
本发明利用大肠菌群在37℃可以发酵乳糖产酸、产气特性，以自制培养基为主，其中添加指示剂溴甲酚紫和TTC（无色氯化三苯四氮唑）溶液，以溴甲酚紫和TTC作为指示剂，将溴甲酚紫和TTC加入乳糖发酵培养基中，配制成混合培养液，利用大肠菌群发酵乳糖产酸可以使得溴甲酚紫变黄，同时，由于甲酸脱氢酶的作用，会使得甲酸分解产生CO2和H2，这个过程中脱掉的氢和TTC反应生产红色的沉淀TTF（三苯甲臜），因此，检测试管中培养液会变黄并伴有红色沉淀生成，反应结束后，离心取上清液，用分光光度计在特定纳米处进行测量，采集数据后，根据不同浓度大肠菌群含量造成的培养液颜色变化程度建立标准曲线，此后未知大肠菌群含量的待检样品根据标准曲线推算大肠菌群含量。本发明方法适用于水质监测、生物、卫生、食品等中大肠菌群的快速检测、分析。
本发明中所使用的乳糖发酵检测培养液的配制如下：
50-90μL2%（质量浓度）的溴甲酚紫溶液、4g胰蛋白胨、0.5g乳糖、0.5gD-甘露醇、0.75gNaCl、0.02g十二醇硫酸钠、0.01g脱氧胆酸钠、100mL蒸馏水，pH6.8-7.2，115℃，15min灭菌后待用；
本发明中所使用的TTC溶液的配制如下：
TTC加入无菌水制成0.5-3%（质量浓度）溶液，避光保存、待用。
实施例1
一种分光光度法快速检测大肠菌群的方法，步骤如下：
（1）溶液配制：
乳糖发酵检测培养液：50μL2%（质量浓度）溴甲酚紫溶液、4g胰蛋白胨、0.5g乳糖、0.5gD-甘露醇、0.75gNaCl、0.02g十二醇硫酸钠、0.01g脱氧胆酸钠、100mL蒸馏水，pH6.8，115℃，15min灭菌后待用；
TTC溶液：TTC加入无菌水制成3%（质量浓度）溶液，避光保存、待用。
（2）检测过程：
①样品匀液的制备：
无菌操作取待检样品25g或25mL，装入含225mL无菌生理盐水的三角瓶中（内置若干玻璃珠），8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成体积比1:10的样品匀液（若液体待检样品检出限较低（≤10cfu/mL）时，也可直接用原液进行检测）；
②过滤：
用中速定量滤纸过滤样品匀液，反复冲洗一次，取5mL滤液用膜过滤器浓缩出1mL菌液，取浓缩的待检液加入含有9mL乳糖发酵检测培养液的检测试管中，同时，用移液器移取30μLTTC溶液到乳糖检测试管中，置于37℃培养，培养360min；
③待检样品的检测：
用已知大肠菌群含量的样品制作标准曲线。检测样品时，按步骤①-②的方法进行处理和培养待检样品，培养液有变色和沉淀现象，按前述步骤取检测管中的培养液，经离心处理发酵液，7000r/min离心，离心5min，取上清液在360nm—500nm处测定吸光值，记录数据，与标准曲线进行比对，根据对比结果确定未知样品中所含大肠菌群数，最终得出未知样品中所含大肠菌群数值。
实施例2
一种分光光度法快速检测大肠菌群的方法，步骤如下：
（1）溶液配制：
乳糖发酵检测培养液：90μL2%（质量浓度）溴甲酚紫溶液、4g胰蛋白胨、0.5g乳糖、0.5gD-甘露醇、0.75gNaCl、0.02g十二醇硫酸钠、0.01g脱氧胆酸钠、100mL蒸馏水，pH7.2，115℃，15min灭菌后待用；
TTC溶液：TTC加入无菌水制成1.5%（质量浓度）溶液，避光保存、待用。
（2）检测过程：
①样品匀液的制备：
无菌操作取待检样品25g或25mL，装入含225mL无菌生理盐水的三角瓶中（内置若干玻璃珠），8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成体积比1:10的样品匀液（若液体待检样品检出限较低≤10cfu/mL时，也可直接用原液进行检测）；
②过滤：
用中速定量滤纸过滤样品匀液，反复冲洗一次，取9mL滤液用膜过滤器浓缩出1mL菌液，取浓缩的待检液加入含有9mL乳糖发酵检测培养液的检测试管中，同时，用移液器移取80μLTTC溶液到乳糖检测试管中，置于37℃培养，培养300min；
③待检样品的检测：
用已知大肠菌群含量的样品制作标准曲线。检测样品时，按步骤①-②的方法进行处理和培养待检样品，培养液有变色和沉淀现象，按前述步骤取检测管中的培养液，经离心处理发酵液，7000r/min离心，离心5min，取上清液在360nm—500nm处测定吸光值，记录数据，与标准曲线进行比对，根据对比结果确定未知样品中所含大肠菌群数，最终得出未知样品中所含大肠菌群数值。
实施例3
一种分光光度法快速检测大肠菌群的方法，步骤如下：
（1）溶液配制：
乳糖发酵检测培养液：60μL2%（质量浓度）溴甲酚紫溶液、4g胰蛋白胨、0.5g乳糖、0.5gD-甘露醇、0.75gNaCl、0.02g十二醇硫酸钠、0.01g脱氧胆酸钠、100mL蒸馏水，pH6.9，115℃，15min灭菌后待用；
TTC溶液：TTC加入无菌水制成2%（质量浓度）溶液，避光保存、待用。
（3）检测过程：
①样品匀液的制备：
无菌操作取待检样品25g或25mL，装入含225mL无菌生理盐水的三角瓶中（内置若干玻璃珠），8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成体积比1:10的样品匀液（若液体待检样品检出限较低≤10cfu/mL时，也可直接用原液进行检测）；
