CN111024636B - 基于CoOOH-TMB氧化***的比色方法用于检测谷胱甘肽 - Google Patents

基于CoOOH-TMB氧化***的比色方法用于检测谷胱甘肽 Download PDF

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Abstract

本公开涉及一种基于CoOOH‑TMB氧化***的比色方法检测谷胱甘肽的方法及其试剂盒，检测GSH的方法包括以下步骤：将待测样品与羟基氧化钴纳米片溶液混合后进行孵育，获得混合溶液一；向混合溶液一中加入醋酸‑醋酸盐缓冲溶液和四甲基联苯胺溶液，混合均匀，获得混合溶液二；测定混合溶液二的吸光度，即可测定GSH的含量。该方法和试剂盒灵敏度高、特异性好，操作简单方便，成本低廉。

Description

基于CoOOH-TMB氧化***的比色方法用于检测谷胱甘肽
技术领域
本公开涉及基于CoOOH-TMB氧化***的比色方法用于检测谷胱甘肽，属于生物和分析化学领域。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
谷胱甘肽是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，存在于几乎身体的每一个细胞，谷胱甘肽有还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两种形式，在生理条件下以还原型谷胱甘肽占绝大多数。谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫***功能，并具有抗氧化作用、整合解毒作用。谷胱甘肽不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。因此，对于检测谷胱甘肽的含量具有多方面的重要意义。
对于谷胱甘肽的检测方法，目前比较常用的方法包括：荧光法、高效液相色谱法(HPLC)、表面增强拉曼光谱法(SERS)、高效毛细管电泳法(HPCE)、酶联免疫吸附测定(ELISA)法等。这些已建立的方法在定量检测谷胱甘肽中虽然具有一定的优势，然而这些检测方法需要昂贵的仪器，操作步骤繁琐费时，成本较高，且需要专业的人员操作。
因此，目前仍需研发更加简便和成本低廉等的谷胱甘肽检测试剂盒和检测方法，以便更适合于科学研究以及日常检测的应用。
发明内容
针对以上背景技术，应用于化学药、生物制品、中药和医疗器械等不同类型的创新产品，以获得上市许可为目标的临床前研究、临床试验的委托合同研究(CRO)。主要用于医用检查检验仪器及服务中的体外诊断检测，本公开提出一种基于CoOOH-TMB氧化***的比色方法检测谷胱甘肽的方法，该方法灵敏度高、特异性好，操作简单方便，成本低廉。
具体的，本公开采用以下技术方案：
本公开的第一个目的，提供一种检测GSH的试剂盒，该试剂盒包括：
羟基氧化钴(CoOOH)纳米片溶液或配置羟基氧化钴(CoOOH)纳米片溶液的物质；
醋酸-醋酸盐缓冲溶液或配制醋酸-醋酸盐缓冲溶液的缓冲物质；和，
四甲基联苯胺。
本公开的第二个目的，提供一种检测GSSG试剂盒，该试剂盒包括：
GSH掩蔽剂；
GSSG碱性还原剂；
所述GSSG碱性还原剂的中和试剂；
羟基氧化钴(CoOOH)纳米片溶液或配置羟基氧化钴(CoOOH)纳米片溶液的物质；
醋酸-醋酸盐缓冲溶液或配制醋酸-醋酸盐缓冲溶液的缓冲物质；和，
四甲基联苯胺(TMB)。
在本公开的第三个目的，提供一种检测GSH的方法，该方法包括以下步骤：
将待测样品与羟基氧化钴纳米片溶液混合后进行孵育，获得混合溶液一；
向混合溶液一中加入醋酸-醋酸盐缓冲溶液和四甲基联苯胺溶液，混合均匀，获得混合溶液二；
测定混合溶液二的吸光度，即可测定GSH的含量。
在本公开的第四个目的，提供一种检测GSSG的方法，该方法包括以下步骤：
向待测样品中加入GSH掩蔽剂，混合均匀，得到混合溶液三；
向混合溶液三中加入GSSG碱性还原剂，混合均匀，得到混合溶液四；
向混合溶液四中加入所述GSSG碱性还原剂的中和试剂，混合均匀，得到混合溶液五；
将混合溶液五与羟基氧化钴溶液混合后进行孵育，获得混合溶液六；
