CN109856102A - 一种检测水产品次黄嘌呤的生物传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测水产品次黄嘌呤的生物传感器及其应用，属于食品分析领域。本发明基于铂纳米(Pt NPs)的催化活性，构建了一种荧光生物传感器，用于检测水产品中次黄嘌呤Hx的含量。所提出的传感***由黄嘌呤氧化酶XOD，邻苯二胺OPD和Pt NPs组成，根据Hx在XOD存在下与氧反应，产生尿酸和H2O2,Pt NPs可催化OPD与H2O2的氧化反应生成发黄色荧光的2,3‑吩嗪二胺，提出了一种快速、简便、灵敏的水产品新鲜度的检测方法。该检测新方法中的Pt NPs的制备简单易得，可以实现对水产品新鲜度的简便分析，具有操作简单，灵敏度和选择性高的特点。易于推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测水产品次黄嘌呤的生物传感器来检测水产品的新鲜度，属于食品分析领域。
背景技术
水产品的新鲜度是评价其质量的重要指标。由于其营养丰富的性质，水产品在酶和微生物的共同作用下在储存和销售期间易于变质。然而，水产品的新鲜度评估是复杂的，因为肉的腐败涉及不同的微生物，物理化学和生化反应。传统上，有两种方法来评估水产品的新鲜度：（1）由专家控制感官特征的感官测试，和（2）化学和生物化学测定目标生物指标的浓度。尽管前一种方法已被证明是快速的，但它昂贵且有时不可靠，因为在降解的初始阶段之前难以评估肉类新鲜度的细微差别。后一种方法引起了很多关注，并且大量研究试图将肉的新鲜度与某些物质（如生物胺，三甲胺，挥发性胺，ATP降解产物和细菌计数）的浓度或存在联系起来。次黄嘌呤Hx常被用作反应水产品新鲜度的指标，近年来开发了各种生物传感器，包括电化学荧光和光学传感器用于测定Hx，因为生物传感器具有诸如简单，快速分析和高灵敏度等许多优点，然而，在大多数报道的方法中所需材料合成比较繁琐，检测周期长，并且传感器的制备本身比较复杂。
发明内容
鉴于上述现有技术中的不足，本发明的一个目的在于提供一种准确高效的荧光分析方法来检测水产品的新鲜度。在各种生物传感器中，荧光分析由于其高灵敏度和抗干扰性能等固有优势，已成为最强大的生物分析和诊断工具之一。本发明主要是基于Pt NPs模拟过氧化物酶的催化活性构建的荧光生物传感器来达到检测水产品的新鲜度的目的。通过Pt NPs催化邻苯二胺OPD与黄嘌呤氧化酶XOD和Hx的产物生成产生荧光的2,3-吩嗪二胺，2,3-吩嗪二胺在580nm处有荧光吸收峰。根据荧光强度检测出水产品中Hx的浓度。
为了达到实现上述检测方法的目的，本发明采用以下技术方案：
所述的检测水产品次黄嘌呤的生物传感器，通过Pt NPs催化OPD与XOD和Hx的产物H2O2的反应得到发荧光的2,3-吩嗪二胺，根据2,3-吩嗪二胺的荧光强度来检测出水产品的新鲜度。
所述的检测水产品次黄嘌呤的生物传感器中Pt NPs的制备方法，具体为：将1mL浓度为16 mM的氯铂酸水溶液和1 mL浓度为40 mM的柠檬酸三钠溶液加入到38 mL水中并在室温下搅拌30分钟。然后，向混合物中加入200 μL浓度为50 mM的硼氢化钠溶液。静置1小时后，得到Pt NPs的棕色悬浮液，使用前将其保持在4 ℃。
所述的检测水产品次黄嘌呤的生物传感器在检测水中新鲜度的应用，具体为：将Hx与黄嘌呤氧化酶XOD置于37oC摇床反应30min，加入Pt NPs反应30min，再加入OPD反应30min，最后于580nm处检测荧光强度，该检测方法耗时短，操作简单。
其中，将Pt NPs，H2O2与不同浓度的OPD反应，得到OPD的最优浓度为2 mM, 将PtNPs，H2O2与OPD反应不同时间，得到最佳反应时间为30min。
相比现有技术的不足，本发明的优点：
1.本发明利用Pt NPs的催化活性构建的荧光生物传感器通过Pt NPs催化OPD与由XOD和Hx产生的H2O2产生的荧光强弱就可知道Hx的浓度。检测工作可在10-15min内完成。
2.本发明所使用的Pt NPs由柠檬酸作为稳定剂修饰在表面，通过硼氢化钠还原氯铂酸得到，制备过程简单快速。
3.本发明在检测过程中不需要复杂的仪器和繁琐的操作，每次检测所需的Pt NPs的量极少（50 μL），检测成本低。
4.本发明检测Hx的线性范围为8–2500 μM，检测的灵敏度高，选择性好，检测限为2.88μM。
5.本发明的测定方法，可以通过荧光吸收峰测定水产品中Hx的浓度，该方法灵敏度高，特异性好，检测过程简便，经济成本低，稳定性好，易于推广使用。
附图说明
图1 为Pt NPs催化OPD和H2O2反应产生2,3-吩嗪二胺的荧光吸收光谱；
图2为对该传感器的可行性分析；
图3为反应过程中OPD浓度和反应时间的优化；
图4为不同浓度的Hx对应的不同荧光强度的曲线图；
图5为Hx的标准曲线图；
图6为Hx检测的干扰性实验。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例1：