②过滤：
用中速定量滤纸过滤样品匀液，反复冲洗一次，取10mL滤液用膜过滤器浓缩出1mL菌液，取浓缩的待检液加入含有9mL乳糖发酵检测培养液的检测试管中，同时，用移液器移取50μLTTC溶液到乳糖检测试管中，置于37℃培养，培养300min；
③待检样品的检测：
用已知大肠菌群含量的样品制作标准曲线。检测样品时，按步骤①-②的方法进行处理和培养待检样品，培养液有变色和沉淀现象，按前述步骤取检测管中的培养液，经离心处理发酵液，7000r/min离心，离心5min，取上清液在360nm—500nm处测定吸光值，记录数据，与标准曲线进行比对，根据对比结果确定未知样品中所含大肠菌群数，最终得出未知样品中所含大肠菌群数值。
本发明中标准曲线的制作方法步骤如下：
标准曲线的绘制：
用已知大肠菌群含量的样品加入乳糖发酵检测培养液的检测试管中，培养60-400min后，检测培养基中有颜色变化并伴有红色沉底物质生产，取检测管中的培养液，经离心处理发酵液，5000-7000r/min离心，离心2min-5min，取上清液置于石英比色皿中用分光光度计进行检测，测量360nm—500nm特殊纳米处的吸光值（即OD值），建立不同含量大肠菌群混合培养液颜色和大肠菌群含量之间的对应线性关系，绘制标准曲线。
本发明的三个实施例的检测结果取平均值后绘制的标准曲线，结果如图1所示，从图中可以看出：
标准分光光度值的回归方程为：
lgY=14.89X-1.33
R2=0.991
公式中：Y：未知样品中大肠菌群的预计含量
X:360nm—500nm处的OD值
R：相关系数。
本发明分光光度法快速检测大肠菌群的方法的相关检测结果：
使用本发明检测方法对无公害鸡蛋中的大肠菌群、非发酵性豆制品中的大肠菌群和饼干中的大肠菌群进行检测，检测结果见表1、表2、表3。
表1无公害鸡蛋中大肠菌群检测结果
表2非发酵性豆制品中大肠菌群检测结果
表3 饼干中大肠菌群检测结果
本发明以溴甲酚紫和TTC为指示剂，通过溶液颜色变化和产生红色沉淀两个较为明显的现象作为判断大肠菌群产酸产气的标准，同时，通过溶液颜色变化程度来预测未知样品中大肠菌群含量。实施例中以浓缩样品1mL菌液加入9mL检测试管中，37℃培养60min-400min后，在360nm—500nm波长处进行吸光值测量，根据标准曲线得出检测样品所含大肠菌群数量后，对比国标法检测结果，发现本发明检测结果均在国标法检测结果可信范围内，说明本 发明检测法较国标法有一定的可信性，可作为大肠菌群检测的有效检测方法。由于国标法检测步骤繁琐、检测时间较长，本发明方法不仅操作简便、检测时间有大幅缩减，而且试用范围较广，大大满足了工业生产和小型实验室的各种需求，预计在未来快速检测领域会有较好的应用前景。
Claims (3)
1.一种分光光度法快速检测大肠菌群的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴溶液配制：
乳糖发酵检测培养液：50-90μL 2％(质量浓度)溴甲酚紫溶液、4g胰蛋白胨、0.5g乳糖、0.5g D-甘露醇、0.75g NaCl、0.02g十二醇硫酸钠、0.01g脱氧胆酸钠、100mL蒸馏水，pH6.8-7.2，115℃，15min灭菌后待用；
TTC溶液：TTC加入无菌水制成0.5-3％(质量浓度)溶液，避光保存、待用；
⑵检测过程：
①样品匀液的制备：
无菌操作取待检样品，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成体积比为1:10的样品匀液，或质量：体积(g：L)为1:10的样品匀液；
②过滤：
用中速定量滤纸过滤样品匀液，得滤液；按滤液：浓缩的待检液的体积比为5-10：1的比例用膜过滤器过滤滤液，得浓缩的待检液；取浓缩的待检液按体积比为1：5-10的比例加入含有乳糖发酵检测培养液中，同时，按浓缩的待检液：TTC溶液的体积比mL：μL为1：30-80的比例取TTC溶液到乳糖发酵检测培养液中，置于37℃培养；
③标准曲线的绘制：
培养60-400min后，检测培养基中有颜色变化并伴有红色沉底物质生产，取检测管中的培养液，经离心处理发酵液，5000-7000r/min离心，离心2min-5min，取上清液置于石英比色皿中用分光光度计进行检测，测量360nm—500nm特殊纳米处的吸光值，建立不同含量大肠菌群混合培养液颜色和大肠菌群含量之间的对应线性关系，绘制标准曲线；
④待检样品的检测：
检测样品时，按步骤①-③的方法进行处理和培养待检样品，培养液有变色和沉淀现象，按前述步骤将培养液离心后，取上清液在360nm—500nm处测定吸光值，记录数据，与③中标准曲线进行比对，根据对比结果确定未知样品中所含大肠菌群数，最终得出待检样品中所含大肠菌群数值。
2.根据权利要求1所述的分光光度法快速检测大肠菌群的方法，其特征在于：所述步骤⑵③中标准曲线的回归方程为：
lgY＝14.89X-1.33
R2＝0.991
公式中：Y：未知样品中大肠菌群的预计含量
X:360nm—500nm处的OD值
R：相关系数。
3.如权利要求1或2所述的分光光度法快速检测大肠菌群的方法在水质监测、生物、食品、卫生方面的大肠菌群的快速检测方面中的应用。
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