向混合溶液六中加入醋酸-醋酸盐缓冲溶液和四甲基联苯胺溶液，混合均匀，获得混合溶液七；
测定混合溶液七的吸光度，即可测定GSSG的含量。
本公开的第五个目的，提供一种测定GSH和GSSG比值的方法，该方法包括以下步骤：
根据所述检测GSH的方法测定待测样品中的GSH的含量；
根据所述检测GSSG的方法测定待测样品中的GSSG的含量；
计算GSH和GSSH的比值。
与本发明人知晓的相关技术相比，本公开其中的一个技术方案具有如下有益效果：
本公开的GSH和GSSH检测方法和试剂盒灵敏度高、特异性好，操作简单方便，成本低廉，不需要昂贵的仪器及生物试剂，针对生物样品的检测具有广泛的应用前景。
附图说明
构成本公开一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
图1：CoOOH的合成以及利用CoOOH检测GSH的原理图。
图2：CoOOH的透射电镜照片。
图3：a、CoOOH的AFM图像；b、CoOOH的相应厚度剖面图。
图4：a、CoOOH的红外光谱图，b、CoOOH的X射线衍射光谱图。
图5：将不同浓度的GSH溶液与CoOOH纳米片溶液混合40℃反应4h后，加入TMB与反应剩余的CoOOH形成oxTMB的0.1-6μM(a)和8-300μM(c)范围内吸光度曲线及其对应的在0.1-6μM(b)和8-300μM(d)范围内在652nm处的吸光度随GSH浓度的变化。
图6：0.1-6μM(a)和8-300μM(b)范围内与不同浓度GSH反应剩余的CoOOH与TMB反应生成oxTMB在652nm处的吸光度随GSH浓度变化的校准曲线。
图7：CoOOH纳米片(a)和TMB(b)的UV-vis吸收光谱图。
图8：抗坏血酸(AA)对GSH检测的影响曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，目前常用的一些谷胱甘肽的检测方法存在操作步骤繁琐费时、成本较高和/或需要专业的人员操作等问题。
为了解决如上的技术问题，在本公开的第一个典型的实施方式中，提供一种检测GSH的试剂盒，该试剂盒包括：
羟基氧化钴(CoOOH)纳米片溶液或配置羟基氧化钴(CoOOH)纳米片溶液的物质；
醋酸-醋酸盐缓冲溶液或配制醋酸-醋酸盐缓冲溶液的缓冲物质；和，
四甲基联苯胺。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述配置羟基氧化钴(CoOOH)纳米片溶液的物质为羟基氧化钴(CoOOH)纳米片和水或聚乙二醇。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述醋酸-醋酸盐可为醋酸-醋酸钠(HAc-NaAc)，pH为3～4，进一步的，pH为4。本发明人将该缓冲液的pH设置为3～4，经过试验验证，体系在该酸环境条件下较长时间反应，有助于分解抗坏血酸等还原性物质或破坏他们的分子结构，从而排除了抗坏血酸等还原性物质的干扰。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述检测GSH的试剂盒还包括说明书，提供检测时的具体说明和注意事项。
在本公开的第二个典型的实施方式中，提供一种检测GSSG试剂盒，该试剂盒包括：
GSH掩蔽剂；
GSSG碱性还原剂；
所述GSSG碱性还原剂的中和试剂；
羟基氧化钴(CoOOH)纳米片溶液或配置羟基氧化钴(CoOOH)纳米片溶液的物质；
醋酸-醋酸盐缓冲溶液或配制醋酸-醋酸盐缓冲溶液的缓冲物质；和，
四甲基联苯胺(TMB)。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述GSH掩蔽剂可为现有技术中的常规试剂，包括但不限于N-乙基马来酰亚胺(NEM)等物质。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述GSSG碱性还原剂可为现有技术中的常规试剂，包括但不限于硼氢化钠等物质。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述GSSG碱性还原剂的中和试剂可为现有技术中的常规试剂，包括但不限于有机酸(例如乙酸等)等物质。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述配置羟基氧化钴(CoOOH)纳米片溶液的物质为羟基氧化钴(CoOOH)纳米片和水或聚乙二醇。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述醋酸-醋酸盐可为醋酸-醋酸钠(HAc-NaAc)，pH为3～4，进一步的，pH为4。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述检测GSSG的试剂盒还包括说明书，提供检测时的具体说明和注意事项。