将1mL浓度为16 mM的氯铂酸水溶液和1 mL浓度为40 mM的柠檬酸三钠溶液加入到38mL水中并在室温下搅拌30分钟。然后，向混合物中加入200 μL浓度为50 mM的硼氢化钠溶液。静置1小时后，得到Pt NPs的棕色悬浮液，制得的Pt NPs平均粒径约为2.4 nm。以上过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用超纯水彻底清洗，晾干。
图1和图2所示为对该传感器可行性的验证，单独的Pt NPs没有荧光吸收峰，当加入OPD和H2O2之后溶液在580nm处有荧光吸收峰，而且当H2O2浓度高时，吸收峰的强度有所降低。图2中只有同时加入Hx和XOD时溶液的荧光强度才会呈现明显的下降趋势；其中a柱形为Pt NPs+OPD+500 μM Hx+XOD, b柱形为Pt NPs +OPD+XOD+50 μM H2O2, c柱形为Pt NPs +OPD+Hx+50 μM H2O2。图3为对该传感器***的反应条件优化，采用控制变量法，确定了OPD的最佳浓度为2 Mm，反应最佳时间为30min。
在最佳实验条件下，将不同浓度的Hx与XOD在37摄氏度摇床中反应30min后加入50μLPt NPs，再催化反应30min后进行荧光吸收检测，得到的Hx浓度与荧光强度的关系如图4，图5所示，观察到FL强度随着Hx浓度的增加而逐渐淬灭，并且FL强度相对于Hx浓度在8-2500μM的范围内是线性的，相关系数为0.990。使用该方法， Hx的检测限（LOD）（S / N = 3，其中S代表灵敏度，N代表噪声）分别计算为2.88μM。
为了研究传感***Hx的选择性，在相同条件下测试了其他底物，包括葡萄糖（Glu），乳酸（LA），抗坏血酸（AA），尿酸（UA），K+，Zn2+，Mg2+，Ca2+。使用提出的方法。在添加这些底物（800μM）后，未观察到荧光强度的显著降低，而在添加Hx后荧光强度显着降低（图6）。这些结果表明，这些干扰几乎不影响生物传感器的性能，验证了所提出的生物传感器的良好选择性和抗干扰能力。
通过检测鱼，虾和鱿鱼中Hx的含量来验证生物传感器的实用性（表1）。从实验结果来看，这种基于Pt NPs的荧光生物传感器可以用于检测水产品变质前的新鲜度，从而判断水产品是否可食用。如表2中总结的，回收率在103.94-109.00％的范围内。此外，根据国家标准GB/T 5009.45-1996，当Hx浓度低于529μM时，水产品被认为是新鲜的。该阈值远高于本发明中提出的生物传感器的LOD。实际上，甚至活虾和鱼中的Hx浓度（分别为13.70±1.31μM和12.97±0.66μM）仍然高于该生物传感器的LOD指示。因此，所提出的生物传感器在评估水产品的新鲜度方面具有良好的应用前景，从而通过繁琐的测试方法避免了由鱼虾腐败引起的经济损失。
表1：通过所提出的传感***和HPLC在虾和鱼肉中测定的Hx浓度的比较
1h代表水产品死亡后一小时，
C1表示通过HPLC检测的Hx浓度，C2表示由所提出的生物传感器检测的Hx浓度，并且水产品在死亡后储存在4℃。
数据显示为平均值±SD（n = 3）
表2：通过提出的生物传感器测定虾中Hx的回收率
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (7)
1.一种检测水产品次黄嘌呤的生物传感器的制备方法，其特征在于：所述生物传感器为Pt NPs，其是以柠檬酸作为稳定剂，通过硼氢化钠还原氯铂酸制备所得。
2.根据权利要求1所述的一种检测水产品次黄嘌呤的生物传感器的制备方法，其特征在于：具体步骤为：将1mL浓度为16 mM的氯铂酸水溶液和1 mL浓度为40 mM的柠檬酸三钠溶液加入到38 mL水中并在室温下搅拌30min；然后，向混合物中加入200 μL浓度为50 mM的硼氢化钠溶液； 静置1h后，得到Pt NPs的棕色悬浮液，使用前将其保持在4 ℃，制备得到PtNPs。
3.一种如权利要求1所述方法制备得到的一种检测水产品次黄嘌呤的生物传感器。
4.一种如权利要求1所述方法制备得到的检测水产品次黄嘌呤的生物传感器在检测水的新鲜度上的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：将30 μL次黄嘌呤Hx与20 μL黄嘌呤氧化酶XOD置于37℃摇床反应30min，加入100 μL Pt NPs反应30min，再加入50 μL 邻苯二胺OPD反应0~60min，氧化后的溶液最后检测荧光强度。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：加入邻苯二胺OPD反应的时间为30min。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：氧化后的溶液在580nm处的荧光强度判断次黄嘌呤Hx的浓度。
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