在本公开的第三个典型的实施方式中，提供一种检测GSH的方法，该方法包括以下步骤：
(1)将待测样品与羟基氧化钴纳米片溶液混合后进行孵育，获得混合溶液一；
(2)向混合溶液一中加入醋酸-醋酸盐缓冲溶液和四甲基联苯胺溶液，混合均匀，获得混合溶液二；
(3)测定混合溶液二的吸光度，即可测定GSH的含量。
CoOOH纳米片可以直接将TMB氧化生成以652nm为吸收峰的oxTMB(蓝色)，并引起颜色从无色变为蓝色，而当GSH存在时，GSH可以将CoOOH纳米片分解为Co2+，Co2+不能氧化TMB，从而减少oxTMB的生成，导致吸光度的降低和蓝色的漂白。因此GSH的浓度很容易通过吸光光谱和裸眼观察颜色变化测定。
在本公开的一个或多个实施方式中，步骤(1)中，所述待测样品可以是生物样品或非生物样品。
生物样品可以来自哺乳动物受试者或非哺乳动物受试者。哺乳动物受试者可以是，例如，人或其它动物物种。生物样品包括生物体液，诸如全血、血清、血浆、痰、淋巴液、***、***粘液、***物、尿、脊髓液、唾液、粪便、脑脊液、泪液、粘液等；生物组织，诸如毛发、皮肤、来自器官或其它机体部分的细胞、切片或切除组织；等等。在许多情况下，所述待测样品是细胞、全血、血浆或血清。
非生物样品包括但不限于，例如食品、保健品等，其也可以使用根据本公开所述的原理的GSH进行检测。
在本公开的一个或多个实施方式中，步骤(1)中，所述羟基氧化钴纳米片溶液为羟基氧化钴纳米片和水或聚乙二醇组成的混合溶液；
进一步的，所述羟基氧化钴纳米片溶液为羟基氧化钴纳米片和聚乙二醇组成的混合溶液，在试验研究发现中，将羟基氧化钴纳米片分散聚乙二醇中，分散效果更加均匀，而且使后续检测体系的稳定时间更长，这样使得检测结果更加准确，显著优于水体系。
在本公开的一个或多个实施方式中，步骤(1)中，所述羟基氧化钴纳米片可通过现有技术的方法进行常规制备。
优选的，所述羟基氧化钴纳米片的形貌为规则的或不规则的六边形，六边形的边长为50～150nm，经过试验验证，此形貌的羟基氧化钴纳米片会使得检测效果更加准确和灵敏度更高。
相应地，提供一种较为优选的羟基氧化钴纳米片的制备方法，该方法包括以下步骤：
向Co(NO3)2·6H2O溶液中加入NaOH溶液，将混合物超声分散，然后将NaClO溶液加入到上述超声处理过的混合物中再进行超声处理，获得羟基氧化钴纳米片。
其中，所述Co(NO3)2·6H2O溶液的浓度为5～15mmoL/L，NaOH溶液的浓度为0.5～1.5moL/L，NaClO溶液的浓度为0.5～1.5moL/L，加入的Co(NO3)2·6H2O溶液、NaOH溶液和NaClO溶液的体积比例为400～800:100～150:10～50。
为了提高制备的CoOOH的分散性和后续检测体系的稳定性，将获得的羟基氧化钴纳米片加入聚乙二醇，超声2-3h。
在本公开的一个或多个实施方式中，步骤(1)中，所述孵育温度为25～42℃，孵育时间为3～5h；为了更好地排除体系内的其他还原性物质的干扰，提高检测特异性，优选孵育温度为40℃，时间为4h。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述羟基氧化钴纳米片溶液的浓度为50～150μg/mL，所述TMB溶液的浓度为2～8mmoL/L。待测样品、羟基氧化钴纳米片溶液和TMB溶液的体积比例为(300～500)：(300～500)：(50～150)。
在本公开的一个或多个实施方式中，所述检测GSH的方法，还包括制备标准曲线以及线性方程的步骤。
具体地，通过制备一系列不同浓度的GSH标准溶液，按照上述检测GSH的方法，得到不同浓度的GSH溶液标准品的吸光度，按照此绘制标准曲线，得到线性方程。
在本公开的第四个典型的实施方式中，提供一种检测GSSG的方法，该方法包括以下步骤：
向待测样品中加入GSH掩蔽剂，混合均匀，得到混合溶液三；
向混合溶液三中加入GSSG碱性还原剂，混合均匀，得到混合溶液四；
向混合溶液四中加入所述GSSG碱性还原剂的中和试剂，混合均匀，得到混合溶液五；
按照所述检测GSH的方法进行操作，即可检测GSSG的含量。
在本公开的或多个实施方式中，所述检测GSSA的方法，还包括制备标准曲线以及线性方程的步骤。
具体地，通过制备一系列不同浓度的GSSA标准溶液，按照上述检测GSSA的方法，得到不同浓度的GSSA溶液标准品下的吸光度，按照此绘制标准曲线，得到线性方程。
本公开的第五个典型的实施方式中，提供一种测定GSH和GSSG比值的方法，该方法包括以下步骤：
根据所述检测GSH的方法测定待测样品中的GSH的含量；
根据所述检测GSSG的方法测定待测样品中的GSSG的含量；
计算GSH和GSSH的比值。
需要注意的是，谷胱甘肽在生物体内或非生物体内均具有重要的作用或意义，比如，降低细胞内的自由基水平、维持新陈代谢过程、去除新陈代谢过程中产生的有毒物质、平衡细胞内氧化还原压力等，本公开检测GSH、GSSG的方法均为非诊断目的的检测方法。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
羟基氧化钴(CoOOH)纳米片溶液的制备：
向500μL Co(NO3)2·6H2O(10mM)溶液中加入125μL NaOH(1.0M)溶液，将混合物超声分散1min，然后将25μL NaClO(0.9M)样品加入到上述超声处理过的混合物中，超声处理10min，生成黑棕色絮状物。为了提高制备的CoOOH的分散性，在上述混合物中加入聚乙二醇，超声2～3h，制备得到羟基氧化钴(CoOOH)纳米片溶液，备用。
通过离心洗涤获得黑棕色CoOOH纳米片，如图2所示，为CoOOH纳米片的投射电镜照片，从图中可以看出，得到的CoOOH纳米片为六边形，边长为50～100nm左右。如图3所示，为CoOOH纳米片的AFM图像和相应厚度剖面图。如图4所示，为CoOOH纳米片的红外光谱和X射线衍射光谱。如图7中a所示，为CoOOH纳米片的UV-vis吸收光谱。
实施例2
一种检测GSH的试剂盒，该试剂盒包括：
羟基氧化钴(CoOOH)纳米片溶液；
醋酸-醋酸钠缓冲溶液；
四甲基联苯胺，如图7的b所示，其为UV-vis吸收光谱。
一种采用上述试剂盒检测GSH的方法，该方法包括：
(1)采用超纯水配制不同浓度的GSH标准溶液，检测不同浓度的GSH标准溶液下的吸光度；
具体的检测方法为：
A、取400μL水与400μL CoOOH(100μg/mL)纳米片溶液加入到离心管中，溶液呈现CoOOH的淡棕黄色，在离心管中加入500μL HAc-NaAc(pH＝4)缓冲溶液(控制溶液的pH为4)、100μL TMB(5mM)(用于显色)于上述溶液中，混合均匀，测其吸光度记为原始溶液吸光度。
B、分别取400μL不同浓度(0.1～6μmoL/L，8～300μmoL/L)的GSH标准溶液与400μLCoOOH(100μg/mL)纳米片溶液加入到离心管中，溶液呈现CoOOH的淡棕黄色；
C、将离心管置于40℃烘箱孵育4h，以便于GSH可以将CoOOH还原成Co2+；孵育4h完成后，取出离心管，淡棕黄色溶液颜色变浅；
D、在离心管中加入500μL HAc-NaAc(pH＝4)缓冲溶液(控制溶液的pH为4)、100μLTMB(5mM)(用于显色)于上述溶液中，混合均匀；加入TMB后变蓝色；
E、移取该混合溶液200μL，于96微孔板中测吸光度，平行测试三次；
以波长为652nm溶液的吸光度作为纵坐标，GSH标准溶液的浓度为横坐标，建立标准曲线，如图5所示。
以原始吸光度与标准曲线纵坐标的差值为新的纵坐标，GSH标准溶液的浓度为横坐标，得到如图6所示的校准曲线。
(2)待测样品中GSH的检测：
具体的检测方法按照步骤(1)所述的方法进行操作，得到吸光度数据，将吸光度数据代入线性方程中即可计算得到待测样品中的GSH的浓度。
试验结果：
1、当加入的GSH浓度增大时，生成的oxTMB减少，从而导致652nm处吸光度的降低；并且可以肉眼观察到溶液颜色由蓝色依次变浅；
2、本公开的方法的线性检测范围0.1-300μM，检测限0.1μM，满足实际检测应用。
实施例3
实际样品中GSH的含量检测，包括以下步骤：
(1)制备SH-SY5Y细胞提取液：PBS洗涤SH-SY5Y细胞一次，离心收集细胞，吸尽上清液。加入细胞沉淀体积3倍量的蛋白去除试剂S溶液，充分Vortex。然后利用液氮和37℃水浴对样品进行两次快速的冻融。4℃或冰浴放置5分钟。4℃，10,000g离心10分钟。取上清液用于总谷胱甘肽的测定。对于处理好的细胞样品需用蛋白去除试剂S溶液进行100倍稀释后再进行测定。
蛋白去除试剂S溶液的配置：
在试剂盒提供的0.4克蛋白去除试剂S中加入8毫升超纯水，配置成8毫升5％的水溶液。4℃保存。
(2)通过实施例2中的方法进行检测，检测得到GSH的含量为12.6878±1.81131μmoL/L。
采用比较成熟的商业用试剂盒对上述SH-SY5Y细胞提取液中的GSH进行检测，该试剂盒为碧云天(Beyotime)总谷胱甘肽检测试剂盒(产品编号S0052)，检测得到GSH的含量为12.07053±0.8551μmoL/L，两者的相对差异为5.11％，不具有显著区别。可见，本公开提供的试剂盒和检测方法与成熟商业试剂盒具有相当的技术效果，而商业试剂盒的价格十分昂贵，本公开提供的试剂盒价格低廉，检测方法简便。
实施例4
一种检测GSSG试剂盒，该试剂盒包括：
N-乙基马来酰亚胺；
硼氢化钠；
乙酸；
羟基氧化钴(CoOOH)纳米片溶液；
醋酸-醋酸钠缓冲溶液；
四甲基联苯胺。
一种采用上述试剂盒检测GSSG的方法，该方法包括以下步骤：
(1)采用超纯水配制不同浓度的GSSG标准溶液，检测不同浓度的GSSG标准溶液下的吸光度；
具体的检测方法为：
A、分别向400μL不同浓度的GSSG标准溶液中加入40μgN-乙基马来酰亚胺，混合均匀，掩蔽GSH；
B、向步骤A的混合体系中加入40μg硼氢化钠，混合均匀，将GSSG还原为GSH；
C、向步骤B的混合体系中加入15μL乙酸，中和多余的硼氢化钠；
D、将步骤C中的混合体系与400μL CoOOH(100μg/mL)纳米片溶液加入到离心管中，溶液呈现CoOOH的淡棕黄色；
E、将离心管置于40℃烘箱孵育4h，以便于GSH可以将CoOOH还原成Co2+；孵育4h完成后，取出离心管，淡棕黄色溶液颜色变浅；
F、在离心管中加入500μL HAc-NaAc(pH＝4)缓冲溶液(控制溶液的pH4)、100μLTMB(5mM)(用于显色)于上述溶液中，混合均匀；加入TMB后变蓝色；
G、移取该混合溶液200μL，于96微孔板中测吸光度，平行测试三次；
以波长为652nm溶液的吸光度作为纵坐标，GSSG标准溶液的浓度为横坐标，建立标准曲线，得到线性方程。
(2)待测样品中GSSG的检测：
具体的检测方法按照步骤(1)所述的方法进行操作，得到吸光度数据，将吸光度数据代入线性方程中即可计算得到待测样品中的GSSG的浓度。
实施例5
干扰性实验：
为考察本公开方法对GSH的选择性，设计了一系列干扰性试验。具体方案为：
将干扰物和GSH组成的混合溶液采用实施例2的方法进行检测，所述干扰物半胱氨酸(Cys)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)或抗坏血酸(AA)，所述混合溶液中，干扰物的浓度设置为0.01～2μmoL/L，通过试验可知，本公开的检测方法对GSH具有较强的特异性。
具体如图8所示，空白对照的652nm处的吸光度是1.3866，加了AA(浓度为2μmoL/L)对比的吸光度是1.3759，两条线在图中显示为重叠。由此可见，抗坏血酸(AA)的加入对体系不构成干扰。而实际应用检测时，生物体内抗坏血酸(AA)浓度一般仅为GSH的千分之一，更不会对体系构成干扰，影响结果的准确性。
实验例1
待测样品中GSH的检测：
具体的检测方法如下：
A、将实施例3中的SH-SY5Y细胞提取液与400μL CoOOH(100μg/mL)纳米片溶液加入到离心管中，溶液呈现CoOOH的淡棕黄色；
B、将离心管置于20℃烘箱孵育2h；孵育2h完成后，取出离心管；
C、在离心管中加入HAc-NaAc(pH＝4)缓冲溶液(控制溶液的pH＝5、100μL TMB(5mM)(用于显色)于上述溶液中，混合均匀；加入TMB后变蓝色；
D、移取该混合溶液200μL，于96微孔板中测吸光度，平行测试三次，得到吸光度数据，将吸光度数据代入按照该实验例同样方法得到的线性方程中即可计算得到SH-SY5Y细胞提取液中的GSH的浓度，检测得到GSH的含量为13.9543±1.25127μmoL/L，与实施例3相比，含量明显较高，两者结果差异显著。
上述实施例为本公开较佳的实施方式，但本公开的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本公开的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本公开的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测GSH的方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
制备标准曲线以及线性方程；
将待测样品与羟基氧化钴纳米片溶液混合后进行孵育，获得混合溶液一；所述羟基氧化钴纳米片溶液为羟基氧化钴纳米片和聚乙二醇组成的混合溶液；所述羟基氧化钴纳米片溶液的浓度为50～150μg/mL，所述孵育温度为40℃，孵育时间为3～5h；
向混合溶液一中加入醋酸-醋酸盐缓冲溶液和四甲基联苯胺溶液，混合均匀，获得混合溶液二；所述醋酸-醋酸盐缓冲溶液的pH为3～4；所述四甲基联苯胺 溶液的浓度为2～8mmoL/L；
测定混合溶液二的吸光度，将混合溶液二的吸光度数据代入线性方程，即可测定GSH的含量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述待测样品是生物样品或非生物样品。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是，所述样品是细胞、全血、血浆或血清。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述羟基氧化钴纳米片的形貌为规则的或不规则的六边形，六边形的边长为50～150nm。
5.如权利要求4所述的方法，其特征是，羟基氧化钴纳米片的制备方法，该方法包括以下步骤：
向Co(NO3)2·6H2O溶液中加入NaOH溶液，将混合物超声分散，然后将NaClO溶液加入到上述超声处理过的混合物中再进行超声处理，获得羟基氧化钴纳米片；
其中，所述Co(NO3)2·6H2O溶液的浓度为5～15mmoL/L，NaOH溶液的浓度为0.5～1.5moL/L，NaClO溶液的浓度为0.5～1.5moL/L，加入的Co(NO3)2·6H2O溶液、NaOH溶液和NaClO溶液的体积比例为400～800:100～150:10～50。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是，孵育时间为4h。
7.如权利要求1所述的方法，其特征是，待测样品、羟基氧化钴纳米片溶液和TMB溶液的体积比例为(300～500)：(300～500)：(50～150)。
8.一种检测GSSG的方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
向待测样品中加入GSH掩蔽剂，混合均匀，得到混合溶液三；
向混合溶液三中加入GSSG碱性还原剂，混合均匀，得到混合溶液四；
向混合溶液四中加入所述GSSG碱性还原剂的中和试剂，混合均匀，得到混合溶液五；
按照权利要求1～7中任一项所述的检测GSH的方法进行操作，即可检测GSSG的含量。
9.如权利要求8所述的方法，其特征是：所述检测GSSG的方法，还包括制备标准曲线以及线性方程的步骤。
10.一种测定GSH和GSSG比值的方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
根据权利要求1～7中任一项所述的检测GSH的方法测定待测样品中的GSH的含量；
根据权利要求8或9所述的检测GSSG的方法测定待测样品中的GSSG的含量；
计算GSH和GSSG的比值。
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